專利名稱：一類飽和胺類化合物在制備外周血造血干細(xì)胞動(dòng)員藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及化合物的新用途，特別是涉及一類飽和胺類化合物(代號(hào)TA01)在制 備外周血造血干細(xì)胞動(dòng)員藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
成人骨髓是血細(xì)胞再生的場所，也是形成血管的內(nèi)皮祖細(xì)胞，能分化為脂肪細(xì)胞、 軟骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞的間充質(zhì)干細(xì)胞等，是干細(xì)胞或祖細(xì)胞的儲(chǔ)存場所。早期的研究顯示， 化療康復(fù)的患者外周血中造血祖細(xì)胞增加，因此認(rèn)識(shí)到造血干細(xì)胞和造血祖細(xì)胞可從骨髓 誘導(dǎo)出來，稱之為"干細(xì)胞動(dòng)員"，這些被動(dòng)員的細(xì)胞可以聚集，也可以再返回骨髓行使其造 血功能。誘導(dǎo)入血的造血細(xì)胞可用于移植。新的干細(xì)胞的誘導(dǎo)分離相關(guān)研究結(jié)果顯示，造 血干細(xì)胞的定量、定性研究及其潛在的作用和外周血造血干細(xì)胞移植的療效是目前研究的 熱點(diǎn)。 粒細(xì)胞集落剌激因子(G-CSF)對(duì)外周血干細(xì)胞的誘導(dǎo)作用 多種因子均可通過不同的作用誘導(dǎo)外周血干細(xì)胞移出，提示在這條導(dǎo)致干細(xì)胞移 出的通路上具有多種調(diào)節(jié)機(jī)制。多種因子的協(xié)同和聯(lián)合作用下，可以誘導(dǎo)一定性質(zhì)和(或) 數(shù)量的干細(xì)胞移植。G-CSF是臨床干細(xì)胞移植的主要誘導(dǎo)劑，其對(duì)外周血干細(xì)胞的誘導(dǎo)作用 比骨髓和臍帶血干細(xì)胞強(qiáng)，而且使中性粒細(xì)胞和血小板恢復(fù)更快，需要輸注的血小板更少， 淋巴細(xì)胞重建更快，相關(guān)的炎癥發(fā)生率及病死率更低。與G-CSF相比，應(yīng)用化學(xué)方法誘導(dǎo)外 周血干細(xì)胞移植(PBSC)后血細(xì)胞計(jì)數(shù)的恢復(fù)時(shí)間更長，發(fā)熱等并發(fā)癥及需要輸血的量更 多。而且經(jīng)化學(xué)方法攝取的外周血干細(xì)胞在進(jìn)行同種異體移植時(shí)已失去活性。PBSC的采集 避免了骨髓采集的侵入性操作及常規(guī)麻醉相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)。為適合移植的配對(duì)及HLA的配型， 已可以清除其中的1 3種成分，而且可以保證明其單倍同一性?；贕-CSF的干細(xì)胞移植 耐受性好，盡管偶有脾破裂發(fā)生。大部分供者可以完成足夠移植干細(xì)胞的采集。雖然尚無 明確成功移植的PBSC最低移植量的閥值，但輸注的CD34+細(xì)胞數(shù)低于2 X 106/kg可能與移 植失敗有關(guān)。較高的CD34+細(xì)胞劑量可能產(chǎn)生急性或慢性移植物抗宿主病的發(fā)生率增加的 消極作用，卻可能產(chǎn)生整體患者生存率增加的積極作用。細(xì)胞亞型，尤其是T細(xì)胞及CD14+ 單核細(xì)胞，可影響移植效果。PBSC質(zhì)量和數(shù)量的變化均可明顯影響移植的效果。
25%的患者，尤其是淋巴瘤患者、多發(fā)性骨髓、急性白血病以及10% _20%的正常 人，G-CSF對(duì)干細(xì)胞的動(dòng)員作用較差，需要擴(kuò)大清除成分的范圍。此外，這種動(dòng)員無力還發(fā) 生在廣泛治療的癌癥患者、遺傳缺陷如Fanconi貧血患者。新近的研究PBSC動(dòng)員及自身移 植治療恢復(fù)期再生障礙性貧血的結(jié)果顯示，應(yīng)用G-CSF收集PBSC只在小部分患者中可行， 在供者和患者中，G-CSF的動(dòng)員作用存在很大的個(gè)體差異。擴(kuò)大同種異體移植的應(yīng)用，尤其 是接受配對(duì)移植物移植的重癥患者、接受具有耐受原的器官移植患者、非致命性遺傳缺陷 病患者，需要更大劑量的動(dòng)員干細(xì)胞來克服HLA障礙而獲得持久的干細(xì)胞植入，促進(jìn)白細(xì) 胞活性恢復(fù)，減少移植物抗宿主病的發(fā)生。