專(zhuān)利名稱(chēng)：表面錨著載體及其用于外源蛋白質(zhì)的系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含冰成核蛋白(INP)基因片段的表面錨著載體，它能將外源蛋白質(zhì)表達(dá)到細(xì)胞表面。
且本發(fā)明涉及使用INP在細(xì)胞表面制備外源蛋白質(zhì)的方法及以該表面表達(dá)系統(tǒng)制備的外源蛋白質(zhì)的應(yīng)用。
具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及表面錨著載體，在細(xì)胞表面制備外源蛋白質(zhì)的方法及其應(yīng)用，它使用細(xì)胞外膜蛋白，來(lái)自丁香假單胞菌，一種革蘭氏陰性菌的冰成核蛋白(INP)。
背景技術(shù)：
目前，在諸如噬菌體，細(xì)菌、酵母等的單細(xì)胞生物中研究了蛋白質(zhì)的表面表達(dá)以產(chǎn)生新疫苗，進(jìn)行各種抗原和抗體的篩選以及將有用的酶定位到細(xì)胞表面。
為了穩(wěn)定地生產(chǎn)疫苗已嘗試蛋白質(zhì)的表面表達(dá)首先在細(xì)胞表面表達(dá)抗原性肽。迄今，為了產(chǎn)生疫苗，將病原菌任意突變并進(jìn)行篩選以選擇能穩(wěn)定誘導(dǎo)免疫的安全細(xì)菌。然而，該篩選方法的缺陷是當(dāng)疫苗經(jīng)口服施用進(jìn)入體和動(dòng)物體時(shí)喪失抗原活性。因此，已進(jìn)行了許多研究以克服這一缺陷。
首先，已進(jìn)入的表面表達(dá)使用的方法是，采用革蘭氏陰性細(xì)菌中的細(xì)胞表面蛋白的基因片段，將它連接到抗原性多肽的基因上并用于轉(zhuǎn)化合適的細(xì)菌宿主以有效地生產(chǎn)融合蛋白質(zhì)。由該方法制備的融合蛋白質(zhì)可作為有效的抗原，因?yàn)樗鼈兎€(wěn)定地伸出細(xì)胞表面。特別是在革蘭氏陰性細(xì)菌中，外膜脂多糖(LPS)增加了在細(xì)胞表面表達(dá)的蛋白質(zhì)的抗原性。
為了在細(xì)胞表面表達(dá)蛋白質(zhì)，分泌信號(hào)在蛋白質(zhì)的一級(jí)序列內(nèi)是必須的，它幫助細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的外源蛋白質(zhì)穿過(guò)細(xì)胞膜。特別是在革蘭氏陰性細(xì)菌中，蛋白質(zhì)應(yīng)穿過(guò)細(xì)胞內(nèi)膜和周質(zhì)空間，穩(wěn)定地定位于細(xì)胞外膜上并向外伸出。例如，表面蛋白質(zhì)，特異性的酶和毒素蛋白質(zhì)具有將蛋白質(zhì)定位到細(xì)胞表面的分泌信號(hào)和靶向信號(hào)。實(shí)際上，經(jīng)過(guò)使用該分泌信號(hào)，靶向信號(hào)等與合適的啟動(dòng)子組合能成功地將外源蛋白質(zhì)表達(dá)到細(xì)胞表面。
迄今，存在于革蘭氏陰性細(xì)菌的表面蛋白主要用于生產(chǎn)必需在細(xì)胞表面的外源多肽。有4類(lèi)用于細(xì)胞表面表達(dá)的蛋白質(zhì)，如細(xì)胞外膜蛋白，脂蛋白，分泌蛋白和細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)蛋白。作為細(xì)胞外膜蛋白，LamB，phoE，OmpA等已用于表面表達(dá)。然而，在這些情況下，表達(dá)到細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)的大小是有限的，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)應(yīng)插入從細(xì)胞表面伸出的環(huán)內(nèi)。另外，還因?yàn)橥庠吹鞍踪|(zhì)的C-和N-端在三維結(jié)構(gòu)上應(yīng)互相靠近。因此，當(dāng)兩個(gè)末端之間的距離較長(zhǎng)時(shí)，應(yīng)將C-和N-端連接。
實(shí)際上，如果LamB或PhoE用于插入包含超過(guò)50-60個(gè)氨基酸的外源多肽時(shí)，由于結(jié)構(gòu)限制，不能穩(wěn)定地生產(chǎn)膜蛋白[Charbit等，免疫學(xué)雜志，1391658-1664(1987)；Agterberg等，疫苗，885-91(1990)]。為了克服結(jié)構(gòu)限制，使用含有將外源蛋白質(zhì)定位到細(xì)胞外膜的最小靶向序列的部分OmpA蛋白質(zhì)，盡管完整的OmpA蛋白質(zhì)也用于將外源蛋白質(zhì)插入到伸出的環(huán)中。使用上面描述的方法，經(jīng)過(guò)與OmpA蛋白質(zhì)C端靶向序列融合將β-丙酰胺酶表達(dá)到細(xì)胞表面上。在這種情況下，OmpA片段輔助的蛋白質(zhì)表達(dá)并結(jié)合到細(xì)胞表面上，與OmpA N末端融合的大腸桿菌脂蛋白LPP的信號(hào)序列幫助將該蛋白質(zhì)定位到細(xì)胞外膜上[Francisco等，美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，4892713-2717(1992)]。
因此，使用外膜蛋白的細(xì)胞表面表達(dá)應(yīng)在細(xì)菌中進(jìn)行，所使用的方法是將選定的外膜蛋白在基因水平與外源蛋白質(zhì)融合，該方法用于誘導(dǎo)融合蛋白的生物合成，穩(wěn)定地穿過(guò)內(nèi)膜并維持外源蛋白質(zhì)與外膜的結(jié)合。因此，上膜蛋白作為表面錨著基序必需滿(mǎn)足下述要求。外膜蛋白應(yīng)當(dāng)(i)具有分泌信號(hào)，融合蛋白能以其穿過(guò)細(xì)胞內(nèi)膜，(ii)具有靶向信號(hào)，該蛋白質(zhì)能以其結(jié)合于細(xì)胞外膜上，(iii)在細(xì)胞表面大量表達(dá)及(iv)不管蛋白質(zhì)的大小如何均能穩(wěn)定表達(dá)。然而，尚未形成滿(mǎn)足所有這些要求的任何細(xì)胞表面錨著基序且僅存在上面的缺陷。
脂蛋白作為一種表面蛋白也已用于表面表達(dá)。具體地說(shuō)，大腸桿菌脂蛋白能因其N(xiāo)端的分泌信號(hào)通過(guò)細(xì)胞內(nèi)膜且因未端L-半酰氨酸經(jīng)共價(jià)結(jié)合能直接定位于外或內(nèi)膜脂類(lèi)上。另外，由于主要脂蛋白LPP在N端結(jié)合于細(xì)胞外膜且在C端結(jié)合于細(xì)胞層，肽葡聚糖上，與外膜OmpA片段連接的外源蛋白質(zhì)能穩(wěn)定地分泌到細(xì)胞外膜用于表面表達(dá)[Francisco，等，美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)4892713-2717(1992)]。經(jīng)過(guò)使用脂蛋白的特征，已采用另一脂蛋白TraT將諸如脊髓灰質(zhì)炎病毒C3抗原決定基等的多肽表達(dá)到細(xì)胞表面上[Felici等，分子生物學(xué)雜志，222301-310(1991)]。另外，尚未確切地了解其功能的肽葡聚糖相關(guān)性脂蛋白(PAL)也已用來(lái)在細(xì)胞表面表達(dá)重組抗體[Fuchs等，生物/技術(shù)，91369-1372(1991)]。在這種情況下，PAL在C端與肽葡聚糖相連，在N端與重組抗體相連以便在細(xì)胞表面表達(dá)融合蛋白。
