專利名稱：促卵泡激素的用途的制作方法
要申請是申請?zhí)枮?8103966.7的專利申請的分案申請。
本發(fā)明涉及促卵泡激素，含有它的藥物組成物和它的純化方法。
促卵泡激素已知對于不育癥的治療是有用的。含有這種激素的制劑已被在體內(nèi)和體外的技術(shù)中采用以幫助受孕。人體FSH已經(jīng)從人腺垂體和絕經(jīng)后的人尿中分離出來了。最近，它已通過采用DNA重組技術(shù)而制備。
含有人體FSH的第一代商用產(chǎn)品含有HMG(即，Pergonalserono)，即從人體絕經(jīng)后的尿中提取出來的人體絕經(jīng)促性腺激素，它它是FSH、促黃體激素(LH)和其它的尿蛋白的混合物。同時，有幾種設(shè)想被用于得到科研和治療用的純FSH制劑。最近投入商用的Metrodin(Serono)產(chǎn)品是一種含有極少量LH，但含有其它尿蛋白的尿促卵泡激素(尿FSH)制劑，它被用于不育癥的治療。當不希望將FSH和外源LH一起用藥，如用于多囊卵巢綜合癥(POOS)時，使用該產(chǎn)品是尤其好的。
至今，不通過肌內(nèi)注射使用FSH進行治療已經(jīng)成功地進行了。因為肌內(nèi)注射通常要由醫(yī)生或醫(yī)護人員來進行，病人要定期地去診所或醫(yī)院以便接受治療。這就造成了大大的不方便。進一步地說，因為治療通常要延長到幾星期以至幾個月，這樣的治療方法所花費的時間常常使得病人不樂意依從。
通過皮下注射而給藥提供了由病人自己給藥的可能性，因而改善了病人的合作性和依從性。
人體絕經(jīng)促性腺激素(HMG)的皮下給藥已經(jīng)被描述過(Nakamura Y·等，《生育和絕育》46(1)46～54，1986)，它是關(guān)于經(jīng)過皮下蠕動泵，依靠脈動給HMG藥而治療女性不育癥。因為在所用產(chǎn)品中有雜質(zhì)存在，皮下注射具有要產(chǎn)生局部過敏反應(yīng)的缺憾。因此，治療須用懸濁液。
P·Roos(“人體促生育激素”《Acta EndocrinologicaSupplementum 131，1968)描述并說明了分別從冰凍垂體和絕經(jīng)后的尿濃縮液中所得到的高純度的垂體和尿的FSH制劑的特征。所得的每毫克垂體FSH中FSH活性的生物效價高達14,000國際單位(I·U·)，每毫克尿FSH中FSH活性的生物效價為780I·U·。在大多數(shù)活性垂體和尿制劑中LH污染量估計約為0.1％(重量)。純化過程則包括如下一種或多種技術(shù)在二乙氨基乙基纖維素上層析，在交聯(lián)葡聚糖G—100上凝膠過濾、羥基磷灰石層析、聚丙酰胺凝膠電泳等等。
純化的最好的FSH制劑的一種被Donini等描述過[“從絕經(jīng)后的尿中得到的FSH的純化和部分化學(xué)物理特性”《Gonadot rophins and Ovarian Development》(二個學(xué)術(shù)會議的會議錄)，Llvingstone，Edinburgh和London；1970)，且每毫克FSH生物效價為1255.6 I·U·，而每毫克LH中LH污染降低為3.2I·U·。這種情況下，起始物質(zhì)是人體絕經(jīng)促性腺激素(HMG)制劑(注冊商標為Pergonal)，它就如上面所陳述的，是一種FSH和LH激素以及其它尿蛋白的混合物。結(jié)果產(chǎn)物是通過將起始HMG放在二乙氨基乙基纖維素上純化，接著在二乙氨乙基纖維素層析柱中層析，在交聯(lián)葡聚糖G—100上凝膠過濾，最后，進行制備型聚丙酰胺凝膠電泳這樣分批純化而得到的。
