專利名稱：活性內(nèi)酯類化合物的聚乙二醇化衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及活性 內(nèi)酯類化合物，尤其是穿心蓮內(nèi)酯及其衍生物的聚乙二醇化偶合 物，及其在制備抗菌消炎、鎮(zhèn)痛、抗病毒等相關(guān)作用的藥物中用途。
背景技術(shù)：
穿心蓮內(nèi)酯(andrographolide)為爵床科植物穿心蓮中提取得到的二萜內(nèi)酯類 化合物，是中藥穿心蓮的主要活性成分之一，在穿心蓮葉中含量高達(dá)1. 84%，在我國已作為 穿琥寧、穿心蓮注射液等解熱鎮(zhèn)痛藥的原料大量生產(chǎn)?，F(xiàn)代藥理研究表明，穿心蓮內(nèi)酯及其 脫水穿心蓮內(nèi)酯、脫氧穿心蓮內(nèi)酯等衍生物具有抗炎抗菌、抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、治療 心腦血管疾病、保肝利膽、抗腫瘤等作用，具有毒性小，價(jià)格低的特點(diǎn)。穿琥寧是由穿心蓮內(nèi)酯與琥珀酸酐反應(yīng)制得的脫水穿心蓮內(nèi)酯琥珀酸半酯單鉀 鹽，其分子結(jié)構(gòu)式如下 穿琥寧具有抗菌消炎、鎮(zhèn)痛、抗病毒等作用，對(duì)流感病毒、呼吸道病毒、腺病毒等有 滅活作用，對(duì)金色葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌等有明顯抑制作用，臨床上常用于治療外感 高熱、急性感染性疾病、尿路感染等，療效好，副作用少，尤其對(duì)抗生素過敏者更應(yīng)首選。穿 琥寧注射液是國家中醫(yī)藥管理局批準(zhǔn)的全國中醫(yī)醫(yī)院急診科(室)首批必備純中藥制劑， 能靜脈和肌肉注射，是目前中醫(yī)急診中較為常用和理想的藥物之一。隨著其應(yīng)用范圍的不斷擴(kuò)大，關(guān)于穿琥寧不良反應(yīng)的報(bào)道也逐漸增多例如，白細(xì) 胞銳減、過敏性休克及其引起的口干等癥狀、嚴(yán)重呼吸困難、藥熱反應(yīng)、過敏反應(yīng)、皮膚過敏 反應(yīng)、皮下紫癜、血小板減少、導(dǎo)致腹痛、腹瀉、肝損害等副作用，嚴(yán)重影響了穿琥寧注射液 的應(yīng)用范圍。穿琥寧為內(nèi)酯類結(jié)構(gòu)，水溶性差，且在水中易水解、開環(huán)、異構(gòu)化和樹脂化而影響 制劑的質(zhì)量，其純度和雜質(zhì)與制備工藝過程有關(guān)，穿琥寧注射液的不良反應(yīng)與其內(nèi)在質(zhì)量 有關(guān)。傳統(tǒng)的穿琥寧注射液需經(jīng)高溫高壓滅菌，此過程易使藥物發(fā)生降解，對(duì)藥物穩(wěn)定性產(chǎn) 生影響。因此，對(duì)穿琥寧結(jié)構(gòu)進(jìn)行大分子修飾，提高結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和水溶性，從而降低毒副作 用，延長作用時(shí)間是十分必要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人經(jīng)研究現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯及其衍生物尤其是穿心蓮內(nèi)酯二琥珀酸半酯 或脫水穿心蓮內(nèi)酯二琥珀酸半酯或脫氧穿心蓮內(nèi)酯二琥珀酸半酯經(jīng)聚乙二醇共價(jià)修飾后，毒 副作用降低，活性有所提高，且顯著增加其水溶性及穩(wěn)定性，延長了其在體內(nèi)的半衰期。本發(fā)明涉及式(I)所示穿心蓮內(nèi)酯或脫水穿心蓮內(nèi)酯或脫氧穿心蓮內(nèi)酯及其衍 生物的聚乙二醇化偶合物 其中，D為^或或— RpR2分別獨(dú)立的為H或
