專利名稱：一種蛋白質(zhì)芯片載體的處理方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)芯片或免疫測(cè)定領(lǐng)域，更具體地涉及一種新的蛋白質(zhì)芯片載體及其處理方法。
背景技術(shù)：
為提高檢測(cè)通量與檢測(cè)效率，近年來發(fā)展起來了一種微陣列酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)，也稱為蛋白質(zhì)芯片技術(shù)——它利用的是抗體與抗原結(jié)合的特異性即免疫反應(yīng)來檢測(cè)樣品。
蛋白質(zhì)芯片構(gòu)建的簡(jiǎn)化模型為選擇一種固相載體能夠牢固地結(jié)合蛋白質(zhì)分子(抗原或抗體)，這樣形成蛋白質(zhì)的微陣列，即蛋白質(zhì)芯片。在基片上構(gòu)建蛋白質(zhì)微陣列，陣列中的每一個(gè)點(diǎn)代表著一個(gè)獨(dú)立的生物化學(xué)反應(yīng)，從而把許許多多的反應(yīng)集成在一塊很小的載體上進(jìn)行。
根據(jù)Rou-Pan huang、Thomas O.joos等資料顯示，蛋白質(zhì)芯片的構(gòu)建流程如下(1)將純化的蛋白質(zhì)溶解于緩沖液中，(2)用高速點(diǎn)樣儀把蛋白質(zhì)點(diǎn)于膜上，(3)點(diǎn)樣儀有針點(diǎn)式和噴點(diǎn)式，點(diǎn)的直徑通常為0.2-0.4um，點(diǎn)樣量一般不超過100nl；(4)再將已點(diǎn)樣的NC膜用TBS沖洗數(shù)次，(5)然后用牛血清蛋白溶液進(jìn)行封閉，經(jīng)室溫涼干待用。
檢測(cè)時(shí)首先向芯片上加待測(cè)物質(zhì)溶液，保溫以充分反應(yīng)，沖洗，加酶標(biāo)反應(yīng)液，保溫以充分反應(yīng)，沖洗，加檢測(cè)液，用檢測(cè)儀檢測(cè)顏色變化或發(fā)光信號(hào)。
用以上方法構(gòu)建的蛋白質(zhì)微陣列，存在著下列缺點(diǎn)(1)靈敏度較低，(2)本底高，
(3)蛋白質(zhì)點(diǎn)陣容易在反應(yīng)過程中擴(kuò)散，陣特別是當(dāng)密度較大時(shí)，易造成不同點(diǎn)的信號(hào)由于距離太近而相互影響。
因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的蛋白質(zhì)芯片固相載體及其制備方法，該固相載體可顯著降低蛋白質(zhì)點(diǎn)樣點(diǎn)的擴(kuò)散和/或提高檢測(cè)靈敏度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種新的蛋白質(zhì)芯片固相載體及其制備方法，該固相載體可顯著降低蛋白質(zhì)點(diǎn)樣點(diǎn)的擴(kuò)散和/或提高檢測(cè)靈敏度。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種蛋白質(zhì)芯片的固相載體，在所述固相載體的表面結(jié)合有親和素-生物素的復(fù)合物，其中親和素-生物素復(fù)合物中生物素的數(shù)量為親合素活性單位的0.15-0.4。
在一優(yōu)選例中，親和素-生物素復(fù)合物中生物素的數(shù)量為親合素活性單位的為1/5-1/3。
在另一優(yōu)選例中，所述的固相載體選自下組玻璃片、塑料片、硝酸纖維(NC)膜、PDVF膜。
在另一優(yōu)選例中，所述的親和素-生物素的復(fù)合物的數(shù)量為5-1000ug/cm2。
在另一優(yōu)選例中，所述的親和素選自下組卵白親和素、鏈霉親和素、及其混合物。
在另一優(yōu)選例中，所述的生物素選自下組生物素N-羥基丁二酰亞胺酯、長臂生物素或其混合物。
在在本發(fā)明的第二方面，提供了制備本發(fā)明上述蛋白質(zhì)芯片固相載體的制備方法，包括步驟(a)將一固相載體浸泡于親和素-生物素復(fù)合物的溶液中，其中親和素—生物素復(fù)合物中生物素的數(shù)量為親合素活性單位的0.15-0.4；(b)用緩沖液洗滌步驟(a)的固相載體；(c)干燥步驟(b)的固相載體。
在一優(yōu)選例中，所述的固相載體選自下組玻璃片、塑料片、硝酸纖維膜、PDVF膜。
在另一優(yōu)選例中，所述的溶液中親和素-生物素的復(fù)合物的濃度為5-1000ug/ml，較佳地為50-500ug/ml，更佳地為100-500ug/ml。
在另一優(yōu)選例中，所述的親和素選自下組卵白親和素、鏈霉親和素、及其混合物；且所述的生物素選自下組生物素N-羥基丁二酰亞胺酯、長臂生物素或其混合物。