H·Van Hell等通過在慣用的層析純化步驟中增加免疫層析和凝膠過濾步驟而得到了很高的生物效價[“人體尿FSH和LH的純化和一些特性”《Gonadotropins》(關(guān)于促性腺激素的國際性專題討論會1記錄，1971)，Wiley Intersci ence，紐約]。為了達到從部分純化的FSH片斷中排除LH活性的目的，免疫層析系采用抗HCG抗體偶聯(lián)到瓊脂糖上而進行。最好的純化FSH片斷中，通過放射免疫測定法(RIA)分析得每毫克FSH中含有4720I·U·FSH，而每毫克LH中LH污染低至15I·U·。
免疫層析的探討業(yè)經(jīng)由Donini等描述過(“從HMG中純化和分離FSH和LH”《Acta Endoc rinologica》52，186～198頁，1966)，早在1966年，他們就得到了每毫克FSH的效價為329.7I·U·和生物學(xué)測不到的數(shù)量的LH污染的FSH制劑。在另一個實驗中，得到一片斷，分析得其每毫克FSH效價為148.3I·U·，每毫克LH效價為2.4I·U·。因為在每毫克FSH效價為329.7I·U·的制劑中沒有進行放射免疫測定，可以通過與H·Van Hell(c.f.supra)的結(jié)果相似來假定，如果采用放射免疫測定，將發(fā)現(xiàn)痕量的LH。
即使最少量的LH污染的生理關(guān)系被Donini等揭示于一篇文章中(“對于促黃體激素的生物測定的新探討”《Acta Endocrinologica，58，463—472頁，1968)，該文揭示了一種新的LH檢測的生物鑒定法，它將一定劑量的生物純的FSH制劑加上LH的恒定增量注入幼年的無創(chuàng)傷的小鼠中，然后，測定子宮的增重，它作為LH活性的相應(yīng)比例。采用這種方法，當與4.44I·U·的FSH一起注射時，哪怕小至0.068I·U·的LH也顯示出可以增加子宮的重量。
這樣就可清楚地看到，完全沒有LH活性的FSH制劑是治療所需要的，絕對純的FSH制劑是期望的。
如上面所述的，最近注冊的產(chǎn)品Metrodin(Serono)是一種純化的FSH制品，它是通過一種大體與Donini等在一篇上面談到的文章(《Acta Endocrinologica》，52，186～198頁，1966)中所描述的基本上相同的方法所制備。具體的量的控制與所說的制劑的生物純度相一致，為每75I·U·的FSH中LH不大于O.7I·U·，即接近生物測定的靈敏度極限。但是，在一些治療應(yīng)用中，期望絕對地沒有LH。進一步地，在Metrodin中，人體FSH還伴有大量其它的尿蛋白，即它不是化學(xué)純的FSH制品。
第2,173,803 A號英國專利申請中提出了另一種從垂體糖蛋白激素中純化FSH的方法。該法堅持首先形成一激素與固定的單克隆抗體的復(fù)合物，然后用一個pH值3～4的酸性緩沖液洗提激素。盡管FSH被考慮了，然而所得到的高純度的激素仍含有0.1％(重量)的LH和0.5％(重量)的TSH。
Scott C·Chappel等在一篇綜述中(《Endocrine Reviews 4(2)，179—211，1983)描述了FSH的微相不均勻性以及伴隨著FSH分子的碳水化合物部分的生理重要性。該假設(shè)可以提出，即在代謝途徑進行到最后的尿分泌時，一些誘發(fā)變異可能發(fā)生，這是因為由申請人進行的實驗所用的本發(fā)明的高純度尿FSH(hpu FSH)制劑和用于比較的高純度垂體FSH制劑之間，所具有的理化特性不同。同步或滯后轉(zhuǎn)譯而誘發(fā)變異顯示了FSH由兩種不同的糖基化和已知為α和β亞基的非共價多肽鏈組成的糖蛋白的微觀變異差別的基礎(chǔ)。β亞基將它的生物特性賦予分子。
順便說及，有一些類似的文章均希望解釋在高純度垂體和尿FSH制劑之間每毫克生物活性的值的實質(zhì)性不同。一個合理的假設(shè)也是取決于碳水化合物部分的關(guān)連，更具體地說，取決于未端唾液酸殘基的作用。
