專利名稱：重組人促卵泡激素及其制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及高比活性的重組人促卵泡激素和其制備方法。另外，本發(fā)明還涉及該制備方法中所用的中間體。
背景技術(shù)：
促卵泡激素(FSH)是調(diào)節(jié)雌性和雄性哺乳動物(包括人類)的生殖相關(guān)功能的重要激素，可用于治療不排卵綜合癥、黃體缺陷以及不育癥等。FSH是一個異源二聚體糖蛋白， 由非共價結(jié)合的α和β亞基結(jié)合而成。其中，α亞基和β亞基均為糖蛋白，各分布有2 個糖基化位點(diǎn)。FSH的糖基結(jié)構(gòu)部分的存在及組分決定了其生物學(xué)功能的性能及穩(wěn)定性。 而對于經(jīng)歷翻譯、剪接和折疊才得到的蛋白質(zhì)產(chǎn)物來說，其活性已經(jīng)難以預(yù)料，而糖基化的存在與組分為預(yù)測蛋白質(zhì)產(chǎn)物的性質(zhì)帶來了更大的難度，以至于美國FDA感嘆道“生物制品的生產(chǎn)過程就是產(chǎn)品”。對于FSH的制備，中國專利第88103966號公開了采用免疫層析和逆相HPLC步驟從絕經(jīng)后尿促性腺激素中純化人FSH (hFSH)。此后，DNA重組制備的hFSH(rhFSH)的方法也有報道。例如，中國專利第98807811號致力于通過引入二硫鍵來穩(wěn)定FSH，而中國專利第 99808813號和第20048003^65號則通過引入一些突變來提高性能及穩(wěn)定性，但是這些蛋白結(jié)構(gòu)的改變將增加該突變的FSH被機(jī)體識別為異源蛋白的隱患，從而在體內(nèi)使用時帶來免疫風(fēng)險。中國專利第 200480036591 號、第 200580037591 號、第 200910048718 號和第 200910051483號通過后期純化步驟的優(yōu)化來提高h(yuǎn)FSH的性能及穩(wěn)定性，最終得到的高純度的FSH的比活達(dá)到12104IU/mg。本發(fā)明人研制了不同于現(xiàn)有技術(shù)的FSH制備方法，在DNA水平上做了大幅度的優(yōu)化，但不在最終產(chǎn)物的蛋白質(zhì)水平上引入突變，即最終產(chǎn)物與天然hFSH的蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)相同，翻譯產(chǎn)物正確，避免了體內(nèi)用藥時的免疫風(fēng)險；另外在轉(zhuǎn)染、培養(yǎng)以及后期純化中進(jìn)行了全面優(yōu)化。最終，本發(fā)明人不但獲得了表達(dá)水平高的rhFSH，更令人意想不到的是，獲得的rhFSH的活性進(jìn)一步得到了提高，比活高于現(xiàn)有技術(shù)所報道的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供不同于現(xiàn)有技術(shù)的rhFSH的制備方法，該方法獲得的最終產(chǎn)物正確，保留了 FSH的生物活性。另外，本發(fā)明還提供了該方法制備而得的 rhFSH以及該方法中使用的中間體。具體而言，在第一方面，本發(fā)明提供了高比活性的重組促卵泡激素，其比活性大于 12200IU/mg，優(yōu)選大于 12300IU/mg，最優(yōu)選為 12350 12400IU/mg，如 12390IU/mg。重組促卵泡激素優(yōu)選是哺乳動物的重組促卵泡激素，最優(yōu)選是重組人促卵泡激素(rhFSH)，該重組人促卵泡激素包括氨基酸序列如SEQ IDNO :2所示的FSHa亞基蛋白和氨基酸序列如SEQ ID NO :4所示的FSHii亞基蛋白。在本文中，重組表示通過DNA重組技術(shù)獲得的，而不是通過從天然來源分離提取的，例如不是從尿液中提取的。優(yōu)選本發(fā)明第一方面的重組促卵泡激素由如下制備方法制備而得(1)將FSH α亞基基因和FSH β亞基基因可操作地插入真核表達(dá)載體中，獲得能表達(dá)FSH α亞基蛋白和FSH β亞基蛋白的轉(zhuǎn)染載體，其中，F(xiàn)SH α亞基基因包含編碼FSH α亞基蛋白的cDNA序列和上游內(nèi)含子序列，F(xiàn)SHβ亞基基因包含編碼FSHi3亞基蛋白的外顯子 2、內(nèi)含子2和外顯子3序列；(2)將轉(zhuǎn)染載體轉(zhuǎn)染入真核細(xì)胞并培養(yǎng)；和(3)將培養(yǎng)上清液依次經(jīng)超濾、陰離子交換層析、疏水層析、陰離子交換層析、分子排阻層析和陰離子交換層析純化。在本文中，可操作地插入表示根據(jù)基因序列和載體序列將基因插入載體從而能夠進(jìn)行表達(dá)。