專利名稱：能夠表達(dá)外源gitr配體的細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用作治療劑或預(yù)防劑例如疫苗(用于治療腫瘤)的能夠表達(dá)糖皮質(zhì)激 素誘導(dǎo)性腫瘤壞死因子受體(在下文中稱為“GITR”)的配體的遺傳修飾細(xì)胞和能夠表達(dá)所 述配體的衍生物的這類細(xì)胞。本發(fā)明還涉及增強(qiáng)的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答和由調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 介導(dǎo)的免疫抑制的控制，所述免疫應(yīng)答由GITR-配體表達(dá)細(xì)胞或表達(dá)所述配體的衍生物的 細(xì)胞誘導(dǎo)。
背景技術(shù)：
活生物體主要由免疫應(yīng)答提供對(duì)外源物質(zhì)的防護(hù)。免疫系統(tǒng)由各種細(xì)胞和從由其 產(chǎn)生的可溶性因子組成。在那些細(xì)胞中，白細(xì)胞尤其是淋巴細(xì)胞在該系統(tǒng)中起主要作用。淋 巴細(xì)胞分為兩大類B淋巴細(xì)胞(在下文中可稱為“B細(xì)胞”)和T淋巴細(xì)胞(在下文中可 稱為“T細(xì)胞”)。兩類細(xì)胞都可以特異性方式識(shí)別抗原并與它們相互作用保護(hù)活生物體。作為繼手術(shù)、化學(xué)療法和放射療法之后的第4種用于治療腫瘤的方法，免疫療法 最近引人注意。由于免疫療法利用人類固有的免疫性，所以據(jù)認(rèn)為接受免疫療法的患者的 身體負(fù)擔(dān)比其它療法中的輕。稱為免疫療法的治療方法包括細(xì)胞轉(zhuǎn)移療法，其中將以下細(xì) 胞轉(zhuǎn)移所述細(xì)胞例如為使用各種方法通過擴(kuò)繁培養(yǎng)，獲得自例如外源誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞(CTL)或外周血淋巴細(xì)胞的淋巴因子激活的細(xì)胞、自然殺傷T細(xì)胞或γ δ T細(xì)胞； 樹突細(xì)胞轉(zhuǎn)移療法或肽疫苗療法，預(yù)期通過所述療法在體內(nèi)誘導(dǎo)抗原特異性CTL ；Thl細(xì)胞 療法；和免疫基因療法，其中將預(yù)期具有各種作用的基因離體引入上述細(xì)胞中以將其轉(zhuǎn)入 體內(nèi)。在這些免疫療法中，傳統(tǒng)上已知⑶4陽性T細(xì)胞和⑶8陽性T細(xì)胞起關(guān)鍵作用。⑶8陽性T細(xì)胞為主要的效應(yīng)細(xì)胞，其能夠直接在體內(nèi)和體外破壞腫瘤細(xì)胞。這些 細(xì)胞對(duì)由MHC I類分子呈遞的抗原肽具有嚴(yán)格特異性。相比之下，NKT細(xì)胞的抗原特異性 沒有這么嚴(yán)格，認(rèn)為它們是顯示固有免疫應(yīng)答的效應(yīng)細(xì)胞。CD4陽性T細(xì)胞被認(rèn)為具有通過多種機(jī)制調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫應(yīng)答的基礎(chǔ)性作用，但 它們并不直接破壞腫瘤。識(shí)別了由MHC II類分子呈遞的腫瘤抗原肽的CD4陽性T細(xì)胞通 過與抗原呈遞細(xì)胞(APC)相互作用促進(jìn)CTL的活化和增殖。相比之下，⑶25陽性/⑶4陽性細(xì)胞(調(diào)節(jié)性T細(xì)胞Treg)已顯示抑制抗腫瘤的 免疫應(yīng)答和各種自身免疫性疾病的進(jìn)展(參見專利文獻(xiàn)1和非專利文獻(xiàn)1)。具體而言，由 于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞通過經(jīng)由靶向CD4陽性T細(xì)胞來控制輔助細(xì)胞功能而阻抑細(xì)胞毒性CD8陽 性T細(xì)胞的活性，所以認(rèn)為某些腫瘤利用該系統(tǒng)用于其增殖，從而避免免疫系統(tǒng)的攻擊。已發(fā)現(xiàn)GITR為在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞中表達(dá)的基因(參見非專利文獻(xiàn)1)，其為細(xì)胞表 面跨膜蛋白受體和腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族的成員。已表明GITR組成地存在于非 活化T細(xì)胞上。GITR與另一種稱為GITR配體(在下文中稱為“GITRL”)的跨膜蛋白結(jié)合。 已表明針對(duì)GITR的拮抗性抗體能消除調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的免疫抑制活性，這表明GITRL在通過 GITR調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的活性中起功能性作用(參見非專利文獻(xiàn)2).現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
專利文獻(xiàn)
專利文獻(xiàn)1 =US 2003049696
非專利文獻(xiàn)
非專利文獻(xiàn)1 :S. Sakaguchi 等，Immunol. Rev. 182(2001)，第 18-32 頁
非專利文獻(xiàn)2 =McHugh 等，Immunity 16 (2002)，第 311-23 頁
發(fā)明簡(jiǎn)述
待本發(fā)明解決的問題
鑒于所述現(xiàn)狀，本發(fā)明目的在于提供具有免疫系統(tǒng)增強(qiáng)作用和廣泛應(yīng)用并可用作 治療劑或預(yù)防劑(疫苗)的物質(zhì)，以及用于治療所述物質(zhì)所施用的受試者的方法。
解決問題的手段
本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)通過將經(jīng)修飾以表達(dá)GITRL或GITRL衍生物的細(xì)胞給予活生物 體，誘導(dǎo)了有效的抗腫瘤疫苗作用和局部抗腫瘤的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。本發(fā)明基于該發(fā) 現(xiàn)得以完成。
換言之，本發(fā)明涉及
[1]能夠表達(dá)外源GITRL(糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)性腫瘤壞死因子受體的配體)或外源 GITRL衍生物的細(xì)胞；
[2] [1]的細(xì)胞，其中所述衍生物為GITRL或GITRL片段與免疫球蛋白Fc片段的融 合蛋白(GITRL-Fc)；
[3] [1]或[2]的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞或免疫細(xì)胞；
[4] [3]的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞為失活的腫瘤細(xì)胞；
[5]用于制備[1]的細(xì)胞的方法，其包括用包含編碼GITRL或GITRL衍生物的基因 的載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞；
[6] [5]的方法，其中所述衍生物為GITRL-Fc ；
[7] [5]或W]的方法，其中所述細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞或免疫細(xì)胞；
[8] [7]的方法，其中所述細(xì)胞為失活的腫瘤細(xì)胞；
[9]包含編碼GITRL或GITRL衍生物的基因的病毒載體；
[10] [9]的病毒載體，其中所述載體選自逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺伴隨病 毒載體和仙臺(tái)病毒載體，并包含編碼GITRL或GITRL衍生物的基因；
[11]包含[1]- ]的任一項(xiàng)中的細(xì)胞作為活性成分的治療劑或預(yù)防劑；
[12] [1]-[4]的任一項(xiàng)中的細(xì)胞在制備[11]的治療劑或預(yù)防劑中的用途；
[13]用于治療受試者的方法，其包括將[1]_[4]的任一項(xiàng)中的細(xì)胞給予所述受試 者；
[14]包含[9]或[10]的病毒載體作為活性成分的治療劑或預(yù)防劑；
[15] [9]或[10]的病毒載體在制備[14]的治療劑或預(yù)防劑中的用途；以及
[16]用于治療受試者的方法，其包括將[9]或[10]的病毒載體給予所述受試者。
發(fā)明效果