應(yīng)該注意，盡管垂體FSH和尿FSH兩者均定義為“FSH”，但目前尚無確切的依據(jù)來證實從兩種來源中分離出來的分子是否相同或是否化學(xué)上是等效的。
業(yè)已發(fā)現(xiàn)，人體尿FSH可以從濃縮的絕經(jīng)后的尿中分離出來，按這樣的純化方法，最終的FSH無任何可測定的痕量LH和其它尿蛋白。進一步并與任何已知的情況相反，對于本發(fā)明的尿FSH的氨基酸分析顯示了一種新的FSH的111個氨基酸的β3-亞基代替已有技術(shù)中所揭示的U8或108個已知的FSHβ-亞基。更具體地說，本發(fā)明提供了一種新的FSHβ-亞基，其氨基酸序列如下Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Tht Ile Ala Ile GluLys Glu Glu Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr ThrTrp Cys Ala Gly Tyr Cys Tyr Thr Arg Asp Leu Val TyrLyr Asp Pro Ala Arg Pro Lys Ile Gln Lys Thr Cys ThrPhe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg Val Pro GlyCys AIa His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro ValAla Thr Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp SerThr Asp Cys Thr Val Arg Gly Leu GIy Pro Ser Tyr CysSer Phe Gly Glu Met Lys Glu以及提供了一種含有已知促性腺激素α—亞基和上面所定義的111個氨基酸β-亞基的新的蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)具有促卵泡激素(FSH)的生物活性。較佳地為呈糖化物的形式。更佳的是它基本上無可測得的痕量促黃體素和其它尿蛋白。
本發(fā)明的又一個方面是一種含有本發(fā)明的純化蛋白質(zhì)和一種藥物學(xué)可接受的賦形劑的藥物組成物。較佳地為該組成物以適于皮下給藥的形式存在。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的藥物組成的皮下注射不會增加通常由于注射已有技術(shù)的FSH制劑而出現(xiàn)的過敏反應(yīng)。
根據(jù)本發(fā)明的又一個方面，本發(fā)明提供一種用于制備本發(fā)明的新的和高純度的FSH的方法。該方法基本上依靠免疫純化步驟和逆相高壓液相色譜(HPLC)的結(jié)合。免疫純化步驟中使用固定化的單克隆抗體，就如在上述第2,173,803A號英國專利申請中所描述的，但有一個很重要的不同是以免疫復(fù)合物中洗提FSH是在比較更高的pH值下進行的。
在本發(fā)明的過程中，洗脫通常采用pH值高于10和摩爾濃度大于0.5的水溶液進行。由申請人所進行的實驗表明，在這些條件下，固定化抗體實質(zhì)上并不是鈍化的。這與上述英國專利申請中所述有顯著不同，該申請揭示(第1頁，36～37行)“使用高pH值的洗提劑實際上是不合適的，因為它會導(dǎo)致抗體迅速鈍化”。
這些方面的不同可能取決于將抗體連接到樹脂上的方法的不同。
