專利名稱：包含皮質(zhì)類固醇和Hedgehog/平滑信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑的藥物組合物的制作方法
包含皮質(zhì)類固醇和Hedgehog/平滑信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑的藥物組合物
本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2003年03月17日、申請(qǐng)?zhí)枮?3808784.7 (國(guó) 際申請(qǐng)?zhí)枮镻CT7TR03/00017 )、發(fā)明名稱為"環(huán)杷明在治療牛皮癬和其它 皮膚病中的用途"的發(fā)明申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
背景技術(shù)：
細(xì)胞分化在產(chǎn)生多細(xì)胞生物體.中起關(guān)鍵作用。在人體中，許多組織中的 細(xì)胞不僅在發(fā)育過(guò)程中、而且在出生后的生命中進(jìn)行分化以產(chǎn)生生物體發(fā)揮 正常功能所需的新細(xì)胞類型。從一種細(xì)胞類型分化成另一種細(xì)胞類型的信號(hào) 可以來(lái)源于直接環(huán)境中的其它細(xì)胞和非細(xì)胞組織成分和/或來(lái)源于更遠(yuǎn)離的 組織和器官(例如激素形式)。細(xì)胞對(duì)新信號(hào)的反應(yīng)的確定也是復(fù)雜的且取決 于信號(hào)的性質(zhì)或信號(hào)組以及所述細(xì)胞更多的內(nèi)在特征(例如其分化狀態(tài)和染 色質(zhì)結(jié)構(gòu))。在人每天的生活過(guò)程中，許多細(xì)胞通過(guò)不同機(jī)制損耗(由于急性 和慢性損害和因其它原因?qū)е碌某绦蛐约?xì)胞死亡)。這些損耗的細(xì)胞一般被
其前體、先祖細(xì)胞和干細(xì)胞受到調(diào)節(jié)的增殖和分化所取代。人皮膚對(duì)環(huán)境損 害(例如物理性創(chuàng)傷)比對(duì)許多內(nèi)部組織具有相對(duì)更大的敏感性，但充分適應(yīng) 于這些情況且表現(xiàn)出其最外層的恒定損耗和取代。從表皮最外層脫落的死亡
表現(xiàn)一般易于檢測(cè)到。涉及非表皮細(xì)胞分化障礙的皮膚病也是可變的。這些 疾病主要原因中的差異導(dǎo)致其有不同的表現(xiàn)和臨床表現(xiàn)，而細(xì)胞分化異常是 它們中的一致特征。已知表現(xiàn)出細(xì)胞分化異常的皮膚病的非限制性實(shí)例包括 尋常鱗癬、片層狀魚(yú)鱗癬、掌跖角化病、毛發(fā)紅糠滲、毛嚢角化病和幾種類 型的皮膚腫瘤。這些皮膚病的原因一般難以理解。然而，細(xì)胞分化調(diào)節(jié)的復(fù) 雜性和多種調(diào)節(jié)因素的存在意味著分化異常有時(shí)可能是主要影響其它過(guò)程 的異常所繼發(fā)的。在不清楚地了解原因和機(jī)理的情況下，可用的這些疾病的 治療策略 一 般難以有效(Braun-Falco O.等(2000) Dermatology, 2nd ed., Springer-Verlag, Berlin)。環(huán)杷明是天然存在于藜,屬植物中的甾類生物堿。這些植物對(duì)食草妊娠
動(dòng)物的致畸性使得將環(huán)杷明鑒定為活性化合物(Keeler R. F. (1969) Phytochemistry 8: 223-225)。環(huán)杷明如何可以表現(xiàn)出致畸性通過(guò)它是 hedgehog/平滑信號(hào)傳導(dǎo)的抑制劑這一發(fā)現(xiàn)而得到揭示(Incardona J. R等(1998) Development 125: 3553-3562; Cooper M. K.等(1998) Science 280: 1603-1607)。 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)聲hedgehog蛋白誘導(dǎo)發(fā)育中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中腹細(xì)胞前體的分化 (GoodrichL.V.等(1998) Neuron 21: 1243-1257)。因此，用環(huán)杷明在發(fā)育中的 小雞大腦中抑制hedgehog/平滑信號(hào)傳導(dǎo)途經(jīng)與防止腹細(xì)胞形成有關(guān)且由此 與前腦無(wú)裂畸形有關(guān)(Incardona J.P.