分泌蛋白質(zhì)，如穿過(guò)細(xì)胞外膜的表面蛋白質(zhì)已用于表面表達(dá)。然而，在革蘭氏陰性細(xì)菌中，分泌蛋白質(zhì)未被很好地開(kāi)發(fā)，僅有一些分泌蛋白質(zhì)經(jīng)輔助特異性分泌過(guò)程的蛋白質(zhì)參與穿透細(xì)胞外膜。例如，來(lái)自克雷白氏桿菌屬種類(lèi)的支鏈淀粉酶在N端用脂成份取代，結(jié)合到細(xì)胞外膜上并分泌進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)基中。Kornacker等試圖經(jīng)過(guò)使用支鏈淀粉酶的N端片段在細(xì)胞表面表達(dá)β-內(nèi)酰胺酶。不幸的是，支鏈淀粉酶-β內(nèi)酰胺酶融合蛋白立即結(jié)合到細(xì)胞表面并分泌進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)基。另外，以上述方法已嘗試使用了堿性磷酸酶，周質(zhì)空間蛋白。但堿性磷酸酶不能穩(wěn)定地表達(dá)到細(xì)胞表面，因?yàn)樵诜置谶^(guò)程中必需14種以上的蛋白質(zhì)[Kornacker等，分子微生物學(xué)，41101-1109(1990)]。
IgA蛋白酶來(lái)自病原微生物奈瑟氏球菌屬并具有獨(dú)特的分泌機(jī)制。IgA蛋白酶的C-末端β-片段具有一個(gè)信號(hào)，N端蛋白酶可以其定位到細(xì)胞外膜上。蛋白酶到達(dá)細(xì)胞外膜在細(xì)胞表面伸出后，伸出的蛋白酶經(jīng)自發(fā)水解分泌進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)基。經(jīng)過(guò)使用IgA蛋白酶的β片段，Klauser等也穩(wěn)定地將12kDa的霍亂毒素B亞基表達(dá)在細(xì)胞表面上[Klauser等，EMBO J.，91991-1999(1990)]。然而，融合蛋白的分泌受到抑制，因?yàn)樵诜置谶^(guò)程中在周質(zhì)空間誘導(dǎo)蛋白質(zhì)折疊。
另外，存在于細(xì)胞表面的其它細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)，如鞭毛，傘毛，菌毛等可用于表面表達(dá)。經(jīng)過(guò)使用鞭毛蛋白，鞭毛的一種結(jié)構(gòu)亞基，分別穩(wěn)定地表達(dá)了霍亂毒素B亞基和來(lái)自乙型肝炎病毒的其它肽，且這些肽分別與抗體強(qiáng)烈地結(jié)合[Newton等，科學(xué)，24470-72(1989)]。經(jīng)過(guò)使用菌毛蛋白，一種在細(xì)胞表面象線(xiàn)一樣存在的菌毛的結(jié)構(gòu)蛋白，也表達(dá)了外源蛋白質(zhì)。結(jié)果，僅成功地表達(dá)了小肽[Hedegaard等，基因，85115-124(1989)]。
除了革蘭氏陰性細(xì)菌的表面蛋白質(zhì)外，最近已嘗試用革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的表面蛋白質(zhì)在細(xì)胞表面表達(dá)外源蛋白質(zhì)[Samuelson等，細(xì)菌學(xué)雜志，1771470-1476(1995)]。另外，穿過(guò)細(xì)胞內(nèi)膜并結(jié)合到細(xì)胞膜上的表面錨著基序是必需的。實(shí)際上來(lái)自Straphylo coclushyicus的脂酶分泌信號(hào)和來(lái)自金黃色葡萄球菌的蛋白A膜結(jié)合基質(zhì)用于將外源蛋白質(zhì)表達(dá)到細(xì)胞表面。結(jié)果，包含80個(gè)氨基酸的瘧疾血液階段抗源和來(lái)自鏈球菌屬G蛋白的白蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)有效地在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的細(xì)胞表面表達(dá)。
在對(duì)上面所述的革蘭氏陰性和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的表面表達(dá)中，已形成了一些用于蛋白質(zhì)表達(dá)的有用的系統(tǒng)。在最近3年中，這些系統(tǒng)已在美國(guó)歐洲、日本等國(guó)申請(qǐng)并作為專(zhuān)利權(quán)進(jìn)行了登記，特別是登記了使用革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞外膜5個(gè)申請(qǐng)。另外，使用菌毛，一種細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)的一個(gè)申請(qǐng)和使用一種細(xì)胞表面脂蛋白的一個(gè)申請(qǐng)已登記。
本發(fā)明人研究了冰成核蛋白質(zhì)(INP)，一種來(lái)自丁香假單胞菌KCTC1832的表面蛋白質(zhì)作為新表面錨著基序并建立了含INP并有效地在細(xì)胞表面表達(dá)外源蛋白質(zhì)的新表面錨著載體，在細(xì)胞表面制備外源蛋白質(zhì)的方法及其使用。
本發(fā)明概述本發(fā)明的目的是利用冰成核蛋白質(zhì)(INP)的特征提供用于表面表達(dá)的表面錨著載體。特別是本發(fā)明的載體含有INP在其一級(jí)序列中所具有的分泌信號(hào)和靶向信號(hào)。
而且本發(fā)明的目的是提供用于制備外源蛋白質(zhì)的方法，它使用INP特征的表面錨著載體并將外源蛋白質(zhì)表達(dá)到細(xì)胞表面上。
更具體地說(shuō)，本發(fā)明提供了制備外源蛋白質(zhì)的方法，其中即使不破碎細(xì)胞或分離也能方便地利用蛋白質(zhì)，因?yàn)樵摰鞍踪|(zhì)表達(dá)到了表面。
另外，本發(fā)明可提供表達(dá)到細(xì)胞表面的外源蛋白質(zhì)的應(yīng)用，它包含有效地生產(chǎn)抗體和抗原及生產(chǎn)用于篩選抗原，結(jié)合或吸附蛋白質(zhì)，生理學(xué)激活物等的文庫(kù)。例如表達(dá)到細(xì)胞表面的果聚糖蔗糖酶可用于有效地生產(chǎn)果聚糖。