本發(fā)明提供能夠表現(xiàn)有效的抗腫瘤疫苗作用和誘導(dǎo)針對(duì)特定抗原的免疫應(yīng)答的 作用的細(xì)胞；包含所述細(xì)胞作為活性成分的治療劑或預(yù)防劑；和用于治療所述細(xì)胞所施用 的受試者的方法。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示pMT-mGFc的示意圖。圖2顯示來自小鼠GITRL-Fc的測(cè)量結(jié)果。圖3顯示小鼠腫瘤大小隨時(shí)間的變化。圖4顯示四聚體測(cè)定的結(jié)果。圖5顯示小鼠腫瘤大小隨時(shí)間的變化。圖6顯示小鼠腫瘤大小隨時(shí)間的變化。圖7顯示四聚體測(cè)定的結(jié)果。圖8顯示小鼠腫瘤大小隨時(shí)間的變化。圖9顯示小鼠腫瘤大小隨時(shí)間的變化。圖10顯示小鼠腫瘤大小隨時(shí)間的變化。圖11顯示T細(xì)胞活化。圖12顯示調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例。圖13顯示CD8陽性T細(xì)胞的比例。圖14顯示小鼠腫瘤大小隨時(shí)間的變化。圖15顯示多功能細(xì)胞的比例。實(shí)施本發(fā)明的方式本文所用術(shù)語“GITRL”是指與糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)性腫瘤壞死因子受體(GITR)結(jié)合 的配體。GITRL也稱為TNFSF18(腫瘤壞死因子(配體)超家族，成員18)。人GITRL的氨基 酸序列示于序列表的SEQ ID NO :6或Swiss Prot ID NO :Q9UNG2。人GITRL的核苷酸序列 示于序列表的SEQ ID NO 7或GenBank檢索號(hào)NM_005092。GITRL由177個(gè)氨基酸構(gòu)成， 并由第1- 位的胞內(nèi)域、第四-49位的跨膜域和第50-177位的胞外域組成。本文所用術(shù)語“GITRL衍生物”是指㈧具有GITRL的部分的片段或⑶包含GITRL 或GITRL片段的融合蛋白，所述片段或蛋白為能夠與GITR相互作用而將刺激傳導(dǎo)至GITR 表達(dá)細(xì)胞的分子。術(shù)語“GITRL-Fc”是指GITRL或GITRL片段與免疫球蛋白Fc片段(CH2 和CH3區(qū))的融合蛋白.本文所用術(shù)語“外源GITRL”是指由已人工和外源地引入的編碼GITRL的核酸表達(dá) 的多肽。在引入上述核酸的細(xì)胞中，可存在與編碼外源GITRL的核酸序列具有相同序列的 內(nèi)源核酸。術(shù)語“外源GITRL衍生物”是指由已人工和外源地引入的編碼GITRL衍生物的 核酸表達(dá)的多肽。本文所用術(shù)語“失活處理”是指進(jìn)行使細(xì)胞不能增殖的處理。該處理允許得到以 下細(xì)胞其不能夠經(jīng)歷隨后的有絲分裂但仍保留表達(dá)處理前已表達(dá)的蛋白(例如GITRL或 GITRL衍生物、細(xì)胞因子或腫瘤抗原)的能力。如下所述，失活處理可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員 已知的各種方法進(jìn)行。失活處理為抑制至少約90%、優(yōu)選約95%或更優(yōu)選基本上100%的 細(xì)胞增殖的處理。本發(fā)明所用術(shù)語“自體的”是指從相同個(gè)體(即自身)或遺傳相同的個(gè)體的衍生 (即自生(autogenicity))。術(shù)語“同種異體的”是指從相同種的不同個(gè)體的衍生(即異生 (allogenicity)) 0本文所用術(shù)語“腫瘤細(xì)胞”是指表現(xiàn)出異常生長(zhǎng)表型或異常細(xì)胞狀態(tài)的細(xì)胞，所述細(xì)胞通過表現(xiàn)出自發(fā)增殖和由此難以控制的細(xì)胞增殖來表征?！澳[瘤細(xì)胞”包括“惡性腫瘤 細(xì)胞”和“良性腫瘤細(xì)胞”，還稱為“贅生物源細(xì)胞”。術(shù)語“腫瘤”是指大量腫瘤細(xì)胞或作為 整體的腫瘤細(xì)胞。本文所用術(shù)語“表達(dá)”是指細(xì)胞中內(nèi)源基因或轉(zhuǎn)基因編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。本文所用術(shù)語“轉(zhuǎn)化”是指將外源核酸引入細(xì)胞中。例如，轉(zhuǎn)化包括使用病毒或非 病毒載體將外源核酸引入細(xì)胞中。用于轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞的多種技術(shù)描述于例如Keown等 Methods of Enzymology 185:527-537(1990)。(1)本發(fā)明的細(xì)胞和載體以及用于制備本發(fā)明細(xì)胞的方法本發(fā)明涉及能夠表達(dá)外源GITRL或外源GITRL衍生物的細(xì)胞，用于治療或預(yù)防腫 瘤。對(duì)所表達(dá)的GITRL或所表達(dá)的GITRL衍生物沒有具體限制，只要其為通過與GITR的相 互作用而將刺激傳導(dǎo)至GITR表達(dá)細(xì)胞的分子即可。刺激傳導(dǎo)的結(jié)果由GITR表達(dá)細(xì)胞所保 持的免疫抑制作用減少來例示。對(duì)于本發(fā)明的制備方法而言，可使用編碼天然存在GITRL 或其衍生物的基因，所述GITRL具有例如SEQ ID NO :6所示的氨基酸序列。編碼GITRL或 GITRL衍生物的基因可表達(dá)為細(xì)胞膜蛋白(包括胞內(nèi)或細(xì)胞表面呈遞的蛋白)，或由細(xì)胞待 釋放的分泌蛋白。能夠表達(dá)GITRL或GITRL衍生物的本發(fā)明細(xì)胞能夠?qū)ITRL或GITRL衍 生物定位于細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞膜上或細(xì)胞周圍，因此與將GITRL本身給予活生物體相比減少全 身效應(yīng)。GITRL衍生物包括具有修飾氨基酸序列的GITRL變體和具有GITRL的部分的片段， 特別是，具有SEQ ID NO :6所示的人GITRL氨基酸序列的第50-177位氨基酸之間的胞外域 或第47-177位氨基酸之間的部分的GITRL片段。GITRL衍生物可為核酸編碼的多肽，所述核 酸在嚴(yán)格條件下與具有SEQ ID NO :7核苷酸序列的核酸的互補(bǔ)鏈雜交。本文所用術(shù)語“嚴(yán) 格條件”是指以下條件其中核酸與例如探針在含0. 5% SDS,5XDenhardt' s和100 μ g/ ml 變性鮭精 DNA 的 6X SSC(1XSSC 表示 0. 15M NaCl，0. 015M 檸檬酸鈉，pH 7.0)中于 68°C 下保溫12-20小時(shí)。與所述探針雜交的DNA可在例如用含0. 5% SDS的0. IXSSC在68°C 下洗滌后檢測(cè)。GITRL衍生物包括融合蛋白，其中GITRL或GITRL片段與另一種蛋白或其它蛋 白融合。融合蛋白可包含分泌信號(hào)、胞內(nèi)定位信號(hào)或標(biāo)簽序列，并且它們由與另一種蛋白 例如受體、配體或抗體或者其片段融合的融合蛋白例示。根據(jù)蛋白生產(chǎn)力和體內(nèi)穩(wěn)定性， GITRL-Fc (GITRL或其片段與免疫球蛋白的Fc片段的融合蛋白)可優(yōu)選用作GITRL衍生物。 盡管得自IgG、IgM、IgA、IgD或IgE的任何片段都可用作免疫球蛋白的Fc片段，但是由于 低細(xì)胞毒性，可優(yōu)選使用來自IgG同種型IgG2的片段。具有免疫球蛋白Fc片段的融合蛋 白可使用市售產(chǎn)品(例如來自hvivoGen的pFUSE-hlgG2-Fc2)制備。盡管GITRL-Fc的Fc 片段可位于融合蛋白的N端或C端，但可優(yōu)選使用在C端具有Fc片段的GITRL衍生物。盡管對(duì)用于表達(dá)外源GITRL或外源GITRL衍生物的細(xì)胞沒有具體限制，但是可例 如優(yōu)選使用腫瘤細(xì)胞或免疫細(xì)胞。所述腫瘤細(xì)胞可為獲得自相同個(gè)體的自身來源(自體 的)腫瘤細(xì)胞，可為獲得自與受試者不同的個(gè)體的同種異體腫瘤細(xì)胞，或者可為已確立的 腫瘤細(xì)胞系。對(duì)于所述腫瘤細(xì)胞系而言，優(yōu)選使用來源于與需要治療或預(yù)防的腫瘤或惡性 腫瘤相同類型的來源的腫瘤細(xì)胞系。能夠表達(dá)GITRL或GITRL衍生物的本發(fā)明腫瘤細(xì)胞可 活化腫瘤細(xì)胞附近存在的免疫細(xì)胞，并阻抑調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的活性，以有效地誘導(dǎo)針對(duì)腫瘤細(xì)胞表面存在的腫瘤抗原的免疫系統(tǒng)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，然后使其中已被誘導(dǎo)表達(dá)GITRL或GITRL衍生 物的腫瘤細(xì)胞失活。