通常，將基因置于啟動子序列和轉(zhuǎn)錄終止序列之間并保持閱讀框一致。根據(jù)蛋白序列可以推導(dǎo)出大量的基因序列，但是不同基因序列的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的效率會有很大差異。盡管有基于表達(dá)宿主的密碼子使用頻率的優(yōu)化手段，但是基因序列的優(yōu)化仍舊帶有很大的經(jīng)驗性。根據(jù)本發(fā)明人的經(jīng)驗，優(yōu)選本發(fā)明第一方面中，亞基基因序列接近(或優(yōu)選等于)其天然基因序列，優(yōu)選FSHα亞基基因的多核苷酸序列如SEQ ID NO=I 所示，和/或，F(xiàn)SHii亞基基因的多核苷酸序列如SEQ ID Ν0:3所示。這些基因序列與現(xiàn)有報道的相應(yīng)基因序列有差異，直接來自天然狀態(tài)的基因序列，這可能是本發(fā)明的rhFSH能夠高表達(dá)的原因之一。FSH的糖基對其生物活性有著至關(guān)重要的影響，因此需要在能夠糖基化的真核生物細(xì)胞中表達(dá)的載體。優(yōu)選本發(fā)明第一方面中，真核表達(dá)載體是哺乳動物表達(dá)載體，可以是串聯(lián)表達(dá)載體，但更優(yōu)選是雙順反子表達(dá)載體。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，真核表達(dá)載體是pIRES載體。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，該載體與CHO-S細(xì)胞配合，表達(dá)獲得的rhFSH的糖基化模式能夠使得該rhFSH的比活性得到提高。優(yōu)選本發(fā)明第一方面中，將FSHa亞基基因和FSHi^亞基基因分別插入pIRES載體中的Nhe I/EcoR I酶切位點(diǎn)之間和)(ba I/Not I酶切位點(diǎn)之間。這樣的構(gòu)建策略使得 FSHa亞基和β亞基的表達(dá)盡可能不相互干擾，由此可能提高表達(dá)量。FSH有兩個亞基，通過多個二硫鍵相連，因此需要在海量的現(xiàn)有表達(dá)宿主細(xì)胞中選擇出能夠使FSH亞基正確連接的真核細(xì)胞，如哺乳動物細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明人的經(jīng)驗，優(yōu)選本發(fā)明第一方面中，真核細(xì)胞是中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，真核細(xì)胞最優(yōu)選是CHO-S細(xì)胞株。該細(xì)胞株相對于其他CHO細(xì)胞，表達(dá)上清液中rhFSH的純度更高，表達(dá)量也更高，方便了下游的純化工作。優(yōu)選本發(fā)明第一方面中，陰離子交換層析選自DEAE-kpharose FF陰離子交換層析和/或Capto Q陰離子交換層析，更優(yōu)選各步陰離子交換層析不完全相同；疏水層析是 Phenyl Sepharose HP疏水層析；分子排阻層析是kphacryl S-100HR分子排阻層析。這些下游純化手段的組合能夠生產(chǎn)出達(dá)到甚至大大超過藥品標(biāo)準(zhǔn)所需純度的rhFSH。在第二方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含本發(fā)明第一方面的重組促卵泡激素和藥學(xué)上可接受的載體。在本文中，“藥學(xué)上可接受的載體”指無毒固態(tài)、半固態(tài)或液態(tài)填充劑、稀釋劑、緩沖劑、保護(hù)劑、防腐劑、包裹材料或其他制劑輔料。優(yōu)選在本發(fā)明第一個層面的各個方面中，通過注射途徑來給藥，尤其是皮下注射，因此所述藥物組合物優(yōu)選是粉針劑(如凍干粉針劑)和液體制劑。該藥物組合物可通過所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的給藥方式來進(jìn)行給藥，來治療由于FSH不足而引起的疾病?？捎媒o藥方式包括，注射、口服、直腸、 舌下、肺部、透皮、離子透入、陰道及鼻內(nèi)給藥，優(yōu)選胃腸道外給藥，如皮下、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)注射。給藥劑量根據(jù)制劑形式和期望的作用時間以及治療對象的情況而有所變化，實(shí)際治療所需的量可以由臨床醫(yī)生根據(jù)受試者實(shí)際情況(如，病人的病情、體重、年齡、性別等)而方便地確定。