所有的含有來(lái)自丁香假單胞菌KCTC1832的INP基因的表面錨著載體可在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
而且本發(fā)明的表面錨著載體可應(yīng)用于所有的細(xì)菌宿主。優(yōu)選該宿主可選自革蘭氏陰性細(xì)菌，更優(yōu)選大腸桿菌，醋桿菌屬種類(lèi)，假單胞菌屬種類(lèi)，黃單胞菌屬種類(lèi)，歐文氏桿菌屬種類(lèi)和Xymomonas sp.。
所有使用這些細(xì)菌的制備方法可在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
在具體的實(shí)施方案中，構(gòu)建了pANC3載體(保藏號(hào)KCTC0326BP)，其中含有來(lái)自丁香假單胞菌KCTC1832的中央重復(fù)區(qū)缺失的INP基因且由于插入了C-端限制性位點(diǎn)而易于克隆外源基因。
另外，可將所有或一些限制性位點(diǎn)插入INP的C端，且含這些限制性位點(diǎn)的所有表面錨著載體可在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
在具體實(shí)施方案中，構(gòu)建了pANC3-CM2重組載體，其中含有中央重復(fù)區(qū)缺失的INP基因且在INP基因的C端連接CMCase基因的N端以融合蛋白的形式將CMCase產(chǎn)生到細(xì)胞表面上。
在具體實(shí)施方案中，構(gòu)建了pGINP21M載體(保藏號(hào)KCTC0239BP)，其中含有INP基因且由于插入了C端限制性位點(diǎn)而易于克隆外源基因。
而且在具體實(shí)施方案中，構(gòu)建了pASCM1重組載體(保藏號(hào)KCTC0237BP)，其中含有INP基因且在INP基因的C端連接羧甲基纖維素酶(CMCase)基因的N端以融合蛋白的形式將CMCase產(chǎn)生到細(xì)胞表面上。
另外在具體實(shí)施方案中，構(gòu)建了pASLP1重組載體，其中也含有INP基因且在INP基因C端連接脂酶基因的N端代替CMCase基因以融合蛋白質(zhì)的形成將脂酶產(chǎn)生到細(xì)胞表面。
且在具體實(shí)施方案中，構(gòu)建了pASIg1重組載體，其中也含有INP基因且在INP基因的C-端連接單鏈Fv抗體基因的N端代替CMCase基因以融合蛋白的形成將單鏈Fv抗體產(chǎn)生到細(xì)胞表面上。
且在具體實(shí)施方案中，構(gòu)建了pSSTS109重組載體，其中也含有INP基因且連接果聚糖蔗糖酶基因以融合蛋白質(zhì)的形式將果聚糖蔗糖酶產(chǎn)生到細(xì)胞表面上。
附圖的簡(jiǎn)要描述

圖1顯示了pGINP21M載體的限制性圖譜，它含有INP基因及在INP基因C端限制性位點(diǎn)。
圖2顯示了pASCM1重組載體的限制性圖譜，它含有CMCase基因且將CMCase表達(dá)到細(xì)胞表面上。
圖3圖示說(shuō)明了從pASCM1重組載體的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子表達(dá)到細(xì)胞表面的CMCase的活性，分別比較了在洗滌的細(xì)胞，培養(yǎng)基和破碎的細(xì)胞中的活性。
圖4以脂裂解程度說(shuō)明了從pASALP1重組載體的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子表達(dá)到細(xì)胞表面的脂酶的活性。
圖5說(shuō)明了經(jīng)過(guò)進(jìn)行ELISA方法從pASIg1重組載體的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子表達(dá)到細(xì)胞表面的單鏈Fv抗體與抗原的結(jié)合活性。
圖6顯示了含有重復(fù)區(qū)缺失的INP基因的pANC3載體的限制性圖譜。
圖7說(shuō)明了從pANC3-CN2重組載體的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子表達(dá)到細(xì)胞表面的CMCase的活性。
圖8顯示了從pANC3-CM2重組載體的大腸桿菌DH5α轉(zhuǎn)化子的免疫熒光染色。左側(cè)組(A和C)顯示了pZL8載體和pSSTS109重組載體的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子的光學(xué)顯微照片，右側(cè)組(B和D)分別顯示了上述大腸桿菌轉(zhuǎn)化子的共焦點(diǎn)熒光顯微照片。
圖9顯示了在完整細(xì)胞系統(tǒng)中蔗糖向果聚糖的生物轉(zhuǎn)化，其中利用了pSSTS109重組載體的大腸桿菌DH5α轉(zhuǎn)化子。優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述冰成核蛋白，一種細(xì)胞外膜蛋白在假單胞菌屬種類(lèi)，歐文氏桿菌屬種類(lèi)，黃單胞菌屬種類(lèi)等中發(fā)現(xiàn)且具有在過(guò)冷的水中誘導(dǎo)冰形成的獨(dú)特功能。
考慮到來(lái)自各種類(lèi)型的細(xì)菌的INP基因的序列，特別是有8個(gè)氨基酸單位在INP中央?yún)^(qū)域是重復(fù)的。預(yù)期該單位象冰顆粒一樣提供排列過(guò)冷的水的框架。且特異性氨基酸序列分別存在于INP的N-和C-端。預(yù)期該序列是分泌信號(hào)和靶向信號(hào)，INP可以其通過(guò)細(xì)胞內(nèi)膜。特別是INP N端在結(jié)合到細(xì)胞外膜中發(fā)揮作用。
INP由超過(guò)1,200個(gè)氨基酸組成且其分子量是118kDa。一級(jí)氨基酸序列由N端特有的氨基酸(占總蛋白質(zhì)序列的4％)和中央重復(fù)區(qū)(占總蛋白質(zhì)序列的81％)組成。特別是8個(gè)氨基酸單位在中央INP區(qū)域內(nèi)精確重復(fù)122次。
Green等經(jīng)過(guò)使用在該蛋白質(zhì)3個(gè)不同區(qū)域的INP基因突變體研究了INP的生理功能[Gren，等，分子普通遺傳學(xué)，215165-172(1988)]。結(jié)果，鑒定了INP的中央重復(fù)單位的長(zhǎng)度影響冰成核活性。缺乏重復(fù)特征減小或喪失冰成核活性且僅減小中央?yún)^(qū)域的長(zhǎng)度保留冰成核活性。因此，如果不考慮蛋白質(zhì)的分泌和靶向，預(yù)期重復(fù)區(qū)域?qū)⑦^(guò)冷的水分子排列到鄰近INP以形成冰顆粒結(jié)構(gòu)。且預(yù)期INP的N端在結(jié)合到細(xì)胞外膜上發(fā)揮作用。即使當(dāng)INP的N端完全裂解，仍保留冰成核活性。然而，預(yù)期INP的C端在將INP分泌并靶向到細(xì)胞外膜上起作用。由于C端的裂解而完全減小了冰成核活性。