失活處理包括物理處理例如X射線或Y射線輻照，和使用化學(xué)劑例如 絲裂霉素C和環(huán)己酰胺的化學(xué)處理?？衫绲幌抻谕ㄟ^用約10-約IOOOcGy劑量和更優(yōu) 選約50-約500cGy劑量的X射線輻照來進(jìn)行失活處理，但對(duì)失活處理沒有具體限制，只要 其允許保持GITRL或GITRL衍生物的表達(dá)并阻抑表達(dá)細(xì)胞的增殖即可。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，將免疫細(xì)胞用作表達(dá)GITRL或GITRL衍生物的細(xì) 胞。所述可用的免疫細(xì)胞通過T細(xì)胞例如CD8陽性T細(xì)胞或CD4陽性T細(xì)胞或者抗原呈遞 細(xì)胞來例示。這些細(xì)胞可為自體的免疫細(xì)胞、同種異體的免疫細(xì)胞或已確立的免疫細(xì)胞系。 當(dāng)考慮腫瘤治療時(shí)，優(yōu)選表達(dá)識(shí)別腫瘤中表達(dá)的腫瘤抗原的T細(xì)胞受體(TCR)的T細(xì)胞。表 達(dá)特異性識(shí)別特定腫瘤抗原的T細(xì)胞受體和GITRL或GITRL衍生物兩者的T細(xì)胞，具有對(duì) 腫瘤細(xì)胞的親和力；因而能夠選擇性地將GITRL或GITRL衍生物轉(zhuǎn)運(yùn)至腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì) 胞的周圍。因此，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的活性被阻抑，因此免疫細(xì)胞在腫瘤附近活化，在所述腫瘤 附近處能夠表達(dá)GITRL或GITRL衍生物的本發(fā)明免疫細(xì)胞特異性地積聚。因此，可強(qiáng)烈誘 導(dǎo)針對(duì)表達(dá)特定腫瘤抗原的腫瘤細(xì)胞的免疫系統(tǒng)。本發(fā)明細(xì)胞可使用病毒或非病毒載體離體轉(zhuǎn)化細(xì)胞來制備，所述載體包含其中編 碼GITRL或GITRL衍生物的基因可操作地連接至調(diào)控元件的核酸構(gòu)建體。本文所用術(shù)語“可操作地連接”是指核酸序列與另一個(gè)或其它核酸序列以功能關(guān) 系連接。例如，如果編碼RNA分子或蛋白的DNA序列被置于啟動(dòng)子或調(diào)控元件的控制之下， 或者將啟動(dòng)子或調(diào)控元件放置以影響編碼或結(jié)構(gòu)DNA序列的表達(dá)水平，則認(rèn)為啟動(dòng)子或調(diào) 控元件“可操作地連接”至編碼RNA分子或蛋白的DNA序列。術(shù)語“調(diào)控元件”是指涉及核苷酸序列表達(dá)的控制的序列。調(diào)控元件包括啟動(dòng)子、 增強(qiáng)子和終止密碼子。調(diào)控元件通常還包括對(duì)正確翻譯核苷酸序列所需要的序列。術(shù)語“啟動(dòng)子”是指通常位于編碼區(qū)上游的非翻譯DNA序列，其包含RNA聚合酶的 結(jié)合位點(diǎn)并起始DNA至RNA的轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子區(qū)還可包含充當(dāng)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)子的其它元件?？捎糜谥苽浔景l(fā)明細(xì)胞的載體包括但不限于例如病毒載體和非病毒載體，例如逆 轉(zhuǎn)錄病毒(包括慢病毒)載體、腺病毒(Ad)載體(包括所述載體的復(fù)制型和復(fù)制缺陷型)、 腺伴隨病毒(AVV)載體、猿猴病毒40(SV-40)載體、皰疹病毒載體、痘苗病毒載體、仙臺(tái)病 毒載體和非病毒質(zhì)粒載體。此外，用于改進(jìn)基因轉(zhuǎn)移效率的物質(zhì)例如RetroNectin (來自 Takara Bio Inc.)可用于基因轉(zhuǎn)移過程中。不使用病毒載體的基因轉(zhuǎn)移方法包括例如(在不限制本發(fā)明的情況下)使用諸如 脂質(zhì)體或配體-聚賴氨酸等載體的方法、磷酸鈣法、電穿孔和粒子轟擊。當(dāng)使用這些方法 時(shí)，將整合至質(zhì)粒DNA、線狀DNA或RNA中的外源基因轉(zhuǎn)移。用于制備本發(fā)明細(xì)胞的、表達(dá)GITRL或GITRL衍生物的基因的載體可含有異源調(diào) 節(jié)序列，例如組成型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、腫瘤選擇性啟動(dòng)子和增強(qiáng)子。這類啟動(dòng)子包括 但不限于例如E2F啟動(dòng)子、端粒酶(hTERT)啟動(dòng)子、巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子/雞β-肌動(dòng)蛋白/ 兔β-珠蛋白啟動(dòng)子、延伸因子1-α啟動(dòng)子(EFl-α啟動(dòng)子)、神經(jīng)膠質(zhì)特異性啟動(dòng)子和神 經(jīng)元特異性啟動(dòng)子。本文所用術(shù)語“增強(qiáng)子”是指以下核苷酸序列當(dāng)其可操作地連接至編 碼序列時(shí)，與僅由啟動(dòng)子單獨(dú)實(shí)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄激活相比，增加可操作地連接至所述啟動(dòng)子的編(即增強(qiáng)由啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄)。另外，在本發(fā)明中，可使用組成型啟動(dòng)子(例如巨細(xì)胞病毒(CMV)立即早期啟動(dòng) 子、RSV LTR,MoMLV LTR,CAG啟動(dòng)子、磷酸甘油酸激酶_1啟動(dòng)子(PGK)和SV-40啟動(dòng)子)。 表達(dá)GITRL或GITRL衍生物的基因的載體還可包含編碼信號(hào)肽或標(biāo)簽肽的核酸。這類載體 可包含或不包含內(nèi)含子。因此，所述載體可包含許多轉(zhuǎn)基因、轉(zhuǎn)基因的組合或轉(zhuǎn)基因/調(diào)控 元件的組合。用于轉(zhuǎn)化能夠表達(dá)外源GITRL或外源GITRL衍生物的本發(fā)明細(xì)胞的方法可包括培 養(yǎng)細(xì)胞的步驟，該步驟在用如上所述的載體轉(zhuǎn)化所述細(xì)胞之前進(jìn)行；或者如果進(jìn)行失活處 理，則在進(jìn)行失活處理之前進(jìn)行?；蛘?，所述方法可包括培養(yǎng)細(xì)胞的步驟，該步驟在用如上 所述的載體轉(zhuǎn)化所述細(xì)胞之后進(jìn)行；或者如果進(jìn)行失活處理，則在進(jìn)行失活處理之前進(jìn)行。 如上所述的培養(yǎng)可使用已知培養(yǎng)基在根據(jù)待培養(yǎng)的細(xì)胞恰當(dāng)?shù)卮_定的培養(yǎng)條件下進(jìn)行。此外，本發(fā)明還包括含有上述核酸構(gòu)建體的載體，所述構(gòu)建體含有可操作地連接 至調(diào)控元件的編碼GITRL或GITRL衍生物的基因。該載體在下文中稱為“本發(fā)明載體”。所 述載體可用于通過將所述載體本身給予受體細(xì)胞而賦予所述細(xì)胞表達(dá)GITRL或GITRL衍生 物的能力，以及用于制備如上所述的本發(fā)明細(xì)胞。對(duì)本發(fā)明載體的類型沒有具體限制；可使用多種如上所述的病毒或非病毒載體。 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用對(duì)細(xì)胞具有高基因轉(zhuǎn)移效率的病毒載體。更優(yōu)選的是，使用可直 接給予活生物體(受試者)的病毒載體?？芍苯咏o予活生物體的病毒載體包括(在不具體 限制本發(fā)明情況下)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺伴隨病毒載體和仙臺(tái)病毒載體。能夠表達(dá)外源GITRL或外源GITRL衍生物的本發(fā)明細(xì)胞誘導(dǎo)周圍免疫細(xì)胞的免 疫應(yīng)答。