等(1998) Development 125 : 3553-3562; CooperM.K.等(1998) Science 280: 1603-1607)。已知前腦無(wú)裂畸形為以藜, 屬為食的綿羊羊羔的常見(jiàn)畸形(Binns W.等(1963) Am J. Vet. Res. 24: 1164-1175)。據(jù)報(bào)導(dǎo)環(huán)杷明還抑制其它系統(tǒng)中的細(xì)胞分化，包括骨髓細(xì)胞分 化成紅細(xì)胞(DetmerK.等(2000) Dev. Biol. 222: 242)和尿殖竇分化成前列腺 (Berman D. M.等(2000) J. Urol. 163: 204)。
從上述現(xiàn)有技術(shù)概括的教導(dǎo)中令人意外和相反的發(fā)現(xiàn)環(huán)杷明起抑制細(xì) 胞分化的作用(Incardona J. P.等(1998) Devel叩ment 125: 3553-3562; Co叩erM. K.等(1998) Science 280: 1603-1607; Detmer K.等(2000) Dev. Biol. 222-242; Berman D.M.等(2000) J. Urol. 163 : 204),我們發(fā)現(xiàn)環(huán)杷明顯著誘導(dǎo)表現(xiàn)出細(xì) 胞分化抑制的基底細(xì)胞癌細(xì)胞分化(TasS.等(2001 )PCT/TR01/00027， WO 02/078703).。類似地，環(huán)杷明能夠使牛皮癬損害表皮的表皮細(xì)胞恢復(fù)正常分 化(Tas S.等(2002) PCT/TR02/00017, WO 02/078704)。此外，從上述報(bào)導(dǎo)中令 人意外地發(fā)現(xiàn)環(huán)杷明對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的存活力沒(méi)有不良影響(Taipale J.等(2000) Nature 406: 1005-1009)，環(huán)杷明-誘導(dǎo)的基底細(xì)胞癌細(xì)胞分化伴隨有大量這些 細(xì)胞的編程性細(xì)胞死亡(Tas S.等(2001)PCT/TR01/00027、 WO 02/078703)。
發(fā)明概述
環(huán)杷明可有效地S1起腫瘤細(xì)胞分化和編程性細(xì)胞死亡，這種情況不僅發(fā) 生在基底細(xì)胞癌中，而且發(fā)生在其它皮膚肺瘤中。在用環(huán)杷明治療時(shí)，來(lái)源 于毛嚢/表皮細(xì)胞系的腫瘤(例如毛發(fā)上皮瘤)和來(lái)源于黑素細(xì)胞的腫瘤(例如 黑素細(xì)胞痣)迅速消失。環(huán)杷明-誘導(dǎo)的對(duì)來(lái)自患有牛皮癬的患者的皮膚的牛 皮癬損害的清除也與使受損表皮細(xì)胞分化有關(guān)。我們公開(kāi)了通過(guò)使用由環(huán)杷明和皮質(zhì)類固醇組成的治療組合物和/或通過(guò)用皮質(zhì)類固醇預(yù)治療損害進(jìn)一 步顯著地提高了環(huán)杷明在治療牛皮癬中的有效性。
本發(fā)明還涉及
1. 環(huán)杷明或環(huán)杷明的藥物上可接受的鹽在制備用于對(duì)患有與細(xì)胞分化 受損相關(guān)的疾病的患者進(jìn)行治療的藥物中的用途。
2. 環(huán)杷明或環(huán)杷明的藥物上可接受的鹽在制備用于對(duì)患有與皮膚細(xì)胞 分化受損相關(guān)的疾病的患者進(jìn)行治療的藥物中的用途。
3. 環(huán)杷明或環(huán)杷明的藥物上可接受的鹽在制備用于對(duì)患有牛皮癬的患 者進(jìn)行治療的藥物中的用途。
4. 環(huán)杷明或環(huán)杷明的藥物上可接受的鹽在制備用于對(duì)患有與程序性細(xì) 胞死亡受損相關(guān)的疾病的患者進(jìn)行治療的藥物中的用途。
5. 環(huán)杷明或環(huán)杷明的藥物上可接受的鹽在制備用于對(duì)患有與皮膚細(xì)胞 或來(lái)源于它們的腫瘤細(xì)胞程序性死亡受損相關(guān)的疾病的患者進(jìn)行治療的藥 物中的用途。
6. 用于對(duì)患有牛皮癬的患者進(jìn)行治療施用的藥物組合物，由在藥物上可 接受的載體中的環(huán)杷明和皮質(zhì)類固醇組成。
7. 項(xiàng)6的藥物組合物，其特征在于環(huán)杷明的濃度為lOmM-20mM且皮 質(zhì)類固醇是濃度為0.5mg/g-1.0mg/g的17-丙酸氯倍他索或濃度為10mM-50 mM的氫化可的松。
