專利名稱：促卵泡激素的液體制劑的制作方法
促卵泡激素的液體制劑本發(fā)明涉及包含促卵泡激素多肽和作為防腐劑的苯扎氯銨和苯甲醇的液體藥物 組合物。組合物還任選地包含一種或多種其他的可藥用賦形劑。在一個實施方案中，組合 物含有作為抗氧化劑的甲硫氨酸。組合物表現(xiàn)出良好的儲藏穩(wěn)定性，并且特別用于其中促 卵泡激素制劑被視為有效療法的病癥和醫(yī)學(xué)適應(yīng)癥的預(yù)防和治療。促卵泡激素(FSH)由垂體前葉的促性腺激素細胞產(chǎn)生并釋放到循環(huán)系統(tǒng)中。FSH 與促黃體激素(LH) —同控制女性的卵母細胞成熟和男性的精子發(fā)生。FSH和LH都屬于由 2個非共價連接的由不同基因編碼的α-和鏈組成的異源二聚體糖蛋白家族。α-和 β-鏈都是糖基化的。α-亞基由92個氨基酸殘基組成，而β-亞基由111個氨基酸殘基 組成，它們各自都有2個潛在的連接天冬酰胺的糖基化位點。 人FSH用于治療不排卵的女性、用于刺激多卵泡發(fā)生(超數(shù)排卵)和用于例如 IVF、ICSI、GIFT或CIFT的輔助受孕的制劑。此外，人FSH用于刺激FSH生成量低或不產(chǎn)生 FSH的女性的卵泡成熟和用于刺激患有先天的或后天的低促性腺素性功能減退癥的男性的 精子發(fā)生。直到20世紀80年代，人FSH的主要來源是從孕齡婦女的尿液分離出來的尿源 FSH0在20世紀90年代引入了高純度的尿源FSH的進一步純化的形式，并且最終從1998 年起開發(fā)出重組FSH并得到廣泛應(yīng)用。隨著重組DNA技術(shù)的出現(xiàn)，在被編碼α-和β-鏈 的核酸序列轉(zhuǎn)染的細胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)人FSH成為可能。在例如WO 88/10270、W0 86/04589 和EP 0 735 139中已經(jīng)公開了編碼α-和β -鏈的DNA序列以及生產(chǎn)重組FSH的方法。目前，在德國市場上有兩種商品化的重組人FSH產(chǎn)品，GONAL-f @和Puregon ，兩 者都是通過在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中表達編碼人野生型α-和β-鏈的DNA序列來生 產(chǎn)的。通常，蛋白質(zhì)的半衰期非常短，并且當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)暴露于各種因素(例如不適宜蛋白 質(zhì)活性表達的溫度、水、空氣界面、高壓、物理/機械脅迫、有機溶劑和微生物污染)時，其發(fā) 生變性，例如單體的聚集、二聚體的解離、和吸附在容器表面上。因此，變性蛋白喪失了內(nèi)在的物理化學(xué)性質(zhì)和生理活性作用。蛋白質(zhì)的變性是不 可逆的，因此，蛋白質(zhì)一旦變性就幾乎不能恢復(fù)其天然的性質(zhì)而回到初始狀態(tài)。具體地講，具有由2個不同亞基組成的異源二聚體結(jié)構(gòu)并且每次以低于幾百微克 的痕量進行給藥的蛋白質(zhì)(例如人FSH)遭受了與相對高的蛋白損失有關(guān)的問題，包括因在 水溶液中二聚體離解和蛋白質(zhì)吸附在容器內(nèi)表面上而引起的蛋白損失。離解的蛋白質(zhì)喪失 了其自身的生理活性，并且離解的單體非常易于聚集。而且，吸附在容器內(nèi)表面上的蛋白質(zhì) 也非常容易通過變性過程聚集。當(dāng)將其向人體給藥時，如此變性的蛋白質(zhì)可以成為形成對 抗體內(nèi)天然存在的蛋白質(zhì)的抗體的誘因。某些蛋白藥物制劑已經(jīng)通過冷凍干燥(凍干)克服了穩(wěn)定性問題。雖然這 些凍干制劑足夠穩(wěn)定以致能保證足夠的半衰期，但是其具有在給藥前必須進行重構(gòu) (reconstitution)的缺點。因此，患者在使用前必須在溶劑(例如注射用水)中重構(gòu)干燥 的糖蛋白，這對于患者而言是缺點和不方便。此外，必須與FSH的凍干制劑一起提供溶劑。對于需要有規(guī)律地注射FSH的患者，例如為了誘導(dǎo)排卵而接受每日劑量的重組人FSH的患 者，促性腺素制劑的易于處理、給藥和注射是重要的。凍干的促性腺素制劑的重構(gòu)要謹慎和 小心，并且如果可能的話應(yīng)避免重構(gòu)。如果能夠生產(chǎn)這些糖蛋白并將其分裝為穩(wěn)定的溶液， 使患者無需重構(gòu)就可直接注射藥物，這將為促性腺素的使用提供便利。此外，凍干過程是費 錢和耗時的加工步驟，如果在制備促性腺素制劑時能夠避免該步驟，這將是有利的。因此，需要即時可用(ready-for-use)的注射制劑，該制劑具有足夠的穩(wěn)定性從 而保證合理的貯藏期。作為應(yīng)對這些限制的可選擇的措施，可以通過向溶液狀態(tài)的蛋白質(zhì)加入穩(wěn)定劑來 改善蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。有用的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑的實例有已知的表面活性劑、蛋白質(zhì)(例如白 蛋白)、多糖、氨基酸、聚合物、鹽等。