所誘導(dǎo)的這類免疫應(yīng)答可在受試者中通過如下來評(píng)價(jià)在開始給予表達(dá)GITRL或 GITRL衍生物的細(xì)胞之前或在開始治療后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，測(cè)定腫瘤生長(zhǎng)抑制能力(例如， 通過測(cè)量腫瘤大小)或使用抗原特異性細(xì)胞毒性測(cè)定、細(xì)胞增殖測(cè)定、溶細(xì)胞性細(xì)胞測(cè)定 (cytolytic cell assay)和體內(nèi)遲發(fā)型超敏反應(yīng)測(cè)試，所述遲發(fā)型超敏反應(yīng)測(cè)試?yán)弥亟M 的腫瘤相關(guān)抗原或免疫原性片段或者抗原衍生肽。這類免疫應(yīng)答還可根據(jù)免疫細(xì)胞組分例 如⑶8陽性T細(xì)胞、⑶4陽性T細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例來評(píng)價(jià)。此外，還可根據(jù)細(xì)胞因 子(例如干擾素(IFN)-Y或腫瘤壞死因子(TNF)-Ci)的產(chǎn)生，或者細(xì)胞表面抗原(例如 CD107a)的存在來評(píng)價(jià)免疫應(yīng)答。產(chǎn)生多種細(xì)胞因子或存在多種細(xì)胞表面抗原的細(xì)胞被稱 為多功能細(xì)胞并可用于免疫治療。用于測(cè)量免疫應(yīng)答的增加的另外的方法包括通常用于測(cè) 量T細(xì)胞反應(yīng)的測(cè)定，例如遲發(fā)型超敏反應(yīng)測(cè)試、使用肽-主要組織相容性復(fù)合體四聚體的 流式細(xì)胞術(shù)、淋巴細(xì)胞增殖測(cè)定、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定、細(xì)胞因子流式細(xì) 胞術(shù)、直接細(xì)胞毒性測(cè)定、通過定量反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng)測(cè)定細(xì)胞因子mRNA和有限稀 釋分析。(2)本發(fā)明治療劑或預(yù)防劑以及細(xì)胞或載體在制備治療劑或預(yù)防劑中的用途兩者都在上文(1)中描述的、表達(dá)外源GITRL或外源GITRL衍生物的本發(fā)明細(xì)胞 和包含核酸構(gòu)建體的載體，都可用于制備包含它們作為活性成分的本發(fā)明治療劑或預(yù)防 劑，所述核酸構(gòu)建體中編碼GITRL或GITRL衍生物的基因可操作地連接至調(diào)控元件。表達(dá)GITRL或GITRL衍生物的腫瘤細(xì)胞可用作治療劑或預(yù)防劑(細(xì)胞疫苗)。在 不受具體理論所束縛下，本發(fā)明細(xì)胞可充當(dāng)有效的細(xì)胞疫苗，因?yàn)檎{(diào)節(jié)性T細(xì)胞的活性被
8表達(dá)GITRL或GITRL衍生物的腫瘤細(xì)胞附近中所表達(dá)的GITRL抑制，并且消除了對(duì)包括抗 原呈遞細(xì)胞、⑶8陽性T細(xì)胞和⑶4陽性T細(xì)胞在內(nèi)的免疫細(xì)胞的抑制作用，即這些細(xì)胞被 活化，導(dǎo)致針對(duì)這些腫瘤細(xì)胞的免疫系統(tǒng)的增強(qiáng)。表達(dá)GITRL或GITRL衍生物的免疫細(xì)胞可用作治療劑或預(yù)防劑。在不受具體理論 所束縛下，有可能的是，例如表達(dá)特異性識(shí)別特定腫瘤抗原的TCR和GITRL或GITRL衍生物 兩者的T細(xì)胞，能夠?qū)ITRL或GITRL衍生物特異地轉(zhuǎn)運(yùn)至腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的周圍。調(diào) 節(jié)性T細(xì)胞的活性由此受到阻抑，結(jié)果免疫細(xì)胞在腫瘤附近活化，在所述腫瘤附近處積聚 能夠表達(dá)GITRL或GITRL衍生物的本發(fā)明免疫細(xì)胞。因此，可強(qiáng)烈誘導(dǎo)針對(duì)表達(dá)特定腫瘤 抗原的腫瘤細(xì)胞的免疫系統(tǒng)。包含核酸構(gòu)建體的載體能夠賦予體內(nèi)受體細(xì)胞表達(dá)GITRL或GITRL衍生物的能 力，所述核酸構(gòu)建體中編碼GITRL或GITRL衍生物的基因可操作地連接至調(diào)控元件。因此， 引入載體的細(xì)胞顯示與上述腫瘤細(xì)胞或免疫細(xì)胞相同的功能。例如，將本發(fā)明載體給予至 腫瘤中與將表達(dá)GITRL或GITRL衍生物的腫瘤細(xì)胞給予至腫瘤中相比具有等價(jià)效果。本發(fā)明治療劑或預(yù)防劑旨在治療或預(yù)防以下疾病能夠表達(dá)GITRL或GITRL衍生 物的細(xì)胞對(duì)所述疾病有效。作為實(shí)例，這類疾病包括腫瘤疾病(例如白血病和實(shí)體瘤)和 由病毒、細(xì)菌和真菌引起的感染性疾病(例如流感、結(jié)核病或深部真菌病)。本發(fā)明治療劑 或預(yù)防劑可用于例如消除或減少腫瘤或感染細(xì)胞或者抑制這類細(xì)胞的生長(zhǎng)。本發(fā)明治療劑或預(yù)防劑可經(jīng)皮內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、靜脈內(nèi)(包 括留置導(dǎo)管插入(indwelling catheterization))、瘤內(nèi)給予或者通過輸入性淋巴管內(nèi)輸 注(intraafferent lymphatic infusion)給予。此外，本發(fā)明治療劑或預(yù)防劑適合用于免 疫療法中。在免疫療法中，將適于治療受試者的T細(xì)胞或失活的腫瘤細(xì)胞通過例如注射或 輸注靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮下或腹膜內(nèi)給予受試者。本發(fā)明治療劑或預(yù)防劑對(duì)用于如上所述的 受試者非常有用，并可按照本領(lǐng)域熟知的方法，通過與例如適合用于胃腸外給予的有機(jī)或 無機(jī)載體、賦形劑或穩(wěn)定劑一起混合，制備成注射劑或輸注劑。本發(fā)明治療劑或預(yù)防劑包含有效量的、能夠表達(dá)外源GITRL或外源GITRL衍生物 的細(xì)胞或者含有核酸構(gòu)建體的載體，所述核酸構(gòu)建體中編碼GITRL或GITRL衍生物的基因 可操作地連接至調(diào)控元件。本文所用有效量是指與未治療的受試者相比，在給予如上所述 的治療劑或預(yù)防劑的受試者中表現(xiàn)出治療效果或預(yù)防效果的細(xì)胞量。具體量可變化，并可 適當(dāng)?shù)馗鶕?jù)劑型、給藥途徑、預(yù)期用途以及受試者的年齡、體重和狀況來確定。例如，在包含 能夠表達(dá)GITRL或GITRL衍生物的本發(fā)明細(xì)胞作為活性成分的本發(fā)明治療劑或預(yù)防劑中， 所述細(xì)胞的量沒有具體限制。然而，例如優(yōu)選1 X IO3至1 X IO11個(gè)細(xì)胞/mL，更優(yōu)選1 X IO4 至IX IOltl個(gè)細(xì)胞/mL和甚至更優(yōu)選IX IO5至IX IO9個(gè)細(xì)胞/mL。此外，本發(fā)明治療劑或 預(yù)防劑的劑量沒有具體限制。然而，例如對(duì)于成人而言，優(yōu)選1 X IO6至1 X IO12個(gè)細(xì)胞/天， 更優(yōu)選1 X IO7至5 X IO11個(gè)細(xì)胞/天和甚至更優(yōu)選1 X IO8至2 X IO11個(gè)細(xì)胞/天。本發(fā)明治療劑或預(yù)防劑還可包含賦形劑。這類賦形劑包括含或不含生理相容性 緩沖劑(例如磷酸鹽或ifepes)、營(yíng)養(yǎng)物(例如葡萄糖)、生理相容性離子或氨基酸(尤其是 無免疫原性組分的氨基酸)的各種細(xì)胞培養(yǎng)基；或等滲鹽水?？墒褂弥С中栽噭?例如白 蛋白或血漿成分)或惰性增稠劑。(3)本發(fā)明治療方法
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本發(fā)明涉及用于治療受試者的方法，其包括以下步驟通過將能夠表達(dá)GITRL或 GITRL衍生物的細(xì)胞或者包含核酸構(gòu)建體的載體給予受試者，來誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，所述核酸構(gòu) 建體中編碼GITRL或GITRL衍生物的基因可操作地連接至調(diào)控元件。本發(fā)明方法中用于治療受試者的細(xì)胞，可通過上文(1)中所述用于制備能夠表達(dá) GITRL或GITRL衍生物的本發(fā)明細(xì)胞的方法獲得。細(xì)胞可為使用從受試者或其他個(gè)體收集 的細(xì)胞作為材料，通過上文(1)中所述的方法制備的細(xì)胞。所述方法還包括在給予受試者 之前，培養(yǎng)所制備的細(xì)胞和/或使用合適的標(biāo)記物分選所述細(xì)胞的步驟。在用于治療受試者的本發(fā)明方法中，將能夠表達(dá)GITRL或GITRL衍生物的細(xì)胞，或 者包含其中編碼GITRL或GITRL衍生物的基因可操作地連接至調(diào)控元件的核酸構(gòu)建體的載 體，即上文O)中所述的本發(fā)明治療劑或預(yù)防劑，給予受試者。如本文所用，受試者沒有具 體限制；然而，優(yōu)選的是，受試者表示患有對(duì)由本發(fā)明方法制備的細(xì)胞易感的疾病的活生物 體(即人類患者或非人類動(dòng)物)，或需要針對(duì)所述疾病進(jìn)行預(yù)防治療的活生物體。將細(xì)胞給予受試者可通過皮內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、靜脈內(nèi)(包括 留置導(dǎo)管插入)或瘤內(nèi)給予或者通過輸入性淋巴管內(nèi)輸注來進(jìn)行。