作為表面表達(dá)基質(zhì)，INP具有許多來(lái)自其一級(jí)氨基酸序列，其結(jié)構(gòu)及其特征的優(yōu)勢(shì)。首先，INP大量表達(dá)到細(xì)胞表面上。其次，表達(dá)到細(xì)胞表面的INP在細(xì)胞生長(zhǎng)的靜止期保持穩(wěn)定。第三，INP位于細(xì)胞外膜上且暴露于外表面。第四，外源蛋白質(zhì)和細(xì)胞表面間的距離便于調(diào)節(jié)，因?yàn)楦鶕?jù)外源蛋白質(zhì)的大小，INP中央重復(fù)單位的長(zhǎng)度可變化。第五，由于INP在大范圍的革蘭氏陰性細(xì)菌中是一種穩(wěn)定表達(dá)的酶，革蘭氏陰性細(xì)菌的各種宿主可用于表面表達(dá)。
為了構(gòu)建含INP基因的表面錨著載體，使用含有所需基因的pGINP21(保藏號(hào)KCTC8608P)質(zhì)粒。在INP C端，切下翻譯終止密碼子，以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)插入3個(gè)新限制性位點(diǎn)，如Bam HI，SmaI和EcoRI，它提供外源蛋白質(zhì)基因的插入位點(diǎn)。結(jié)果，構(gòu)建了pGINP21M載體(保藏號(hào)KCTC0239BP)(見(jiàn)圖1)，其中上面提到的任意限制性酶位點(diǎn)對(duì)于經(jīng)基因操作構(gòu)建釋譯密碼閱讀框來(lái)插入外源蛋白是可能的。
另外，可構(gòu)建在INP C-端含全部或一些限制性位點(diǎn)的各種載體。
以上面的方法構(gòu)建的表面錨著載體含有原始INPDNA序列且表達(dá)INP。且當(dāng)外源蛋白質(zhì)基因在框架中連接到INP C端時(shí)，可表達(dá)融合蛋白質(zhì)且穩(wěn)定地結(jié)合到細(xì)胞表面。
對(duì)于表面錨著載體的有效性，應(yīng)鑒定外源蛋白質(zhì)的合成，穿過(guò)細(xì)胞內(nèi)膜并結(jié)合到細(xì)胞表面。因此，外源蛋白質(zhì)基因在閱讀框中連接到INP基因上，轉(zhuǎn)化進(jìn)細(xì)菌宿主以誘導(dǎo)表達(dá)且鑒定融合蛋白質(zhì)表達(dá)到細(xì)胞表面上。
經(jīng)過(guò)使用以上述方法構(gòu)建的pGINP21M載體，構(gòu)建了pASCM1重組載體(保藏號(hào)KCTC0237BP)以便將來(lái)自革蘭氏陰性細(xì)菌，芽孢桿菌屬種類(lèi)的羧甲基纖維素酶(CMCase)表達(dá)到細(xì)胞表面。羧甲基纖維素酶基因的N-端390bp DNA從含該基因的pUC19載體獲得[ParK，等，酶微生物學(xué)技術(shù)，8(12)725-728(1986)]并插入pGINP21M載體中。然后從不同pUC19載體獲得CMCase的C-端DNA片段并插入上述制備的載體中以構(gòu)建pASCM1重組載體(見(jiàn)圖2)。
為了將CMCase酶表達(dá)到細(xì)胞表面上，用pASCM1重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，培養(yǎng)并誘導(dǎo)表面表達(dá)。然后，使用羧甲基纖維素酶作底物檢測(cè)CMCase活性。結(jié)果，分別在洗滌的完整大腸桿菌細(xì)胞和破碎的大腸桿菌細(xì)胞中本發(fā)明的酶活性相似。因此，預(yù)期總酶活性?xún)H出現(xiàn)在伸出細(xì)胞表面的CMCase中。由于羧甲基纖維素分子量太高難以穿透細(xì)胞外膜，因此將細(xì)胞表面表達(dá)的CMCase與溶于底物溶液的羧甲基纖維素接觸可出現(xiàn)酶活性。由于細(xì)胞培養(yǎng)基不顯示CMCase活性，表明CMCase很少?gòu)募?xì)胞表面分離且限制了酶活性(見(jiàn)圖3)。
已構(gòu)建了含INP的pASLP1重組載體以便將來(lái)自革蘭氏陰性細(xì)菌，假單胞菌屬種類(lèi)的脂酶表達(dá)到細(xì)胞表面。經(jīng)過(guò)進(jìn)行pCR從pJH92質(zhì)粒(Jung Kook Hoon，生物科學(xué)部，Ph D Thesis，KIST，1990)獲得脂酶基因且與用Bam HI和Eco RI消化的pASCM1重組載體連接以構(gòu)建產(chǎn)生INP與脂酶的融合蛋白的pASLP1重組載體。
為了將脂酶表達(dá)到細(xì)胞表面，用pASLP1重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，培養(yǎng)并誘導(dǎo)表面表達(dá)。然后，以醋酸銅方法測(cè)量脂酶活性。與缺乏脂酶的宿主細(xì)胞相比，在將脂酶表達(dá)到細(xì)胞表面的轉(zhuǎn)化大腸桿菌中出現(xiàn)更高的脂酶活性。因此，將脂酶表達(dá)到細(xì)胞表面的宿主細(xì)胞可直接用于雙相脂水解(見(jiàn)圖4)。
已構(gòu)建含INP基因的pASIg1重組載體以表達(dá)單鏈Fv抗體。從能在大腸桿菌中以分泌蛋白生產(chǎn)抗體的pLUV2質(zhì)粒獲得單鏈Fv抗體基因并以上述方法插入以構(gòu)建pASIg1重組載體。
為了將單鏈Fv抗體表達(dá)到細(xì)胞表面，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，培養(yǎng)并誘導(dǎo)表面表達(dá)。然后，以測(cè)量抗原與表面表達(dá)的抗體的結(jié)合程度的ELISA(酶聯(lián)免疫吸附)法鑒定單鏈Fv抗體的表面表達(dá)。
已構(gòu)建了含INP基因的pSSTS109重組載體(保藏號(hào)KCTC0327 BP)以表達(dá)果聚糖蔗糖酶。用pZL8載體進(jìn)行PCR獲得果聚糖蔗糖酶基因，亞克隆進(jìn)pT7 Blue(R)載體，然后插入本發(fā)明的pGINP21M載體中。
為了將果聚糖蔗糖酶表達(dá)到細(xì)胞表面上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，培養(yǎng)并誘導(dǎo)表面表達(dá)。經(jīng)過(guò)進(jìn)行免疫熒光染色獲得果聚糖蔗糖酶的表面表達(dá)(見(jiàn)圖8)。
另外，表達(dá)到細(xì)胞表面的果聚糖蔗糖酶可用于從蔗糖方便且有效地生產(chǎn)果聚糖(見(jiàn)圖9)。
為了構(gòu)建含重復(fù)區(qū)缺失的INP基因的表面錨著載體，已誘變了INP基因以缺失中央重復(fù)區(qū)。