然而，考慮到各種蛋白質(zhì)的獨特的物理化學(xué)性質(zhì)，應(yīng)該 選擇并使用最合適的穩(wěn)定劑。而且，由于不同穩(wěn)定劑之間的競爭作用和不良反應(yīng)，不同穩(wěn) 定劑的聯(lián)合使用可能帶來預(yù)想的不良副作用。此外，由于不同的穩(wěn)定劑具有特定的對穩(wěn)定 相應(yīng)蛋白質(zhì)有利的濃度范圍，存在于溶液中的蛋白質(zhì)的成功穩(wěn)定還需要認真關(guān)注和很多努 力。已經(jīng)將FSH配制成在管形瓶、筆膽(carpoule)或安瓿中的單劑量和多劑量的液體 形式。單劑量形式在使用之前的貯存中必須保持穩(wěn)定和有效。多劑量形式不僅在使用之前 的貯存中必須保持穩(wěn)定和有效，而且在安瓿開封之后的多劑量使用方案的給藥期間也必須 保持穩(wěn)定、有效和相對無菌。出于該原因，多劑量形式經(jīng)常含有抑菌劑。GONAL-f ，一種人重組FSH的即時可用的液體制劑，可用作由注射筆給藥的注射 用溶液。溶液含有作為防腐劑的間甲酚(ROTE LISTE 2007，No. 50 004)。Puregon 也可 用作即時可用的注射用液體制劑，其含有作為防腐劑的苯甲醇(ROTE LISTE 2007, No. 50 010)。含有防腐劑的FSH液體制劑也已記載于專利文獻中。國際專利申請 W0-A1-00/04913記載了包含防腐劑的FSH和FSH變體的制劑，所述的防腐劑選自苯酚、間甲 酚、對甲酚、鄰甲酚、氯甲酚、苯甲醇、對羥基苯甲酸烷基酯、苯扎氯銨、芐索氯銨、脫氫醋酸 鈉和硫柳汞。盡管這些防腐劑的使用以一般的方式被提及，但并未公開重組人FSH液體制 劑中的防腐劑的特定的組合或混合物。此外，國際專利申請WO 2004/037607涉及人FSH的水性制劑，其包含甘氨酸、甲硫 氨酸、非離子型表面活性劑和磷酸鹽緩沖液作為穩(wěn)定劑。另外，制劑可以任選地包括防腐 劑，提及的有苯甲醇、甲酚、對羥基苯甲酸酯及其混合物。國際專利申請WO 2004/087213 Al記載了 FSH的液體藥物組合物，其包含選自 Pluronic F77、Pluronic F87、Pluronic F88 和 Pluronic F68 的表面活性劑。組合物 可以進一步包含選自苯酚、間甲酚、對甲酚、鄰甲酚、氯甲酚、苯甲醇、對羥基苯甲酸烷基酯、 苯扎氯銨、芐索氯銨、脫氫醋酸鈉和硫柳汞的抑菌劑。未提及抑菌劑的混合物或組合。因此，雖然需要提供含有防腐劑的促性腺素制劑，以便制劑適合于多次給藥，但生 產(chǎn)含有人蛋白的防腐的藥物制劑已經(jīng)證明是困難的。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用防腐劑時，如果藥物 制劑貯存較長時間，其引起穩(wěn)定性問題。在該過程中，人蛋白失活并且形成團塊，這可能是 造成所觀察到的對注射溶液不耐受的原因。在活性的人蛋白成分存在的情況下，不能用通 常的方法生產(chǎn)用于輸液或注射的防腐的藥物制劑，這是因為在121°C的高壓滅菌器中的滅菌條件下活性物質(zhì)被滅活并且其結(jié)構(gòu)被破壞。也已知藥劑學(xué)中通常所用的防腐劑與有活性 的人蛋白成分發(fā)生反應(yīng)從而使之滅活。所用的防腐劑的類型對于耐受性有重要作用。所有 防腐劑都具有或高或低的過敏率。因此，為了實現(xiàn)良好的防腐，而且使與某種人糖蛋白組合 的特定的防腐劑的缺點最小化，選擇人蛋白制劑中的防腐劑是關(guān)鍵。因此，仍然迫切需要開發(fā)新的人重組FSH液體制劑，其由防腐劑進行防腐并且能 夠在延長的時間內(nèi)穩(wěn)定維持人重組FSH的活性。根據(jù)本發(fā)明，該問題和其他的問題能夠通過主權(quán)利要求的特征解決。有利的實施方案在從屬權(quán)利要求中進行定義。令人驚訝地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在包含作為活性劑的FSH或其變體和作為防腐劑的苯扎氯 銨和苯甲醇的液體藥物組合物中配制重組人FSH提供了良好的組合物穩(wěn)定性，以致其能夠 用于單劑量和多劑量用途。本發(fā)明的組合物不需冷藏就能在延長的時間內(nèi)貯存，沒有顯著 的活性損失并且沒有顯著的降解。推測作為防腐劑的苯扎氯銨和苯甲醇的組合特別有利于 與糖激素FSH組合，這是因為其提供了更好的防腐效果和確保與ras之間的不利的相互作 用保持最低水平。除非另有說明，以下定義是用來對用于描述本發(fā)明的各種術(shù)語的含義和范圍進行 舉例說明和定義。術(shù)語“FSH”是指作為全長成熟蛋白的促卵泡激素多肽，其非限制性地包括人FSH 或“hFSH”，不論其是重組生產(chǎn)的還是從人源分離得到的(例如絕經(jīng)后婦女的尿液)。技術(shù) 人員根據(jù)科學(xué)文獻和專利文獻(參見例如WO 2004/087213)可以獲知該人糖蛋白的蛋白質(zhì) 序列和人FSH β -亞基的蛋白質(zhì)序列。如本說明書所附的，人FSH的α -鏈的氨基酸序列記載于SEQ ID No. 1中，人FSH 的β-鏈的氨基酸序列記載于SEQ ID Νο.2中。