實(shí)施例在下文中用實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明，但本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例的范圍。實(shí)施例1 表達(dá)小鼠GITRL-Fc的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建通過從BALB/c小鼠(CLEA Japan, Inc.)的脾提取mRNA,并使用示于SEQ ID NO 1 的 mGITRL-FLF 引物和示于 SEQ ID NO 2 的 mGITRL-FLR 引物進(jìn)行 RT-PCR，得到 EcoRV-小 鼠GITRL-Bgl II。將如此得到的PCR片段用內(nèi)切核酸酶EcoRV和Bgl 11 (Takara Bio Inc.)切割，然后克隆至pFUSE-mFc2載體(InvivoGen)的EcoRV-BglII位點(diǎn)中，從而產(chǎn)生 pFuse-mFc/mGITRL。使用作為模板的 pFuse-mFc/mGITRL、示于 SEQ ID N0:3 的 mGF5 引物 和示于SEQ ID NO 4的mFc3引物進(jìn)行PCR。將如此得到的擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至pCR-Blunt載 體(Invitrogen)中，從而產(chǎn)生pCRblunt-mGFc。將通過用內(nèi)切核酸酶NotI和Sail (Takara Bio Inc.)消化pCRblunt-mGFc得到的小鼠GITRL-Fc部分切下，并克隆至pMIN載體的 NotI-SalI 位點(diǎn)[Gene Therapy，第 7 卷，第 797-804 Q000)頁]，從而產(chǎn)生 pMT-mGFc。圖 1 顯示pMT-mGFc的示意圖。該質(zhì)粒編碼融合多肽，其包含跨越GenBank檢索號(hào)NP_899247下 所示小鼠GITRL的氨基酸44-173的區(qū)和得自小鼠IgG2的Fc片段。將如此制備的質(zhì)粒 pMT-mGFc 與 Retorovirus Packaging Kit Eco (Takara Bio Inc.)中所含質(zhì)粒pGP和pE-eco共轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK293T細(xì)胞，然后將轉(zhuǎn)染子培養(yǎng)2天以得到 細(xì)胞上清液，然后通過0.45 μ m濾器(Milex HV, Millipore)將細(xì)胞上清液過濾，從而得到 MT-mGFc/ECO逆轉(zhuǎn)錄病毒。實(shí)施例2 小鼠GITRL-Fc基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的制備按照制造商提供的方案使用Retronectin (Takara Bio Inc.)，以用實(shí)施例1制備 的MT-mGFc/ECO逆轉(zhuǎn)錄病毒感染甲基膽蒽(化學(xué)致癌物)誘導(dǎo)的小鼠纖維肉瘤細(xì)胞CMS 5 [Journal of Experimental Medicine，第 146 卷，第 720_7；34 頁(1977)]，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)染有 小鼠GITRL-Fc基因的CMS5細(xì)胞。隨后，通過有限稀釋進(jìn)行克隆，并得到小鼠GITRL-Fc基 因轉(zhuǎn)染的CMS5細(xì)胞克隆1和7(在下文中分別稱為“克隆1”和“克隆7”)。
通過以下方法進(jìn)行克隆細(xì)胞中小鼠GITRL-Fc表達(dá)的測(cè)量將轉(zhuǎn)染有小鼠 GITRL-Fc基因的CMS5細(xì)胞以2 X IO5個(gè)細(xì)胞/200 μ 1的密度鋪板至96孔板中，然后在10 小時(shí)后加入2μ1 10倍稀釋的Golgi Plug (BD Biosciences)。將細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)9小時(shí)。 將Cytof ix/Cytoperm Kit (BD Biosciences)用于固定細(xì)胞和浸泡膜，然后將細(xì)胞用抗-小 鼠IgGmAb-FITC綴合物(Caltag)染色。通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞中的小鼠GITRL-Fc表達(dá)。 圖2顯示通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量細(xì)胞中的小鼠GITRL-Fc的結(jié)果(a)非轉(zhuǎn)染細(xì)胞；(b)小鼠 GITRL-Fc基因轉(zhuǎn)染的主體細(xì)胞(bulk cell)；和(c)克隆1。如圖2(c)所示，小鼠GITRL-Fc 的產(chǎn)生在轉(zhuǎn)染有小鼠GITRL-Fc基因的細(xì)胞克隆中確證。實(shí)施例3:荷瘤實(shí)驗(yàn)將克隆1和7各自以1 X IO6個(gè)細(xì)胞/0. ImL的濃度皮下注入8-10周齡BALB/c小 鼠(CLEA Japan, Inc.)和 8-10 周齡 C. B-17/lcr-scid/scidJcr 小鼠(CLEA Japan, Inc.) 的右背區(qū)，然后在皮下注射后每隔2-3天測(cè)定腫瘤大小。測(cè)量腫瘤的最大直徑和最小直徑， 并通過將最大直徑乘以最小直徑計(jì)算腫瘤大小。每一個(gè)組別使用5只小鼠。圖3顯示各個(gè)小鼠組別中小鼠腫瘤大小的時(shí)間依賴性變化。水平軸表示天數(shù)而縱 軸表示腫瘤大小的乘積(最大直徑X最小直徑mmXmm)。對(duì)于每個(gè)轉(zhuǎn)染有小鼠GITRL-Fc 基因的CMS5細(xì)胞克隆，盡管免疫缺陷C. B-17/lcr-scid/scidJcr小鼠顯示腫瘤大小持續(xù)增 加，但在具有正常免疫功能的BALB/c小鼠中腫瘤大小減小，并且在第17天之前幾乎觀察不 到腫瘤。該圖顯示移植至小鼠右背區(qū)的腫瘤直徑的乘積實(shí)心圓表示用克隆1移植的BALB/ c小鼠組；實(shí)心三角形表示用克隆7移植的BALB/c小鼠組；空心圓表示用克隆1移植的 C. B-17/lcr-scid/scidJcr小鼠組；和空心三角形表示用克隆7移植的C. B-17/lcr-scid/ scidjcr小鼠組。實(shí)施例4 在荷瘤小鼠中誘導(dǎo)腫瘤特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的確證將CMS5或如實(shí)施例2制備的克隆1以IX IO6個(gè)細(xì)胞/0. ImL的濃度皮下注入 8-10周齡BALB/c小鼠的右背區(qū)。在皮下注射后第8和14天，收集脾細(xì)胞及其局部淋巴結(jié) 細(xì)胞，然后如下進(jìn)行四聚體測(cè)定將來自CMS5腫瘤排斥抗原的表位肽9m(SEQ ID NO 5)以 1 μ M終濃度加至5X IO5個(gè)細(xì)胞的小鼠肥大細(xì)胞瘤細(xì)胞系PL HTR細(xì)胞[Somatic Cell and Molecular Genetics，第11卷，第467-475頁(198 ]，然后將細(xì)胞在37°C下培養(yǎng)2小時(shí) (9m肽脈沖的PI. HTR細(xì)胞)。將這些細(xì)胞以1 40比例與脾細(xì)胞混合，然后將這些9m肽 脈沖的PI. HTR細(xì)胞也與局部淋巴結(jié)細(xì)胞和脾細(xì)胞以1 40 8的比例混合。將混合物共 培養(yǎng)1周，用9m與小鼠H2/Kd的四聚體(9m/Kd四聚體-PE綴合物)(The Ludwig Institute Core Factory, Lausanne, Switzerland)染色,然后通過流式細(xì)胞術(shù)分析。圖4顯示通過流式細(xì)胞術(shù)分析的結(jié)果。封閉區(qū)域表示與9m/Kd四聚體-PE綴合物 反應(yīng)的細(xì)胞。如圖4(A)-(D)所示，在用CMS5皮下注射的小鼠中于第8和14天收集的所有 脾細(xì)胞和局部淋巴結(jié)細(xì)胞中，沒有檢測(cè)到與9m/Kd四聚體-PE綴合物反應(yīng)的細(xì)胞。相反，如 圖4(E)-(H)所示，在用克隆1皮下注射的小鼠中于第14天收集的脾細(xì)胞和局部淋巴結(jié)細(xì) 胞中，都證實(shí)顯著出現(xiàn)與9m/Kd四聚體-PE綴合物反應(yīng)的細(xì)胞。因此，確證了僅在負(fù)荷克隆 1的小鼠中誘導(dǎo)針對(duì)CMS5的腫瘤特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。實(shí)施例5 在接受各種抗體的負(fù)CMS5GITRL-FC小鼠中腫瘤生長(zhǎng)的監(jiān)測(cè)將如實(shí)施例2制備的克隆1以IX IO6個(gè)細(xì)胞/0. ImL的濃度皮下注入8-10周齡