8. 環(huán)杷明或如本說(shuō)明書(shū)中所述的環(huán)杷明衍生物在制備用于對(duì)患有與細(xì) 胞分化受損相關(guān)的疾病的患者進(jìn)行治療的藥物中的用途。
9. 環(huán)杷明或如本說(shuō)明書(shū)中所述的環(huán)杷明衍生物在制備用于對(duì)患有與皮 膚細(xì)胞分化受損相關(guān)的疾病的患者進(jìn)行治療施用的藥物中的用途。
10. 環(huán)杷明或如本說(shuō)明書(shū)中所述的環(huán)杷明衍生物在制備用于對(duì)患有牛皮 癬的患者進(jìn)行治療的藥物中的用途。
11. 環(huán)杷明或如本說(shuō)明書(shū)中所述的環(huán)杷明衍生物在制備用于對(duì)患有與程 序性細(xì)胞死亡受損相關(guān)的疾病的患者進(jìn)行治療施用的藥物中的用途。
12. 環(huán)杷明或如本說(shuō)明書(shū)中所述的環(huán)杷明衍生物在制備用于對(duì)患有與皮 膚細(xì)胞或來(lái)源于它們的腫瘤細(xì)胞程序性死亡受損相關(guān)的疾病的患者進(jìn)行治 療施用的藥物中的用途。
. 環(huán)杷明或環(huán)杷明的藥物上可接受的鹽在制備用于對(duì)患有與色素沉著增加相關(guān)的痣或皮膚病的患者進(jìn)行治療施用的藥物中的用途。 附圖簡(jiǎn)述


圖1A表示1位29歲男性治療前肘前區(qū)牛皮癬損害( 7x8mm)的外觀。 圖1B表示用環(huán)杷明霜治療24小時(shí)后與圖1B相同的損害和不進(jìn)行治療
44小時(shí)的隨訪(從治療開(kāi)始第68小時(shí))。
圖1C表示1位29歲男性治療前三角肌區(qū)上的牛皮癬損害( 9x11 mm)。 圖1D表示在用含有等體積環(huán)杷明和17-丙酸氯倍他索霜?jiǎng)?0.5 mg/g)的
預(yù)混合霜治療第68小時(shí)時(shí)與圖1C相同的損害。
圖1E表示1位29歲男性在用17-丙酸氯倍他索霜?jiǎng)?0.5 mg/g)治療48
小時(shí)后索下區(qū)上的牛皮癬損害( llxl2mm)。
圖1F表示在用環(huán)杷明霜取代17-丙酸氯倍他索(0.5 mg/g)治療到第24小
時(shí)時(shí)與圖1E相同的損害。
圖1G表示具有免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)的EGFR的無(wú)損害皮膚組織。觀
察到表皮中顯示出EGFR的細(xì)胞限于基底層。200X原始放大倍數(shù)。
圖1H表示具有免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)的EGFR的未治療的牛皮癬損害
皮膚組織。觀察到損害表皮中的上基細(xì)胞表現(xiàn)出顯著增加的EGFR表達(dá)。
200X原始放大倍數(shù)。
圖ll表示切下前用環(huán)杷明霜治療24小時(shí)且然后通過(guò)免疫組織化學(xué)方法
對(duì)EGFR染色的牛皮癬損害皮膚組織。觀察到表皮中顯示出EGFR的細(xì)胞限
于基底層。200X原始放大倍數(shù)、
圖2A表示1位82歲的男性在治療前面頰上的毛發(fā)上皮瘤和附近的痣。
圖2B表示用環(huán)杷明治療24小時(shí)后與圖2A中相同的皮膚區(qū)域。
圖2C表示來(lái)自圖2B中所示帶有殘留的腫瘤細(xì)胞的切下的皮膚區(qū)域的
切片。H & E, 400X原始放大倍數(shù)。
圖2D表示來(lái)自與圖2C中相同的組織的另一個(gè)區(qū)域。除大量編程性細(xì)
胞死亡的細(xì)胞和通過(guò)除去它們形成的胞嚢結(jié)構(gòu)外，還觀察到腫瘤被單核細(xì)胞
浸潤(rùn)。H & E， 400X原始放大倍數(shù)。
圖3A表示1位59歲男性在治療前下眼瞼上色素沉著的BCC。
圖3B表示在用環(huán)杷明治療第3天時(shí)與圖3A中相同的BCC。
圖3C表示來(lái)自圖3B中所示BCC的治療區(qū)的切片。H & E, 400X原始放大倍數(shù)。
圖3D表示來(lái)自圖3B中所示BCC的治療區(qū)切片上殘留腫瘤細(xì)胞面積的 封閉視野。H&E，400X原始放大倍數(shù)。
圖3E表示從治療前圖3A中所示BCC得到的鉆取活組織檢查材料的切 片。H & E, 400X原始放大倍數(shù)。