根據(jù)本發(fā)明，洗脫液的pH較佳地為高于11，更佳地是在11.3～11.7的范圍內(nèi)。
摩爾濃度的值較佳地為大于0.8，更佳為約1。
用于本發(fā)明的合適的洗脫液是氨、二乙酰胺以及諸如TRIS緩沖液這樣的緩沖液。甘氨酸-NaoH等等。
隨后的逆相高壓液相色譜(HPLC)步驟使可以得到完全除去沾染任何蛋白質(zhì)的產(chǎn)物。除去的方法不是僅采用免疫純化步驟，如在英國專利申請中所述的。這樣的步驟不僅有效地除去了含有蛋白質(zhì)的痕量殘渣，而且保持了FSH所有的生物活性，這樣的事實對于P·Hallin和S·A·Khan(《J·Liq·Chromat·》9(13)，2855—68，1986)的文章中的觀點來說是新奇的，因為該文認為進行逆相HPLC后，牛FSH和人體FSH的生物活性就會失去。另一方面，該文揭示了當人體尿制劑(即含F(xiàn)SH和LH兩者)進行離子交換HPLC后，生物活性物令人滿意地得到回收，但是，有部份分離。
HPLC步驟后，F(xiàn)SH采用通常的技術(shù)再處理。為了貯藏和/或運用的目的，產(chǎn)品可以被凍干。另一些適宜的方法是將產(chǎn)品有效地濃縮，穩(wěn)定或進行其他處理，它們是可以考慮的。
很明顯，絕經(jīng)后尿的可用性大于人體垂體的可用性。這種相應(yīng)的可用性對于申請人的發(fā)明是很重要的。
本發(fā)明的過程中使用的對FSH專一性單克隆抗體可采用已知的的技術(shù)制備。
在一個典型的實例中，劍橋大學(xué)的雜交細胞株9/14被進行其對于FSH的最佳親和力的篩選。單克隆抗體采用細胞培養(yǎng)技術(shù)在上清液培養(yǎng)基中而制備，并通過50％(W/V)硫酸銨的鹽分級分離而純化，然后，進行離子化的逆相色譜和HPLC凝膠過濾并滲析。
如上所述由細胞株9/14制備的單克隆抗體和純化的詳細說明如下a)蛋白質(zhì)純度不小于90％b)免疫球蛋白的分級Ig Glc)親和力常數(shù)3.5×108L·mole-1d)特征抗原 雜交反應(yīng)FSH100HCG 1HCG—β亞基 1LH 1TSH 1e)在溶液中對于FSH的親和力每毫克單克隆抗體約1,000I·U·的FSH。
FSH專一性單克隆抗體根據(jù)J·Porath在《Methods inEnzymolohy》34，13—30頁，1974中所描述的方法，通過二乙烯基砜而化學(xué)地結(jié)合到瓊脂糖4B上。
在一個典型的實例中，1升瓊脂糖4B首先置于多孔玻璃過濾器上，用5升新鮮蒸餾水洗滌，然后，用5升1M的碳酸鈉洗滌(pH11)。洗滌后的瓊脂糖懸浮于1升1M的碳酸鈉(pH11)中。在持續(xù)攪拌下滴加入200ml二乙烯基砜。在室溫就下進行反應(yīng)70分鐘，然后加入1N HCl(至pH7.0)使反應(yīng)停止。
活化的樹脂懸浮于1升含有2克抗FSH單克隆抗體的0.25M的碳酸氫鈉中以使90％以上的抗體結(jié)合到活化樹脂上。這樣得到的免疫樹脂于4℃下貯存。
如下實例1列舉了采用商用HMG，即PergonalSerono中的活性成分的本發(fā)明的方法的兩個純化步驟。
可以理解，盡管HMG是本發(fā)明過程中較佳的初始物料，然則本發(fā)明也可以采用低純度的物料，如絕經(jīng)后的尿濃縮液等等。使用每毫克僅含1I·U·FSH的尿濃縮液作初始物料已經(jīng)得到了很好的結(jié)果。
本發(fā)明的另外一些方面和優(yōu)點在考慮了下列實例后將變得更為明顯，但它并不限于此。實例1高純度尿FSH(hpu FSH)的制備步驟1在抗FSH的Mc Ab—DVS—瓊脂糖上的免疫純化HMG被用作起始原料。
將免疫樹脂抗FSH Mc Ab—DVS—瓊脂糖于0.1MTris-HCl，0.3M NaCl的緩沖液中平衡，pH＝7.5，4℃。