這些氨基酸序列對應(yīng)于分別以登錄號J 00152記載于EMBL數(shù)據(jù)庫中和以登錄號ΝΜ_000510記載于NCBI數(shù)據(jù)庫中的人FSH的α-鏈 和β-鏈的野生型氨基酸序列。編碼人FSH的野生型核酸序列在SEQ ID No. 3 ( = α -鏈)和No. 4 ( = β -鏈) 中顯示。重組FSH可以按照如在人類中天然發(fā)現(xiàn)的野生型核酸序列編碼，或者其可以被改 變的核酸序列編碼，所述的改變的核酸序列表達產(chǎn)生具有野生型氨基酸序列的FSH，S卩，與 在人類中天然發(fā)現(xiàn)的野生型蛋白質(zhì)序列相同。例如，編碼人FSH的核酸序列能夠以這種方式發(fā)生改變?yōu)榱嗽黾釉谶@些宿主細 胞中的重組FSH的表達水平和產(chǎn)率，使編碼人FSH的α-和β -鏈的核酸序列中的一者或 兩者調(diào)整為在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中選擇使用的密碼子。編碼人FSH并且按照CHO細胞中的密碼子選擇方面進行改良的核酸序列的實例記 載于國際專利申請WO 2009/000913中。編碼人FSH的β -鏈的改良核酸序列是記載于SEQ ID No. 5中的核酸序列的編碼區(qū)(在SEQ ID No. 5中，編碼區(qū)起始于核苷酸56并且延伸到 核苷酸442)，編碼人FSH的α -鏈的改良核酸序列是記載于SEQ ID No. 6中的核酸序列的 編碼區(qū)(在SEQ ID No. 6中，編碼區(qū)起始于核苷酸19并且延伸到核苷酸366)。含有重組核 苷酸分子(其包括編碼人FSH的β-鏈的第一種改良的核酸序列和編碼人FSH的α-鏈的 第二種改良的核酸序列)的CHO細胞系以保藏號DSM ACC2833于2007年3月28日存放于在 Braunschweig 的 DSMZ0在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的FSH液體制劑含有通過由FSH核酸序列的重組基 因表達得到的重組人野生型FSH，就人FSH的β-鏈和FSH的α -鏈而言，所述的FSH核 酸序列按照CHO細胞中的密碼子選擇進行了改良。在另一個優(yōu)選的實施方案中，通過WO 2009/000913所公開的FSH核酸序列表達得到重組FSH。表述“FSH變體”是指包括與人FSH在氨基酸序列、糖基化類型或亞基間連接上有 所不同，但表現(xiàn)出FSH活性的那些分子。實例包括CTP-FSH，長效的改良的重組FSH，由野 生型α -亞基和雜合的β -亞基組成，其中hCG的羧端肽已經(jīng)與FSH的β -亞基的C末端 融合，如 LaPolt 等人在內(nèi)分泌學(xué)(Endocrinology)，131，2514-2520 (1992)中或者 Klein 等人在Human R印rod.，18，50-56 (2003)中所述的。也包括單鏈CTP-FSH，由Klein等人在 Fertility & Sterility, 77,1248-1255 (2002)中所述的單鏈分子。FSH變體的其他的實例 包括具有引入α-和/或 β-亞基的另外的糖基化位點的FSH分子，如WO 01/58493中所 公開的，和具有亞基間S-S鍵的FSH分子，如WO 98/58957中所公開的。FSH變體的其他實 例在WO 2004/087213中公開，其特征在于β-亞基的羧基端缺失。FSH變體的其他實例包 括因蛋白質(zhì)的氨基酸序列變化(其中該變化引入了另外的糖基化位點或者缺失天然存在 的糖基化位點)而與野生型FSH相比具有改變的糖基化程度的FSH分子。進一步地，本發(fā)明的FSH或FSH變體可以是已經(jīng)被化學(xué)部分修飾的FSH分子。例 如，這類FSH偶聯(lián)物可包含聚亞烷基二醇(例如PEG)、羥烷基淀粉(例如HES)或其他聚合 物部分。FSH異源二聚體或FSH變體異源二聚體能夠用任意合適的方法來生產(chǎn)，例如根據(jù) 具體情況通過重組技術(shù)生產(chǎn)、從天然來源分離或純化、或者通過化學(xué)合成，或者它們的任意組合。術(shù)語“重組”的使用是指使用重組DNA技術(shù)(參見例如WO 85/01958)生產(chǎn)的FSH 或FSH變體的制劑。有若干種的α -和β -亞基已知道FSH的基因組和cDNA克隆的序列。 用重組技術(shù)生產(chǎn)重組FSH或FSH變體的各種方法記載于現(xiàn)有技術(shù)中，參見例如歐洲專利申 請EP 0 711 894和歐洲專利申請EP 0 487 512。本發(fā)明所用的FSH或FSH變體不但可以用重組方法(包括從哺乳動物細胞、例如 中國倉鼠卵巢(CHO)細胞)來生產(chǎn)，而且可以從其他生物來源(例如從尿液來源)純化得 到?，F(xiàn)有技術(shù)中公開了可用的方法。重組人FSH可以從宿主細胞培養(yǎng)上清液通過1個或多個純化步驟純化得到。合適 的純化方法是技術(shù)人員已知的并且包括離子交換色譜法、疏水作用色譜法、羥磷灰石色譜 法、親和色譜法和凝膠過濾。