圖3F表示含有圖3A中箭頭標(biāo)記的BCC結(jié)節(jié)部分的切片。治療3天后 切下組織且不治療的6天隨訪。H & E, 400X原始放大倍數(shù)。
彩色印刷
將與說(shuō)明書(shū)附圖1-2頁(yè)(圖1A、圖1B、圖1C、圖1D、圖1E、圖1F、 圖1G、圖1H、圖11、圖2A、圖2B、圖2C、圖2D、圖3A、圖3B、圖3C、 圖3D、圖3E、圖3F)相同圖的彩色印刷以附圖la-2a頁(yè)加入，因?yàn)榭梢詫⒁?性質(zhì)導(dǎo)致的免疫組織化學(xué)數(shù)據(jù)和發(fā)現(xiàn)以最佳彩色方式而非灰色等級(jí)傳送；我 們需要慎重考慮專利管理機(jī)構(gòu)的這一 實(shí)際要求并保持頁(yè)面作為本專利申請(qǐng) 的組成部分。不過(guò)，如果專利管理機(jī)構(gòu)認(rèn)為必要，那么可以將該附圖la-2a 頁(yè)從本專利申請(qǐng)中除去。
發(fā)明詳述
我們公開(kāi)了環(huán)杷明可有效地誘導(dǎo)幾種細(xì)胞類型分化且可以在我們公開(kāi)
好治療有效性。公開(kāi)了在腫瘤(包括惡性腫瘤和良性腫瘤)中環(huán)杷明誘導(dǎo)腫瘤 細(xì)胞分化通常與肺瘤細(xì)胞的編程性細(xì)胞死亡(程序性死亡)有關(guān)，由此增添了 環(huán)杷明的抗腫瘤的治療有效性。通過(guò)使用由在適宜藥物載體中的環(huán)杷明和皮 質(zhì)類固醇組成的治療組合物甚至可以進(jìn)一步增加環(huán)杷明在牛皮癬中尚無(wú)先 例的治療有效性(公開(kāi)在上述PCT/TR02/00017、 WO 02/078704中)。
可以將環(huán)杷明溶于乙醇或另 一種適宜的溶劑且可以將其與適宜的藥物 載體混合，這取決于所需的施用方式。就局部施用而言，可以將環(huán)杷明溶于 乙醇或另一種適宜的溶劑且可以將其與適宜的基質(zhì)霜、軟膏或凝膠混合。還 可以將環(huán)杷明混入水凝膠或其它能夠控釋的藥物劑型中且可以使其吸附在 皮膚貼劑上。使用通過(guò)將環(huán)杷明在乙醇中的溶液與基質(zhì)霜混合至得到所示環(huán) 杷明終濃度得到的霜?jiǎng)┇@得了本文圖1A-圖II和圖2A-圖2D以及圖3A-圖3F中所示的作用。所用的基質(zhì)霜主要由重石蠟油(10% w/w)、凡士林(10%
w/w)、十八》克醇(8% w/w)、 polyoxylsteareth-40(3。/ow/w)和水(680/() w/w)制成， 而還能夠配制另一種適宜的基質(zhì)霜。環(huán)杷明與皮質(zhì)類固醇(均為甾類分子)的 脂與水溶解性和分子結(jié)構(gòu)的相似性有利于它們?cè)谙嗤乃幬镙d體中混合。環(huán)
杷明和皮質(zhì)類固醇在藥物劑型中的最佳濃度和最佳給藥劑量和施用方案顯 然可以受到如特定藥物劑型、特定皮質(zhì)類固醇和所治療損害的確定位置和特 性這類因素的影響；不過(guò)，可以通過(guò)下列眾所周知的公開(kāi)最優(yōu)化方法測(cè)定這 些因素。獲得圖1C和圖1D中所示作用中所用的皮質(zhì)類固醇為在基質(zhì)霜終 濃度 0.55mM的17-丙酸氯倍他索(環(huán)杷明在相同霜中的濃度為9mM)。用于 預(yù)治療圖1E中所示損害的皮質(zhì)類固醇為在基質(zhì)霜中終濃度 l.lmM的17-丙 酸氯倍他索。通過(guò)用 50 mM氬化可的松取代該霜中的17-丙酸氯倍他索獲得 相似的皮質(zhì)類固醇作用。注意到本領(lǐng)域中眾所周知的其它皮質(zhì)類固醇分子 也是合適的且能夠以適宜的濃度取代上述皮質(zhì)類固醇分子(對(duì)指定的皮質(zhì)類 固醇而言，適宜濃度也是本領(lǐng)域中公知的)。
圖1A表示1位29歲男性治療前肘前區(qū)牛皮癬斑片。每4小時(shí)將約20)al 環(huán)杷明霜(在上述基質(zhì)霜中的18mM環(huán)杷明)施用在該損害上，持續(xù)24小時(shí)。 然后停止治療并隨訪損害。在治療的第8小時(shí)損害顯示紅斑減少且然后在未 治療的隨訪期中也持續(xù)消退至第3天時(shí)圖1B中所示的狀態(tài)并在第4天時(shí)變 得無(wú)法檢測(cè)到。