結(jié)構(gòu) X「mPEG，但不同時(shí)為 H;其中，mPEG 為 CH2CH2 (OCH2CH2) n「0CH3，叫=0-1000 ；X1 為 A = - (NH-CR3R4-CO) n3-(NH-CR5R6-CO) n4-(NH-CR7R8-CO) n5-(NH-CR9R10-CO) n6-Z-； R3到Rltl分別獨(dú)立的為H，取代或未取代的C1-C6直鏈或者支鏈烷基，取代或未取代的C2-C6 直鏈或者支鏈烯基或者炔基，取代或未取代的C1-C6直鏈或者支鏈烷氧基，取代或未取代 的C1-C6直鏈或者支鏈烷硫基，取代或未取代的C2-C6直鏈或者支鏈烯基或者炔基氧基，取 代或未取代的C2-C6直鏈或者支鏈烯基或者炔基，環(huán)烷基或環(huán)鏈烯基，芳基，雜環(huán)基；-(CH2) n7-C0-0-mPEG ；- (CH2) n7-C0-N-mPEG ;n7為l_6，mPEG定義同前；其中，優(yōu)選地，雜環(huán)烷基為其 環(huán)結(jié)構(gòu)中含1-5個(gè)(優(yōu)選1-3個(gè))獨(dú)立地選自N、0和S等的雜原子的環(huán)狀基團(tuán)；芳基為未 取代的或被獨(dú)立地選自鹵素，硝基，羧基或C1-C4烷基的取代基單取代或二取代或三取代的 4、5、6、或7元單環(huán)或雙環(huán)芳香基團(tuán)，如苯基或者或萘基等；雜環(huán)基可為未取代的或被獨(dú)立 地選自鹵素，硝基，羧基或C1-C4烷基的取代基單取代或二取代的、含有1-5個(gè)獨(dú)立地選自N、 0和S等的雜原子的4、5、6、或7元單環(huán)或雙環(huán)芳香基團(tuán)，如吡咯基，呋喃基，吡啶基等；n3到 n6分別獨(dú)立的為0或1 ;Z為0或NH。B = -NH-(CH2) n8-S-S-(CH2) n9-C (0)-Z- ;n8 為 2-5, n9 為 1-4 ;Z 為 0 或 NH。Y = -NH- (CH2) n10-S_M-，n10 為 2-5 ；M為
更為優(yōu)選的，M為 本發(fā)明再一方面涉及含至少一種式(I)化合物及藥用載體或賦形劑的藥物組合 物。本發(fā)明還涉及至少一種式(I)化合物在制備抗菌消炎、鎮(zhèn)痛、抗病毒等相關(guān)的藥 物中用途。根據(jù)本發(fā)明，在本發(fā)明中使用的縮寫詞具有下面的含義PEG-聚乙二醇mPEG-單甲氧基聚乙二醇Et3N-三乙胺RP-HPLC-反相液相色譜TLC-薄層色譜EDC · HCl-I-乙基_3_ (3_ 二甲胺丙基)碳二亞胺鹽酸鹽DCM-二氯甲烷DMAP- 二甲胺基吡啶Ts-Cl-對(duì)甲苯磺酰氯MALDI-T0F-MS-基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜TCID50-半數(shù)培養(yǎng)感染劑量MDCK-犬腎細(xì)胞DMEM-—種培養(yǎng)基根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明所涉及的mPEG-OH可以作為商品化試劑從德國Fluka公司購 買，HiPEG-NH2可以購買或通過以下反應(yīng)得到
「00331_ 本發(fā)明以平均分子量為350、500、550、750、1000、1100、2000 和 5000 的
CH3O-PEG-OH (mPEG)，其也可表示為 mPEG350，mPEG500, mPEG550, mPEG750, mPEG1000, mPEG1100, mPEG2000和mPEG5_為原料，合成了系列單位點(diǎn)mPEG修飾以及雙位點(diǎn)mPEG修飾的脫水穿心 蓮內(nèi)酯衍生物。各化合物經(jīng)RP-HPLC以及TLC分析為單一峰，經(jīng)質(zhì)譜和氫譜、碳譜核磁分析， 確證結(jié)構(gòu)正確。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的藥物組合物制成適用于哺乳動(dòng)物用的各種劑型，例如用甘 露醇作賦形劑制成注射劑。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例下述實(shí)施例代表本發(fā)明的說明性實(shí)施方案，但本發(fā)明不受這些實(shí)施例的限制。實(shí) 施例所用平均分子量為 350、500、550、750、1000、1100、2000 和 5000 的 CH3O-PEG-OH (mPEG) 為德國Fluka公司產(chǎn)品，1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDOHCl)與二甲 胺基吡啶(DMAP)均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?shí)施例1以穿琥寧為起始原料，制備脫水穿心蓮內(nèi)酯二琥珀酸半酯的單位點(diǎn) mPEG1100衍生物。 