在第三方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明第一方面的重組促卵泡激素的制備方法。優(yōu)選所述制備方法包括(1)將FSH α亞基基因和FSHi^亞基基因可操作地插入真核表達(dá)載體中，獲得能表達(dá)FSHa亞基蛋白和FSHii亞基蛋白的轉(zhuǎn)染載體，其中，F(xiàn)SHa亞基基因包含編碼FSHa 亞基蛋白的cDNA序列和上游內(nèi)含子序列，F(xiàn)SHβ亞基基因包含編碼FSHi3亞基蛋白的外顯子2、內(nèi)含子2和外顯子3序列；(2)將轉(zhuǎn)染載體轉(zhuǎn)染入真核細(xì)胞并培養(yǎng)；和(3)將培養(yǎng)上清液依次經(jīng)超濾、陰離子交換層析、疏水層析、陰離子交換層析、分子排阻層析和陰離子交換層析純化。優(yōu)選本發(fā)明第三方面中，亞基基因序列接近(或優(yōu)選等于)其天然基因序列，優(yōu)選 FSHa亞基基因的多核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示，和/或，F(xiàn)SH^亞基基因的多核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示。優(yōu)選本發(fā)明第三方面中，真核表達(dá)載體是哺乳動物表達(dá)載體，可以是串聯(lián)表達(dá)載體，但更優(yōu)選是雙順反子表達(dá)載體。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，真核表達(dá)載體是PlRES載體。優(yōu)選本發(fā)明第三方面中，將FSHa亞基基因和FSHi^亞基基因分別插入pIRES載體中的Nhe I/EcoR I酶切位點(diǎn)之間和)(ba I/Not I酶切位點(diǎn)之間。優(yōu)選本發(fā)明第三方面中，真核細(xì)胞是中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，真核細(xì)胞最優(yōu)選是CHO-S細(xì)胞株。優(yōu)選本發(fā)明第三方面中，陰離子交換層析選自DEAE-kpharose FF陰離子交換層析和/或Capto Q陰離子交換層析，更優(yōu)選各步陰離子交換層析不完全相同；疏水層析是 Phenyl Sepharose HP疏水層析；分子排阻層析是kphacryl S-100HR分子排阻層析。另外，本發(fā)明還提供了基因、載體、細(xì)胞以及細(xì)胞培養(yǎng)物等，其可以作為本發(fā)明第三方面的制備方法中的中間體。具體而言，在第四方面，本發(fā)明提供了 FSHa亞基基因，其包含編碼FSHα亞基蛋白的cDNA序列和上游內(nèi)含子序列，優(yōu)選FSHa亞基蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，F(xiàn)SHa亞基基因的多核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。在第五方面，本發(fā)明提供了 FSHii亞基基因，其包含編碼FSHβ亞基蛋白的外顯子 2、內(nèi)含子2和外顯子3序列，優(yōu)選FSHii亞基蛋白的氨基酸序列如SEQID Ν0:4所示。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，F(xiàn)SHii亞基基因的多核苷酸序列如SEQ ID Ν0:3所示。在第六方面，本發(fā)明提供了載體，其包含本發(fā)明第四方面的基因和/或本發(fā)明第五方面的基因，優(yōu)選包含本發(fā)明第四方面的基因和本發(fā)明第五方面的基因。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，最優(yōu)選的載體是pIRES-FSH-α/β。
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在第七方面，本發(fā)明提供了細(xì)胞，其包含本發(fā)明第四方面的基因和/或本發(fā)明第六方面的基因，或者其轉(zhuǎn)染入了本發(fā)明第六方面的載體。所述細(xì)胞的出發(fā)細(xì)胞優(yōu)選是CHO 細(xì)胞，更優(yōu)選是CHO-S細(xì)胞株。在第七方面，本發(fā)明提供了細(xì)胞上清液，其為培養(yǎng)本發(fā)明第七方面的的細(xì)胞所得的上清液。本發(fā)明的有益效果在于可以替代現(xiàn)有人FSH的使用和制備；本發(fā)明的rhFSH的活性高；本發(fā)明的制備方法能夠表達(dá)具有適宜糖基化模式的高活性rhFSH，而且表達(dá)量高， 培養(yǎng)上清液純度高。