將編碼INP N端特異性區(qū)域，前2個(gè)重復(fù)亞基，最后3個(gè)重復(fù)亞基和C端特異性區(qū)域的基因片段精確克隆到pKK223-3質(zhì)粒載體tac啟動(dòng)子下游。結(jié)果，構(gòu)建了pANC3載體(保藏號(hào)KCTC0326BP)(見(jiàn)圖6)。
經(jīng)過(guò)使用以上述方法構(gòu)建的pANC3載體，已構(gòu)建了pANC3-CM2重組載體以表達(dá)CMCase到細(xì)胞表面上。以上述方法測(cè)量CMCase活性(見(jiàn)圖7)。
如上所述，本發(fā)明的表面表達(dá)系統(tǒng)有效地生產(chǎn)有用的酶和抗體。上面表達(dá)的外源蛋白質(zhì)作為例子說(shuō)明了使用INP的表面表達(dá)，但不是為了限制本發(fā)明。以本發(fā)明的細(xì)胞表面表達(dá)系統(tǒng)可將任何外源蛋白質(zhì)表達(dá)到細(xì)胞表面上。
下面的實(shí)施例將進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，而不限制本發(fā)明。
實(shí)施例<實(shí)施例1>用于表面表達(dá)的pGINP21M載體的構(gòu)建為了構(gòu)建含INP基因的表面錨著載體，使用含克隆的INP基因的pGINP21質(zhì)粒(7.1kb)(保藏機(jī)構(gòu)韓國(guó)生物科學(xué)和生物技術(shù)研究所；保藏號(hào)KCTC86089，保藏日期1994年7月13日)。為了提供外源蛋白質(zhì)基因的插入位點(diǎn)，經(jīng)PCR反應(yīng)插入3個(gè)新的限制性位點(diǎn)。結(jié)果，以PCR機(jī)器擴(kuò)增了從Kpn位點(diǎn)到INP基因C末端的大約1.7kb的片段。
使用SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2引物。合成SEQ.ID.No.1引物以插入KpnI限制性位點(diǎn)，合成SEQ.ID.No.2引物以依次插入諸如Bam HI，Sma I和Eco RI的3個(gè)限制性位點(diǎn)。插入的限制性位點(diǎn)有利于基因擴(kuò)增后亞克隆INP基因。以PCR機(jī)器擴(kuò)增的基因片段用限制性酶Kpn I和Eco RI消化，并插入已用Kpn I和EcoRI消化的pGINP21載體中。結(jié)果，構(gòu)建了pGINP21M載體(見(jiàn)圖1)，其中插入了新限制性位點(diǎn)代替INP基因的翻譯終止密碼子。pGINP21M載體的大小是7.1kb。用本發(fā)明的pGINP21M載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，轉(zhuǎn)化的大腸桿菌于1997年3月28日保藏于KRIBB，KIST(保藏號(hào)KCTC0239BP)。
<實(shí)施例2>pASCM1重組載體的構(gòu)建構(gòu)建pASCM1重組載體，它使用INP并可在細(xì)胞表面表達(dá)CMCase。
為了將CMCase基因插入pGINP21M載體用于表面表達(dá)，用BamHI和EcoRI消化該載體，也用BamHI和EcoRI消化含CMCaseN端390bp DNA的PVLC19通用克隆載體。上面制備的2個(gè)DNA片段與DNA連接酶連接以構(gòu)建pGINP21CM1質(zhì)粒。然后，經(jīng)過(guò)用Eco RI消化從另一PVLC19載體的Eco RI位點(diǎn)獲得CMCase的C端DNA片段并插入含CMCase N-端的pGINP21CM1質(zhì)粒的EcoR1位點(diǎn)。結(jié)果，將完整的CMCase基因連接到INP基因的C端。上面制備的pASCM1重組載體在圖2中顯示。用本發(fā)明的pASCM1重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，轉(zhuǎn)化的大腸桿菌于1997年3月22日保藏于KRIBB，KIST(保藏號(hào)KCTC0237BP)。
<實(shí)施例3>CMCase的表面表達(dá)用pASCM1重組載體經(jīng)大腸桿菌，在含100ml LB培養(yǎng)基和抗生素，100mg/L氨芐青霉素的500ml燒瓶中培養(yǎng)并誘導(dǎo)表面表達(dá)。
然后，使用羧甲基纖維素作底物經(jīng)DNS方法測(cè)量CMCase活性。具體地說(shuō)，1％(W/V)羧甲基纖維素溶于50mM檸檬酸緩沖液中以制備底物溶液。加入0.5ml該底物溶液與0.5ml酶溶液充分混合并在雙層熱水貯槽中60℃加溫30分鐘進(jìn)行反應(yīng)。然后，加入3ml DNS溶液，它經(jīng)過(guò)將7.5g 2，5-二硝基水楊酸，14.0g NaOH，216.1gRochel鹽，5，4g苯酚和5.9g Na2S2O5依次溶于1L純水中制備。底物溶液與DNS溶液在沸水中反應(yīng)5分鐘，然后在冰水中冷卻。使用室溫的冷卻溶液測(cè)550nm的吸光率。經(jīng)過(guò)與葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)比較計(jì)算釋放的還原糖量。1單位的酶表示1分鐘釋放1μM葡萄糖的酶量。
結(jié)果，當(dāng)洗滌后的完整大腸桿菌細(xì)胞和破碎的大腸桿菌細(xì)胞用作酶來(lái)源時(shí)，兩種情況的酶活性相似。
<實(shí)施例4>重組載體pASLP1的構(gòu)建構(gòu)建pASLP1重組載體，它使用INP并能在細(xì)胞表面表達(dá)脂酶。
用Bam HI和Eco RI消化實(shí)施例2中制備的PASCM1重組載體，去掉CMCase基團(tuán)以制備表面的pJH92質(zhì)粒并經(jīng)PCR技術(shù)操作以插入Bam HI和Eco RI限制性位點(diǎn)。因此，經(jīng)過(guò)用Bam HI和Eco RI消化該pJH92載體可獲得脂酶基因并連接進(jìn)上面制備的表面錨著載體上。結(jié)果，構(gòu)建了pASLP1重組載體，它能以融合蛋白質(zhì)的形式表達(dá)INP和脂酶。
<實(shí)施例5>脂酶的表面表達(dá)以氯化鈣方法用pASLP1重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，以實(shí)施例3所述的相同方法培養(yǎng)并誘導(dǎo)表面表達(dá)。然后，以下面所述的醋酸銅方法測(cè)量表達(dá)到細(xì)胞表面上的脂酶活性。5ml大腸桿菌培養(yǎng)液與溶于5ml異辛烷的5％的橄欖油底物混合并在40℃反應(yīng)1小時(shí)。然后，懸浮溶液和油相，用1ml醋酸銅試劑處理3ml懸浮溶液并劇烈搖動(dòng)。然后，測(cè)量反應(yīng)混合物在715nm下的吸光率。此時(shí)，預(yù)期吸光率越高，酶活性越高，因?yàn)榻到饬烁嗟挠彤a(chǎn)生酸性酯。結(jié)果，測(cè)量的表達(dá)到細(xì)胞表面的脂酶活性在圖4中表示。
