專利名稱：：一種蓖麻毒素的蛋白質(zhì)懸浮芯片制備及定量檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種蓖麻毒素(ricin)的蛋白質(zhì)懸浮芯片制備及定量檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：蓖麻毒素(ricintoxin，以下簡(jiǎn)稱ricin)是蓖麻籽中含有的一種高毒性的糖蛋白，由A、B多肽鏈靠二辟u鍵組成的異二聚體，A鏈為效應(yīng)鏈，具有RNAN-糖苷酶活性，可使核糖體失活；B鏈為結(jié)合鏈，含有兩個(gè)半乳糖結(jié)合位點(diǎn)，介導(dǎo)A鏈進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮毒性作用。蓖麻毒素經(jīng)呼吸道吸入、消化道:f聶入和月幾肉注射均可致人中毒。人經(jīng)口致死量0.15-0.2g，靜脈注射致死量20mg,小鼠腹腔LD50約為3.0(xg/kg。蓖麻毒素毒性大，性質(zhì)穩(wěn)定，來(lái)源較廣，提取成本低廉。隨著多個(gè)恐怖組織和極端分子研制和使用荒麻毒素的消息接連進(jìn)入媒體，這種致命的、毒性極強(qiáng)的生物毒素被美國(guó)等國(guó)列為最有可能被用做恐怖襲擊的生物恐怖因子。在蓖麻毒素的快速偵檢方面，美國(guó)、歐盟等國(guó)家一直十分重視，已建立了供實(shí)驗(yàn)室和現(xiàn)場(chǎng)使用的方法如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、化學(xué)分析技術(shù)、生物傳感器技術(shù)以及膠體金免疫層析方法等；我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)也建立了檢測(cè)蓖麻毒素的ELISA和膠體金免疫層析方法及其配套診斷試劑。建立蓖麻毒素的快速定量試劑具有重要現(xiàn)實(shí)意義。同時(shí)，本發(fā)明選擇蓖麻毒素作為植物毒素的代表建立檢測(cè)模型。懸浮芯片(suspensionarray)也稱液相芯片(1iquidarray,liquidchip),是20世紀(jì)70年代美國(guó)Luminex公司研制出的新一代生物芯片技術(shù)，利用帶編碼的微球體作為栽體，流式細(xì)胞儀作為檢測(cè)平臺(tái)，對(duì)核酸、蛋白質(zhì)等生物分子進(jìn)行大規(guī);漠測(cè)定。目前，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于免疫分析、核酸研究、酶學(xué)分析、抗體篩選及受體與配體的識(shí)別分析等領(lǐng)域。懸浮芯片的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所制作的微球，包覆不同比例的紅光及紅外光發(fā)色劑，而產(chǎn)生100種不同比例顏色，作為100種獨(dú)特的色彩編號(hào)，每顆微球大小約5.5jLim,可依不同研究目的如免疫分析、核酸研究、酶分析、受體和配體識(shí)別分析等，并根據(jù)不同研究目的而標(biāo)定特定抗體、核酸探針及各種受體探針。標(biāo)記探針的微球與待測(cè)物在96孔板中進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)后，利用機(jī)器自動(dòng)將反應(yīng)液吸起并通過(guò)一微細(xì)管檢測(cè)通道，每次僅允許一個(gè)微球通過(guò)檢測(cè)通道。檢測(cè)通道中設(shè)有兩道激光，一道為紅色，激發(fā)微球基質(zhì)中的顏色，識(shí)別微球分類編碼以確定檢測(cè)項(xiàng)目；一道為綠色，激發(fā)報(bào)告分子的顏色，記錄信號(hào)強(qiáng)弱以檢測(cè)待測(cè)物的含量。當(dāng)待測(cè)樣本與特定微球的探針吸附在一起時(shí)，兩道激光所激發(fā)的光都可被檢測(cè)到。而若樣本中不含該標(biāo)的物，則僅有微球中的激發(fā)光可被檢測(cè)到。再通過(guò)機(jī)器與計(jì)算機(jī)自動(dòng)統(tǒng)計(jì)分析兩道激光所激發(fā)的微球種類與數(shù)量，從而判定待測(cè)樣本中有幾種測(cè)試目標(biāo)物在其中，得知測(cè)試樣本中有無(wú)待測(cè)病原存在，或同時(shí)存在有幾種至數(shù)十種病原。