到目前，造血干細(xì)胞移植已成為治療白血病的主要手段之一。然而，昂貴的治療費(fèi)用使許多白血病患者喪失了生的希望。我國每年新增白 血病患者四五萬人，加上歷年累計(jì)的患者，全國有近百萬名白血病患者需要接受造血干細(xì) 胞移植治療，接受造血干細(xì)胞移植通常需要花費(fèi)30萬元，這對(duì)于普通家庭來說無異于天文 數(shù)字。目前臨床上通過G-CSF的作用使造血干/祖胞從骨髓進(jìn)入外周血，采集與患者有一 定血緣關(guān)系的人的造血干細(xì)胞，這是人們通常的采集干細(xì)胞的做法。然而，通過此種方法采 集造血干細(xì)胞進(jìn)行干細(xì)胞移植，其操作起來程序相當(dāng)繁雜，為了達(dá)到移植所需要的量必須 采用外科手術(shù)。這是由于G-CSF是通過間接的作用實(shí)現(xiàn)造血干/祖細(xì)胞的動(dòng)員的，首先誘 使一種金屬蛋白酶的釋放來干擾CXCR4/SDF-1的相互作用，從而導(dǎo)致干細(xì)胞的釋放。干細(xì) 胞供者不得不進(jìn)行4-6天的藥物注射，而醫(yī)院不同部門、人員之間的協(xié)調(diào)也都是必須的。
雖然G-CSF已成功應(yīng)用，但要獲得明顯的臨床突破還有大量的問題需要解決，特 別是干細(xì)胞劑量，不同患者的最適誘導(dǎo)及個(gè)體差異，需清除的成分，最佳動(dòng)員時(shí)間及移植成 分控制等。 骨髓作為成人干細(xì)胞的貯存場所有助于組織修復(fù)，問題是動(dòng)員藥物是否可以動(dòng)員 除HSC外的其它干細(xì)胞，是否有新的藥物可特異的動(dòng)員成人干細(xì)胞。 已知的飽和胺類化合物已收錄于小分子化合物庫中，它是氫鍵的受體，通過氫 鍵和特殊空間位點(diǎn)與蛋白和碳水化合物作用，屬于一類新型醫(yī)藥中間體(Rozenbaum W，
Antimoniotungstate(HPA—23)treatment of three patients with AIDS and one
withprodrome， Lancet, 1985， 1 :450-451)，其已知的用途有可以介入HIV病毒進(jìn)入T細(xì)胞、 炎癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、哮喘和血管損傷等方面的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一類飽和胺類化合物TA01的新用途，即在制備外周血造血干細(xì)胞 動(dòng)員藥物中的應(yīng)用。 所述化合物TA01具有式I所示的分子式其中，& = H、 CH3、 CH2CH3， R2 = H、 CH3、 CH2CH3 ;優(yōu)選& = R2 = CH3。
本發(fā)明的藥物可采用注射劑的劑型。 所述注射劑的溶劑的選擇是多種多樣的，如pH7. 5-8. 5的TE緩沖液、生理鹽水、 PBS或滅菌蒸餾水等，優(yōu)選為pH7. 5-8. 5的TE緩沖液。 需要的時(shí)候，在上述藥物中還可以加入一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。所述載 體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑等。 上述藥物的用量一般為5mg/kg體重/day,療程一般為1_2天。劑量和療程都可根
4據(jù)實(shí)際情況調(diào)整。 本發(fā)明提供了飽和胺類化合物TAOl的新用途，即在制備外周血造血干細(xì)胞動(dòng)員 藥物中的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)證明，該化合物能夠有效的動(dòng)員骨髓中的造血干細(xì)胞，是一類新型的造 血干細(xì)胞動(dòng)員劑。TAOl能動(dòng)員較大劑量的造血干細(xì)胞，采集PBSC比較方便，采集時(shí)無需麻 醉，也無需多部位穿剌骨髓抽髓引起的痛苦；對(duì)于部分侵犯骨髓的患者和多發(fā)性骨髓瘤的 患者，由于骨質(zhì)破壞或腫瘤細(xì)胞浸潤骨髓，及骨盆局部放療等原因無法采集骨髓時(shí)，可采集 PBSC;移植后造血功能恢復(fù)快，移植后感染、出血等并發(fā)癥少，減少了抗生素和成分輸血的 應(yīng)用，降低了移植相關(guān)死亡率，縮短了住院時(shí)間，節(jié)減了費(fèi)用；與骨髓相比，外周血中腫瘤細(xì) 胞混入的少。本發(fā)明將在外周血造血干細(xì)胞動(dòng)員藥物的研究和開發(fā)中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用 前景廣闊。 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。