在另一優(yōu)選例中，浸泡條件為室溫下90-150分鐘，或4℃過夜；而且干燥條件為室溫涼干或冷凍干燥。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過深入而廣泛的研究，發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)芯片的固相載體的表面結(jié)合有一種特定的親和素-生物素的復(fù)合物時(shí)，不僅可顯著降低蛋白質(zhì)點(diǎn)樣點(diǎn)的擴(kuò)散作用，而且可提高檢測(cè)靈敏度。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)芯片固相載體基本上由(a)常規(guī)固相載體和(b)結(jié)合于固相載體上的本發(fā)明特定的親和素-生物素復(fù)合物所構(gòu)成。
用于本發(fā)明特定的親和素-生物素復(fù)合物是一種由一定比例的親和素和生物素結(jié)合而成的復(fù)合物。通常，1個(gè)分子的親和素結(jié)合4個(gè)分子的生物素，形成完全復(fù)合的復(fù)合物。本發(fā)明的復(fù)合物是非完全復(fù)合的復(fù)合物，即每1分子親和素與小于4個(gè)分子的生物素所形成的復(fù)合物。較佳的復(fù)合物是每1分子親和素與小于0.6-2個(gè)分子的生物素所形成的復(fù)合物，更佳地是每1分子親和素與小于0.8-1.5個(gè)分子的生物素所形成的復(fù)合物。
另一種表示親和素-生物素復(fù)合物中生物素/親和素比例的方式是以親合素活性單位為基準(zhǔn)。親合素活性單位被定義為一定數(shù)量親和素所能結(jié)合的生物素的數(shù)量。在本發(fā)明的復(fù)合物中，生物素的數(shù)量通常為親合素活性單位的0.15-0.4，較佳地為1/5-1/3。
可用于本發(fā)明的親和素沒有特別限制。代表性的例子包括(但并不限于)卵白親和素、鏈霉親和素或其混合物等。
可用于本發(fā)明的生物素沒有特別限制。代表性的例子包括(但并不限于)活化生物素，例如生物素N-羥基丁二酰亞胺酯、長臂生物素或其混合物等，
如本文所用，術(shù)語“蛋白質(zhì)芯片固相載體”就是在其上點(diǎn)有蛋白質(zhì)點(diǎn)樣點(diǎn)的基片材料，常見的載體包括玻璃片、塑料片、硝酸纖維(NC)膜、PDVF膜等，其中特別優(yōu)選的是NC膜。
本發(fā)明還提供了蛋白質(zhì)芯片固相載體的制備方法。以NC膜為例，其處理方法如下首先，在進(jìn)行蛋白質(zhì)點(diǎn)樣前將NC膜浸泡于親和素-生物素復(fù)合體溶液中，其中其中親和素-生物素復(fù)合物中生物素的數(shù)量為親合素活性單位的0.15-0.4。
接著，用緩沖液(如PBS緩沖液)洗滌數(shù)次。
最后，干燥處理(如室溫涼干或冷凍干燥)。
親和素-生物素復(fù)合物溶液中，親和素-生物素復(fù)合物的濃度通常為5-1000ug/ml，較佳地為100ug/ml-500ug/ml。親和素-生物素復(fù)合物中生物素所占比例為親合素活性單位的1/5-1/3。
至于浸泡溫度和時(shí)間，沒有特別限制。通常，在親和素-生物素復(fù)合物溶液中的浸泡時(shí)間為室溫下90-150分鐘或更長，或4℃過夜。
據(jù)測(cè)試，通過本發(fā)明處理NC膜后，再進(jìn)行蛋白質(zhì)點(diǎn)樣，經(jīng)抗原抗體反應(yīng)，最終的樣品信號(hào)的本底值可下降7-12％，相應(yīng)的樣品最小檢出量也可減少8％以上，從而檢測(cè)靈敏度有了較大提高。
另外，NC膜經(jīng)過親合素-生物素復(fù)合物處理，蛋白質(zhì)樣點(diǎn)的擴(kuò)散也有所減小，免疫反應(yīng)前后樣點(diǎn)面積比為1.5倍，而未經(jīng)過處理的二者面積比為2.2倍以上。換言之，本發(fā)明點(diǎn)樣點(diǎn)面積僅為對(duì)照的50％左右。因此，經(jīng)過親和素-生物素處理的NC膜，發(fā)光反應(yīng)后同一孔內(nèi)不同點(diǎn)之間光信號(hào)的相互干擾大大減小了，也預(yù)示著可以進(jìn)一步提高蛋白質(zhì)芯片的集成度。