<實(shí)施例6>pASIg1重組載體的構(gòu)建構(gòu)建pASIg1重組載體，它使用了INP并能將人類(lèi)化的單鍵Fv抗體表達(dá)到細(xì)胞表面。為了制備脂酶基因，用Sal I和Eco RI消化含單鏈Fv抗體基因且能作為分泌蛋白產(chǎn)生該抗體的pLUV2質(zhì)粒并連接到一個(gè)合成寡核苷酸上以加入一個(gè)新的Bg1 II限制性位點(diǎn)代替Sal I位點(diǎn)。用Eco RI和Bam HI消化實(shí)施例2制備的pASCM1重組載體以去掉用于表面表達(dá)的CMCase基因并連接到用Bgl II和Eco RI消化的單鏈抗體基因上。結(jié)果，構(gòu)建了pASIG1重組載體，它能以融合蛋白的形式表達(dá)INP和單鏈Fv抗體。
<實(shí)施例7>單鏈Fv抗體的表面表達(dá)。
用pASIg1重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌并以實(shí)施例3所述的相同方法誘導(dǎo)表面表達(dá)。然后，以測(cè)量抗原與表面表達(dá)的抗體的結(jié)合程度的ELLSA方法鑒定表達(dá)到細(xì)胞表面的單鏈Fv抗體的活性。在表達(dá)抗體的細(xì)胞和僅含表達(dá)載體的細(xì)胞中分別比較了抗原結(jié)合的程度。
調(diào)節(jié)各細(xì)胞使具有相同的濃度，收獲，用PBS緩沖液洗滌(pH7.4)并用1.4ml相同的緩沖液重懸。將這些懸浮溶液分成25，50，100，200和250μl的批次，然后與能結(jié)合抗體(H69k)的臨界濃度的pre-S2抗原混合并在室溫下反應(yīng)2小時(shí)。然后在室溫下離心結(jié)合的溶液2分鐘并將所得的上清液加入ELISA板上覆蓋過(guò)夜。此時(shí)，加入計(jì)算量的抗體H69k并以如下的ELISA方法測(cè)量覆蓋的抗體量。
經(jīng)過(guò)使用含2％牛血清白蛋白的TBS-T緩沖液
封閉覆蓋過(guò)夜的平板2小時(shí)并用TBS-T緩沖液洗滌。然后，加入10ng第一抗體H69k，反應(yīng)2小時(shí)并用相同的緩沖液洗滌以去掉未結(jié)合的抗體。用1000倍的緩沖液稀釋與辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的第二抗體并反應(yīng)。加入H2O2作過(guò)氧化物酶的底物且OPD作顯色劑以誘導(dǎo)顯色且經(jīng)過(guò)使用硫酸終止該反應(yīng)。然后，測(cè)量在492nm下的吸光率并轉(zhuǎn)換成對(duì)不含細(xì)胞的空白的100％吸光率的百分?jǐn)?shù)。結(jié)果，與對(duì)照細(xì)胞的抗原結(jié)合進(jìn)行比較，結(jié)果如圖5所示。
<實(shí)施例8>含果聚糖蔗糖酶基因的pSSTS109重組載體的構(gòu)建構(gòu)建pSSTS109重組載體，它使用INP并能將果聚糖蔗糖酶表達(dá)到細(xì)胞表面。
將果聚糖蔗糖酶基因插入本發(fā)明的pGINP21M載體中。使用pZL8載體[Song和Rhee，生物技術(shù)通訊，161305-1310(1994)]作模板進(jìn)行PCR以擴(kuò)增果聚糖蔗糖酶。此時(shí)分別與開(kāi)架閱讀框(ORF)上游和下游序列互補(bǔ)且含有新的限制性酶位點(diǎn)，即ORF起點(diǎn)為Bam HI位點(diǎn)，終點(diǎn)為Sma I和Eco RI位點(diǎn)的寡核苷酸SEQ.ID.No.3和SEQ.ID.No.4用作引物。將PCR產(chǎn)物有效地亞克隆進(jìn)pTT Blue(R)載體(Novagen Co.，USA)。用Bam HI-Eco RI消化亞克隆的果聚糖蔗糖酶基因并插入用相同酶消化的pGINP21M載體中。
結(jié)果，制備pSSTS109重組載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，且轉(zhuǎn)化的大腸桿菌于1997年3月27日保藏于KRIBB，KIST(保藏號(hào)KCTC 0327 BP)。
<實(shí)施例9>果聚糖蔗糖酶的表面表達(dá)用pSSTS109重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌并以實(shí)施例3所述的相同方法誘導(dǎo)表面表達(dá)。
表面錨著的果聚糖蔗糖酶的物理觀(guān)察在圖8中提供。用果聚糖蔗糖酶反應(yīng)抗體和FITC抗記的第二抗體的免疫熒光染色該果聚糖蔗糖酶。有效染色的陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞如圖8(D)所示，而陰性反應(yīng)細(xì)胞末染色(見(jiàn)圖8(B))。這是INP能指導(dǎo)外源蛋白質(zhì)表達(dá)到細(xì)胞外膜且作為表面錨著基序有用的直接證據(jù)。
<實(shí)施例10>經(jīng)過(guò)使用表面表達(dá)系統(tǒng)將蔗糖生物轉(zhuǎn)變?yōu)楣厶且褕?bào)道了經(jīng)過(guò)使用果聚糖蔗糖酶使蔗糖經(jīng)酶轉(zhuǎn)變?yōu)楣厶荹Song和Rhee，生物技術(shù)通訊，161305-1310(1994)]。生物轉(zhuǎn)化的最適溫度為10℃，在10％蔗糖溶液中的最高產(chǎn)率為46％。洗滌經(jīng)過(guò)使用INP錨著基序在其表面表達(dá)果聚糖蔗糖酶的完整細(xì)胞，然后用于以最大產(chǎn)量直接形成果聚糖，如果將它們重懸于10℃的乙酸緩沖溶液(pH5.5)中無(wú)需分離酶或制備細(xì)胞溶胞產(chǎn)物(見(jiàn)圖9)。
起始細(xì)胞濃度較低，如1.3 OD600nm。由于果聚糖蔗糖酶的比活足夠高，該細(xì)胞密度適用于生物轉(zhuǎn)化。在12天反應(yīng)期間精確水解77％的所加入的蔗糖并聚合成果聚糖(51.1g/l)。此時(shí)從上述蔗糖溶液釋放并積累未聚合的葡萄糖(77g/l)。與這些陽(yáng)性細(xì)胞的結(jié)果相比，在胞質(zhì)空間含果聚糖蔗糖酶的陰性細(xì)胞在反應(yīng)期間不能將蔗糖轉(zhuǎn)變?yōu)楣厶?。結(jié)果，僅檢測(cè)到少量的葡萄糖，如2.13g/l，無(wú)可測(cè)量的果聚糖量。因此證實(shí)了用洗滌的完整細(xì)胞形成的果聚糖由表面暴露的果聚糖蔗糖酶的反應(yīng)引起。
<實(shí)施例11>含重復(fù)區(qū)缺失的INP的pANC3載體的構(gòu)建為了構(gòu)建含重復(fù)區(qū)缺失的INP基因的表面錨定載體，已誘變了INP基因使缺失中央重復(fù)區(qū)。