稱取穿琥寧2. 85g(5mmol)置于500ml反應(yīng)瓶中，加入125ml乙醇和175ml水的混 合溶液，固體溶解后，在冰浴條件下，滴加5. OmllM的HC 1水溶液，滴加完畢后攪拌10分 鐘，室溫(25°C)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去大量乙醇后，用乙酸乙酯萃取，用無水硫酸鈉干燥后，旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)除去溶劑，定量得脫水穿心蓮內(nèi)酯二琥珀酸半酯2. 60g。將2. 6g (5mmol)脫水穿心蓮內(nèi)酯二琥珀酸半酯溶于100ml DCM,加入1. 95g EDC · HCl (IOmmol)溶解后，攪拌反應(yīng)10分鐘，再加入8. 25gmPEG1100(7. 5mmol)。冰浴條件 下，加入0.061g DMAP(0. 5mmol)。反應(yīng)5小時(shí)，HPLC監(jiān)測反應(yīng)完全后，濃縮反應(yīng)液，通過硅 膠柱層析，得淡黃色油狀液體，用無水乙醚沉淀出白色固體，得4. 55g產(chǎn)物，收率55. 8%。經(jīng) 經(jīng)MALDI-T0F-MS鑒定，分子量在1826左右呈正態(tài)分布(mPEG11(1(1原料分子量在1244左右呈 正態(tài)分布)，分子量正確。實(shí)施例2以脫水穿心蓮內(nèi)酯二琥珀酸半酯為起始原料，制備脫水穿心蓮內(nèi)酯二琥 珀酸半酯的單位點(diǎn)HiPEGlicici衍生物。將2. 53g(5mmol)脫水穿心蓮內(nèi)酯二琥珀酸半酯溶于100ml DCM，加入1.95g EDC · HCl (IOmmol)溶解后，攪拌反應(yīng)10分鐘，再加入8. 25gmPEG1100(7. 5mmol)。冰浴條件 下，加入0.061g DMAP(0. 5mmol)。反應(yīng)5小時(shí)，HPLC監(jiān)測反應(yīng)完全后，濃縮反應(yīng)液，通過硅 膠柱層析，得淡黃色油狀液體，用無水乙醚沉淀出白色固體，得4. 42g產(chǎn)物，收率54. 2%。實(shí)施例3以穿琥寧為起始原料，制備脫水穿心蓮內(nèi)酯二琥珀酸半酯的雙位點(diǎn) mPEG1100衍生物。 稱取穿琥寧2. 85g(5mmol)置于500ml反應(yīng)瓶中，加入125ml乙醇和175ml水的混 合溶液，固體溶解后，在冰浴條件下，滴加5. Oml IM的HCl水溶液，滴加完畢后攪拌10分 鐘，室溫(25°C)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去大量乙醇后，用乙酸乙酯萃取，用無水硫酸鈉干燥后，旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)除去溶劑，定量得脫水穿心蓮內(nèi)酯二琥珀酸半酯2. 60g。將2. 6g (5mmol)脫水穿心蓮內(nèi)酯二琥珀酸半酯溶于IOOml DCM,加入2. 14g EDC · HCl (Ilmmol)溶解后，攪拌反應(yīng)10分鐘，再加入12. 12g mPEG11(1(1(ll讓ol)。冰浴條件 下，加入0.061g DMAP(0. 5mmol)。反應(yīng)8小時(shí)，HPLC監(jiān)測反應(yīng)完全后，濃縮反應(yīng)液，通過硅 膠柱層析，得淡黃色油狀液體，用無水乙醚沉淀出白色固體，得5. 59g產(chǎn)物，收率42.5%。經(jīng) MALDI-TOF-MS鑒定，分子量在2962左右呈正態(tài)分布(mPEG11(1(1原料分子量在1244左右呈 正態(tài)分。布)，分子量正確。氫譜數(shù)據(jù)如下脫水穿心蓮內(nèi)酯二琥珀酸半酯結(jié)構(gòu)上H歸屬 δ 0. 86 (3Η, s, 17-CH3)，1. 00 (3H, s, 18_CH3)，1. 20-1. 27 (1H, m, I-CH2)，1. 31 (1—H，d, 5—CH)， 1. 53-1. 57 (2H, m, I-CH2, 6_CH2)，1. 64-1. 