往層析柱中加入相當于結(jié)合的FSH總量的80～90％的IUFSH(RIA)。
未被滯留蛋白質(zhì)用平衡緩沖液洗滌至洗出物的OD280值小于0.02。
于4℃下，用1M的氨溶液將吸收的uFSH從免疫樹脂中洗脫出來。所收集的氨洗出液的量約為免疫樹脂體積的4倍，在4℃，加入冰醋酸盡快將溶液pH調(diào)整到9.0，溶液在Amicon設(shè)備(膜C·D·10,000Ds)超濾并濃縮到很小的體積。步驟2逆相HPLC最終的溶液調(diào)節(jié)pH＝5.6，加入C18逆相層析柱(Pre PakWaters)，該柱事先在室溫下用0.05M PH＝5.6的醋酸銨緩沖液平衡。
洗脫液的流速為100ml/min，且在280nm下監(jiān)測。
HPLC純化采用一配有紫外檢測器和制備型梯度產(chǎn)生器的Prep 500A設(shè)備(Waters)進行。
在流動相中異丙醇高達50％的梯度洗脫下將生物活性的高純度尿FSH洗脫出來。級分用GPC和RIA分析檢驗。
在真空、40℃下蒸發(fā)除去有機溶劑，然后將溶液冷凍并凍干。實例2FSH的特性將本發(fā)明的高純度尿FSH制劑進行幾個理化、生物和免疫方面的測試以獲得它的完整的特性。如在下面所指出的，大多數(shù)試驗均以下面所描述的方法而得到的高純度垂體FSH作對比。
粗的人垂體抽提物(HPG)，是由人體生長激素抽提中所得到的副產(chǎn)品，被用作初始原料。
整個過程包括如下步驟1)用含6％pH＝5.6的醋酸銨的40％的乙醇抽提粗HPG，上清液用96％冷乙醇進行沉淀而進行初級純化。2)在二乙氨乙基纖維素上，用0.15M PH＝7的乙酸鈉作為洗脫劑進行離子交換層析，然后用96％冷乙醇沉淀而進一步純化。3)在交聯(lián)葡聚糖G-100上，用0.05M碳酸氫鈉作為緩沖液進行FSH級分的凝膠過濾而進一步純化。4)在SP-交聯(lián)葡聚糖C50上進行離子交換層析，用0.1M磷酸鹽緩沖液(pH6.2)洗脫后再冷凍干燥得到最后一步純化的垂體FSH。
垂體FSH在體內(nèi)的生物專一活性被測定為4770I·U·FSH/毫克凍干粉未(Steelman-pohley試驗，2級IRP—HMG的I·U·)，測定方法是采用“生物分析”中描述的。
特性試驗進行如下LH污染試驗借助于專一性LH放射免疫分析法進行用以2級IRP—HMG作對照標定的標準LH和125I—LH為示蹤物，兩者均包含在Biodata公司最近注冊的LH ter KIT(10204號)中。由申請人制備的羊抗-HCG抗血清作為抗血清被使用，它對LH具有100％的交叉反應(yīng)性，而對于FSH則小于0.1％。
RIA分析過程是遵循每一個制造商的說明去所做的，得到的結(jié)果是在根據(jù)實例1制備的高純度尿FSH中沒有可測出的LH污染。
上述的結(jié)果使用一名為DELFIA(分離一強化鑭熒光免疫檢測器)由LKB-Pharmacia注冊的更為靈敏的檢測器檢測而得到證實。十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)根據(jù)Laemmli在《Nature》227，68—685頁(1970)中所描述的過程，在減壓條件下，用13.5％pH＝8.8的聚丙烯酰胺凝膠在SDS中進行平板凝膠電泳。
用0.25％庫瑪斯亮蘭R-250在25％甲醇/75％乙酸溶液中進行染色。
將如上所描述的方法所得到的本發(fā)明的hpu FSH制劑和高純度垂體FSH制劑進行上述試驗。結(jié)果列于

圖1中，尿FSH和垂體FSH制劑(依次為uFSH和pFSH)的帶區(qū)與分子量的標志帶區(qū)(M.W)一起顯示。