純化重組人FSH的方法在例如WO 00/63248、W0 2006/051070 和 WO 2005/063811 中公開。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，F(xiàn)SH或FSH變體分別對應(yīng)于人FSH或源自人FSH。在 本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中，F(xiàn)SH或FSH變體已經(jīng)用重組技術(shù)生產(chǎn)。更優(yōu)選地，F(xiàn)SH是已經(jīng)重組生產(chǎn)的人FSH，特別優(yōu)選在用載體或包含編碼FSH的人 糖蛋白α-亞基和β-亞基(由SEQ ID No. 3和4(=野生型核酸序列)或者由SEQ ID No. 5和6(=密碼子優(yōu)化的核酸序列)編碼)的DNA的載體轉(zhuǎn)染的中國倉鼠卵巢細胞中生 產(chǎn)。編碼α-和β-亞基的DNA可以存在于相同或不同的載體上。
7
重組FSH與其來自尿液的對應(yīng)物相比具有若干優(yōu)點。使用重組細胞的培養(yǎng)和分離 技術(shù)保證批次間的一致性。相反地，不同批次的尿液的FSH在亞基的純度、糖基化類型、唾 液酸化作用和氧化方面差別巨大。由于重組FSH具有更好的批次間一致性和純度，該激素 可使用例如等電聚焦法(IEF)的技術(shù)容易地進行定性和定量。能夠容易地對重組FSH進行 定性和定量允許按激素重量填充管形瓶，而不是按生物測定來填充。術(shù)語“FSH活性”是指FSH制劑引發(fā)與FSH相關(guān)的生物響應(yīng)的能力，例如女性患者 體內(nèi)的在 Steelman-Pohley 檢驗(Steelman 等人(1953)內(nèi)分泌學(xué)(Endocrinology) 53， 604-616)中的卵巢重量增加或者卵泡生長。通過超聲能夠評估女性患者體內(nèi)的卵泡生長， 例如根據(jù)在刺激第8天平均直徑為約16mm的卵泡的數(shù)量。用針對FSH的可接受的標(biāo)準評 估生物活性。術(shù)語“水性稀釋劑”是指含水的液體溶劑。水性溶劑系統(tǒng)可以僅由水組成，或者可 以由水加上1種或多種可混溶的溶劑組成，并且可以含有溶解的溶質(zhì)，例如糖、緩沖劑、鹽 或其他賦形劑。更常用的非水溶劑是短鏈有機醇(例如甲醇、乙醇、丙醇)、短鏈酮(例如丙 酮)和多元醇(例如甘油)。在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中，水性稀釋劑是水，即，本發(fā)明的 即時可用的液體制劑是水性制劑?！皬埩φ{(diào)節(jié)劑”或“等滲劑”是身體上耐受的并且為制劑賦予適當(dāng)?shù)膹埩亩乐?穿過與制劑接觸的細胞膜的水的凈流量。合適的等滲劑非限制性地包括甘油、氨基酸或蛋 白質(zhì)(例如甘氨酸或白蛋白)、鹽(例如氯化鈉)、糖(例如右旋糖、蔗糖、海藻糖和乳糖) 和糖醇(例如甘露醇和山梨醇)。術(shù)語“抑菌的”或“抑菌劑”或“防腐劑”是指加入到制劑中的用作抗菌劑的成分或 物質(zhì)。本發(fā)明的含F(xiàn)SH或FSH變體的防腐制劑優(yōu)選符合對于防腐效果的法律或法規(guī)，從而 成為在商業(yè)上可行的多用途產(chǎn)品，優(yōu)選用于人。用于本發(fā)明的制劑的抑菌劑是苯扎氯銨和苯甲醇的組合。雖然組合物中可能包 括其他防腐劑(即，除了苯扎氯銨和苯甲醇之外)，例如苯酚、間甲酚、對甲酚、鄰甲酚、氯甲 酚、對羥基苯甲酸烷基酯(甲基、乙基、丙基、丁基等)、芐索氯銨、脫氫醋酸鈉或硫柳汞，但 優(yōu)選僅有苯扎氯銨和苯甲醇作為防腐劑存在。術(shù)語“緩沖劑”或“生理上可接受的緩沖劑”是指制劑中已知安全的藥用或獸醫(yī)用 的并且具有維持或控制制劑的PH在制劑所需的pH范圍內(nèi)的作用的化合物溶液。用于控制 PH在適度酸性的pH至適度堿性的pH的可接受的緩沖劑非限制性地包括諸如磷酸鹽、醋酸 鹽、檸檬酸鹽、精氨酸、三羥甲基氨基甲烷和組氨酸的化合物。優(yōu)選的緩沖劑是磷酸鹽緩沖 劑。術(shù)語“磷酸鹽緩沖劑”是指調(diào)整到需要的pH的含有磷酸或其鹽的溶液。通常，磷 酸鹽緩沖劑是由磷酸或磷酸的鹽(其非限制性地包括鈉鹽和鉀鹽)制成的。一些磷酸鹽是 本領(lǐng)域已知的，例如酸的鈉和鉀一價、二價和三價鹽。磷酸的鹽也已知以存在的鹽的水合物 存在。磷酸鹽緩沖劑可以覆蓋例如約PH4至約pHIO的pH范圍，優(yōu)選的范圍是約pH 5至約 PH 9，最優(yōu)選的pH范圍是約6.0至約8.0，最優(yōu)選是pH 7. 0或約pH 7.0。在優(yōu)選的實施方 案中，緩沖系統(tǒng)僅由磷酸鹽緩沖劑組成，即，制劑中除了磷酸鹽之外不存在其他緩沖劑。術(shù)語“管形瓶”寬泛地指適合于以液體形式在無菌狀態(tài)保存FSH的容器。本文所 用的管形瓶的實例包括安瓿、藥筒、泡罩包裝或其他適合于通過注射器、泵(包括滲透泵)、導(dǎo)管、透皮貼劑、肺或跨粘膜噴霧劑向患者遞送FSH的貯庫。適合于包裝胃腸外、肺、跨粘膜 或經(jīng)皮給藥的產(chǎn)品的管形瓶是本領(lǐng)域熟知和公認的。