69 (2H, m, 2_CH2)，1. 81 (1H，d, 6-CH)，2. 05 (1H， m, 7-CH2)，2. 33-2. 74 (10H, m, 7-CH2, 9-CH，22_CH2，23_CH2，26_CH2，27_CH2)，4. 15 (1H, d, 19-CH2)，4. 39 (1H, d, 19_CH2)，4. 56 (1H, s, 20_CH2)，4. 64 (1H, t, 3_CH)，4. 80 (1H, s, 20_CH2)， 4. 82 (2H, s, 15-CH2)，6· 12 (1H, d, 12-CH)，6· 92 (1H, dd, 11-CH)，7· 18 (1H, s, 14-CH) ；mPEG 結(jié) 構(gòu)上 H 歸屬δ 3. 38 (6Η，s，-OCH3 ，3. 56-3. 67 (200H, m, -OCH2CH2-)。氫譜確證含有小分子 特征峰和HiPEGlicitl特征峰。結(jié)合氫譜和質(zhì)譜確證結(jié)構(gòu)正確，為雙mPEG11(1(1偶合的脫水穿心蓮 內(nèi)酯二琥珀酸半酯衍生物。實(shí)施例4以脫水穿心蓮內(nèi)酯二琥珀酸半酯為起始原料，制備脫水穿心蓮內(nèi)酯二琥 珀酸半酯的雙位點(diǎn)mPEG11(1(1衍生物。將2. 53g(5mmol)脫水穿心蓮內(nèi)酯二琥珀酸半酯溶于100ml DCM，加入2.14g EDC · HCl (Ilmmol)溶解后，攪拌反應(yīng)10分鐘，再加入12. 14g mPEG11(1(1(ll讓ol)。冰浴條件 下，加入0.061g DMAP(0. 5mmol)。反應(yīng)8小時(shí)，HPLC監(jiān)測反應(yīng)完全后，濃縮反應(yīng)液，通過硅 膠柱層析，得淡黃色油狀液體，用無水乙醚沉淀出白色固體，得5. 64g產(chǎn)物，收率42.9%。實(shí)施例5以脫水穿心蓮內(nèi)酯二琥珀酸半酯和平均分子量為350的HiPEG35tl為起始 原料，制備脫水穿心蓮內(nèi)酯二琥珀酸半酯的雙位點(diǎn)mPEG35(l衍生物。將0. 53g (Immol)脫水穿心蓮內(nèi)酯二琥珀酸半酯溶于25ml DCM,加入0. 50g EDC · HCl (2. 5mmol)溶解后，攪拌反應(yīng)15分鐘，再加入0. 77g mPEG350 ( 2 . 2mmol)。冰浴條件 下，加入0.012g DMAP (0. lmmol)。反應(yīng)10小時(shí)，HPLC監(jiān)測反應(yīng)完全后，濃縮反應(yīng)液，通過硅 膠柱層析，得淡黃色油狀產(chǎn)物0. 58g，收率47. 9%。HiPEG35tl重復(fù)單元?dú)鋽?shù)與脫水穿心蓮內(nèi)酯 二琥珀酸半酯12位(見實(shí)施例3示意圖)的特征氫數(shù)比例為74 1，證明結(jié)構(gòu)正確。實(shí)施例6以脫水穿心蓮內(nèi)酯二琥珀酸半酯和平均分子量為500的mPEG·為起始 原料，制備脫水穿心蓮內(nèi)酯二琥珀酸半酯的雙位點(diǎn)mPEG·衍生物。
將5. 32g (IOmmol)脫水穿心蓮內(nèi)酯二琥珀酸半酯溶于150ml DCM,加入5g EDC · HCl (25mmol)溶解后，攪拌反應(yīng)15分鐘，再加入1 IgmPEG5tltl(22mmol)。冰浴條件下，力口 入0. 122g DMAP(Immol)。反應(yīng)10小時(shí)，HPLC監(jiān)測反應(yīng)完全后，濃縮反應(yīng)液，通過硅膠柱層 析，得淡黃色油狀產(chǎn)物6. 90g，收率45.6%。經(jīng)MALDI-T0F-MS鑒定，分子量在1596左右呈 正態(tài)分布(mPEG·原料分子量在548左右呈正態(tài)分布)，分子量正確。實(shí)施例7以脫水穿心蓮內(nèi)酯二琥珀酸半酯和平均分子量為750的HiPEG75tl為起始 原料，制備脫水穿心蓮內(nèi)酯二琥珀酸半酯的雙位點(diǎn)mPEG75(l衍生物。將5. 32g (IOmmol)脫水穿心蓮內(nèi)酯二琥珀酸半酯溶于150ml DCM,加入5g EDC · HCl (25mmol)溶解后，攪拌反應(yīng)15分鐘，再加入1 IgmPEG75tl(22mmol)。冰浴條件下，力口 入0. 122g DMAP(Immol)。