懸浮芯片技術(shù)由于利用微球在溶液中反應(yīng)，克服了片膜芯片在大分子檢測(cè)時(shí)受表面張力、空間效應(yīng)等對(duì)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的影響，同時(shí)利用激光檢測(cè)技術(shù)，大大提高了樣品檢測(cè)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，具有優(yōu)于片膜芯片的操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好等特點(diǎn)。目前發(fā)展的懸浮芯片主要是基于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法的建立和方法評(píng)價(jià)及優(yōu)化，以縮短檢測(cè)時(shí)間，降低方法的檢測(cè)成本。但是懸浮芯片是否能夠檢測(cè)植物毒素例如蓖麻毒素，是否適合從粉末、液體等樣品中快速直接檢測(cè)，其定量檢測(cè)能力如何，尚缺乏模型和評(píng)價(jià)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種蓖麻毒素(ricin)的蛋白質(zhì)懸浮芯片，同時(shí)還提供基于該芯片的蓖麻毒素的定量檢測(cè)方法。本發(fā)明的技術(shù)方案具體如下一種檢測(cè)蓖麻毒素蛋白質(zhì)懸浮芯片，該懸浮芯片包括編碼微球(例如027號(hào))，包被微球的蓖麻毒素的捕獲抗體(例如兔抗蓖麻毒素A抗體)、生物素標(biāo)記的蓖麻毒素檢測(cè)抗體(例如蓖麻毒素單抗RAC)、鏈親和素-藻紅蛋白(SA-PE)及相關(guān)緩沖溶液。一種蓖麻毒素的蛋白質(zhì)懸浮芯片檢測(cè)方法，檢測(cè)過(guò)程中全部反應(yīng)可在96孔濾板上進(jìn)行也可在微量離心管中進(jìn)行，包括下列步驟(l)每孔加入含已包被捕獲抗體編碼微球的工作溶液，用清洗液清洗；(2)加入檢測(cè)樣品，孵育后清洗；(3)加入用生物素化檢測(cè)抗體，孵育后清洗；(4)加入鏈親和素—藻紅蛋白(SA-PE)，孵育后清洗，(5)加入檢測(cè)緩沖液后混勻，(6)用懸浮芯片系統(tǒng)讀取FMI數(shù)值(平均熒光強(qiáng)度)并分析數(shù)據(jù)判定檢測(cè)結(jié)果陰性或陽(yáng)性。一種蓖麻毒素的蛋白質(zhì)懸浮芯片定量檢測(cè)方法，該方法包括下列步驟(1)加入的陽(yáng)性檢測(cè)樣品或標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)4倍梯度倍比系列稀釋，(2)制作樣品濃度對(duì)應(yīng)FMI值的劑量-反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，(3)用分析軟件擬合劑量-反應(yīng)曲線和方程，(4)未知濃度樣品可根據(jù)劑量-反應(yīng)曲線和方程判斷樣品檢測(cè)濃度，可判定方法檢測(cè)限和動(dòng)態(tài)4企測(cè)范圍。本發(fā)明人經(jīng)過(guò)大量和深入的研究，對(duì)蓖麻毒素的蛋白質(zhì)懸浮芯片制備及其檢測(cè)條件作了實(shí)質(zhì)性的優(yōu)化，其具有下列優(yōu)點(diǎn)1、抗體包被量的改進(jìn)抗體的包被量需要以檢測(cè)效果進(jìn)行優(yōu)化，懸浮芯片所需的抗體包被量很低，優(yōu)化結(jié)果為10pg/1.25x106個(gè)微球，即20-40ng/2500~5000個(gè)微球/測(cè)試，而傳統(tǒng)免疫學(xué)ELISA方法的包被量為200ng/測(cè)試。2、生物素標(biāo)記的改進(jìn)標(biāo)記抗體所用的生物素是過(guò)量的，過(guò)量的值試劑盒中有參考的計(jì)算公式。理論上講，在檢測(cè)過(guò)程中，過(guò)量的生物素因未標(biāo)記上抗體而不被微球上結(jié)合捕獲抗體的抗原連^r,清洗時(shí)被抽濾掉，不會(huì)與隨后加入的SA-PE反應(yīng)，不影響檢測(cè)。但在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中，偶爾遇到過(guò)檢測(cè)信號(hào)可能降低的現(xiàn)象，因此建議生物素標(biāo)記抗體后，盡量去除多余的生物素。