圖1為TAO1合成過程示意圖 圖2為TAOl能提高小鼠外周血中CD34+細(xì)胞含量的檢測結(jié)果
圖3為TAOl能提高小鼠外周血中WBC含量的檢測結(jié)果 圖4為TAOl能提高小鼠外周血中單個(gè)核所產(chǎn)生的CFU數(shù)，也能提高小鼠外周血中 單個(gè)核所產(chǎn)生的CFU-GM數(shù)的檢測結(jié)果 圖5為注射TAOl動(dòng)員的外周血中單個(gè)核能提高照射致死劑量小鼠存活率的檢測 結(jié)果
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。
實(shí)施例1、TA01的合成 如圖l所示流程，用本發(fā)明的方法合成TAOl。參考文獻(xiàn)①梅光泉，e， 13'， P 〃 _三氨基三乙基胺合成方法的改進(jìn)，贛南師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，3 :55-56，②Kimura E等，Cleavage of amino acid esters and peptides with hydroxo叫ue (2， 2 '， 2〃 _triaminotriethylamine)cobalt(III) ion， Inorg. Chem， 1970，9(5) :1187)。具體方包 括以下步驟 鄰苯二甲酰亞胺鉀的合成(I) 在裝有1600ml無水乙醇的圓底燒瓶中，加入80.0g鄰苯二甲酰胺，加熱回流0.5h， 僅有少量的原料未溶；用傾析法將此熱溶液倒入30. 5g氫氧化鉀混合液中(30ml水和90ml 乙醇)，立即生成白色沉淀，冷卻后過濾，回收乙醇，產(chǎn)品用200ml丙酮洗滌，得產(chǎn)品98. Og， 產(chǎn)率合98.0%。 N-P-溴乙基鄰苯二甲酰亞胺的合成(II) 在裝配有攪拌器及回流冷凝管的圓底燒瓶中放入150g鄰苯二甲酰亞胺鉀， 450gl，2-二溴乙烷，將混合物置于油浴，加熱12h，保持油浴溫度在180 19(TC，然后再改 用冷凝管將過量的1， 2- 二溴乙烷減壓蒸出，回收得到約290g。在上面粗制的N- 13 -溴乙基 鄰苯二甲酰亞胺和KBr的混合物中，加入30ml乙醇，回流O. 5h，直到黑色油狀物完全溶解為止?；旌弦撼脽徇^濾，并用少量熱乙醇洗滌KBr沉淀，合并濾液，減壓蒸盡乙醇。將上述干燥的剩余物加入500ml CS2溶劑中回流15 20min，趁熱過濾，在減壓下
蒸去CS2，得到淺褐色晶體131.0g，產(chǎn)率63.6X，熔點(diǎn)78 80°C . |3 ， |3 ' ， |3 〃 -三鄰苯二甲酰亞胺基三乙基胺的合成(III) 將46. Og產(chǎn)物(II)加熱溶化，維持在140 150°C ，通入過量干燥NH3，反應(yīng)5 8h，往混合物中加入450ml乙醇，加熱回流0. 5h，過濾，沉淀用熱乙醇洗，再經(jīng)少量水洗滌， 用冰乙酸重結(jié)晶，得白色晶體25. 2g產(chǎn)率78.0X，溶點(diǎn)為187.5°C。
|3 ， |3 ' ， |3 〃 -三氨基三乙基胺鹽酸的合成(IV) 往20. Og產(chǎn)物(III)中滴加50ml濃HCL，溫度控制在15(TC左右，反應(yīng)2h，濃縮至 原體積的一半左右，濾去鄰苯二甲酸沉淀，用4倍熱乙醇處理濾液，靜置一晝夜，析出白色 晶體8. Og產(chǎn)率為84. 0%，熔點(diǎn)283°C。
|3 ， |3 ' ， |3 〃 -三氨基三乙基胺的合成(V) 取6. Og產(chǎn)物(IV)與2. 6gK0H混合均勻(摩爾比為1 : 2)，不斷振蕩，加入少許 K2C03吸收水，胺則從水相中分出，可以聞到濃烈的剌鼻臭味，塞緊容器。 一晝夜后過濾，在 分液漏斗中收集兩層濾液，胺處于淡黃色溶液的上層，減壓蒸餾，得一清晰透明的液體，液 體再經(jīng)金屬鈉干燥后減壓蒸餾，收集135°C /9mm Hg餾分，得到無色稠液體，產(chǎn)品重1. 6g，產(chǎn) 率為47. 2%。 三(2-(二甲氨基)乙基)胺的合成(VI)