11BALB/c小鼠的右背區(qū)。在該處理中，從皮下注射前1天開始每隔3天持續(xù)2周，將50 μ g 抗-小鼠CD4抗體(Clone GKl. 5)或25 μ 1抗-小鼠CD8抗體(Clone Lyt2. 2)通過眼窩靜 脈給予，或者在皮下注射前1天，將250yg抗-小鼠⑶25抗體(Clone PC61)通過眼窩靜 脈一次給予。在皮下注射后每隔2-3天，以與實(shí)施例3所述相同的方式測(cè)定腫瘤大小。每 一個(gè)組別使用三只小鼠。圖5顯示各個(gè)小鼠組別中小鼠腫瘤大小的時(shí)間依賴性變化。水平軸表示天數(shù)，而 縱軸表示腫瘤直徑的乘積(mmXmm)?？招膱A表示三只小鼠中每一只的結(jié)果，而實(shí)心圓表示 所述結(jié)果的平均值。在圖5中，GITR-Fc顯示來自未給予抗體處理的小鼠的結(jié)果，抗-CD25 表示來自給予抗-小鼠CD25抗體的小鼠的結(jié)果，抗-CD4表示來自給予抗-小鼠CD4抗體 的小鼠的結(jié)果，和抗-CD8表示來自給予抗-小鼠CD8抗體的小鼠的結(jié)果。未給予抗體處理 的小鼠和給予抗-小鼠CD25抗體的小鼠顯示腫瘤大小減小，并且腫瘤在第15天之前幾乎 消失。相反，給予抗-小鼠CD4抗體的小鼠和給予抗-小鼠CD8抗體的小鼠顯示在各個(gè)組 別中3只小鼠的2只中腫瘤大小持續(xù)增加，這表明CD4陽性T細(xì)胞和CD8陽性T細(xì)胞兩者 都涉及抗腫瘤作用。實(shí)施例6 在給予輻射滅活的小鼠GITRL-Fc基因轉(zhuǎn)染的CMS5細(xì)胞的小鼠中，CMS5 腫瘤生長(zhǎng)和腫瘤特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的誘導(dǎo)的確證將通過用IOOcGy X射線輻照滅活的CMS5或通過用IOOcGy X射線輻照滅活的實(shí)施 例2制備的克隆1，以5X IO6個(gè)細(xì)胞/0. ImL的濃度皮下注入8_10周齡BALB/c小鼠的右背 區(qū)，然后在7天后，將CMS5以IX IO6個(gè)細(xì)胞/0. ImL的濃度皮下注入所述小鼠的右背區(qū)。在 皮下注射后每隔2-3天，以與實(shí)施例3所述相同的方式測(cè)定腫瘤大小。在皮下注射后第14 天收集脾細(xì)胞及其局部淋巴結(jié)細(xì)胞，然后以與實(shí)施例4所述相同的方式進(jìn)行四聚體測(cè)定。圖6顯示各個(gè)小鼠組別中小鼠腫瘤大小的時(shí)間依賴性變化；水平軸表示天數(shù)，而 縱軸表示腫瘤直徑的乘積(mmXmm)。圖7顯示四聚體測(cè)定的結(jié)果。給予X射線輻照滅活的 克隆1的小鼠，與給予X射線輻照滅活的CMS5的小鼠相比顯示腫瘤生長(zhǎng)的抑制(圖6)，并 相對(duì)于CMS5顯示對(duì)腫瘤特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的顯著誘導(dǎo)(圖7)。這些結(jié)果表明X 射線輻照滅活的CMS5GITRL-Fc保留作為疫苗的功能。實(shí)施例7 當(dāng)將X射線輻照滅活的CMS5 GITRL-Fc給予用各種抗體阻斷的小鼠時(shí)， CMS5腫瘤生長(zhǎng)的監(jiān)測(cè)將通過用IOOcGy X射線輻照滅活的實(shí)施例2制備的克隆1，以5X IO6個(gè)細(xì)胞 /0. ImL的濃度皮下注入8-10周齡BALB/c小鼠的右背區(qū)。從第6天開始每隔3天持續(xù)2周， 將50 μ g抗-小鼠CD4抗體(Clone GKl.幻或25 μ 1抗-小鼠CD8抗體(Clone Lyt2. 2)通 過眼窩靜脈給予所述小鼠，或者在第6天，將250yg抗-小鼠⑶25抗體(Clone PC61)通 過眼窩靜脈一次性給予所述小鼠。在第7天，將CMS5以IX IO6個(gè)細(xì)胞/0. ImL的濃度皮下 注入所述小鼠的右背區(qū)。在皮下注射后每隔2-3天，以與實(shí)施例3所述相同的方式測(cè)定腫 瘤大小。圖8顯示各個(gè)小鼠組別中小鼠腫瘤大小的時(shí)間依賴性變化。在該圖中，水平軸表 示天數(shù)，而縱軸表示腫瘤直徑的乘積(mmXmm)?？招膱A表示三只小鼠中每一只的結(jié)果，而 實(shí)心圓表示所述結(jié)果的平均值。在圖8中，GITR-Fc顯示未給予抗體處理的小鼠的結(jié)果， 抗-CD25表示來自給予抗-小鼠CD25抗體的小鼠的結(jié)果，抗-CD4表示來自給予抗-小鼠CD4抗體的小鼠的結(jié)果，和抗-CD8表示來自給予抗-小鼠CD8抗體的小鼠的結(jié)果。未給予 抗體處理的小鼠和給予抗-小鼠CD25抗體的小鼠顯示腫瘤大小增加的抑制，而給予抗-小 鼠CD4抗體的小鼠和給予抗-小鼠CD8抗體的小鼠顯示腫瘤大小以顯著性方式持續(xù)增加， 這表明⑶4陽性T細(xì)胞和⑶8陽性T細(xì)胞兩者都參與X射線輻照滅活的CMS5GITRL-Fc的
疫苗作用。實(shí)施例8 小鼠GITRL-Fc基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的產(chǎn)生按照實(shí)施例2所述的方法，將小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞系CD6 (ATCC CRL-2638)用 MT-mGFc/ECO逆轉(zhuǎn)錄病毒感染，以產(chǎn)生小鼠GITRL-Fc基因轉(zhuǎn)染的CD6細(xì)胞。隨后，通過 有限稀釋進(jìn)行克隆，并得到小鼠GITRL-Fc基因轉(zhuǎn)染的CD6細(xì)胞克隆21 (在下文中稱為 “CT26-21”)。使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)，將其中已整合 GITRL-Fc 基因的質(zhì)粒載 體pcDNA3. 1 (Invitrogen)轉(zhuǎn)染入小鼠黑色素瘤細(xì)胞系B16(ATCC CRL-6475)，以產(chǎn)生小鼠 GITRL-Fc基因轉(zhuǎn)染的B16細(xì)胞。隨后，通過有限稀釋進(jìn)行克隆，并得到小鼠GITRL-Fc基因 轉(zhuǎn)染的B16細(xì)胞克隆2和3(在下文中分別稱為“B16-2”和“B16-3”)。實(shí)施例9:荷瘤實(shí)驗(yàn)將CI^6、CT26-21(各自 IX IO6 個(gè)細(xì)胞/0. ImL)、B16、B16_2 和 B16-3 (各自 5 X IO5 個(gè)細(xì)胞/0. ImL)皮下注入8-10周齡BALB/c小鼠(CLEA Japan, Inc.)的右背區(qū)，并在皮下 注射后每隔2-3天，以與實(shí)施例3所述相同的方式測(cè)定腫瘤大小。每一個(gè)組別中使用5只 小鼠。圖9和10顯示各個(gè)小鼠組別中平均小鼠腫瘤大小的時(shí)間依賴性變化。水平軸表 示天數(shù)，而縱軸表示腫瘤大小的乘積(最大直徑X最小直徑mmXmm)。與對(duì)照(由圖中的 空心正方形表示)相比，小鼠GITRL-Fc基因轉(zhuǎn)染的CD6細(xì)胞克隆(CI^6_21，由圖9中的實(shí) 心正方形表示)和小鼠GITRL-Fc基因轉(zhuǎn)染的B16細(xì)胞克隆(B16-2和B16-3，分別由圖10 中的實(shí)心正方形和實(shí)心三角形表示)兩者都顯示在具有正常免疫功能的BALB/c小鼠中腫 瘤大小的減小。結(jié)果表明GITRL-Fc在各種癌細(xì)胞中的抗腫瘤效果。