3、檢測(cè)的靈敏度及動(dòng)態(tài)范圍本發(fā)明蓖麻毒素蛋白質(zhì)懸浮芯片定量檢測(cè)方法與經(jīng)典的免疫學(xué)ELISA檢測(cè)方法相比，結(jié)果有著《艮好的吻合性(相關(guān)系數(shù)112=0.9934)。同時(shí)，懸浮芯片方法靈敏度(29.lng/mL)高于ELISA方法(119ng/mL)靈敏度高4倍以上；并且懸浮芯片方法動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍(29.1-100852.lng/mL)高于ELISA方法動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍(119-58500ng/mL)2個(gè)數(shù)量級(jí)。4、方法的特異性本發(fā)明通過(guò)選用蓖麻毒素毒素為^^r測(cè)標(biāo)的抗原，分別以兔抗蓖麻毒素A抗體(RTA2-G)為捕獲抗體，以生物素化的蓖麻毒素單抗Bio-RAC檢測(cè)抗體。本研究試驗(yàn)證明，在存在肉毒毒素(B0NT)重組HIVP24抗原、牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白、胰蛋白胨、禽流感病毒HA蛋白、禽流感病毒NH蛋白等干擾抗原存在條件下本方法具有良好的特異性。5、樣品的檢測(cè)能力本發(fā)明評(píng)價(jià)了懸浮芯片方法對(duì)"白色粉末"等環(huán)境和食品樣品的檢測(cè)能力。通過(guò)對(duì)奶粉、小麥面粉、玉米淀粉、混合型果珍粉末等模擬添加樣品的檢測(cè)，初步證實(shí)了該方法在檢測(cè)可疑污染蓖麻毒素的"白色粉末"樣品中的實(shí)用性。圖1:蓖麻毒素檢測(cè)用027號(hào)微球包被捕獲抗體兔抗蓖麻毒素IgG檢測(cè)示意圖；圖2:蛋白質(zhì)懸浮芯片方法檢測(cè)蓖麻毒素劑量-反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；圖3:ELISA方法檢測(cè)蓖麻毒素的劑量-反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；圖4:蛋白質(zhì)懸浮芯片方法與ELISA方法檢測(cè)蓖麻毒素的相關(guān)性。具體實(shí)施方式本發(fā)明涉及的蓖麻毒素的蛋白質(zhì)懸浮芯片制備方法、檢測(cè)及定量方法通過(guò)下面的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明不以任何方式受該實(shí)施例的限定。一、材料1.蛋白質(zhì)懸浮芯片的相關(guān)緩沖液(1)0.03MPB緩沖液(pH7.2):2.83gNa2HP04，1.36g1([^04定容至11。(2)0.01MPB緩沖液(pH7.2):由0.03MPB緩沖液稀釋而成。(3)PBS緩沖液(pH7.4):NaCl137mmol/L;KC12.7mmol/L;Na2HP0410mmol/L;KH2P042mmol/L。用800mL蒸餾水溶解8gNaCl，0.2gKCl，1.44gNa2HP(X和0.24gKH2P04。用HC1調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4,加水至1L。分裝后在15psi(1.05kg/cm2)高壓蒸汽20分鐘，或過(guò)濾除菌，保存于室、、曰/皿。(4)微球清洗液PBS(pH7.4)，0.05%T磁N-20。(5)微球活化緩沖液IOOmMNaH2P04:3gNaH2P04，5NNaOH1.5mL,定容于250mL，pH6.2。(6)微球包被緩沖液0.05MMES，pH5.0:2.44gMES,5NNaOH0.15mL，定容于250mL。(7)微球保存液PBS-TBN:PBS,0.1%BSA，0.02%TWEEN,0.05%疊氮化物，pH7.4。(8)微球封閉液PBS-BN:PBS，1%BSA，0.05°/。疊氮化物，pH7.4。(9)檢測(cè)緩沖液PBS,1%BSA，pH7.4。(10)抗體稀釋液0.01mmol/LPB(pH7.2)。(ll)孩i球稀釋液PBS,1仰SA，pH7.4。(12)樣品稀釋液0.01MPB，pH7.2。(13)生物素化抗體稀釋液:PBS-TBN(PBS，0.簡(jiǎn)A,0.02%TWEEN-20,0.05%NaN3,pH7.4)。(14)SA-PE稀釋液:PBS(pH7.4)，1%BSA。2.抗原與抗體本發(fā)明所使用蓖麻毒素抗原為天然提純、經(jīng)蛋白層析系統(tǒng)(Sapherose4B,ProteinG柱)純化獲得。