化合物V進(jìn)行甲基化反應(yīng)，得到化合物VI 。 合成的飽和胺類化合物為三(2-(二甲氨基)乙基)胺，以下實(shí)驗(yàn)均以此化合物為 例。當(dāng)然，該化合物也可用其它已公開文獻(xiàn)介紹的方法合成。 同樣，式I表示的其它化合物可按已公開文獻(xiàn)方法合成，或參照以上合成操作改 變相應(yīng)基團(tuán)后合成，本發(fā)明不再一一詳述。 實(shí)施例2、 TA01能提高小鼠外周血中CD34+細(xì)胞的含量 9只雄性C57小鼠(購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，隨機(jī)分 成三組，DMSO(購自北化)組3只，G-CSF(購自廈門特寶生物工程股份有限公司)組3只， TA01組3只，每只小鼠按5mg/kg體重計(jì)算注射量，注射劑的溶劑為pH7. 5_8. 5的TE緩沖 液。皮下注射4h后，剪尾取100 ii L血液，按1 : 10的比例加入紅細(xì)胞裂解液(購自晶美 生物工程有限公司)，混勻，室溫靜置10-15min， 1500rpm/min離心6min，棄去上清，加入1 % 的血清(購自Hyclone公司)100ul，吹打混勻，加入0. 75ul —抗(Purified anti-mouse CD34，購自Biolegend公司，超凈臺(tái)中操作)，混勻，室溫孵育l-2h。補(bǔ)含有1X血清的PBS 至1. 5ml， 1500rpm/min離心5min，棄去上清，加入1%的血清100ul，吹打混勻，加入2ul 二 抗(羊抗小鼠，F(xiàn)ITC標(biāo)記，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，混勻，室溫孵育30min。 補(bǔ)含有1X血清的PBS至1. 5ml，1500rpm/min離心5min，棄去上清，加入1X的血清500ul， 吹打混勻，流式細(xì)胞儀檢測CD34+細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。從結(jié)果中(如圖2所示)可以看出，較 DMSO組和G-CSF組，TA01能提高小鼠外周血中CD34+細(xì)胞的含量。
實(shí)施例3、 TA01能提高小鼠外周血中白細(xì)胞(WBC)的含量 9只雄性C57小鼠，隨機(jī)分成三組，DMSO組3只，G-CSF組3只，TA01組3只，每只 小鼠按5mg/kg體重計(jì)算注射量，注射劑的溶劑為pH7. 5-8. 5的TE緩沖液。皮下注射4h后，
6剪尾取10 L血液，加入2mL血細(xì)胞稀釋液(購自濟(jì)南博萊生物技術(shù)有限公司)，細(xì)胞分析 儀檢測WBC的含量。從結(jié)果中(如圖3所示，*表示與匿S0組相比有顯著性差異)可以看 出，較匿S0組和G-CSF組，TA01能提高小鼠外周血中WBC的含量。 實(shí)施例4、TA01能提高小鼠外周血中單個(gè)核所產(chǎn)生的CFU數(shù)，也能提高小鼠外周血 中單個(gè)核所產(chǎn)生的CFU-GM(粒單系造血組細(xì)胞集落)數(shù) 9只雄性C57小鼠，隨機(jī)分成三組，DMSO組3只，G-CSF組3只，TA01組3只，每只 小鼠按5mg/kg體重計(jì)算注射量，注射劑的溶劑為pH7. 5-8. 5的TE緩沖液。皮下注射4h后， 摘眼球取血，10ml離心管事先用肝素(購自天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司)清洗一 遍，混勻后，補(bǔ)PBS(購自Hyclone公司)至5ml，混勻。小鼠淋巴細(xì)胞分離液(購自天津?yàn)?洋生物制品科技有限責(zé)任公司)預(yù)先分裝成5ml/管(超凈臺(tái)中操作)，將與PBS混勻的血 液輕輕的注入分離液的上層，2000rpm/min離心20min。將中間白白的一層細(xì)胞吸入10ml離 心管中，補(bǔ)PBS至10ml，混勻，1500rpm/min離心5min，棄去上層PBS，補(bǔ)PBS至10ml，混勻， 1500rpm/min離心5min，棄去上層PBS，補(bǔ)PBS至lml，混勻，細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。計(jì)算每毫升 血液中單個(gè)核的數(shù)量，并將之與500 L半固體培養(yǎng)基(配方為0. 9%甲基纖維素，15%胎 牛血清，100U/ml青霉素/鏈霉素，lmM丙酮酸鈉，2mM谷氨酰胺，2mM PFHM 11 ， 200 y g/ml轉(zhuǎn) 鐵蛋白，1% BSA，O. 45mM MTG， 30% MDM， 50ng/ml SCF， lOng/ml TPO， lOng/ml IL_3， lOng/ ml IL-ll， lOng/ml GM_CSF，3U/ml EPO)，混勻，37°C 、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，對(duì)總CFU和 CFU-GM進(jìn)行計(jì)數(shù)。