在uFSH和pFSH制劑中，發(fā)現(xiàn)糖蛋白典型主色帶均在接近20,000道爾頓的同樣分子量，它也符合文獻的數(shù)值。從糖蛋白在SDS-凝膠電泳的已知特性來看，這個值只有很小的過高估計。尺寸大小的排阻層析hpu FSH和hpp FSH的分析在TSKG2000 SLKB柱中進行.用0.1M pH6.8的磷酸緩沖液加0.2M Nacl作為洗脫液，流速為0.7ml/分，讀數(shù)在波長230毫微米nm時取得。
結(jié)果列于圖2中，它顯示了uFSH和pFSH每一個主波峰具有大致相同的滯留時間(分別為13.37和13.55分鐘)。等電(點)聚焦等電(點)聚焦在固定于11.5％(W/V)TCA和3.5％(W/V)磺基水揚酸上的含5％聚丙烯酰胺凝膠薄層上進行，用銀染色裝置(BIO-RAD)進行染色。
hpp FSH和hpu FSH的結(jié)果均列于圖3中，圖3也顯示了等電點的標記。從圖中可以看出，尿FSH和垂體FSH都顯示了幾個帶區(qū)，但它們的類型是絕然不同的，尤其是，尿FSH的主帶區(qū)在pH低于4.8的區(qū)域，而垂體FSH所顯示的主帶區(qū)在一個較高的pH范圍內(nèi)。
這個試驗表明尿FSH和垂體FSH是兩種不同的分子，如果不是它們各自的蛋白質(zhì)部分不同，那么至少就是它們的碳水化合物部分有所不同。生物鑒定hpu FSH的FSH在體內(nèi)的生物活性采用Steelman pohley方法(《Endocrinology》53，604-616，1953)測定，采用HMGHouse標準校準的2級國際參考HMG制劑作為對比材料用于生物鑒定。該鑒定系被測定FSH生物活性的國際單位(I.U.)的所有主要藥典和保健協(xié)會所認可。
經(jīng)測定，根據(jù)上述實例所制備的hpu FSH制劑的FSH的比活性為6200I.U./毫克凍干粉末，即這是已描述的FSH尿制劑的最高的比活性。氨基酸序列的測定a)UFSH亞基的分離法uFSH亞基的分離系采用配有一層析柱Aquapore RP-300，200×4.6mm，7μm(Brownlee Labs)的Waters HPLC體系進行。
洗脫劑是A＝0.1％ TFA(三氟乙酸，HPLC級、Pierce)，B＝0.055％TFA(在乙睛中)。流速為1ml/min，溫度為35℃，初始狀態(tài)下為15％B。
20分鐘時，梯度上升為40％B。
紫外檢測是調(diào)節(jié)在229nm進行。
通常用20(微升mcl)分析器注入0.5mg/ml的hpu FSH溶液和0.5％TFA。在TFA溶液中預(yù)保溫不是必需的。
制劑的分離采用同樣的柱進行。
注射0.5mg溶解于A緩沖液中的hp人體uFSH(批號032)可得到很好的分離。級分用手工收集，采用Speed Vac濃縮器干燥。亞基溶于水中，采用HPLC分析，并貯存于-20℃。
約10.5分鐘，β亞基被洗脫，波峰很寬，15分鐘時，α亞基被洗提，波峰很窄。
對于β亞基和α亞基的每一個波峰的認識是通過專性RIA方法來完成的。
通常，β亞基的回收率為50％左右，而α亞基的回收率則為90％以上。b)α和β亞基的還原和羧甲基化如(a)中所分離的亞基的還原在0.5M三(羥甲基)甲胺(Tris)、0.1％EDTA、6M(pH 8.5)鹽酸胍中，37℃下進行2小時，使用15倍摩爾過量于半胱氨酸含量的DTT(二硫蘇糖醇，Serva)。
然后，往反應(yīng)混合物中加入碘乙酸鈉(2.1克分子過量于DTT)，并在黑暗中保持30分鐘。
要使反應(yīng)停止可加入1％巰基乙醇和TFA。
羧甲基化的亞基采用HPLC純化。
B羧甲基化亞基難溶于水，故最終的產(chǎn)量很低。c)β亞基的還原、吡啶乙基化和胰蛋白酶消化在a)中所分離的β亞基的還原在室溫下，以下列方式進行2小時0.1mg，β亞基0.5ml0.5M Tris，0.1％EDTA，6M的鹽酸胍pH8.52.7mg二硫蘇糖醇。