本發(fā)明所使用捕獲抗體為兔抗蓖麻毒素A抗體，由本實(shí)驗(yàn)室采用正辛酸-飽和硫酸銨提純法提取獲得；檢測(cè)抗體為生物素化蓖麻毒素單抗RCA，購(gòu)自美國(guó)Sigma7>司。二、待測(cè)樣品的制備1、目標(biāo)分析物樣品的制備本發(fā)明以蓖麻毒素作為目標(biāo)分析物樣品。干^"0樣品或作為方法特異性測(cè)試的樣品是目標(biāo)檢測(cè)物外的其它毒素或抗原蛋白質(zhì)，包括B0NT、重組HIVP24抗原、BSA、酪蛋白、胰蛋白胨、禽流感病毒HA蛋白、禽流感病毒NH蛋白等。將上述待分析樣品均溶于樣品稀釋液液中，4。C保存。蓖麻毒素的儲(chǔ)備液濃度為lmg/mL。比較實(shí)驗(yàn)中，相同樣品用于ELISA和懸浮芯片的檢測(cè)。將待分析的蓖麻毒素用樣品稀釋液以4倍倍比系列稀釋為不同濃度樣品，以繪制樣品檢測(cè)劑量-反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中幾個(gè)樣品濃度低于檢測(cè)的敏感度，高濃度樣品應(yīng)使編碼微球的結(jié)合位點(diǎn)處于飽和狀態(tài)。2、模擬污染樣品分別將0.5g奶粉、玉米淀粉、小麥面粉、速溶果珍等粉末加入到5mL樣品稀釋液中，將不同濃度的蓖麻毒素?fù)饺氲椒勰悠分?，?jīng)充分振搖混勻，靜置2h以上，使目標(biāo)分析物與待測(cè)模擬白色粉末充分吸附。再用脫脂棉、薄濾紙、厚濾紙、0.45^un濾膜濾紙過(guò)濾或低速離心(2000rpm,lmin)后，上清液作為待檢樣品進(jìn)行懸浮芯片方法的檢測(cè)。實(shí)施例l、檢測(cè)蓖麻毒素病毒的蛋白質(zhì)懸浮芯片的制備1、捕獲抗體包被編碼微球本發(fā)明采用的027號(hào)編碼微球購(gòu)自美國(guó)BI0-RAD公司，編碼微球用于標(biāo)記可以捕獲荒麻毒素的抗體，即利用兔抗蓖麻毒素A抗體包被微球。A、編碼微球的活化取100juL(1.25x106個(gè))編碼微球到1.5mL離心管中，l徹0g離心，小心吸出并棄去上清液。加入100iiiL的微球清洗緩沖液懸浮，震蕩并超聲后14000g離心，小心吸出并棄去上清液。加入100jaL的微球活化緩沖液，接著先加入10ML新鮮配置的EDC(50mg/mL),再加入10iuL新鮮配置的50mg/mL的氨基活性的生物素(生物素-LC-hydrazide)或羧基活性的生物素(即Sulfo-NHS-生物素，SH-活性的生物素)，在室溫震搖20分鐘。加入150jaL的PBS(pH7.4)，震蕩后，14000g離心，小心吸出并棄去上清液。加入100jnL的PBS(pH7.4)懸浮編碼微球。B、用抗體包被編碼微球取捕獲抗體兔抗蓖麻A抗體4-50|ig加入到活化后的編碼微球中，用PBS緩沖液定容至500|aL,室溫震搖2小時(shí)。14000g離心，小心吸出并棄去上清液。用500|iL的PBS緩沖液洗一次，14000g離心，小心吸出并棄去上清液。加入250iaL的封閉緩沖液懸浮編碼孩i球，在室溫震搖30分鐘，14000g離心，小心吸出并棄去上清液。加入500HiL的微球保存液洗滌編碼微球，16000g離心，小心吸出并棄去上清液。最后用150juL的微球保存液懸浮編碼微球，于4'C避光保存?zhèn)溆?。C、包被微球的計(jì)數(shù)吸取適量微球，稀釋后，用血球計(jì)數(shù)板(O.10mm;l/400mm2)在普通顯微鏡下計(jì)數(shù)。根據(jù)公式(每個(gè)大格數(shù)x104x稀釋倍數(shù)x體積(mL))計(jì)算微球數(shù)量。2、檢測(cè)抗體標(biāo)記生物素A、生物素的標(biāo)記分別配制好濃度為10mM生物素(Biotin)溶液和2mg/mL的待標(biāo)記抗體溶液，將計(jì)算好體積的生物素加入到待標(biāo)記抗體溶液中，在室溫震搖30分鐘(或水上2小時(shí))，過(guò)柱脫鹽后分裝，-20"凍存?zhèn)溆?。B、抗體用量計(jì)算以標(biāo)記2mg/mL的IgG(免疫球蛋白，分子量150，000)lmL溶液為例，需加入IOmM生物素溶液約27|il。計(jì)算過(guò)程如下2mgIgG1mmolIgG20mmoiB她n___..丄.1mllgGx~-^——x-=0.000266mmolBiot,n1mlIgG150,000mgIgG1mmolIgG1,000000L0.000266mmolBiotln——^——-=26.6y舊iotinReagentL.10mmolC、生物素化抗體的優(yōu)化選擇用ELISA方法對(duì)生物素化抗體進(jìn)行質(zhì)量控制，方法如下1)用抗原包被ELISA96孔板每孔加入50yL，4。C靜止過(guò)夜；2)加入封閉液(含5%BSA的PBS溶液)在37。