為了便于理解，以下將通過具體的附圖和實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指出的是，具體實(shí)例和附圖僅是為了說明，并不構(gòu)成對本發(fā)明范圍的限制。顯然本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以根據(jù)本文說明，在本發(fā)明的范圍內(nèi)對本發(fā)明做出各種各樣的修正和改變，這些修F和改變也納入本發(fā)明的范圍內(nèi)。另外，本發(fā)明引用了公開文獻(xiàn)，這些文獻(xiàn)也是為了更清楚地描述本發(fā)明，它們的全文內(nèi)容均納入本發(fā)明進(jìn)行參考，就好像它們的全文已經(jīng)在本發(fā)明說明書中重復(fù)敘述過一樣。


圖IAFSHa和β亞基基因序列的PCR產(chǎn)物電泳圖，其中上樣樣品為，第1道 分子量標(biāo)記，依次為 0. 5kb, 1. Okb, 1. 5kb, 2. Okb, 2. 5kb, 3. 0kb,4. Okb, 5. 0kb,6. 0kb,8. Okb, 10. Okb ；第 2 道FSH0 亞基基因[約 1. 96kb]；第 3 道FSHa 亞基 CDNA[約 0. 7kb]；第 4 道FSHα亞基基因的內(nèi)含子[約2. IkbJ0圖2本發(fā)明的pIRES-FSH-α/β載體的酶切電泳鑒定圖譜，其中上樣樣品為，第 1 道分子量標(biāo)記，依次為 0. 5kb, 1. Okb, 1. 5kb，2. 0kb，2. 5kb，3. 0kb，4. 0kb，5. 0kb，6. Okb, 8. Okb, 10. Okb ；第 2 道分子量標(biāo)記，依次為 0. 25kb,0. 5kb, 1. Okb, 1. 5kb，2. Okb ；第 3 道未酶切的ρ IRES-FSH- α /β載體作為對照；第4道p IRES-FSH- α/β載體用Nhe I/EcoRI雙酶切；第5道:pIRES-FSH- α/β載體用Xbal/NotI雙酶切。圖3WeStern Blot結(jié)果圖，其中上樣樣品為，第1道蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記；第2道 本發(fā)明的工程細(xì)胞株培養(yǎng)上清液10 μ 1 ；第3道現(xiàn)有5F5細(xì)胞培養(yǎng)上清液10 μ 1作為對照； 第4道從人尿提取的尿源性FSH 10 μ g作為對照。圖4DEAE-kphar0Se陰離子交換層析圖譜，其中箭頭所示的峰經(jīng)檢測有FSH活性。圖5Phenyl Sepharose HP疏水層析圖譜，其中箭頭所示的峰經(jīng)檢測有FSH活性。圖6Capto Q陰離子交換層析圖譜，其中箭頭所示的峰經(jīng)檢測有FSH活性。圖7S印hacryl S-100HR分子排阻層析圖譜，其中箭頭所示的峰經(jīng)檢測有FSH活性。圖SDEAE-kpharose FF陰離子交換層析圖譜，其中箭頭所示的峰經(jīng)檢測有FSH活性。圖9FSH蛋白的SEC-HPLC鑒定圖譜。圖10FSH蛋白亞基的RP-HPLC鑒定圖譜。
具體實(shí)施方式
以下本文將通過具體的實(shí)施例來描述發(fā)明。如未特別指明之處，可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的《分子克隆實(shí)驗指南》(第三版)(Cold Spring Harbor laboratory ^ ess)、《細(xì)胞實(shí)驗指南》(科學(xué)出版社，北京，中國，2001年)、《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊》(科學(xué)出版社，2000)等手冊和相關(guān)藥物法規(guī)、規(guī)定以及本文所引用的參考文獻(xiàn)和所用的試劑、載體等的廠商說明來實(shí)施。另外，實(shí)施例中所使用的材料除有特別說明外，均可通過商業(yè)途徑從市場上購買。實(shí)施例IrhFSH基因的克隆及表達(dá)1，人FSH α亞基基因中內(nèi)含子序列的克隆本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SHa亞基基因中的多個內(nèi)含子盡管不對最終表達(dá)的FSHa 亞基產(chǎn)生影響，但是對FSH α亞基的表達(dá)量產(chǎn)生影響，有的增加表達(dá)，有的卻減少表達(dá)，其中FSHa亞基基因上游的內(nèi)含子能夠顯著增加表達(dá)量，因此保留對這一內(nèi)含子片段進(jìn)行克隆。