術(shù)語“穩(wěn)定性”是指本發(fā)明的制劑中的FSH的物理、化學(xué)和構(gòu)象的穩(wěn)定性(包括 生物活性的保持)。蛋白制劑的不穩(wěn)定性可能由蛋白質(zhì)分子的化學(xué)降解或聚集從而形成更 高數(shù)量級的聚合物引起，由異源二聚體離解成單體、去糖基化、糖基化修飾、氧化(特別是 α -亞基的氧化)或任何其他降低本發(fā)明所包括的FSH多肽的至少1種生物活性的結(jié)構(gòu)變 化導(dǎo)致?！胺€(wěn)定的”溶液或制劑或藥物組合物是指其中蛋白質(zhì)的降解程度、修飾、聚集、生物 活性喪失等受到可接受地控制，并且不會隨著時間而發(fā)生不可接受地增加。優(yōu)選地，制劑保 留至少80%或約80%的FSH活性并且在約2-8°C的溫度下保持至少6個月時間。通過使用 Steelman-Pohley卵巢增重生物檢定法能夠測量FSH活性。術(shù)語“治療”是指對需要以刺激卵巢或睪丸或者由FSH調(diào)節(jié)的任何其他生理反應(yīng) 為目的而施用FSH的患者進行給藥、隨訪、管理和/或照料。因此，治療可以非限制性地包 括為了誘導(dǎo)或改善精子質(zhì)量、刺激男性體內(nèi)的睪酮釋放或女性體內(nèi)的卵泡發(fā)育或誘導(dǎo)排卵 而施用FSH。用語“多劑量給藥”或“多劑量使用”是指包括用于1次以上注射(例如2、3、4、5、 6或更多次注射)的FSH制劑的單個管形瓶、安瓿、筆膽或藥筒的使用。優(yōu)選在至少約12個 小時、24個小時、48個小時等的時間內(nèi)、優(yōu)選多達約12天的時間內(nèi)進行注射。可以間隔時 間進行注射，例如間隔6、12、24、48或72小時。發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過將FSH或FSH變體與作為防腐劑的苯扎氯銨和苯甲醇二者進 行配制，得到了表現(xiàn)出高的蛋白穩(wěn)定性同時具有良好防腐作用的制劑。而且，人們認為本發(fā) 明的FSH制劑組合物與本領(lǐng)域中已知的FSH制劑相比表現(xiàn)出改進的局部耐受性(例如在注 射點沒有刺激)。苯扎氯銨優(yōu)選以足以在需要的貯藏期(例如6至12至24個月)內(nèi)維持FSH穩(wěn)定 性并且足以防止細菌生長的濃度存在于制劑中。優(yōu)選地，本發(fā)明的液體制劑中的苯扎氯銨的濃度為約0. 005mg/ml至約0. 05mg/ ml、更優(yōu)選為約 0. 01mg/ml 至約 0. 04mg/ml、最優(yōu)選為 0. 02mg/ml 或約 0. 02mg/ml (0. 002% (w/v))。苯甲醇優(yōu)選以足以在需要的貯藏期(例如6至12至24個月)內(nèi)維持FSH穩(wěn)定性 并且足以防止細菌生長的濃度存在于制劑中。優(yōu)選地，本發(fā)明的液體制劑中的苯甲醇的濃度為約0. 5mg/ml至約20. Omg/ml、更 優(yōu)選為約1. Omg/ml至約15. Omg/ml、更特別優(yōu)選為約5. Omg/ml至約12. Omg/ml、最優(yōu)選為 10. Omg/ml 或約 10. Omg/ml (1. 0% (w/v))。本發(fā)明的液體制劑之中的促卵泡激素(FSH)的濃度優(yōu)選為約150IU/ml至約 2，000IU/ml、更優(yōu)選為約300IU/ml至約1，500IU/ml、更特別優(yōu)選為約450IU/ml至約 750IU/ml、最優(yōu)選為 600IU/ml 或約 600IU/ml。重組FSH的體內(nèi)生物比活性通常在約8，OOOIU FSH/mg蛋白質(zhì)至約16，OOOIU FSH/ mg蛋白質(zhì)的范圍。例如，可從商業(yè)上購買到的產(chǎn)品Puregon(來自O(shè)rganon)中的重組人FSH 具有約10，OOOIE/mg蛋白質(zhì)的生物比活性，而對于來自Serono的Gonal-f，重組人FSH的生
9物活性為約13，600IE/mg蛋白質(zhì)。通過與FSH和其他促性腺素相關(guān)的已知方法可以測定FSH活性。這些方法包括例 如酶免疫測定法(EIA)或報道基因測定法。通常用歐洲藥典第5版中所述的源自尿液的 FSH的生物檢定法來測定生物活性。在這一過程中，通過將FSH增大用絨促性素處理的未成 熟大鼠的卵巢的效果與標(biāo)準制劑的同樣效果相比較來評價生物活性。本發(fā)明的液體藥物組合物中的FSH或FSH變體的濃度通常在10至200 μ g/ml的 范圍。如果組合物是用于多用途給藥(例如通過使用注射筆)，F(xiàn)SH或FSH變體的可用濃度 將在30至150yg/ml的范圍、優(yōu)選在40至100yg/ml的范圍。一般而言，F(xiàn)SH濃度取決于用途(單劑量或多劑量)、給藥方式、給藥工具和FSH或 FSH變體的生物活性。優(yōu)選地，F(xiàn)SH或FSH變體是藥物組合物中唯一存在的藥物活性劑，雖然可能包括其 他的促性腺激素(例如LH)。