實(shí)施例10 =GITRL-Fc的T細(xì)胞活化能力的監(jiān)測(cè)將對(duì)得自9m肽特異性TCR基因轉(zhuǎn)染DUC18小鼠的9m肽特異性的⑶8陽性T細(xì)胞 (3 X IO5個(gè)細(xì)胞)，與IX IO6個(gè)細(xì)胞的得自用100ng/ml、10ng/ml或lng/ml 9m肽脈沖的野 生型BALB/c小鼠的脾細(xì)胞混合，然后將混合物在37°C下于以下各種培養(yǎng)基中溫育15小時(shí) 含10%胎牛血清(FCS)的RPMI1640培養(yǎng)基(在圖11中用作對(duì)照，由空心正方形表示)； 含濃度為5 μ g/ml的DTA-I (抗-GITR激動(dòng)劑抗體)的補(bǔ)充10% FCS的RPMI1640培養(yǎng)基 (在圖中表示為DAT-I，由實(shí)心正方形表示)；補(bǔ)充有50 μ 1培養(yǎng)小鼠GITRL-Fc基因轉(zhuǎn)染克 隆1細(xì)胞(實(shí)施例2中制備)上清液的、補(bǔ)充10% FCS的RPMI1640培養(yǎng)基(在圖中表示為 CMS5GITRL-Fc sup，由實(shí)心三角形表示)；和補(bǔ)充有50 μ 1培養(yǎng)小鼠GITRL-Fc基因轉(zhuǎn)染克隆 1細(xì)胞(實(shí)施例2中制備)上清液和濃度為5 μ g/ml的抗-GITRL抗體的、補(bǔ)充10% FCS的 RPMI1640培養(yǎng)基(在圖中表示為CMS5GITRL-Fc sup+GITRLmAb,由空心三角形表示)。將各 種DUC18小鼠來源的對(duì)9m肽特異的⑶8陽性T細(xì)胞的胞內(nèi)IFN- γ，用抗-IFN- γ抗體(BD Biosciences)染色并通過流式細(xì)胞術(shù)分析。圖11顯示在各種肽濃度下，在各個(gè)樣品的⑶8陽性細(xì)胞中所含IFN-Y陽性細(xì)胞的比例。類似于DTA-I (其刺激GITR活化效應(yīng)細(xì)胞)，小鼠GITRL-Fc基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的上清 液顯示通過活化CTL克隆誘導(dǎo)IFN- Y產(chǎn)生?？?GITRL抗體抑制對(duì)在小鼠GITRL-Fc基因 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的上清液中產(chǎn)生IFN-Y的誘導(dǎo)，該事實(shí)表明從小鼠GITRL-Fc基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞分 泌的GITRL-Fc具有與α GITR激動(dòng)劑抗體等價(jià)的活性，并刺激和活化T細(xì)胞中的GITR。實(shí)施例11 =GITRL-Fc對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞誘導(dǎo)的阻抑作用的監(jiān)測(cè)將CMS5或如實(shí)施例2制備的小鼠GITRL-Fc基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆1 (表示為圖 12和13中的CMS5GLFc)，以IX IO6個(gè)細(xì)胞/0. ImL的濃度皮下注入8_10周齡BALB/c小 鼠的右背區(qū)。在皮下注射后第9天，采集CMS5的脾細(xì)胞(脾)、局部淋巴結(jié)細(xì)胞(DLN)和 腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TIL)，并將它們用抗-⑶4抗體(BD Biosciences)、抗-Foxp3抗體(e Biosciences)、抗-CD8 抗體(BD Biosciences)和抗-CD25 抗體(BD Biosciences)染色， 并通過流式細(xì)胞術(shù)分析。圖12顯示各種組織中CD4陽性、Foxp3陽性細(xì)胞(調(diào)節(jié)性T細(xì)胞)對(duì)CD4陽性、 Foxp3陰性細(xì)胞的比。圖13顯示CD8陽性細(xì)胞對(duì)CD4陽性、Foxp3陽性細(xì)胞(調(diào)節(jié)性T細(xì) 胞)的比。如圖12所示，小鼠GITRL-Fc基因轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞顯示在腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞中比 CMS5中顯著較強(qiáng)對(duì)誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的阻抑，并且如圖13所示，其表明CD8細(xì)胞的比例相 對(duì)于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例增加。實(shí)施例12 通過GITRL-Fc表達(dá)監(jiān)測(cè)T細(xì)胞獲得多功能性將CMS5以1父106個(gè)細(xì)胞/0. ImL的濃度皮下注入8_10周齡BALB/c小鼠的右背區(qū)。 7天后，將小鼠分組成通過尾靜脈注射注射了 IX IO6個(gè)細(xì)胞/0. ImL的9m肽特異性⑶8陽 性T細(xì)胞(獲得自DUC18小鼠)的組別(表示為圖14和15中的ACT)；通過尾靜脈注射注 射了 IX IO6個(gè)細(xì)胞/0. ImL的9m肽特異性⑶8陽性T細(xì)胞(獲得自DUC18小鼠)然后用 1 X IO7個(gè)細(xì)胞/0. ImL的輻射滅活的CMS5皮下注入左背區(qū)的組別(表示為圖14和15中的 ACT+CMS5 vac)；和通過尾靜脈注射注射了 1 X IO6個(gè)細(xì)胞/0. ImL的9m肽特異性⑶8陽性 T細(xì)胞(獲得自DUC18小鼠)然后用1 X IO7個(gè)細(xì)胞/0. ImL的輻射滅活小鼠GITRL-Fc基因 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆1(如實(shí)施例2所制備)皮下注入左背區(qū)的組別(表示為圖14和15中的 ACT+CMS5GLFc vac) 0以與實(shí)施例3所述相同的方式每隔3_5天，測(cè)定各個(gè)組別小鼠的腫瘤 大小。在第10天，采集局部淋巴結(jié)細(xì)胞，并將⑶8陽性細(xì)胞用抗-IFN-γ抗體、抗-TNF-a 抗體(BD Biosciences)和抗-CD 107a抗體(e Biosciences)染色，然后通過流式細(xì)胞術(shù) 分析。圖14顯示各個(gè)小鼠組別中平均小鼠腫瘤大小的時(shí)間依賴性變化。水平軸表示天 數(shù)，而縱軸表示腫瘤大小的乘積(最大直徑X最小直徑mmXmm)。在給予得自DUC18小鼠 的9m肽特異性⑶8陽性T細(xì)胞+小鼠GITRL-Fc基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的組別中，腫瘤生長(zhǎng)幾乎 被抑制，這表明GITRL-Fc增強(qiáng)腫瘤抗原特異性T細(xì)胞的抗腫瘤作用。圖15顯示在轉(zhuǎn)移入淋巴結(jié)的9m肽特異性⑶8陽性細(xì)胞中存在的以下細(xì)胞類型 的比例顯示IFN-Y產(chǎn)生、TNF-α產(chǎn)生和⑶107a表達(dá)(細(xì)胞毒性粒細(xì)胞產(chǎn)生的能力的指 數(shù))的所有三種功能的細(xì)胞(3型)；顯示兩種功能的細(xì)胞0型)；顯示單種功能的細(xì)胞(1 型)；和沒有任何功能的細(xì)胞(0型)。與其它組別相比，給予得自DUC18小鼠的9m肽特異 性⑶8陽性T細(xì)胞+小鼠GITRL-Fc基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的組別，具有較高的顯示三種或兩種功能的細(xì)胞比，這表明GITRL-Fc允許腫瘤抗原特異性效應(yīng)T細(xì)胞以高效率獲得多功能性。實(shí)施例13 表達(dá)小鼠GITRL-Fc的腺病毒載體的制備將制備于實(shí)施例1的載體pMT-mGFc用內(nèi)切核酸酶NotI和&ilI(Takara Bio Inc.) 切割，然后經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳，并從凝膠中回收含小鼠GITRL-Fc序列的約1. 2kbp片 段。將所回收的片段用DNA Blunting Kit(Takara Bio Inc.)切成平端，然后連接至粘粒 載體 pAxCAwtit2 (Takara Bio Inc.)的 SwaI 位點(diǎn)中。