作為制備蛋白質(zhì)芯片或蛋白質(zhì)微點(diǎn)陣酶聯(lián)免疫反應(yīng)載體的NC膜，經(jīng)過親和素-生物素復(fù)合物處理與未經(jīng)處理進(jìn)行比較，因此，本發(fā)明可廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)芯片或以膜為基片的免疫反應(yīng)體系。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1本實(shí)施例以乙型肝炎抗-HCV、抗-Core、抗-NS3、抗-NS4、抗-NS5等5種抗體的檢測(cè)為例制備蛋白質(zhì)芯片。
(a)蛋白質(zhì)芯片固相載體的制備選擇Whatman公司生產(chǎn)的孔徑0.4mm親水性NC膜，室溫下浸泡于100ug/ml、生物素占親合素活性單位1/4的親合素—生物素復(fù)合物溶液中室溫下120分鐘，pH 7.8的PBS緩沖液洗滌3次，室溫涼干。復(fù)合物中所用親合素為鏈霉親合素，生物素為長鏈生物素。
(b)蛋白質(zhì)芯片的制備用高速蛋白質(zhì)點(diǎn)樣儀將丙型肝炎5種抗體的對(duì)應(yīng)5種抗原分別點(diǎn)于上述經(jīng)親合素—生物素處理的NC膜上與未經(jīng)處理的NC膜上，每陣列16(4×4)個(gè)樣點(diǎn)。再用5％的小牛血清(BSA)封閉，室溫涼干待用。
(c)檢測(cè)將HCV陽性的血清與上述兩種NC膜進(jìn)行膜反應(yīng)，兩者最終反應(yīng)結(jié)果比較如下
表1

實(shí)施例2重復(fù)實(shí)施例1的測(cè)序，不同點(diǎn)僅在于使用了不同濃度或不同比例的親和素-生物素復(fù)合物、不同的固相載體(詳見表2)。
表2

此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)芯片的固相載體，其特征在于，在所述固相載體的表面結(jié)合有親和素-生物素的復(fù)合物，其中親和素-生物素復(fù)合物中生物素的數(shù)量為親合素活性單位的0.15-0.4。
2.如權(quán)利要求1所述的固相載體，其特征在于，所述的固相載體選自下組玻璃片、塑料片、硝酸纖維膜、PDVF膜。
3.如權(quán)利要求1所述的固相載體，其特征在于，所述的親和素-生物素的復(fù)合物的數(shù)量為5-1000ug/cm2。
4.如權(quán)利要求1所述的固相載體，其特征在于，所述的親和素選自下組卵白親和素、鏈霉親和素、及其混合物。
5.如權(quán)利要求1所述的固相載體，其特征在于，所述的生物素選自下組生物素N-羥基丁二酰亞胺酯、長臂生物素或其混合物。
6.一種權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)芯片固相載體的制備方法，其特征在于，包括步驟(a)將一固相載體浸泡于親和素-生物素復(fù)合物的溶液中，其中親和素-生物素復(fù)合物中生物素的數(shù)量為親合素活性單位的0.15-0.4；(b)用緩沖液洗滌步驟(a)的固相載體；(c)干燥步驟(b)的固相載體。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的固相載體選自下組玻璃片、塑料片、硝酸纖維膜、PDVF膜。
8.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的溶液中親和素-生物素的復(fù)合物的濃度為5-1000ug/ml。
9.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的親和素選自下組卵白親和素、鏈霉親和素、及其混合物；且所述的生物素選自下組生物素N-羥基丁二酰亞胺酯、長臂生物素或其混合物。
10.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，浸泡條件為室溫下90-150分鐘，或4℃過夜；而且干燥條件為室溫涼干或冷凍干燥。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種蛋白質(zhì)芯片的固相載體，在所述固相載體的表面結(jié)合有親和素－生物素的復(fù)合物，其中親和素—生物素復(fù)合物中生物素的數(shù)量為親合素活性單位的0.15－0.4。本發(fā)明的蛋白質(zhì)芯片固相載體可顯著降低蛋白質(zhì)點(diǎn)樣點(diǎn)的擴(kuò)散，并提高檢測(cè)靈敏度。本發(fā)明還提供了所述蛋白質(zhì)芯片固相載體的制備方法。
文檔編號(hào)G01N33/543GK1512180SQ0216050
公開日2004年7月14日 申請(qǐng)日期2002年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月27日
發(fā)明者穆海東 申請(qǐng)人:穆海東