圖1C表示同一患者治療前在三角肌區(qū)皮膚上的另一個(gè)牛皮癬斑片。在 每4小時(shí)將約20^d含有 9 mM環(huán)杷明和 0.55 mM17-丙酸氯倍他索(在基質(zhì) 霜中)的霜?jiǎng)┦┯迷谠摀p害上。該損害在第8小時(shí)也表現(xiàn)出紅斑減少且在第3 天時(shí)變得無(wú)法檢測(cè)到(圖1 D表示其在第68小時(shí)的外觀)。在同一患者中，用 含有 L1 mM17-丙酸氯倍他索(但不含環(huán)杷明)的霜?jiǎng)┰诿?小時(shí)或8小時(shí)覆 蓋的其它牛皮癬損害在相同期限中沒(méi)有顯示出可檢測(cè)到的改變(即這些損害 在第3天時(shí)仍然保持)。甚至在一半濃度下，我們使用同一患者的其它損害 也觀察到了對(duì)環(huán)杷明的增強(qiáng)的治療反應(yīng)，促^f吏我們對(duì)由環(huán)杷明和皮質(zhì)類固醇 組成的治療組合物進(jìn)一步評(píng)價(jià)。我們還評(píng)價(jià)了使用局部用皮質(zhì)類固醇治療牛 皮癬損害、隨后用環(huán)杷明霜(在基質(zhì)霜中的18 mM環(huán)杷明)治療的方案。圖 表示同一患者在施用環(huán)杷明前索下區(qū)上的牛皮癬斑片。單獨(dú)用皮質(zhì)類固 醇霜將該損害治療48小時(shí)，然后停止施用皮質(zhì)類固醇并每4小時(shí)使用 20nl環(huán)杷明霜(在基質(zhì)霜中的18 mM環(huán)杷明)治療。圖1F表示施用環(huán)杷明霜的第 24小時(shí)的損害且到該時(shí)間時(shí)損害接近完全消失。
使用半定量標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)牛皮褲損害的嚴(yán)重程度通過(guò)下列方式進(jìn)行對(duì)損害 的紅斑、突起和鱗片進(jìn)行分別評(píng)分且然后計(jì)算總評(píng)分而得到所謂的該損害的 EES評(píng)分的評(píng)分(Bowman P. H.等(2002) J. Am. Acad. Dermatol. 46: 907-913)。 表I表示通過(guò)EES評(píng)分評(píng)價(jià)對(duì)不同治療形式的治療反應(yīng)的比較。觀察到在治 療牛皮癬損害中使用由環(huán)杷明和皮質(zhì)類固醇組成的治療組合物比使用僅含 環(huán)杷明作為活性組分的組合物顯著^是高了治療有效性。用皮質(zhì)類固醇將損害 預(yù)治療1天、隨后用環(huán)4巴明霜(在基質(zhì)霜中的18mM環(huán)杷明)治療的方案類似 地提高了治療有效性。表I表示用含有環(huán)杷明的組合物治療1天且然后在不 進(jìn)行任何治療的情況下隨訪的牛皮癬損害也發(fā)生消退，但消退速度一般相對(duì) 較緩慢。盡管后一種特性可能具有某些臨床實(shí)踐應(yīng)用的價(jià)值，但是預(yù)計(jì)大部 分患者優(yōu)選更快速地清除其損害。
單獨(dú)的環(huán)杷明霜以遠(yuǎn)快于使用如上所述的常規(guī)治療方法 (PCT/TR02/00017、 WO 02/078704)和本文獲得的速度4吏牛皮癬損害消退和清 除。然而，當(dāng)將環(huán)杷明與皮質(zhì)類固醇聯(lián)用或在用皮質(zhì)類固醇預(yù)治療后使用環(huán) 杷明時(shí)，治療反應(yīng)能夠進(jìn)一步得到提高.。這一特性增加了環(huán)杷明療法的臨床 應(yīng)用且可能部分與皮質(zhì)類固醇的抗炎作用有關(guān)。已經(jīng)充分認(rèn)識(shí)到了炎癥細(xì)胞 和細(xì)胞因子對(duì)牛皮癬損害發(fā)展的作用(Krueger J. G等(1990) J. Invest. Dermatol. 94:135S-140S)。已知表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)及其一種或多種配 體(例如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子a)的表達(dá)在牛皮癬損害表皮中顯著增加。它們可以建立 進(jìn)一步通過(guò)由炎癥使表皮EGFR增加而產(chǎn)生自分泌刺激環(huán)(Krueger J. G.等 (19卯)J. Invest. Dermatol. 94: 135S-140S)。然而，對(duì)單獨(dú)的環(huán)杷明霜(而不是 對(duì)單獨(dú)的皮質(zhì)類固醇)非常規(guī)的快速治療反應(yīng)和實(shí)際上停止施用環(huán)杷明后牛 皮癬損害持續(xù)消退這一事實(shí)與環(huán)杷明(而非皮質(zhì)類固醇)對(duì)關(guān)鍵/接近的致病 過(guò)程的有效干預(yù)一致。