從結(jié)果(如圖4所示，*表示與匿SO組相比有顯著性差異)可以看出， 較匿SO組和G-CSF組，TAOl能提高小鼠外周血中單個(gè)核所產(chǎn)生的CFU數(shù)，也能提高小鼠外 周血中單個(gè)核所產(chǎn)生的CFU-GM數(shù)。 實(shí)施例5、注射TA01動(dòng)員的外周血中單個(gè)核能提高照射致死劑量小鼠的存活率9 只雄性C57小鼠，隨機(jī)分成三組，用6°Co y射線進(jìn)行全身照射，劑量率2. 72Gy/min，照射量 7. OGy。 9只雄性C57小鼠，隨機(jī)分成三組，DMSO組3只，G-CSF組3只，TAOl組3只，每只小 鼠按5mg/kg體重計(jì)算注射量，注射劑的溶劑為pH7. 5-8. 5的TE緩沖液。皮下注射4h后，摘 眼球取血，10ml離心管事先用肝素清洗一遍，混勻后，補(bǔ)PBS至5ml，混勻。小鼠淋巴細(xì)胞分 離液(購自天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司)預(yù)先分裝成5ml/管(超凈臺(tái)中操作)， 將與PBS混勻的血液輕輕的注入分離液的上層，2000rpm/min離心20min。將中間白白的一 層細(xì)胞吸入10ml離心管中，補(bǔ)PBS至10ml，混勻，1500rpm/min離心5min，棄去上層PBS，補(bǔ) PBS至10ml ，混勻，1500rpm/min離心5min，棄去上層PBS，補(bǔ)PBS至0. 5ml ，混勻。將得到的 單個(gè)核細(xì)胞尾靜脈注射至經(jīng)致死劑量照射的小鼠體內(nèi)，觀察小鼠在30天內(nèi)的存活數(shù)量。從 結(jié)果(如圖5所示)可以看出，較匿SO組和G-CSF組，注射TAOl動(dòng)員的外周血中單個(gè)核能 提高照射致死劑量小鼠的存活率。 以上實(shí)驗(yàn)以三(2-(二甲氨基)乙基)胺為例，驗(yàn)證了式I表示的化合物能有效動(dòng) 員骨髓中的造血干細(xì)胞。本發(fā)明用同樣方法也驗(yàn)證了式I表示的其它化合物也具有類似效 果，這里不再一一詳述實(shí)驗(yàn)過程。
權(quán)利要求
一類飽和胺類化合物在制備外周血造血干細(xì)胞動(dòng)員藥物中的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述飽和胺類化合物具有式I所示的分子式其中，& = H、 CHy或CH2CH3， R2 = H、 CH 或CH2CH3。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述飽和胺類化合物式中，1^ = R2 = CH3，命名為三(2-(二甲氨基)乙基)胺。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物的劑型為注射劑。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述注射劑的溶劑為pH 7. 5-8.5的TE緩沖液、生理鹽水、PBS或滅菌蒸餾水。
全文摘要
本發(fā)明提供了一類飽和胺類化合物的新用途，即其在制備外周血造血干細(xì)胞動(dòng)員藥物中的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)證明，該化合物(代號(hào)TA01)能夠有效的動(dòng)員骨髓中的造血干細(xì)胞，是一類新型的造血干細(xì)胞動(dòng)員劑。本發(fā)明將在外周血造血干細(xì)胞動(dòng)員藥物的研究和開發(fā)中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號(hào)A61P35/00GK101716167SQ20091024172
公開日2010年6月2日 申請(qǐng)日期2009年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月8日
發(fā)明者任祥亮, 南雪, 呂洋, 岳 文, 師偉, 施雙雙, 李艷華, 裴雪濤, 陳琳 申請(qǐng)人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所