為了防止FSH或FSH變體吸附到管形瓶、安瓿、筆膽、藥筒或注射器的表面上，本發(fā) 明的藥物組合物可以進一步包含表面活性劑，優(yōu)選非離子表面活性劑。在此，非離子表面活 性劑降低蛋白質(zhì)溶液的表面張力，從而防止蛋白質(zhì)吸附或聚集在疏水表面上。能夠用于本 發(fā)明的非離子表面活性劑的優(yōu)選的實例可以包括基于聚山梨醇酯的非離子表面活性劑和 基于泊洛沙姆的非離子表面活性劑。這些非離子表面活性劑可以單獨或者以其任意組合使 用?；诰凵嚼娲减サ姆请x子表面活性劑是特別優(yōu)選的。基于聚山梨醇酯的非離子表面活 性劑的具體實例包括聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60和聚山梨醇酯80。聚山 梨醇酯20和聚山梨醇酯80是更特別優(yōu)選的，聚山梨醇酯20是最優(yōu)選的。聚山梨醇酯20具 有相對低的臨界膠束濃度。因此，聚山梨醇酯20不僅在即使低濃度下減少或防止蛋白質(zhì)的 表面吸附，而且抑制蛋白質(zhì)的化學(xué)降解。在本發(fā)明的液體組合物中使用高濃度的非離子表 面活性劑是不合適的。這是因為使用高濃度的非離子表面活性劑導(dǎo)致干擾效應(yīng)，因此當(dāng)使 用如紫外光譜或等電聚焦的分析方法進行蛋白質(zhì)的濃度測定或穩(wěn)定性評價時，很難精確地 評價蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。因此，本發(fā)明的水性制劑含有濃度低于1. Omg/ml和更優(yōu)選0. 05至 0. 5mg/ml的非離子表面活性劑。在優(yōu)選的實施方案中，聚山梨醇酯20是制劑中唯一存在的表面活性劑。優(yōu)選地，本發(fā)明的FSH制劑的pH在約6. 0和約8. 0之間、更優(yōu)選約6. 5至約7. 5、 包括約PH 6. 8、pH 7. 0、pH 7. 2和pH 7. 4。優(yōu)選的緩沖劑是磷酸鹽，優(yōu)選的反荷離子是鈉 或鉀離子。在總?cè)芤褐芯彌_劑濃度能夠在5mM、10mM、50mM、100mM、150mM、200mM、250mM 和 500mM之間變化。優(yōu)選地，緩沖劑的濃度是50mM或約50mM。具有pH 7. O的50mM的磷酸鹽 緩沖劑是特別優(yōu)選的。能夠通過加入適量的合適酸或堿來調(diào)節(jié)制劑的pH。在一個實施方案中，用NaOH調(diào) 節(jié)液體藥物組合物的PH。優(yōu)選地，本發(fā)明的制劑含有抗氧化劑，例如甲硫氨酸、亞硫酸氫鈉、乙二胺四乙酸 (EDTA)的鹽、丁羥甲苯(BHT)和丁羥茴醚(BAH)。最優(yōu)選甲硫氨酸?？寡趸瘎┓乐笷SH(特 別是α-亞基)的氧化。液體藥物組合物中的甲硫氨酸的濃度優(yōu)選是約0. 1至約1. Omg/ml、更優(yōu)選約0. 2至 0. 8mg/ml、最優(yōu)選是 0. 5mg/ml 或約 0. 5mg/ml。在優(yōu)選的實施方案中，甲硫氨酸是本發(fā)明的制劑中唯一存在的抗氧化劑。優(yōu)選地，本發(fā)明的制劑含有作為穩(wěn)定劑和張力調(diào)節(jié)劑的單糖或二糖或者糖醇，例 如蔗糖、右旋糖、乳糖、山梨醇和/或甘油。最優(yōu)選的是糖醇，特別優(yōu)選甘露醇。糖或糖醇的濃度優(yōu)選為約1. 0至10mg/ml、最優(yōu)選的濃度為5. Omg/ml或約5. Omg/ ml。在一個實施方案中，本發(fā)明的組合物中所存在的甘露醇的量為5. Omg/ml在優(yōu)選的實施方案中，甘露醇是本發(fā)明的制劑中唯一存在的張力調(diào)節(jié)劑。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的制劑不含任何甘氨酸。在一個實施方案中，本發(fā)明的液體藥物組合物含有作為活性劑的FSH或其變體、 作為表面活性劑的聚山梨醇酯20和/或聚山梨醇酯80、作為張力調(diào)節(jié)劑的甘露醇、作為緩 沖劑的磷酸鹽、作為穩(wěn)定劑的甲硫氨酸和作為防腐劑的苯甲醇和苯扎氯銨、以及水，并且沒 有其他賦形劑。如上所述，本發(fā)明提供單次使用和多劑量使用的液體制劑，其含有至少2種抑菌 劑的組合。本發(fā)明的制劑適合于藥用或獸醫(yī)用。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于人藥用的制備物品，其包括包裝材料和容 器，所述容器包含在水性稀釋劑中的FSH或FSH變體以及苯甲醇和苯扎氯銨、任選地含有緩 沖劑和/或其他賦形劑的溶液，其中所述的包裝材料包含標(biāo)明該溶液可以在第一次使用后 保存24小時或更長的時間的書面材料。容器優(yōu)選是注射器、管形瓶、輸液瓶、安瓿或筆膽。 最優(yōu)選地，容器是在注射筆中的筆膽。在第一次使用之前，在容器封閉前，管形瓶、安瓿、筆膽或藥筒已經(jīng)被打破，本發(fā)明 的制劑可以保持至少約6個月、12個月或24個月。在優(yōu)選的貯藏條件下，在第一次使用前， 本發(fā)明的藥物組合物保持遠離強光(優(yōu)選在暗處)、在約2-8°C溫度下。本發(fā)明的制劑能夠使用公認的裝置進行給藥。