吡啶乙基化是通過將0.02ml 4-乙烯基吡啶加入到前述的溶液中而進行的。
反應(yīng)在室溫下進行2小時。最后，反應(yīng)混合物放于用0.1％TFA平衡的C4軟片(Baker)上。
軟片用0.1％TFA洗滌，吡啶乙基化的β亞基用40％乙晴、0.1％TFA洗脫。洗出的級分被干燥，并用HPLC法純化，如前面所述的對β亞基的處理。
用HPLC預(yù)純化的吡啶乙基化β亞基被溶解于1％NH4HCO3中，pH＝8。
將胰蛋白酶加至溶液中，反應(yīng)在37℃進行1.5小時。
胰蛋白酶級分采用與前面所描述的同樣的方法進行純化，除了梯度在30秒內(nèi)從0％變?yōu)?5％，且紫外檢測在214nm進行。
胰蛋白酶級分采用與所報導(dǎo)的用于亞基順序化的同樣的方法進行順序化(可見e))。d)α亞基的順序分析幾個順序分析測定(runs)使用α亞基、羧甲基化α亞基或完整的高純度人體u FSH來進行，通常以5納摩爾或更少的量加入蛋白質(zhì)順序分析儀(470A，(Applied Biosystem)，并采用生物體系中所使用的03RPTH標準程序表(由AppliedBioystem提供)或?qū)Ｒ坏难h(huán)順序，即使被專一循環(huán)03CPRO取代的脯氨酸或甘氨酸斷裂開來。
從分子的NH2末端起的頭45個氨基酸被測定，結(jié)果證實了和文獻中[《J.Biol.Chem.》250，6735(1975)]已知的氨基酸順序符合。
從已知順序的丙氨酸開始的52位和78位的天門冬酰胺是產(chǎn)生糖基化的氨基酸。
在NH2端總是存在異種性，這在所有的順序樣品中都是相同的。在鏈中，完整的分子(即從丙氨酸開始的)占65％，而缺少二個氨基酸(即從天門冬氨酸開始)的分子占5％，而缺少頭三個氨基酸(即從纈氨酸開始)的分子占30％。
1 5鏈的65％AlaProAspValGln……鏈的5％ AspValGln……鏈的30％ ValGln……α亞基的異種性。e)β亞基的順序化幾個順序化均采用β亞基、羧甲基化β亞基、完整的高純度人體uFSH和吡啶乙基化β亞基的胰蛋白酶肽。
樣品被加入到蛋白質(zhì)順序分析儀(470A，生化體系中用的)，采用生化體系中所使用的03RPTH標準程序表。
結(jié)果表明β亞基為111個氨基酸長度，且具有下列的氨基酸順序。Ash Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Tht Ile Ala Ile GluLys Glu Glu Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Ash Thr ThrTrp Cys Ala Gly Tyr Cys Tyr Thr Arg Asp Leu Val TyrLyr Asp Pro Ala Arg Pro Lys Ile Gln Lys Thr Cys ThrPhe Lys Glu Leu Val Tyr GIu Thr Val Arg Val Pro GlyCys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro ValAla Thr Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp SerThr Asp Cys Thr Val Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr CysSer Phe Gly Glu Met Lys Glu從上述順序的位置1的天門冬酰胺起的7和24位置上的天門冬酰胺是發(fā)生糖基化的氨基酸。