C封閉lh;3)洗液(含0.5%Tween20的PBS)洗3次，拍干；4)加入生物素化的抗體，每孔50|iL,室溫力文置30min;5)洗液洗3次，拍干；6)加入適量SA/HRP(辣根酶標(biāo)記鏈霉親和素)，5(^L/孔，室溫放置30min;7)洗液洗3次，拍干；8)加入TMB顯色液(可溶型單組分TMB底物溶液)顯色，50)aL/孔，室溫;故置10min;9)最后用2MH2S04終止反應(yīng)。應(yīng)用酶標(biāo)4義測(cè)讀A450nm凄史值。結(jié)果判定若陰性對(duì)照孔出現(xiàn)很淡藍(lán)色，陽(yáng)性孔顏色很深，則生物素化抗體可使用；否則,需重新進(jìn)行新一4侖抗體的生物素化標(biāo)記。實(shí)施例2、懸浮芯片制備法條件的優(yōu)化1、微球包被抗體及抗體包被量的選擇分別以4pg、8pg、lOjig、16pg、24^g、40pg、48pg的量包被lOOpL編碼為027號(hào)的微球。經(jīng)檢測(cè)效果比較，以25x106個(gè)微球即20-40ng/2500"5000個(gè)微球/測(cè)試包被效果最好，顯微鏡下計(jì)數(shù)后避光冷藏保存待用。如圖1所示，包^^兔抗蓖麻毒素A抗體的027號(hào)孩O求均落在其正確檢測(cè)區(qū)域內(nèi)，并且獲得高信噪比結(jié)果(MFI值遠(yuǎn)大于2000),說(shuō)明優(yōu)化的懸浮芯片檢測(cè)系統(tǒng)可成功用于蓖麻毒素檢測(cè)。2、生物素化抗體的優(yōu)化本發(fā)明分別用氨基活性的生物素(生物素-LC-hydrazide)和羧基活性的生物素(即Sulfo-NHS-生物素，SH-活性的生物素)標(biāo)記4企測(cè)抗體，經(jīng)質(zhì)控過(guò)程檢測(cè)效果比較，本實(shí)驗(yàn)中SH-活性的生物素標(biāo)記檢測(cè)抗體^企測(cè)效果較好，檢測(cè)效果的方法采用本領(lǐng)域的常規(guī)方法或安裝制造商的產(chǎn)品說(shuō)明書所述的方法。本發(fā)明人經(jīng)過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)2mg/mL生物素化的抗體以1:50稀釋作為檢測(cè)抗體進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示生物素化檢測(cè)抗體Bio-RCA可獲得高檢測(cè)值和低背景值的檢觀'J效果。實(shí)施例3、懸浮芯片樣品制備、檢測(cè)及結(jié)果判定1、待測(cè)樣品制備用樣品稀釋液將待測(cè)樣本配置為不同濃度樣本進(jìn)行蛋白質(zhì)懸浮芯片檢測(cè)。2、樣品的檢測(cè)及結(jié)果判定檢測(cè)過(guò)程全部反應(yīng)均在96孔濾板上進(jìn)行，檢測(cè)過(guò)程如下1)每孔加入50juL含相應(yīng)編碼樣iJ求的工作溶液，用清洗液洗滌并用真空泵抽濾；2)加入50pL檢測(cè)樣品，混勻后室溫避光震搖30分鐘，用清洗液洗滌并抽濾；3)加入50iaL適當(dāng)濃度的用抗體稀釋液稀釋后的生物素化抗體，混勻后室溫避光震搖30分鐘，洗液洗滌并真空泵抽濾；4)加入50uL的SA-PE，混勻后室溫避光震搖IO分鐘。洗液洗滌并真空泵抽濾；5)加入125iaL的檢測(cè)緩沖液，經(jīng)蝸旋重懸混勻；6)用懸浮芯片系統(tǒng)讀取FMI數(shù)值并分析數(shù)據(jù)。3、檢測(cè)結(jié)果判定根據(jù)試驗(yàn)研究結(jié)果與相關(guān)研究報(bào)道，本發(fā)明定義蛋白質(zhì)懸浮芯片方法檢測(cè)蓖麻毒素的最低檢出限(L0D值)為檢測(cè)熒光強(qiáng)度臨界值(Cutoff)對(duì)應(yīng)的檢測(cè)物濃度。其中，Cutoff的定義是采用空白對(duì)照樣品(Blank)熒光檢測(cè)信號(hào)MFI均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差(SD),即Cutoff值為=MFI歸+3xSD。若檢測(cè)結(jié)果高于L0D對(duì)應(yīng)焚光強(qiáng)度值則判定為蓖麻毒素檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性；若檢測(cè)結(jié)果低于L0D對(duì)應(yīng)熒光強(qiáng)度值則判定為蓖麻毒素檢測(cè)結(jié)果陰性。