因?yàn)镋GFR在牛皮癬損害表皮上基層中的超表達(dá)可以 建立自分泌刺激環(huán)且由于EGFR表達(dá)返回至表皮的基底層被^L為有效治療 各種形式牛皮癬的第一種跡象(King L. E. Jr等(1990) J. Invest. Dermatol. 95: 10S-12S),所以評(píng)價(jià)EGFR表達(dá)模式對(duì)環(huán)杷明治療的反應(yīng)。為了該目的，將 抗人EGFR的小鼠單克隆抗體EGFR,113(Novocastra Labs. Ltd., U. K.)用作 初級(jí)抗體并如制造商推薦的進(jìn)行免疫組織化學(xué)測(cè)定。圖II表示在牛皮癬損害上施用環(huán)杷明霜使EGFR表達(dá)模型迅速正?；颐庖呓M織化學(xué)檢測(cè)的 EGFR在治療的第24小時(shí)再次大部分局限于表皮的基底層(圖11)。環(huán)杷明治 療損害后的EGFR表達(dá)模型(圖ll)與未損害皮膚中觀察到的無(wú)區(qū)另'j(圖1G)。
表現(xiàn)出顯著相反的病理模型和EGFR在表皮上基層中的超表達(dá)(圖1H)。因 此，根據(jù)EGFR表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)可以判斷環(huán)杷明治療對(duì)牛皮癬損害還具有快速治 療作用(KingL. E. Jr等(1990), J. Invest. Dermatol. 95: 10S-12S)。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)環(huán)杷明使基底細(xì)胞癌細(xì)胞分化與其編程性細(xì)胞死亡(程序性死 亡)有關(guān)(PCT/TR02/00017、 WO 02/078704)。圖2A-圖2D表示環(huán)杷明的這類 作用并非局限于基底細(xì)胞癌。毛發(fā)上皮瘤是與導(dǎo)致hedgehog-平滑信號(hào)傳導(dǎo) 增加的遺傳改變有關(guān)的腫瘤(Vorechovsky I等(1997) Cancer Res. 57: 4677-4681; Nilsson M.等(2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 3438-3443)。圖 2A表示82歲男性在治療前面頰上的毛發(fā)上皮瘤且圖2B表示僅接觸環(huán)杷明 霜24小時(shí)后的相同皮膚區(qū)域(在基質(zhì)霜中的18 mM環(huán)杷明；在每3小時(shí)將 ~25pl霜直接施用在腫瘤上)。由于快速消退，所以在第24小時(shí)停止治療并 切下相當(dāng)于原始腫瘤的整個(gè)皮膚區(qū)域用于研究。圖2C和圖2D表示在第24 小時(shí)含有殘留的腫瘤細(xì)胞的組織區(qū)且顯示在這些殘留的腫瘤細(xì)胞中顯著的 編程性細(xì)胞死亡活性。觀察到因腫瘤細(xì)胞以編程性細(xì)胞死亡方式去除而產(chǎn)生 的胞嚢空間(圖2C、圖2D)和腫瘤的單核細(xì)胞浸潤(rùn)(圖2D)。在本專利中另一 個(gè)值得關(guān)注的發(fā)現(xiàn)為在治療的第24小時(shí)接近位于治療腫瘤的痣的尺寸減小 且色素沉著(圖2B與圖2A)。當(dāng)環(huán)杷明能夠從施用的相鄰區(qū)域擴(kuò)散時(shí)，所述 的痣(良性黑素瘤)看起來(lái)對(duì)相對(duì)低濃度的環(huán)杷明敏感。實(shí)際上，在另一位志 愿者中使用環(huán)杷明霜(在基質(zhì)霜中的18 mM環(huán)杷明)治療黑素痣也類似地產(chǎn) 生快速除色素作用和痣消失(數(shù)據(jù)未顯示)。
圖3A表示1位59歲男性在治療前下眼瞼上的色素沉著的基底細(xì)胞癌 (BCC)。將環(huán)杷明霜(在基質(zhì)霜中的18mM環(huán)杷明)施用在該患者的所有結(jié)節(jié) 上，但不包括箭頭標(biāo)記的一個(gè)。僅接受從相鄰治療區(qū)擴(kuò)散的環(huán)杷明的這個(gè)結(jié) 節(jié)可以接觸相對(duì)低濃度的環(huán)杷明。當(dāng)這一胂瘤色素沉著的性質(zhì)有利于臨床隨 訪時(shí)，在第3天停止治療(在每4小時(shí)施用 20pl環(huán)4巴明)，此時(shí)治療區(qū)上的 腫瘤顯著消退，但仍然含有可見(jiàn)的部分(圖3B)。然后在不進(jìn)行治療的情況下 探察腫瘤用于可能的后期作用研究。在不進(jìn)行治療的情況下沒(méi)有觀察到臨床
10明顯的進(jìn)一步消退且在隨訪的第6天(從治療開(kāi)始的第9天)切下相當(dāng)于原始 腫瘤的皮膚面積。從腫瘤腫瘤區(qū)得到的蘇木精-伊紅染色的切片顯示了缺乏