其克隆采用常規(guī)的PCR法，以人基因組DNA(Clontech公司)為模板進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序依次為95°C 5分鐘，三十個循環(huán)(每循環(huán)94°C 1分鐘，50°C 1分鐘，72°C 1分鐘)， 720C 10分鐘；擴(kuò)增所用的引物如下(分別引入NheI和I^stI酶切位點(diǎn)): 引物 a 1 5 ‘ AAGGTAAGTGCTAGCAAATT3 ‘NheI引物 a 2 5 ‘ TAATCCATGGCGCTCCTGCAGA3 ‘PstIPCR產(chǎn)物在0. 8%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳確認(rèn)，其長度為2. Ikb左右(如圖1所示)。用膠回收試劑盒(美國Qiagen公司)回收該DNA片段后，直接連接，克隆到pGEM -T 載體(美國Promega公司)中，獲得的重組載體命名為TA-alpha-intron。2，人FSH α亞基前體cDNA序列的克隆本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，雖然FSH α亞基前體RNA(編碼116個氨基酸)需要在細(xì)胞內(nèi)多一步剪接過程才能產(chǎn)生成熟的人FSHa亞基(92個氨基酸)，但是用前體進(jìn)行表達(dá)得到的成熟的人FSH α亞基表達(dá)量大于直接使用成熟的人FSH α亞基進(jìn)行表達(dá)，因此保留對人 FSHa亞基前體的cDNA序列進(jìn)行克隆。其克隆采用常規(guī)的PCR法，以從人垂體cDNA文庫(Becton Dickinson Company, BD)為模板進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序依次為95°C 5分鐘，三十個循環(huán)(每循環(huán)94°C 1分鐘， 50°C 1分鐘，72°C 1分鐘)，72°C 10分鐘；擴(kuò)增所用的引物如下(分別引入I^stI和EcoRI酶切位點(diǎn))

引物α 3
5' CATGTCTGTCTGCAGGAGCGCCATGGATTACTACACA 3' PstI
引物 α 4 5 ‘ AGAATTCAGCACTTGGTAAAACATTTAAGATTT3 ‘ EcoRI
PCR產(chǎn)物在0.8%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳確認(rèn)，其長度為600bp左右(如圖1所示)。用膠回收試劑盒回收該DNA片段后，直接連接，克隆到pGEM -T載體中，獲得的重組載體命名為TA-alpha-cDNA。
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3，人FSH β亞基基因序列的克隆本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，直接對包含F(xiàn)SHii基因的外顯子2、內(nèi)含子2和外顯子3的序列的DNA序列進(jìn)行表達(dá)，其中包括了 FSHii的前體以及內(nèi)含子等冗余序列，但是獲得的人 FSH^亞基的產(chǎn)量將顯著提高，因此保留對這一 DNA序列的克隆。其克隆采用常規(guī)的PCR法，以人基因組DNA(Clontech公司)為模板進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序依次為95°C 5分鐘，三十個循環(huán)(每循環(huán)94°C 1分鐘，50°C 1分鐘，72°C 1分鐘)， 720C 10分鐘；擴(kuò)增所用的引物如下(分別引入^CbaI和NotI酶切位點(diǎn)):引物β :5， ATCTAGACCAGACCAGGATGAAGACACTC3’XbaI引物β2:5’ AAGCGGCCGCAAATGTCCACTGATCTTTATTCTT3‘NotIPCR產(chǎn)物在0. 8%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳確認(rèn)，其長度為1. 96kb左右(如圖1所示)。用膠回收試劑盒回收該DNA片斷后，直接連接，克隆到pGEM -T載體中，重組載體命名為 TA-beta。