反應(yīng)10小時(shí)，HPLC監(jiān)測反應(yīng)完全后，濃縮反應(yīng)液，通過硅膠柱層 析，得淡黃色蠟狀產(chǎn)物7. 21g，收率35.8%。經(jīng)MALDI-T0F-MS鑒定，分子量在1904左右呈 正態(tài)分布OiiPEG75ci原料分子量在702左右呈正態(tài)分布)，分子量正確。實(shí)施例8以脫水穿心蓮內(nèi)酯二琥珀酸半酯和平均分子量為100 0的IiiPEGicicici為起始 原料，制備脫水穿心蓮內(nèi)酯二琥珀酸半酯的雙位點(diǎn)HiPEGicicici衍生物。將2. 53g(5mmol)脫水穿心蓮內(nèi)酯二琥珀酸半酯溶于100ml DCM，加入2.14g EDC · HCl (Ilmmol)溶解后，攪拌反應(yīng)10分鐘，再加入11. 02g HiPEGiqqq(II^oI)。冰浴條件 下，加入0.061g DMAP(0. 5mmol)。反應(yīng)8小時(shí)，HPLC監(jiān)測反應(yīng)完全后，濃縮反應(yīng)液，通過硅 膠柱層析，得淡黃色油狀液體，用無水乙醚沉淀出白色固體，得5. 68g產(chǎn)物，收率45.2%。經(jīng) 經(jīng)MALDI-T0F-MS鑒定，分子量在2565左右呈正態(tài)分布(mPEG1(1(lcl原料分子量在1047左右呈 正態(tài)分布)，分子量正確。實(shí)施例9以脫水穿心蓮內(nèi)酯二琥珀酸半酯和平均分子量為2000的mPEG2_為起始 原料，制備脫水穿心蓮內(nèi)酯二琥珀酸半酯的雙位點(diǎn)mPEG2_衍生物。將0. 53g (Immol)脫水穿心蓮內(nèi)酯二琥珀酸半酯溶于25ml DCM,加入0. 5g EDC · HCl (2. 5mmol)溶解后，攪拌反應(yīng)15分鐘，再加入4. 4gmPEG2000 ( 2 . 2mmol)。冰浴條件 下，加入0.012g DMAP (0. lmmol)。反應(yīng)10小時(shí)，HPLC監(jiān)測反應(yīng)完全后，濃縮反應(yīng)液，通過硅 膠柱層析，得淡黃色油狀液體，用無水乙醚沉淀出白色固體，得產(chǎn)物1. 78g，收率39. 5%。經(jīng) 氫譜鑒定，mPEG2000重復(fù)單元?dú)鋽?shù)與脫水穿心蓮內(nèi)酯二琥珀酸半酯12位(見實(shí)施例3示意 圖)的特征氫數(shù)比例為487 1，證明結(jié)構(gòu)正確。實(shí)施例10以脫水穿心蓮內(nèi)酯二琥珀酸半酯和平均分子量為5000的mPEG5_為起 始原料，制備脫水穿心蓮內(nèi)酯二琥珀酸半酯的雙位點(diǎn)mPEG5·衍生物。將0. 53g (Immol)脫水穿心蓮內(nèi)酯二琥珀酸半酯溶于25ml DCM,加入0. 5g EDC -HCl (2. 5mmol)溶解后，攪拌反應(yīng)10分鐘，再加入llgmPEG5_(2. 2mmol)。冰浴條件下， 加入0. 012g DMAP (0. lmmol)。反應(yīng)10小時(shí)，HPLC監(jiān)測反應(yīng)完全，濃縮反應(yīng)液，通過硅膠柱 層析，得淡黃色油狀液體，用無水乙醚沉淀出白色固體，得3. 28g產(chǎn)物，收率31.2%。mPEG5_ 重復(fù)單元?dú)鋽?shù)與脫水穿心蓮內(nèi)酯二琥珀酸半酯12位(見實(shí)施例3示意圖)的特征氫數(shù)比 例為1126 1，證明結(jié)構(gòu)正確。實(shí)施例11穿琥寧與脫水穿心蓮內(nèi)酯二琥珀酸半酯的單位點(diǎn)HiPEGlicitl以及mPEG2_ 衍生物穩(wěn)定性評(píng)價(jià)按藥典規(guī)定現(xiàn)配磷酸鉀緩沖液，并按比例加入20%的乙醇，取穿琥寧原料藥、PEG修飾物分別溶于上述溶液中，置于光照條件下，分別于5天、10天后取樣，用HPLC進(jìn)行檢測。 結(jié)果在三個(gè)PH值以及光照條件下，原料藥穿琥寧5天即全部分解，而脫水穿心蓮內(nèi)酯二琥 珀酸半酯的單位點(diǎn)mPEG11(1(1以及mPEG_S生物在10天時(shí)，幾乎所有樣品含量仍大于90%， 其穩(wěn)定性明顯好于穿琥寧原料藥。詳見表1、表2和表3。表1溶液pH為3. 