腫瘤細(xì)胞的許多胞嚢空間(圖3C)。被覆這些胞嚢的上皮不存在(圖3C)與預(yù)先 由腫瘤細(xì)胞占據(jù)的組織區(qū)域中的這些胞嚢的表現(xiàn)一致。此時(shí)(未治療隨訪的 第6天)，組織切片顯示相對(duì)少量的編程性細(xì)胞死亡的細(xì)胞(圖3C)與已知從 活組織中快速清除的編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞一致。另一方面，特別是接近胞嚢 邊緣的殘留腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出顯示棘狀的分化特征的細(xì)胞的非尋常高的頻率 (例如該區(qū)域趨于圖3C的下左側(cè)；用更清晰的較高放大倍數(shù)觀察到來(lái)自圖3D 中的另一個(gè)區(qū)域作為典型)。分化的相似區(qū)域或胞嚢在獲自開(kāi)始治療前相同 腫瘤的鉆取活組織檢查材'料中不存在(圖3E)。接受相對(duì)低濃度環(huán)杷明的腫瘤 結(jié)節(jié)(圖3A中由箭頭標(biāo)記)在隨訪的第6天具有大胞嚢中心(圖3F)。然而， 該結(jié)節(jié)的殘余周邊持續(xù)使細(xì)胞具有典型的BCC形態(tài)，不過(guò)，細(xì)胞具有分化 特征(例如具有擴(kuò)大和更具嗜酸性的細(xì)胞質(zhì))的頻率再次增加且在周圍存在較 小的胞嚢(圖3F)。因此，盡管腫瘤對(duì)最佳濃度環(huán)杷明的反應(yīng)相對(duì)迅速，但是 接觸最適度以下濃度遺留了在隨訪期中持續(xù)生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞。
這些實(shí)施例進(jìn)一步解釋了所述治療方法在使腫瘤細(xì)胞分化和編程性細(xì) 胞死亡以及在使表現(xiàn)出hedgehog-平滑信號(hào)傳導(dǎo)增加的腫瘤臨床迅速消退中 的有效性。對(duì)具有不同基因型的不相關(guān)患者的幾種獨(dú)立的腫瘤的有效性與所 述治療方法的 一般應(yīng)用 一致。根據(jù)我們?cè)谝郧肮_(kāi)的組織學(xué)/免疫組織化學(xué)標(biāo) 準(zhǔn)(PCTITR01/00027、 WO 02/078704),在所述條件下用環(huán)杷明治療沒(méi)有顯示 出對(duì)正常組織成分(包括公認(rèn)的千細(xì)胞)的過(guò)度的有害影響。此外，在撰寫(xiě)本 文時(shí)已經(jīng)隨訪2年以上的施用環(huán)杷明的以前皮膚部位持續(xù)表現(xiàn)出健康樣的皮 膚和毛發(fā)，從而提示對(duì)干細(xì)胞具有功能性保護(hù)作用且長(zhǎng)期使用安全。
本文和以前7>開(kāi)的環(huán)4巴明的大部分生物和治療作用(WO02/078703 、 WO02/078704)具有一致的特征，即它們與細(xì)胞分化起因有關(guān)。由此特別關(guān)注 其它分子可以由環(huán)杷明衍生或按照它們發(fā)揮與環(huán)杷明相似的受體結(jié)合特性 和生物和治療作用的方式合成這些分子。這類分子在本文中稱作"環(huán)杷明衍 生物"。將本文所用的術(shù)語(yǔ)"環(huán)杷明衍生物"定義如下
體分子修飾部分的分子，按照這類方式使得新衍生的分子能夠持續(xù)與相同的 生物靶(即平滑蛋白)特異性結(jié)合以發(fā)揮本發(fā)明和WO 02/078703和WO
ii02/078704中公開(kāi)的環(huán)杷明的生物作用。環(huán)杷明的這類修飾可以包括一種或
子基團(tuán)(特別是小分子基團(tuán)，諸如曱基)，條件是所得分子穩(wěn)定且具有特異性 結(jié)合與發(fā)揮本發(fā)明和WO 02/078703和WO 02/078704中公開(kāi)的環(huán)杷明生物 作用的環(huán)杷明相同的生物靶的能力。本領(lǐng)域技術(shù)人員易于從環(huán)杷明衍生這類 新分子且本領(lǐng)域技術(shù)人員也易于例如通過(guò)測(cè)試本申請(qǐng)以及WO02/078703和 WO 02/078704中力\并的4物傳用夾石糸拿在浙斬4 " A年中識(shí)>,印 物作用繼續(xù)或消除。
表I.牛皮癬損害對(duì)不同類型治療的反應(yīng)的半定量評(píng)價(jià)_
治療前和治療第4天牛 皮癬損害的ESS評(píng)分 吖平均值士S. D.)