實(shí)施例4、懸浮芯片對(duì)蓖麻毒素抗原的特異性檢測(cè)應(yīng)用懸浮芯片檢測(cè)方法分別對(duì)BONT、重組HIVP24抗原、BSA、酪蛋白、胰蛋白胨、禽流感病毒HA蛋白、禽流感病毒NH蛋白等進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)實(shí)施例3中檢測(cè)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，僅蓖麻毒素抗原為陽(yáng)性，其余干擾抗原均為陰性。說(shuō)明本發(fā)明所建立的蓖麻毒素抗原蛋白質(zhì)懸浮芯片檢測(cè)方法與其它測(cè)試抗原均不發(fā)生交叉反應(yīng)或非特異反應(yīng)。實(shí)施例5、懸浮芯片定量檢測(cè)模型的建立1、蓖麻毒素抗原標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品制備用樣品稀釋液將蓖麻毒素標(biāo)準(zhǔn)品由234iug/mL以4倍倍比梯度稀釋至3.56ng/mL成系列濃度樣品。同時(shí)，相同樣品用于ELISA方法;險(xiǎn)測(cè)。2、劑量-反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制按照實(shí)施例3中的檢測(cè)方法檢測(cè)上述系列濃度樣品，并根據(jù)懸浮芯片系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果繪制劑量-反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖2所示)。其中，X軸代表抗原的濃度(ng/mL),Y軸代表懸浮芯片儀檢測(cè)的熒光值(MFI)。每個(gè)數(shù)據(jù)代表3次的檢測(cè)結(jié)果平均值，坐標(biāo)軸以對(duì)數(shù)-對(duì)數(shù)關(guān)系設(shè)定。懸浮芯片系統(tǒng)根據(jù)檢測(cè)結(jié)果擬合蓖麻毒素劑量-反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程FI=22.9039+(10162.2-22.9039)/[1+(Conc/23169.6)—170,]。.5580673、懸浮芯片檢測(cè)蓖麻毒素抗原的靈敏度和動(dòng)態(tài)范圍根據(jù)最低檢出限定義和劑量-反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，本發(fā)明即蛋白質(zhì)懸浮芯片方法檢測(cè)蓖麻毒素抗原的靈敏度為29.lng/mL(Cutoff=40.28,Blank=26.0，SD=4,76)。本發(fā)明定義最高檢出限為使編碼微球的結(jié)合位點(diǎn)處于飽和狀態(tài)的檢測(cè)物濃度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線隨著蓖麻毒素濃度的升高，其對(duì)應(yīng)的MFI值也隨之遞增，當(dāng)蓖麻毒素濃度超過(guò)100852.Ing/mL時(shí)，抗原抗體的免疫反應(yīng)達(dá)到飽和狀態(tài)，MFI值開(kāi)始進(jìn)入平臺(tái)期，說(shuō)明樣品中的待檢物濃度過(guò)高，需要將樣品稀釋后再檢測(cè)。因此，根據(jù)最低檢出限與最高檢出限可以判定本發(fā)明即懸浮芯片定量檢測(cè)蓖麻毒素抗原的動(dòng)態(tài)范圍為29.1~100852.lng/mL。實(shí)施例6、蛋白質(zhì)懸浮芯片方法與ELISA方法檢測(cè)蓖麻毒素的比較1、雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法作為對(duì)這，采用包括下列步驟的雙抗體夾心ELISA4企測(cè)1)向普通ELISA微孔板每孔加入50jaL用PB緩沖液稀釋的捕獲抗體5-50ng，4。C靜止過(guò)夜；2)加入封閉液，在37。C封閉2小時(shí)；3)洗液洗3次，拍干；4)加入檢測(cè)樣品，每孔50^L，室溫放置40分鐘；洗液洗3次，拍干；5)加入適量生物素化檢測(cè)抗體，每孔50pL，室溫放置30分鐘；洗液洗3次，拍干；6)加入適量SA/HRP(辣才艮酶標(biāo)記鏈霉親和素)，50pL/孔，室溫》t置3分鐘；洗液洗3次，拍干；7)加入TMB顯色液(可溶型單組分TMB底物溶液)顯色，50pL/孔，室溫放置10分鐘；8)用2MH2S(U冬止反應(yīng)；9)應(yīng)用酶標(biāo)儀測(cè)讀A45^數(shù)值。