包含這些單個的管形瓶系統(tǒng)的實 例包括用于遞送溶液的筆注射器裝置，例如已知的Easyject 、G0NAL-F 筆、Humaject 、 吣￥0 611@、8-0 筆3肽0卩611 、？011丨8^111 -筆、Puregon -筆和 OptiPen ?？梢詫⒎€(wěn)定的防腐的制劑以澄清溶液提供給患者。溶液可以單次使用或者其可以 重復(fù)多次使用并且可以滿足單次或多次循環(huán)的患者治療，因此提供了比當(dāng)前可用的治療方 案更方便的治療方案。本發(fā)明的水性制劑是即時可用的溶液，F(xiàn)SH制劑在任何時間點都不需重構(gòu)?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域中熟知的多種給藥方法將本文所述的穩(wěn)定的防腐制劑中的FSH 或FSH變體給予符合本發(fā)明的患者，包括皮下或肌肉注射、經(jīng)皮、肺、跨粘膜、植入、滲透泵、 藥筒、微量泵、口服或技術(shù)人員理解的其他方法。提供以下實施例，僅僅是用來進一步地舉例說明本發(fā)明的制劑和組合物的制備。 本發(fā)明的范圍不應(yīng)解釋為僅僅由以下實施例組成。本發(fā)明也涉及含有本發(fā)明的液體藥物組合物的藥物容器。合適的藥物容器可從現(xiàn) 有技術(shù)獲知。例如，容器可以是注射器、管形瓶、輸液瓶、安瓿或筆膽。在優(yōu)選的實施方案中， 當(dāng)容器是注射器時，注射器裝配有針頭保護系統(tǒng)?？蓮默F(xiàn)有技術(shù)獲知的該針頭保護系統(tǒng)幫 助降低傷害的危險。在另一個實施方案中，容器是注射筆中的筆膽。本發(fā)明也涉及制備本發(fā)明的液體藥物組合物的方法，其中將作為活性劑的FSH或
11FSH變體配制在包含作為防腐劑的苯扎氯銨和苯甲醇以及其他藥用賦形劑的水性制劑中。在另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的液體藥物組合物用于多劑量給藥的用途。本發(fā) 明的藥物組合物能夠有利地用于治療不育癥和與FSH相關(guān)的其他病癥。在優(yōu)選的實施方案 中，本發(fā)明的FSH制劑用于人的治療。然而，通常也可將本發(fā)明藥物組合物給予其他哺乳動 物，例如綿羊、牛、豬或馬。發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的藥物液體制劑表現(xiàn)出非常好的貯藏穩(wěn)定性。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，術(shù) 語“貯藏穩(wěn)定的”被理解為指在25°C下制劑貯藏3個月之后，活性的FSH或FSH變體的含量 仍然達到原始濃度的80%或更多。優(yōu)選地，在25°C貯藏3個月之后，F(xiàn)SH活性的剩余含量 仍達到原始活性的至少85%、更優(yōu)選至少90%和最優(yōu)選至少95%。FSH或FSH變體的生物活性能夠通過在給定的條件下，將其增大用絨促性素處理 的未成熟大鼠的卵巢的效果與國際標(biāo)準制劑或以國際單位標(biāo)定的參照制劑的同樣效果相 比較來進行評價(歐洲藥典，第5版)。例如，Albanese等人在 Mol. Cell Endocrinol. 101 :211_219 (1994)中描述了 FSH 體外活性的測定。用于本發(fā)明的制劑的FSH或FSH變體的純度應(yīng)當(dāng)為至少95%、優(yōu)選至少97%、更 優(yōu)選至少99%和最優(yōu)選高于99%。借助HPLC分析能夠測定純度。實施該分析的合適的材 料和方案能夠從例如Vydac或TOSOH Bioscience的商業(yè)供應(yīng)商獲得。配制本發(fā)明的溶液的組分能夠從常規(guī)來源獲得，例如從如Sigma或Merck公司獲得。本發(fā)明的制劑能夠根據(jù)常規(guī)的方法來進行生產(chǎn)。制劑的組分能夠溶解于水性緩沖 液中?；蛘?，由于純化過程，已經(jīng)能夠在水性緩沖液中得到FSH或FSH變體。最后，將制成的液體制劑填充到合適的藥物容器中，在其中貯藏直至給藥。以下實施例是為了舉例說明本發(fā)明，而不是限制其范圍。
實施例實施例1通過重組技術(shù)制備重組人FSH用標(biāo)準方法在轉(zhuǎn)染的CHO宿主細胞中生產(chǎn)重組人FSH。這些方法包括CHO細胞克 隆的傳代(所述克隆產(chǎn)生來自編碼人FSH的α-鏈和β-鏈的一種或多種重組核酸分子的 重組人FSH)、在合適的條件下培養(yǎng)宿主細胞和從細胞培養(yǎng)物中提純重組人FSH。合適的方 法記載于如上所述的現(xiàn)有技術(shù)中。在優(yōu)選的實施方案中，重組人FSH按照國際專利申請W02009/000913所述生產(chǎn)。實施例2液體FSH制劑通過在水性磷酸鹽緩沖溶液中配制以下組分來制備包含重組人FSH的液體制劑。
權(quán)利要求