56時(shí)樣品含量變化 實(shí)施例12脫水穿心蓮內(nèi)酯二琥珀酸半酯的雙位點(diǎn)mPEh■衍生物活性評(píng)價(jià)-對(duì)二 甲苯致小鼠耳腫脹的影響取昆明種小鼠70只，按性別體重隨機(jī)分為7組，每組10只，雌雄各半。即陰性對(duì) 照組(葡萄糖溶液)，穿心蓮內(nèi)酯組，穿琥寧組，代號(hào)為Lkql09030脫水穿心蓮內(nèi)酯二琥珀酸 半酯的雙位點(diǎn)mPEG11(l(l衍生物的高、中、低劑量組，陽性對(duì)照組(地塞米松)。對(duì)穿心蓮內(nèi)酯 組以200mg/kg尾靜脈給藥，穿琥寧組以100mg/kg尾靜脈給藥，Lkql09030高劑量以200mg/ kg尾靜脈給藥，中劑量以100mg/kg靜脈給藥，低劑量以50mg/kg尾靜脈注射給藥。陽性對(duì)照組(地塞米松注射液)以0.01375%的濃度給小鼠尾腔注射2.75!1^/1^。上述各組小鼠 均每日給藥一次，連續(xù)給藥三天，于末次給藥后30min，用二甲苯0. 02ml/只涂抹每鼠左耳 致炎，右耳作對(duì)照，致炎后20分鐘脫頸椎處死小鼠，以9mm直徑打孔器取下耳緣左、右耳片， 分別用電子天平稱重，以左、右耳片重量差表示腫脹度，進(jìn)行組間顯著比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表 4。表4化合物L(fēng)kql09030對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響 與陰性對(duì)照組比較< 0. 001由表4顯示，將穿心蓮內(nèi)酯，穿琥寧，Lkql09030 (高、中、低)，每日一次，連續(xù)三天， 靜脈給藥后。穿琥寧、Lkql09030高劑量組、中劑量組及低劑量組腫脹度與陰性對(duì)照組比較 有顯著差異性，且穿琥寧、Lkql09030中劑量組對(duì)二甲苯致炎的抗炎效果相當(dāng)。實(shí)施例13脫水穿心蓮內(nèi)酯二琥珀酸半酯的雙位點(diǎn)HiPEG1■衍生物活性評(píng)價(jià)-對(duì)醋 酸所致小鼠疼痛的影響取昆明種小鼠70只，按體重隨機(jī)分為7組，每組10只，雌雄各半。分別為陰性對(duì) 照組(5%葡萄糖溶液)，穿心蓮內(nèi)酯組(200mg/kg)，穿琥寧組(100mg/kg)，Lkql09030高 (200mg/kg)、中(100mg/kg)、低劑量組(50mg/kg)，陽性對(duì)照組(嗎啡)。除陽性對(duì)照組外其 余各組均以尾靜脈注射給藥，連續(xù)給藥3天，給藥劑量為0. 2ml/10g。陽性對(duì)照組于實(shí)驗(yàn)當(dāng) 日腹腔注射0. 06%嗎啡溶液0. 4ml/20g。于末次給藥30mi η后，給小鼠腹腔注射0. 6%醋 酸0. 2ml/只，記錄給醋酸后20min內(nèi)小鼠因腹膜受刺激而引起扭體反應(yīng)次數(shù)，進(jìn)行組間顯 著性比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。表5化合物L(fēng)kql09030對(duì)醋酸所致小鼠疼痛的影響(η = 10，X士S) 與陰性對(duì)照組比較*P < 0. 05 ***P <0. 001表5結(jié)果表明，穿心蓮內(nèi)酯、穿琥寧、化合物L(fēng)kql09030(高、中、低)尾靜脈注射給 藥，每日一次，連續(xù)三天，能抑制小鼠腹腔注射醋酸所引起的扭體反應(yīng)次數(shù)，與陰性對(duì)照組 比較具有顯著性的差異，說明穿心蓮內(nèi)酯、穿琥寧、化合物L(fēng)kql09030(高、中、低)具有顯著 的鎮(zhèn)痛作用。實(shí)施例14脫水穿心蓮內(nèi)酯二琥珀酸半酯的單位點(diǎn)HiPEG2tltic^i生物抗流感病毒體外 活性評(píng)價(jià)一、實(shí)驗(yàn)材料1、樣品1_3號(hào)樣品，配制起始濃度為1 20。1號(hào)穿心蓮內(nèi)酯2號(hào)穿琥寧3號(hào)MPEG2000穿琥寧修飾4號(hào)MPEG4100穿琥寧修飾2、病毒株流感病毒甲1亞型，實(shí)驗(yàn)前測定其TCID5tl為l(T6_87l00ul， 100TCID50/100ul 為 1(Γ4.83。3、細(xì)胞株MDCK細(xì)胞，生長液為含10%胎牛血清的DMEM。