4，重組人FSH雙順反子表達(dá)載體的構(gòu)建對上述構(gòu)建的TA-alpha-intron載體以NheI和PstI (內(nèi)切酶均購自美國 NewEngland Biolabs)雙酶切后，以膠回收試劑盒回收該約2. Ikb的FSHa亞基內(nèi)含子片段；同樣，對上述構(gòu)建的TA-alpha-cDNA載體以I^stI和EcoRI雙酶切后，以膠回收試劑盒回收該約0. 7kb的FSH α亞基cDNA片段。用"Γ4連接酶(美國Promega公司)將上述兩個雙酶切片段與用NheI//EcoRI雙酶切的pIRES載體(美國CL0NTECH公司，Cat. No. 631605)連接，獲得的重組載體命名為pIRES-alpha，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci。抽提轉(zhuǎn)化陽性菌株中的pIRES-alpha，以Nhe I/EcoRI雙酶切，驗證有約2. 7kb的插入片段；測序分析發(fā)現(xiàn)，插入片段具有SEQ ID N0:1所示的DNA序列，我們預(yù)計最終表達(dá)產(chǎn)物是序列如SEQ ID NO :2所示的成熟的FSH α亞基的氨基酸序列。該DNA序列與Genbank等公共數(shù)據(jù)庫中的序列有所差異，包括序列中缺失數(shù)據(jù)庫中相當(dāng)于第10-15位的TCTAGA以及第978-979位的CA，而第186位為T (數(shù)據(jù)庫中為Α)，第769位為G (數(shù)據(jù)庫中為Α)，第1559位為C (數(shù)據(jù)庫中為 Τ)，第1762位為G(數(shù)據(jù)庫中為Α)。對上述構(gòu)建的TA-beta載體以^CbaI和NotI雙酶切后，以膠回收試劑盒回收該約1. 96kb的FSHii亞基片段。用T4連接酶將該雙酶切片段與用)(baI/N0tI雙酶切的pIRES-alpha載體連接，獲得的重組載體命名為pIRES-FSH- α/β,然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5 α。抽提轉(zhuǎn)化陽性菌株中的pIRES-FSH- α t/ β，分別以Xba I/NotI和Nhe I/EcoR I雙酶切，驗證確有約2. 7kb和約1. 96kb的插入片段(如圖2所示)；測序分析發(fā)現(xiàn)，約1. 96kb 的插入片段具有SEQ ID NO :3所示的DNA序列，我們預(yù)計最終表達(dá)產(chǎn)物是序列如SEQ ID NO :4所示的成熟的FSHii亞基的氨基酸序列。該DNA序列與Genbank等公共數(shù)據(jù)庫中的序列有所差異，包括序列中的數(shù)據(jù)庫中相當(dāng)于第44位為A(數(shù)據(jù)庫中為G)。5，rhFSH表達(dá)細(xì)胞株的建立rhFSH需要得到適當(dāng)?shù)奶腔拍鼙ＷC其活性及實(shí)際生產(chǎn)所需的蛋白表達(dá)量，因此，經(jīng)本發(fā)明人研究，需要選用中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)中的CHO-S細(xì)胞(可購自Gibco公司)。采用經(jīng)本發(fā)明人優(yōu)化的Lipofectamine2000法將pIRES-FSH- α /β轉(zhuǎn)染入CHO-S 細(xì)胞中。具體而言，將CHO-S細(xì)胞培養(yǎng)在IOml CHO無血清培養(yǎng)液(JRHBiosciences公司) 中，待其長至1 X IO6個/ml的密度時，以IOOOrmp離心2min，棄去培養(yǎng)液，用CHO無血清培養(yǎng)液洗滌三次，洗滌后離心去除培養(yǎng)液，然后將細(xì)胞用anl CHO無血清培養(yǎng)基重懸；將15 μ g pIRES-FSH- α /β 質(zhì)粒 DNA 和 4δ μ lLipofectamine2000 (購自 hvitrogen 公司)混勻，室溫置10分鐘后，加到上述細(xì)胞懸液中，將該混合液在37°C溫箱中培養(yǎng)6小時后，以SOOrmp 離心5min，棄去上清液，再加8ml新鮮的CHO無血清培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)M小時。然后將培養(yǎng)獲得的細(xì)胞用37°C預(yù)熱的30ml CHO無血清培養(yǎng)液稀釋成細(xì)胞懸液， 取IOml細(xì)胞懸液，用CHO無血清培養(yǎng)液稀釋為40ml，從中取10ml，用CHO無血清培養(yǎng)液繼續(xù)稀釋為50ml，以50 μ 1/孔接種于96孔板(接種細(xì)胞數(shù)為5 X IO2/孔)。