2、樣品的懸浮芯片檢測(cè)方法1)每孔加入50ml含相應(yīng)編碼纟鼓球的工作溶液，洗液洗滌并用真空泵抽濾2次；2)加入50jLiL檢測(cè)樣品，混勻后室溫避光震搖30分鐘，用清洗液洗滌并抽濾3次；3)加入50uL適當(dāng)濃度的用抗體稀釋液稀釋后的生物素化抗體，混勻后室溫避光震搖30分鐘，洗液洗滌并真空泵抽濾3次；4)加入50iaL的SA-PE，混勻后室溫避光震搖10分4中。用清洗液洗滌并真空泵抽濾3次；5)加入125jnL的檢測(cè)援沖液，經(jīng)蝸旋重懸混勻；6)用Bio-Plex懸浮芯片系統(tǒng)讀取FMI數(shù)值并分析凄t據(jù)。3、兩種檢測(cè)方法的靈敏度和動(dòng)態(tài)范圍及相關(guān)性的比較實(shí)施例5中制備的相同一組蓖麻毒素樣品同時(shí)應(yīng)用懸浮芯片和ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)。繪制ELISA方法檢測(cè)蓖麻毒素抗原的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2和3中橫坐標(biāo)為樣品濃度，縱坐標(biāo)為吸光度值，坐標(biāo)軸取對(duì)數(shù)-對(duì)數(shù)關(guān)系)，并與實(shí)施例5中懸浮芯片方法結(jié)果進(jìn)行比較。根據(jù)兩種方法標(biāo)準(zhǔn)曲線懸浮芯片方法(如圖2所示)靈敏度為29.lng/mL，線性沖企測(cè)范圍29.1~100852.lng/mL;ELISA方法(如圖3所示)靈敏度為119ng/mL，線性檢測(cè)范圍119-58500ng/mL。可以得出結(jié)論檢測(cè)相同蓖麻毒素抗原樣品，蛋白質(zhì)懸浮芯片方法比ELISA方法具有更高的檢測(cè)靈敏度，即高4倍；并且具有更寬的動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍，即高2個(gè)數(shù)量級(jí)。另外，將兩種方法檢測(cè)結(jié)果在119-58500ng/mL范圍內(nèi)進(jìn)行比較(如圖4所示)可以判定蛋白質(zhì)懸浮芯片方法與ELISA方法有良好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為0.9934。實(shí)施例7、人工污染"白色粉末"樣品的檢測(cè)1、人工污染"白色粉末"樣品的制備將一定含量的蓖麻毒素或空白(樣品稀釋液)依照不同濃度分別摻入奶粉、淀粉、面粉、速溶果珍等粉末樣品制備人工污染樣品。將0.5g粉末加入到5mL樣品稀釋緩沖液中，充分混勻，靜置2小時(shí)，讓待測(cè)樣品與白色粉末充分吸附。2、人工污染"白色粉末"樣品的檢測(cè)對(duì)上述被污染的"白色粉末"樣品進(jìn)行處理，選用棉花、薄濾紙、厚濾紙、0.45pm濾膜、0.22pm濾膜過(guò)濾，以及2000rpm、5分鐘和1000rpm、4分鐘低速離心等方法處理人工添加樣品后的粉末溶液，收集濾液或上清液后按照實(shí)施例進(jìn)行懸浮芯片分析檢測(cè)。表1懸浮芯片對(duì)人工污染"白色粉末"樣品的檢測(cè)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>注+代表;^r測(cè)結(jié)果陽(yáng)性；~^表檢測(cè)結(jié)果陰性根據(jù)所檢測(cè)的18個(gè)樣品中，檢測(cè)結(jié)果(如表1所示)全部正確，初步證明了蛋白質(zhì)懸浮芯片方法可以快速、準(zhǔn)確、高效地應(yīng)用于蓖麻毒素污染的"白色粉末，，樣品的實(shí)際檢測(cè)工作。權(quán)利要求1、一種采用蛋白質(zhì)懸浮芯片檢測(cè)蓖麻毒素的方法，其特征在于，檢測(cè)過(guò)程中全部反應(yīng)可在96孔濾板或者微量離心管中進(jìn)行，該方法包括下列步驟(1)向孔加入含已包被捕獲抗體編碼微球的工作溶液，用清洗液清洗；(2)加入待測(cè)樣品，孵育后清洗；(3)加入用生物素化的檢測(cè)抗體，孵育后清洗；(4)加入SA-PE，孵育后清洗；(5)加入檢測(cè)緩沖液后混勻；(6)用懸浮芯片系統(tǒng)讀取平均熒光強(qiáng)度(FMI)數(shù)值并分析數(shù)據(jù)判定檢測(cè)結(jié)果。2、如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，用于包被微球的捕獲抗體為抗荒麻毒素A抗體，采用生物素標(biāo)記的抗蓖麻毒素A抗體作為4企測(cè)抗體，并且其組合組成檢測(cè)體系。