在β亞基的NH末端總是存在異種性，這與所有的順序化樣品是一樣的。完整的分子(即從天門冬酰胺開始的)占鏈的35％，缺少第一個氨基酸(即從絲氨酸開始的)分子占15％，缺少頭二個氨基酸(即從半胱氨酸開始)的分子占50％。
15鏈的35％AsnSerCysGluLeu……鏈的15％ SerCysGluLeu……鏈的50％ CysGluLeu……β亞基的異種性。實例3藥物制劑含有本發(fā)明中所制得的hpu FSH的藥物制劑的生產(chǎn)不是很困難的。主旨是在凍干后仍保持它的生物活性，這樣以于注射用的制劑是較佳的形式。冷凍含有hpu FSH的制劑可使用生理鹽水和/或其它合適的稀釋劑重建，以形成可以注射的溶液。
一些賦形劑可以適宜地用于組成中，作為組成的一部分，這樣的賦形劑如甘露醇、乳糖、甘氨酸、葡萄糖、蔗糖和它們的混合物。另外，一些常用的載體，填充劑等也可使用?；旌衔锸呛嫌玫摹?br> 在本發(fā)明所進行的實驗中，乳糖被用作可以注射用的制劑的賦形劑。
在制備可注射用的配方時，較佳地是通過加入常用的酸性物或堿性物來調(diào)節(jié)pH。酸性物包括乙酸等。堿性物包括氫氧化鈉等。也可使用混合物。
一種或多種穩(wěn)定劑，如白蛋白等的使用是期望的。
用于制造20,000瓶針劑，且每瓶含有75I.U.FSH的藥物生產(chǎn)的典型例子如下。
計算出的一定量(以生物活性為單位)的凍干FSH粉末塊溶解于注射用的700ml冷的無熱原的水中。如果需要的話，可能用乙酸或氫氧化鈉將pH重新調(diào)整到6.2和6.8，本申請中可能這樣。然后將溶液經(jīng)過0.2微米孔徑的過濾器進行無菌過濾。
將200g乳糖溶解于2升注射用的無熱原的水中，如上所述進行無菌過濾，并加入到FSH溶液中。
注射用無熱原的水加到最后體積達15升。溶液被分放入安瓿瓶中(每瓶0.75ml)并在無菌冷凍室中冷凍。
所得到的安瓿瓶中每瓶含75I.U.F S H和10mg乳糖。
在一個較佳具體例中，安瓿瓶中的藥劑可以含有150I.U.FSH。
根據(jù)藥物制劑的又一個實例，除賦形劑乳糖外，所制得的安瓿瓶藥劑中還含有1mg人體白蛋白作為穩(wěn)定劑。
盡管本發(fā)明通過一些特例而列舉了，但可以理解，在不違背本發(fā)明的宗旨和范圍的情況下，可以作出各種變化。
權(quán)利要求
1.一種促卵泡激素(FSH)在制備藥劑中的用途，它包括將治療有效量的FSH用于制備藥劑。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其中所述的藥劑進一步包括合適的賦型劑。
3.如權(quán)利要求2所述的用途，其中所述的賦型劑是乳糖。
4.如權(quán)利要求1或2所述的用途，其中所述的藥劑是用于注射的冷凍藥物制劑。
5.如權(quán)利要求1—4所述的用途，其中所述的藥劑適合于皮下給藥。
6.如權(quán)利要求1所述的用途，其中所述藥劑的每安瓿瓶藥中含有75I.U.的FSH。
7.如權(quán)利要求1所述的用途，其中所述藥劑的每安瓿瓶藥中含有150I.U.的FSH。
8.如權(quán)利要求1—7所述的用途，其中所述的藥劑進一步包括作為穩(wěn)定劑的人體白蛋白。
全文摘要
本發(fā)明采用免疫層析和逆相HPLC步驟從絕經(jīng)后尿促性腺激素中純化人體FSH，得到一種生物活性激素，它沒有可測定的痕量的LH和其它尿蛋白。
文檔編號C07K19/00GK1117873SQ9510756
公開日1996年3月6日 申請日期1995年7月20日 優(yōu)先權(quán)日1987年6月26日
發(fā)明者朱塞佩·阿帕亞, 塞雷納拉·塞拉尼, 安東尼諾·塞那 申請人:切薩雷·西羅諾公司研究院