4、試劑耗材DMEM(美國Gibco公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；96孔細(xì)胞 培養(yǎng)板(美國Corning公司)·二、實(shí)驗(yàn)方法1、樣品配制用DMEM對(duì)樣品進(jìn)行倍比稀釋，其藥液濃度分別為50mg/ml(l 20)、25mg/ ml(l 40)、12. 5mg/ml(l 80)、6. 25mg/ml (1 160)、3. 13mg/ml (1 320)、1.56mg/ ml(l 640)、0. 78mg/ml(l 1280)、0. 39mg/ml (1 2560)、.................等濃度。2、MDCK細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)取1 40 1 5120的1-3號(hào)樣品稀釋液，分別加入到長成單層的96孔MDCK 細(xì)胞培養(yǎng)版中，IOOul/孔，每濃度3孔，置37°C，5 % CO2培養(yǎng)箱中96h，觀察細(xì)胞病變，測定 樣品對(duì)MDCK細(xì)胞的毒性反應(yīng)。3、抗病毒實(shí)驗(yàn)將IOOTCID5ci流感病毒液分別加入到長成單層的96孔MDCK細(xì)胞培養(yǎng)版中，IOOul/孔，2h后頃去病毒液，每孔內(nèi)再加入不同濃度的、對(duì)細(xì)胞無毒性作用的樣品稀釋液，lOOul/ 孔，每濃度3孔，置35°C ,5% CO2培養(yǎng)箱中24h后觀察細(xì)胞病變，96h后進(jìn)行血凝實(shí)驗(yàn)。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.樣品對(duì)MDCK細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)表IMDCK細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn) 表1結(jié)果提示1號(hào)樣品從1 320開始對(duì)細(xì)胞無毒性，2號(hào)樣品從1 160開始 對(duì)細(xì)胞無毒性，3號(hào)樣品從1 320開始對(duì)細(xì)胞無毒性。2、抗流感病毒實(shí)驗(yàn)表2樣品對(duì)流感病毒致MDCK細(xì)胞病變的抑制實(shí)驗(yàn) 表2結(jié)果提示1號(hào)樣品從1 320稀釋濃度開始，對(duì)流感病毒感染MDCK細(xì)胞沒 有抑制作用；2號(hào)樣品從1 160稀釋濃度開始，對(duì)流感病毒感染MDCK細(xì)胞沒有抑制作用； 3號(hào)樣品從1 320到1 1280稀釋濃度，對(duì)流感病毒感染MDCK細(xì)胞有抑制作用，之后濃 度沒有抑制作用。結(jié)論
1、1號(hào)樣品1 40 1 160均對(duì)細(xì)胞有明顯毒性作用，從最大無毒性濃度 1 320 1 40960，1號(hào)樣品對(duì)流感病毒致MDCK細(xì)胞病變無抑制作用。2、2號(hào) 樣品從1 40 1 80均對(duì)細(xì)胞有明顯毒性作用，從最大無毒性濃度 1 160 1 20480，2號(hào)樣品對(duì)流感病毒致MDCK細(xì)胞病變無抑制作用。3、3號(hào)樣品從1 40 1 160均對(duì)細(xì)胞有明顯毒性作用，從最大無毒性濃度 1 320 1 1280，3號(hào)樣品對(duì)流感病毒致MDCK細(xì)胞病變有抑制作用，其他濃度對(duì)細(xì)胞病 變無抑制作用。
權(quán)利要求
式(I)所示活性內(nèi)酯類化合物包括穿心蓮內(nèi)酯或脫水穿心蓮內(nèi)酯或脫氧穿心蓮內(nèi)酯及其衍生物的聚乙二醇化偶合物其中，D為R1、R2分別獨(dú)立的為H或結(jié)構(gòu)X1-mPEG，但不同時(shí)為H；其中，mPEG為CH2CH2(OCH2CH2)n1-OCH3，n1＝0-1000；X1為n2為0-4，X2可以為A、B或YA＝-(NH-CR3R4-CO)n3-(NH-CR5R6-CO)n4-(NH-CR7R8-CO)n5-(NH-CR9R10-CO)n6-Z-；R3到R10分別獨(dú)立的為H，取代或未取代的C1-C6直鏈或