3、如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述的包被微球的捕獲抗體兔抗蓖麻毒素A抗體用量為10pg/1.25xio6個(gè)編碼孩t球或20-40ng/2500"5000個(gè)纟鼓5求/測(cè)試。4、如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述方法中的標(biāo)記檢測(cè)抗體蓖麻毒素單抗RCA的生物素為羧基活性的生物素。5、如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，2mg/mL生物素化的檢測(cè)抗體Bio-RCA以l:50—1:1000稀釋作為檢測(cè)抗體進(jìn)行檢測(cè)。6、一種定量檢測(cè)蓖麻毒素的蛋白質(zhì)懸浮芯片方法，其特征在于，該方法包括下列步驟(1)加入的陽(yáng)性檢測(cè)樣品或標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)梯度倍比稀釋，所述梯度倍比稀釋為4倍；(2)將系列稀釋樣品在懸浮芯片系統(tǒng)中檢測(cè)讀取對(duì)應(yīng)熒光值(MFI);(3)制作樣品濃度對(duì)應(yīng)MFI值的劑量-反應(yīng)曲線；(4)用分析軟件擬合劑量-反應(yīng)曲線和方程；(5)未知濃度樣品可根據(jù)劑量-反應(yīng)曲線和方程判斷未知樣本中蓖麻毒素濃度。7、如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，用于包被微球的捕獲抗體為兔抗蓖麻毒素A抗體，采用生物素標(biāo)記的蓖麻毒素單抗RCA作為4企測(cè)抗體，并且其組合組成檢測(cè)體系。8、如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的包被微球的捕獲抗體兔抗蓖麻毒素A抗體用量為10jLig/1.25xio6個(gè)編碼微球或20-40ng/2500~5000個(gè)微球/測(cè)試。9、如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法中的標(biāo)記檢測(cè)抗體蓖麻毒素單抗RCA的生物素為氣基活性的生物素。10、如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，2mg/mL生物素化的檢測(cè)抗體Bio-RCA以1:50—1:1000稀釋作為檢測(cè)抗體進(jìn)行檢測(cè)。11、一種檢測(cè)荒麻毒素的蛋白質(zhì)懸浮芯片，其特征在于包括編碼微球，包被微球的蓖麻毒素的捕獲抗體、生物素標(biāo)記的蓖麻毒素檢測(cè)抗體、鏈親和素—藻紅蛋白及所述的緩沖溶液。12、權(quán)利要求ll所述的蛋白質(zhì)懸浮芯片，其特征在于用于包被微球的捕獲抗體為抗蓖麻毒素A抗體，采用生物素標(biāo)記的抗蓖麻毒素抗體作為才企測(cè)抗體，并且其組合組成纟企測(cè)體系。全文摘要本發(fā)明涉及一種蓖麻毒素(ricin)蛋白質(zhì)懸浮芯片的其制備方法、檢測(cè)方法及定量方法。檢測(cè)方法的具體步驟向孔加入工作溶液和待測(cè)樣品；加入檢測(cè)抗體；加入SA-PE；加入檢測(cè)緩沖液后混勻；讀取數(shù)值并分析數(shù)據(jù)判定檢測(cè)結(jié)果。定量方法的步驟為加入陽(yáng)性檢測(cè)樣品或標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)梯度倍比稀釋，將系列稀釋樣品在懸浮芯片系統(tǒng)中檢測(cè)讀取對(duì)應(yīng)熒光值(MFI)；制作劑量-反應(yīng)曲線；擬合劑量-反應(yīng)曲線和方程。懸浮芯片包括編碼微球，包被微球的蓖麻毒素的捕獲抗體、生物素標(biāo)記的蓖麻毒素檢測(cè)抗體、鏈親和素-藻紅蛋白及所述的緩沖溶液。本發(fā)明的方法檢測(cè)能力好、靈敏度高、特異性強(qiáng)、動(dòng)態(tài)范圍寬。文檔編號(hào)G01N33/569GK101545905SQ20091008025公開(kāi)日2009年9月30日申請(qǐng)日期2009年3月17日優(yōu)先權(quán)日2009年3月17日發(fā)明者孫肖紅,宇楊,靜王,王景林,胡孔新申請(qǐng)人:中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院