以上培養(yǎng)板放入37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)Mh，然后各孔中加入150ul含G418(購自 Amresco公司)的選擇性培養(yǎng)液(即，將G418溶解于CHO無血清培養(yǎng)液中)，其中G418的起始濃度為200μ g/ml。將細(xì)胞重新放置37°C培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每隔3天換選擇性培養(yǎng)液，換的選擇性培養(yǎng)液中G418濃度依次為200 μ g/ml,400 μ g/ml和1000 μ g/ml。G418濃度遞加至lmg/ml培養(yǎng)14 18天，對照的CHO-S空白細(xì)胞全部死亡時，轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞出現(xiàn)存活的克隆。收集細(xì)胞克隆并更換G418濃度為800 μ g/ml的選擇性培養(yǎng)液培養(yǎng)，作為表達(dá)FSH的工程細(xì)胞株。經(jīng)FSH檢測ELISA試劑盒(美國R&D公司)檢測，存活的克隆表達(dá)水平高，其rhFSH的表達(dá)水平為2 μ g/106細(xì)胞/24hr，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于現(xiàn)有5F5細(xì)胞的表達(dá)量；經(jīng) Western Blot檢測，其表達(dá)的rhFSH為單一條帶，均一性優(yōu)于提取自人尿的尿源性FSH(如圖3所示)。重復(fù)該培養(yǎng)步驟均能獲得工程細(xì)胞株。實(shí)施例2rhFSH的純化及鑒定取實(shí)施例1的工程細(xì)胞株的培養(yǎng)上清液1000ml，過截留分子量為IOkD的超濾膜， 取濾液上樣于用含 0. lmol/L NaCl 的 20mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)平衡的 DEAE Sepharose FF陰離子交換層析柱(GE Healthcare公司)并收集流穿液(見附圖4)；增加此步驟收集的流穿液的鹽離子濃度使之達(dá)到0. 5mol/L NaCl，上樣Phenyl Sepharose HP層析柱(GE Healthcare公司)進(jìn)行層析，并用20mmol/LTriS-HCl (pH 8.0)緩沖液洗脫，收集洗脫液中 ELISA法檢測含F(xiàn)SH的峰(見圖幻；將收集的洗脫液上樣Capto Q層析柱(GE Healthcare 公司)進(jìn)行層析，并分別用含 0. 02mol/L NaCl 的 20mmol/L Tris-HCl (pH 8. 0)及含 0. Imol/ LNaCl的20mmOl/LTriS-HCl(pH 8.0)進(jìn)行階段洗脫，并收集洗脫液，ELISA法檢測后活性級分為用含0. Imol/LNaCI的20mmol/LTriS-HCl (pH 8. 0)洗脫的洗脫液(見圖6)，并收集；將收集液直接上樣于已經(jīng)用10mmol/LTris-HCl(pH 8. 0)平衡好的kphacryl S-100HR 層析柱(GE Healthcare公司)并按照紫外吸收值進(jìn)行收集洗脫液中FSH純度較高部分 (見圖7)，將收集液上樣于DEAE Sepharose FF層析柱，分別用含0. 02M NaCl的IOmmol/L Tris-HCl (pH 8. 0)及含 0. 08mol/LNaCl 的 10mmol/L Tris-HCl (pH 8. 0)進(jìn)行階段洗脫，并收集洗脫液(見圖8)。即獲得了純化的rhFSH，任選可進(jìn)一步冷凍干燥而濃縮。該純化的rhFSH水解后經(jīng)SDS聚丙烯酰氨凝膠電泳鑒定，經(jīng)上述過程純化得到的 rhFSH經(jīng)SEC-HPLC(Agilent Technologies公司)鑒定(圖9)，峰位與我們預(yù)測的理論值一致，純度達(dá)到99%;經(jīng)反相HPLC鑒定(圖10)，產(chǎn)物中的兩個亞基分子量都與我們預(yù)測的理論值一致，表明通過篩選得到的FSH工程細(xì)胞能夠正確剪接并且轉(zhuǎn)化前體蛋白，具有正確的亞基結(jié)構(gòu)，而其糖基化后的產(chǎn)物的分子量在43KD左右，表明經(jīng)上述純化過程能夠保留 rhFSH的糖基化模式，從而保證了表達(dá)FSH的高活性。 采用常規(guī)的大鼠卵巢增重法(劉志勇，等.高純度卵泡刺激素效價及相關(guān)指標(biāo)的檢測.江西醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2004年，第1期)，通過比較FSH標(biāo)準(zhǔn)品(WHO生物活性標(biāo)準(zhǔn)品 96/642)與經(jīng)上述過程純化得到的rhFSH對雌性幼大鼠卵巢增重的程度，以確定本發(fā)明的糖基化模式的rhFSH的效價。結(jié)果顯示，該rhFSH的體內(nèi)生物學(xué)比活為12390IU/mg。