使用 Gigapack III XL Packaging Extract (Agilent ^Technologies)，將如此獲得的重組DNA轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α (Takara Bio Inc.)中，然后在補(bǔ)充有氨芐西林的LB培養(yǎng)基中挑選轉(zhuǎn)化體。將該轉(zhuǎn)化體進(jìn)一步培養(yǎng)以制 備粘粒 DNA，其命名為 “pAxCAwtit2-mGITRL-FcA”。然后，使用TransIT-293(Mirus Bio LLC)以將用內(nèi)切核酸酶 BspT104I (Takara Bio Inc.)切割的PAxCAwtit2-mGITRL-Fc轉(zhuǎn)化HEK293細(xì)胞。將如此獲得的轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)，然 后將培養(yǎng)物超聲破碎。將含表達(dá)GITRL-Fc的腺病毒載體AxCA-mGITRL-Fc的濃縮培養(yǎng)上清 液回收，并得到原代病毒溶液。將原代病毒溶液用于感染HEK293細(xì)胞，然后將所述細(xì)胞培養(yǎng)。將培養(yǎng)物超聲處理 并回收上清液，從而得到第二代病毒溶液。通過同樣的操作獲得第三代和第四代病毒溶液。以類似的方式，從粘粒載體pAXCAwtit2-AcGFP中制備第四代病毒溶液，所述載體 中AcGFP基因克隆自pAcGFPl載體(Clontech)。將該病毒溶液中包含的腺病毒載體命名為 AxCA-AcGFP0最后，將Adeno-X Rapid Titer Kit (Clontech)用于測(cè)定兩種不同的第四代病毒 溶液的病毒滴度。實(shí)施例14 用腺病毒載體感染小鼠腫瘤細(xì)胞將實(shí)施例13中制備的各種腺病毒載體的第四代病毒溶液用于以10和50的 MOI (感染復(fù)數(shù)每個(gè)細(xì)胞感染病毒的量)感染甲基膽蒽(化學(xué)致癌物)誘導(dǎo)的小鼠纖維 肉瘤細(xì)胞系CMS5和小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞系CD6，然后將細(xì)胞培養(yǎng)2天。為確定感染效率，將用 AxCA-AcGFP的第四代病毒溶液感染的各個(gè)腫瘤細(xì)胞系都通過流式細(xì)胞術(shù)分析。結(jié)果，對(duì)于 以10M0I感染的CMS5和CI^6，分別證實(shí)72. 2%的CMS5細(xì)胞和57. 的細(xì)胞已被病 毒感染。對(duì)于以50M0I感染的CMS5和CT26，也分別證實(shí)99. 的CMS5細(xì)胞和94. 9%的 CT26細(xì)胞已被病毒感染。將用AxCA-mGITRL-Fc和AxCAwt2以50M0I感染的各個(gè)腫瘤細(xì)胞 系都用于后續(xù)實(shí)施例中。實(shí)施例15 在給予腺病毒載體感染的小鼠腫瘤細(xì)胞的小鼠中腫瘤生長(zhǎng)的確認(rèn)將實(shí)施例14中制備的AxCA-mGITRL-Fc感染的CMS5、非感染的CMS5、 AxCA-mGITRL-Fc感染的CD6和非感染的CT26，以1 X IO6個(gè)細(xì)胞/0. 2mL的濃度皮下注射至 8-10周齡BALB/c小鼠(CLEA Japan, Inc.)的右背區(qū)，然后在皮下注射后每隔2_3天，以與 實(shí)施例3所述相同的方式測(cè)定腫瘤大小。各個(gè)組別中使用5只小鼠。在第15天，腫瘤直徑大小的平均值士標(biāo)準(zhǔn)差((最大直徑+最小直徑/2 :mm)為 11. 74 士 3. 49 (對(duì)于 AxCA-mGITRL-Fc 感染的 CMS5)、15. 59 士 1. 84 (對(duì)于非感染的 CMS5)、 5. 76士4. 65(對(duì)于 AxCA-mGITRL-Fc 感染的 CT26)和 13.洸士3. 45 (對(duì)于非感染的 CT26)。小鼠GITRL-Fc基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞顯示腫瘤大小減小，這表明在各種腫瘤細(xì)胞中表 達(dá)GITRL-Fc的腺病毒載體對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。
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工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明的細(xì)胞、治療劑、預(yù)防劑和治療方法可用于治療或預(yù)防疾病，包括腫瘤和感 染。它們能夠有效地誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)。SEQIDNO1:mGITRL-FLF 引物
SEQIDNO2:mGITRL-FLR 引物
SEQIDNO3:mGF5引物
SEQIDNO4:mFc3引物
SEQIDNO5表位肽9m
權(quán)利要求
1.一種能夠表達(dá)外源GITRL(糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)性腫瘤壞死因子受體的配體)或外源 GITRL衍生物的細(xì)胞。
2.權(quán)利要求1的細(xì)胞，其中所述GITRL衍生物為GITRL或GITRL片段與免疫球蛋白Fc 片段的融合蛋白(GITRL-Fc)。
3.權(quán)利要求1或2的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞或免疫細(xì)胞。
4.權(quán)利要求3的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞為失活的腫瘤細(xì)胞。
5.一種用于制備權(quán)利要求1的細(xì)胞的方法，其包括用包含編碼GITRL或GITRL衍生物 的基因的載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述GITRL衍生物為GITRL-Fc。
7.權(quán)利要求5或6的方法，其中所述細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞或免疫細(xì)胞。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述細(xì)胞為失活的腫瘤細(xì)胞。
9.一種包含編碼GITRL或GITRL衍生物的基因的病毒載體。
10.權(quán)利要求9的病毒載體，其中所述載體選自逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺伴隨 病毒載體和仙臺(tái)病毒載體，并且包含編碼GITRL或GITRL衍生物的基因。
11.一種包含權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的細(xì)胞作為活性成分的治療劑或預(yù)防劑。
12.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的細(xì)胞在制備權(quán)利要求11的治療劑或預(yù)防劑中的用途。
13.一種用于治療受試者的方法，其包括將權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的細(xì)胞給予所述受 試者。
14.一種包含權(quán)利要求9或10的病毒載體作為活性成分的治療劑或預(yù)防劑。
15.權(quán)利要求9或10的病毒載體在制備權(quán)利要求14的治療劑或預(yù)防劑中的用途。
16.一種用于治療受試者的方法，其包括將權(quán)利要求9或10的病毒載體給予所述受試者ο
全文摘要
本文公開了能夠表達(dá)外源GITRL或外源GITRL衍生物的細(xì)胞；用于制備所述細(xì)胞的方法；包含所述細(xì)胞作為活性成分的治療劑或預(yù)防劑；所述細(xì)胞在制備治療劑或預(yù)防劑中的用途；包括將所述細(xì)胞給予受試者的步驟的方法；攜帶編碼GITRL或GITRL衍生物的基因的病毒載體；包含所述病毒載體作為活性成分的治療劑或預(yù)防劑；所述病毒載體在制備治療劑或預(yù)防劑中的用途；和包括將所述病毒載體給予受試者的步驟的方法。
文檔編號(hào)A61P31/10GK102149820SQ200980136139
公開日2011年8月10日 申請(qǐng)日期2009年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月12日
發(fā)明者三井潤(rùn), 加藤郁之進(jìn), 峰野純一, 池田裕明, 珠玖洋, 竹中由貴 申請(qǐng)人:國(guó)立大學(xué)法人三重大學(xué), 寶生物工程株式會(huì)社