者支鏈烷基，取代或未取代的C2-C6直鏈或者支鏈烯基或者炔基，取代或未取代的C1-C6直鏈或者支鏈烷氧基，取代或未取代的C1-C6直鏈或者支鏈烷硫基，取代或未取代的C2-C6直鏈或者支鏈烯基氧基或者炔基氧基，取代或未取代的C2-C6直鏈或者支鏈烯基或者炔基，環(huán)烷基或環(huán)鏈烯基，芳基，雜環(huán)基；-(CH2)n7-CO-O-mPEG；-(CH2)n7-CO-NH-mPEG；n7為1-6，mPEG定義同前；其中，優(yōu)選地，雜環(huán)烷基為其環(huán)結(jié)構(gòu)中含1-5個(gè)(優(yōu)選1-3個(gè))獨(dú)立地選自N、O和S等的雜原子的環(huán)狀基團(tuán)；芳基為未取代的或被獨(dú)立地選自鹵素，硝基，羧基或C1-C4烷基的取代基單取代或二取代或三取代的4、5、6、或7元單環(huán)或雙環(huán)芳香基團(tuán)，如苯基或者或萘基等；雜環(huán)基可為未取代的或被獨(dú)立地選自鹵素，硝基，羧基或C1-C4烷基的取代基單取代或二取代的、含有1-5個(gè)獨(dú)立地選自N、O和S等的雜原子的4、5、6、或7元單環(huán)或雙環(huán)芳香基團(tuán)，如吡咯基，呋喃基，吡啶基等；n3到n6分別獨(dú)立的為0或1；Z為O或NH；B＝-NH-(CH2)n8-S-S-(CH2)n9-C(O)-Z-；n8為2-5，n9為1-4；Z為O或NH；Y＝-NH-(CH2)n10-S-M-，n10為2-5；M為更為優(yōu)選的，M為n10＝2。FSA00000077839600011.tif,FSA00000077839600012.tif,FSA00000077839600013.tif,FSA00000077839600021.tif,FSA00000077839600022.tif
2.權(quán)利要求1中所述化合物，當(dāng)A中ri3= ri4 = ri5 = Ii6 = 0時(shí)，Z為0或ΝΗ。
3.權(quán)利要求1中所述化合物，當(dāng)B中Ii8= 2，Ii9 = 1時(shí)，Z為0或ΝΗ。
4.權(quán)利要求1中所述化合物，當(dāng)Y中M為
5.權(quán)利要求1-4 任一化合物，其中 mPEG 為 mPEG35Q，mPEG500, mPEG550, mPEG750, mPEG1000, mPEG1100，mPEG2000 禾口 mPEG5000。
6.權(quán)利要求5的化合物，其中所述化合物為 脫水穿心蓮內(nèi)酯二琥珀酸半酯的單位點(diǎn)mPEG11Q(l， 脫水穿心蓮內(nèi)酯二琥珀酸半酯的雙位點(diǎn)mPEG11QQ， 脫水穿心蓮內(nèi)酯二琥珀酸半酯的雙位點(diǎn)mPEG㈣， 脫水穿心蓮內(nèi)酯二琥珀酸半酯的雙位點(diǎn)mPEG■， 脫水穿心蓮內(nèi)酯二琥珀酸半酯的雙位點(diǎn)mPEG75Q， 脫水穿心蓮內(nèi)酯二琥珀酸半酯的雙位點(diǎn)mPEG-。， 脫水穿心蓮內(nèi)酯二琥珀酸半酯的雙位點(diǎn)mPEG2_， 脫水穿心蓮內(nèi)酯二琥珀酸半酯的雙位點(diǎn)mPEG5_。
7.藥物組合物，其含有權(quán)利要求1-6的至少一種式(I)的化合物及藥物載體或賦形劑。
8.權(quán)利要求1-7中任一化合物在制備抗菌消炎、鎮(zhèn)痛、抗病毒等相關(guān)作用的藥物中用
全文摘要
本發(fā)明涉及活性內(nèi)酯類化合物的聚乙二醇化衍生物，其制備方法，含它們的藥物組合物，及其在抗菌消炎、鎮(zhèn)痛、抗病毒等方面的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P37/02GK101870768SQ20101015292
公開日2010年10月27日 申請(qǐng)日期2010年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月22日
發(fā)明者喬磊, 全東琴, 馮思良, 劉克良, 孟慶斌, 李思成, 賈啟燕, 韓寒 申請(qǐng)人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所;成都一平醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司