權(quán)利要求
1.高比活性的重組促卵泡激素，優(yōu)選是重組人促卵泡激素(rhFSH)，其比活性大于 12200IU/mg，優(yōu)選大于 12300IU/mg，最優(yōu)選為 12350 12400IU/mg，如 12390IU/mg。
2.權(quán)利要求1所述的重組促卵泡激素，其由如下制備方法制備而得(1)將FSHα亞基基因和FSHβ亞基基因可操作地插入真核表達(dá)載體中，獲得能表達(dá) FSHa亞基蛋白和FSHii亞基蛋白的轉(zhuǎn)染載體，其中，F(xiàn)SHa亞基基因包含編碼FSHa亞基蛋白的cDNA序列和上游內(nèi)含子序列，F(xiàn)SHβ亞基基因包含編碼FSHβ亞基蛋白的外顯子2、 內(nèi)含子2和外顯子3序列；(2)將轉(zhuǎn)染載體轉(zhuǎn)染入真核細(xì)胞并培養(yǎng)；和(3)將培養(yǎng)上清液依次經(jīng)超濾、陰離子交換層析、疏水層析、陰離子交換層析、分子排阻層析和陰離子交換層析純化。
3.權(quán)利要求2所述的重組促卵泡激素，其中，F(xiàn)SHa亞基基因的多核苷酸序列如SEQID NO :1所示，和/或，F(xiàn)SH^亞基基因的多核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。
4.權(quán)利要求2所述的重組促卵泡激素，其中，真核表達(dá)載體是哺乳動物表達(dá)載體，優(yōu)選是PlRES載體。
5.權(quán)利要求4所述的重組促卵泡激素，其中，將FSHα亞基基因和FSHβ亞基基因分別插入PlRES載體中的Nhe I/EcoR I酶切位點(diǎn)之間和)(ba I/Not I酶切位點(diǎn)之間。
6.權(quán)利要求2所述的重組促卵泡激素，其中，真核細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞，優(yōu)選是中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)，更優(yōu)選是CHO-S細(xì)胞。
7.權(quán)利要求2所述的重組促卵泡激素，其中，陰離子交換層析選自DEAE-kpharoseFF 陰離子交換層析和/或Capto Q陰離子交換層析，疏水層析是Wienyl Sepharose HP疏水層析，分子排阻層析是kphacryl S-100HR分子排阻層析。
8.藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-7之任一所述的重組促卵泡激素和藥學(xué)上可接受的載體。
9.如權(quán)利要求2-7之任一所述的重組促卵泡激素的制備方法。
10.可用于權(quán)利要求9所述的重組促卵泡激素的制備方法中的中間體，其選自(a)FSH α亞基基因，其包含編碼FSH α亞基蛋白的cDNA序列和上游內(nèi)含子序列，優(yōu)選其多核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示；(b)FSH^亞基基因，其包含編碼FSHβ亞基蛋白的外顯子2、內(nèi)含子2和外顯子3序列， 優(yōu)選其多核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示；(c)載體，其包含(a)和/或(b)所述的基因，優(yōu)選其為pIRES-FSH-α/β；(d)細(xì)胞，優(yōu)選是CHO細(xì)胞，更優(yōu)選是CHO-S細(xì)胞，其包含(a)和/或(b)所述的基因， 或者其轉(zhuǎn)染入了(c)所述的載體；或(e)細(xì)胞上清液，其為培養(yǎng)(d)所述的細(xì)胞所得的上清液。
全文摘要
本發(fā)明提供了高比活性的重組人促卵泡激素和其制備方法。另外，本發(fā)明還提供了該制備方法中所用的中間體，包括基因、載體和細(xì)胞。
文檔編號A61K38/24GK102295695SQ201110269900
公開日2011年12月28日 申請日期2011年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月14日
發(fā)明者丁麗艷, 劉洪霞, 尉繼征, 石欣欣, 郝鵬, 金磊 申請人:長春金賽藥業(yè)股份有限公司