治療 評(píng)分的損害數(shù)量 治療前 第4天
基質(zhì);ffi5 6.6±1.0 6.0±0.6
環(huán)、牙巴明霜 4 6.5±0.4 0.4±0.2
(環(huán)杷明+CS)霜 5 6.7±0.9 0±0
環(huán)杷明霜，僅l天6 6.8±1.7 0.9±0.3
(環(huán)杷明+CS)霜，僅1天7 6.7±1.3 0.4±0.3
*紅斑、突起和鱗片評(píng)分的總和(每個(gè)按0-4的等級(jí)，具有0.5的增加， 如Bowman P. H.等所述(2002) J. Am. Acad. Dermatol. 46: 907-913)。在"僅1 天"治療中，用環(huán)杷明持續(xù)治療僅1天。然后在不進(jìn)行治療的情況下隨訪損 害并測(cè)定EES評(píng)分。顯示了在每一難療類型中評(píng)分的損害數(shù)量。在第4天前 切下用于組織病理學(xué)/免疫組織化學(xué)分析的損害進(jìn)行的評(píng)分不包括在本評(píng)價(jià) 和計(jì)算中。(環(huán)杷明+CS)霜治療指的是用含有 9 mM環(huán)杷明和~0.55 mM17-丙酸氯倍他索的霜?jiǎng)┲委熁蛟谟煤衺 1.1 mM 17-丙酸氯倍他索的霜?jiǎng)╊A(yù)治療 1天后用含有 18 mM環(huán)杷明的霜?jiǎng)┲委煛＿@兩種類型治療的結(jié)果相似且由 此以單組計(jì)算。
權(quán)利要求
1.一種藥物組合物，其包含(1)環(huán)杷明或其它抑制Hedgehog/平滑信號(hào)傳導(dǎo)的分子，和(ii)皮質(zhì)類固醇。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述其它分子結(jié)合平滑蛋白從而抑制Hedgehog/平滑信號(hào)傳導(dǎo)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述皮質(zhì)類固醇是17-丙酸氯倍他索或氫化可的松。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述組合物是能夠控釋的藥物劑型。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述組合物是霜?jiǎng)┗蜍浉嗷蚰z或水凝膠的形式。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的藥物組合物，用于治療牛皮癬。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含皮質(zhì)類固醇和Hedgehog/平滑信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑的藥物組合物。含有環(huán)杷明的藥物組合物能夠使表現(xiàn)出細(xì)胞分化抑制的皮膚細(xì)胞克服這種抑制。這類組合物有效地治療與細(xì)胞分化受損相關(guān)的疾病。在腫瘤中，環(huán)杷明誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化通常伴隨有腫瘤細(xì)胞的編程性細(xì)胞死亡，由此增添了治療有效性。通過(guò)使用由環(huán)杷明和皮質(zhì)類固醇組成的組合物可以顯著提高環(huán)杷明在治療牛皮癬中的有效性，而牛皮癬為一種與細(xì)胞分化受損相關(guān)的常見(jiàn)疾病。
文檔編號(hào)A61K8/63GK101642458SQ20091014621
公開(kāi)日2010年2月10日 申請(qǐng)日期2003年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月19日
發(fā)明者奧克泰·阿夫西, 辛南·塔斯 申請(qǐng)人:辛南·塔斯