將編碼INP N端特異性區(qū)域(175個(gè)氨基酸殘基)，前2個(gè)重復(fù)亞基(32個(gè)氨基酸殘基)，后3個(gè)重復(fù)亞基(48個(gè)氨基酸殘基)和INP的C端特異性區(qū)域(49個(gè)氨基酸殘基)的重組DNA精確放在pKK223-3質(zhì)粒載體tac啟動(dòng)子下游(Pharmacia.Co.，Sweden)，產(chǎn)生表面錨定載體，pANC3(見(jiàn)圖6)。
用本發(fā)明的pANC3載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，轉(zhuǎn)化的大腸桿菌于1997年3月27日保藏于KRIBB，KIST(保藏號(hào)KCTC 0326 BP)。
<實(shí)施例12>pANC3-CM2重組載體的構(gòu)建構(gòu)建pANC3-CM3重組載體，它使用重復(fù)區(qū)缺失的INP且能在細(xì)胞表面表達(dá)CMCase。
經(jīng)過(guò)進(jìn)行實(shí)施例2的相同程序?qū)MCase基因也亞克隆進(jìn)pANC3載體以制備表面錨著載體pANC3-CM2。
<實(shí)施例13>用重復(fù)區(qū)缺失的INP表面表達(dá)CMCaseINP是具有內(nèi)部重復(fù)區(qū)的大型多肽，該重復(fù)區(qū)對(duì)于運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外膜可能是不必要的。按實(shí)施例12所述也將CMCase基因亞克隆進(jìn)pANC3錨著載體，制備pANC3-CM2重組載體。用pANC3-CM2重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109菌株。經(jīng)過(guò)進(jìn)行實(shí)施例3相同的程序測(cè)定轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109細(xì)胞表面的總CMCase活性。
洗滌細(xì)胞后經(jīng)測(cè)量完整細(xì)胞CMCase活性來(lái)證實(shí)(見(jiàn)圖7)。在42℃生長(zhǎng)的細(xì)胞顯示出比在37℃生長(zhǎng)的細(xì)胞具有更高水平的CMCase活性。在生長(zhǎng)的早期靜止期其活性達(dá)到最大點(diǎn)，然后其活性在幾小時(shí)內(nèi)下降。
結(jié)果證實(shí)INP的N端和/或C端區(qū)在其本身一級(jí)序列上具有分泌和靶向信號(hào)，因?yàn)槿狈NP中央重復(fù)區(qū)的INP也引導(dǎo)CMCase到細(xì)胞表面。
在本發(fā)明中制備的pGINP21M載體和pANC3載體有效地表達(dá)CMCase脂酶，人類(lèi)化的單鏈Fv抗體，果聚糖蔗糖酶等到大腸桿菌的細(xì)胞表面。該載體具有如下所述的極大的優(yōu)勢(shì)。表達(dá)的蛋白質(zhì)不被稀釋?zhuān)驗(yàn)樵摰鞍踪|(zhì)濃度位于細(xì)胞表面。僅經(jīng)過(guò)洗滌細(xì)胞就能容易地鑒定該表達(dá)，因?yàn)榧?xì)胞破碎或蛋白質(zhì)分離或純化不是必需的。
使用INP特性的本發(fā)明的載體對(duì)于克隆外源蛋白基因是有用的，因?yàn)樵贗NP的一級(jí)序列中除了分泌信號(hào)和靶向信號(hào)外，INP的中央重復(fù)區(qū)的長(zhǎng)度可根據(jù)需要發(fā)生變化。因此，該載體所具有的顯著優(yōu)勢(shì)是外源蛋白質(zhì)和細(xì)胞表面間的距離可便于調(diào)節(jié)。
本發(fā)明的制品的方法使用了INP的特性且能不管細(xì)胞周期而穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白質(zhì)。它能應(yīng)用于各類(lèi)細(xì)菌宿主。另外，表面表達(dá)因?yàn)榇罅勘磉_(dá)到細(xì)胞表面而有利于外源蛋白質(zhì)的鑒定。
本發(fā)明的表面表達(dá)系統(tǒng)可用于有效地生產(chǎn)重組外源蛋白質(zhì)，它包括各種抗原，抗體，酶，結(jié)合或吸附蛋白，用于篩選生理學(xué)激活劑的肽文庫(kù)等。由于該系統(tǒng)具有廣泛的應(yīng)用，所以它可用于生產(chǎn)新疫苗，抗肽抗體，用于分離微生物的吸附劑，位于細(xì)胞表面的酶等。
尤其是表達(dá)到細(xì)胞表面的果聚糖蔗糖酶對(duì)于從蔗糖生產(chǎn)果聚糖是非常有用的，日本發(fā)明的該方法可有效地用于生物轉(zhuǎn)化。
序列描述(1)一般信息(iii)序列數(shù)4個(gè)(2)SEQ ID No.1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)堿基對(duì)，(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€(xiàn)型(ii)分子類(lèi)型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID No.1AAGTA CAGGT ACCGCAGGTC ACGAG(2)SEQ ID No.2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度34個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€(xiàn)型(ii)分子類(lèi)型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID No.2GGAGTGCTTG AATTCCCCGG GATCCTTTAC CTCT(2)SEQ ID No.3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€(xiàn)型(ii)分子類(lèi)型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID No.3GGATCCGATG TTGAATAAAG CAGGC(2)SEQ ID No.4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度28個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€(xiàn)型(ii)分子類(lèi)型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID No.4GATTCCGGGA ATCAGAAACG AAACGTCA
權(quán)利要求