液體藥物組合物，其包含促卵泡激素(FSH)或其變體和作為防腐劑的苯扎氯銨和苯甲醇。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的液體藥物組合物，其中所存在的苯扎氯銨的濃度為 0. 005-0. 03mg/ml和所存在的苯甲醇的濃度為5. 0-12. Omg/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的液體藥物組合物，其中所存在的FSH或其變體的濃度為10至 200 μ g/ml。
4.根據(jù)上述權(quán)利要求中任意一項的液體藥物組合物，其進一步包含作為抗氧化劑的甲硫氨酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的液體藥物組合物，其中所存在的甲硫氨酸的濃度為0.1至1. Omg/ml ο
6.根據(jù)上述權(quán)利要求中任意一項的液體藥物組合物，其進一步包含表面活性劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的液體藥物組合物，其中表面活性劑是聚氧乙烯脫水山梨醇烷基
8.根據(jù)權(quán)利要求7的液體藥物組合物，其中聚氧乙烯脫水山梨醇烷基酯是聚山梨醇酯 20或聚山梨醇酯80。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的液體藥物組合物，其中所存在的聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80 的濃度為0. 05至0. 5mg/ml。
10.根據(jù)上述權(quán)利要求中任意一項的液體藥物組合物，其進一步包含張力調(diào)節(jié)劑。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的液體藥物組合物，其中張力調(diào)節(jié)劑是糖醇或糖。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的液體藥物組合物，其中張力調(diào)節(jié)劑是甘露醇。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的液體藥物組合物，其中所存在的甘露醇的濃度為1.0至IOmg/ml ο
14.根據(jù)上述權(quán)利要求中任意一項的液體藥物組合物，其具有6.5至7. 5的pH范圍。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的液體藥物組合物，其中pH范圍是6.8至7. 2。
16.根據(jù)權(quán)利要求14或15的液體藥物組合物，其中用NaOH調(diào)節(jié)pH。
17.根據(jù)上述權(quán)利要求中任意一項的液體藥物組合物，其進一步包含生理上可接受的 緩沖劑。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的液體藥物組合物，其中緩沖劑是磷酸鹽。
19.根據(jù)權(quán)利要求17或18的液體藥物組合物，其中所存在的緩沖劑的濃度為 10-100mmol/lo
20.根據(jù)上述權(quán)利要求中任意一項的液體藥物組合物，其中組合物含有作為活性劑的 FSH或其變體、作為表面活性劑的聚山梨醇酯20和/或聚山梨醇酯80、作為張力調(diào)節(jié)劑的 甘露醇、作為緩沖劑的磷酸鹽、作為穩(wěn)定劑的甲硫氨酸和作為防腐劑的苯甲醇和苯扎氯銨， 并且沒有其他賦形劑。
21.藥物容器，其含有根據(jù)上述權(quán)利要求中任意一項的液體藥物組合物。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的藥物容器，其中容器是注射器、管形瓶、輸液瓶、安瓿或筆膽。
23.根據(jù)權(quán)利要求21或22的藥物容器，其中容器是在注射筆中的筆膽。
24.制備根據(jù)權(quán)利要求1-20中任意一項的液體藥物組合物的方法，其中將作為活性劑 的FSH或其變體配制到水性制劑中，所述水性制劑包含作為防腐劑的苯扎氯銨和苯甲醇以及其他藥用賦形劑。
25.制備包裝的藥物組合物的方法，其包括將包含F(xiàn)SH或其變體以及苯扎氯銨和苯甲 醇的溶液置于管形瓶、安瓿、筆膽或藥筒中。
26.根據(jù)權(quán)利要求1-20中任意一項的液體藥物組合物用于多劑量給藥的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含促卵泡激素多肽和作為防腐劑的苯扎氯銨和苯甲醇的液體藥物組合物。組合物還任選地包含一種或多種其他的可藥用賦形劑。在一個實施方案中，組合物含有作為抗氧化劑的甲硫氨酸。組合物表現(xiàn)出良好的貯藏穩(wěn)定性，并且特別用于其中促卵泡激素制劑被視為有效療法的病癥和醫(yī)學(xué)適應(yīng)癥的預(yù)防和治療。
文檔編號A61K47/18GK101970010SQ200980104085
公開日2011年2月9日 申請日期2009年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月8日
發(fā)明者E·科勒, S·斯托爾曾伯格 申請人:拜奧吉耐里克斯股份公司