1.一種表面錨著載體，它含有冰成核蛋白質(zhì)(INP)的基因片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的表面錨著載體，其中INP來(lái)自丁香假單胞菌KCTC1832。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的表面錨著載體，它含有包括N端分泌信號(hào)和C端靶向信號(hào)的INP的基因片段。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的表面錨著載體，其中INP基因的長(zhǎng)度在INP的中央重復(fù)區(qū)中是可變的。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的表面錨著載體，它含有用于插入外源基因的在INP基因C端的限制性位點(diǎn)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或權(quán)利要求5的表面錨著載體，它是pANC3克隆載體。
7.經(jīng)過(guò)用權(quán)利要求6的pANC3克隆載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌制備的轉(zhuǎn)化子(保藏號(hào)KCTC0326BP)。
8.根據(jù)權(quán)利要求5的表面錨著載體，它是pGINP21M克隆載體。
9.經(jīng)過(guò)用權(quán)利要求7的pGINP21M克隆載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌制備的轉(zhuǎn)化子(保藏號(hào)KCTC0239BP)。
10.用于表面表達(dá)的重組載體，其中外源蛋白質(zhì)的基因插入權(quán)利要求6的表面錨著載體。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的pANC3-CM2重組載體，其中外源蛋白質(zhì)包括用于表面表達(dá)的CMCase。
12.用于表面表達(dá)的重組載體，其中的外源蛋白質(zhì)基因插入權(quán)利要求8的表面錨著載體中。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的pASCM1重組載體，其中外源蛋白質(zhì)包括用于表面表達(dá)的CMCase。
14.根據(jù)權(quán)利要求12的pASLP1重組載體，其中外源蛋白質(zhì)包括用于表面表達(dá)的脂酶。
15.根據(jù)權(quán)利要求12的pASIG1重組載體，其中外源蛋白質(zhì)包括用于表面表達(dá)的人類(lèi)化的單鏈Fv抗體。
16.根據(jù)權(quán)利要求12的pSSTS109重組載體，其中的外源蛋白質(zhì)包括用于表面表達(dá)的果聚糖蔗糖酶。
17.經(jīng)過(guò)用權(quán)利要求10或權(quán)利要求12的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞制備的轉(zhuǎn)化子。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的轉(zhuǎn)化子，其中的宿主細(xì)胞包括大腸桿菌，醋桿菌屬種類(lèi)，假單胞菌屬種類(lèi)，黃單胞菌屬種類(lèi)，歐文氏桿菌屬和Xymomonas sp.。
19.根據(jù)權(quán)利要求17的轉(zhuǎn)化子，它經(jīng)過(guò)用權(quán)利要求11的pANC3-CM2重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109獲得。
20.根據(jù)權(quán)利要求17的轉(zhuǎn)化子，它經(jīng)過(guò)用權(quán)利要求13的pASCM1重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109獲得(保藏號(hào)KCTC0237BP)。
21.根據(jù)權(quán)利要求17的轉(zhuǎn)化子，它經(jīng)過(guò)用權(quán)利要求14的pASLP1重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109獲得。
22.根據(jù)權(quán)利要求17的轉(zhuǎn)化子，它經(jīng)過(guò)用權(quán)利要求15的pASIG1組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109獲得。
23.根據(jù)權(quán)利要求17的轉(zhuǎn)化子，它經(jīng)過(guò)用權(quán)利要求16的pSSTS109重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α獲得(保藏號(hào)KCTC0327BP)。
24.一種制備外源蛋白質(zhì)的方法，包括如下步驟a)培養(yǎng)權(quán)利要求17的轉(zhuǎn)化子。b)以融合蛋白的形式將外源蛋白質(zhì)與INP表達(dá)到細(xì)胞表面。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的用于制備外源蛋白質(zhì)的方法，其中的外源蛋白質(zhì)是果聚糖蔗糖酶。
26.根據(jù)權(quán)利要求17的制備外源蛋白質(zhì)的方法，其中外源蛋白質(zhì)的大小可經(jīng)過(guò)調(diào)節(jié)INP中央重復(fù)區(qū)的INP基因長(zhǎng)度而變化。
27.以權(quán)利要求24的方法制備的外源蛋白質(zhì)的應(yīng)用，包括抗體，酶，抗原，結(jié)合蛋白質(zhì)，吸附蛋白質(zhì)和肽文庫(kù)。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的外源蛋白質(zhì)的應(yīng)用，其中的外源蛋白質(zhì)是果聚糖蔗糖酶，它可用于使用權(quán)利要求23的轉(zhuǎn)化子來(lái)制備果聚糖。
全文摘要
本發(fā)明涉及表面錨著載體,用于制備外源蛋白質(zhì)到細(xì)胞表面的方法及其應(yīng)用,它使用了來(lái)自革蘭氏陰性細(xì)菌,丁香假單胞菌的細(xì)胞外膜蛋白,冰成核蛋白(INP)。
文檔編號(hào)C12N9/42GK1185809SQ97190288
公開(kāi)日1998年6月24日 申請(qǐng)日期1997年4月2日 優(yōu)先權(quán)日1996年4月2日
發(fā)明者潘在龜, 鄭興采, 樸勝煥, 韓文熙, 樸英薰 申請(qǐng)人:韓國(guó)科學(xué)技術(shù)研究院