專利名稱：基于內(nèi)皮抑素基因的免疫脂質(zhì)體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別涉及基于內(nèi)皮抑素(Vasohibin)基因的免 疫脂質(zhì)體，還涉及該免疫脂質(zhì)體的制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肺纖維化(pulmonary fibrosis, PF)是以肺間質(zhì)彌漫性滲出、浸潤和纖維化 為主要病變的一大類疾病。其發(fā)病機(jī)制仍不清楚，臨床缺乏特效治療藥物，預(yù) 后極差。因此，對(duì)肺纖維化發(fā)病機(jī)制及其防治的研究具有重要的臨床意義。
傳統(tǒng)認(rèn)為慢性炎癥在肺纖維化中起重要作用，然而針對(duì)單個(gè)或多個(gè)細(xì)胞因 子抑制炎癥反應(yīng)以減輕肺纖維化的措施被證明效果不佳。近年來，血管生成在 肺纖維化發(fā)生中的作用日益受到重視。文獻(xiàn)報(bào)道，肺纖維化早期血管生成異常 增加，而血管生成是炎癥發(fā)生和組織修復(fù)的中心，炎性因子對(duì)血管生成有促進(jìn) 作用，血管生成又是炎性細(xì)胞滲入病灶并活化的通路，血管生成的失控必定會(huì) 引起炎癥反應(yīng)和組織修復(fù)的失控，因此，血管生成可能是肺纖維化形成中的一 個(gè)核心環(huán)節(jié)而起關(guān)鍵作用。
生理情況下，血管生成受血管生成促進(jìn)因子和血管生成抑制因子的平衡調(diào) 節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制血管生成促進(jìn)因子如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)或促 進(jìn)血管生成抑制因子如干擾素誘導(dǎo)蛋白-10 (IP-10)的產(chǎn)生，能夠減輕博來霉素 致大鼠肺纖維化模型血管生成和肺纖維化的程度，提示在肺纖維化過程中血管 生成促進(jìn)因子占有優(yōu)勢而血管生成抑制因子相對(duì)不足，因此，調(diào)節(jié)血管生成促 進(jìn)因子和血管生成抑制因子之間的平衡可能為肺纖維化防治提供新的策略。
Vasohibin是新近發(fā)現(xiàn)的血管生成抑制因子，'選擇性表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞， 可以被血管生成促進(jìn)因子如VEGF等誘導(dǎo)產(chǎn)生，并通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)抑制血管生成。研究表明，Vasohibin基因轉(zhuǎn)染至小鼠肝組織中可使血漿中Vasohibin釋放 增加，并在遠(yuǎn)隔部位表現(xiàn)出抗血管生成效應(yīng)；在小鼠視網(wǎng)膜新生血管生成模型 中，血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF高表達(dá)與Vasohibin mRNA升高相伴行，敲除Vasohibin 基因后導(dǎo)致視網(wǎng)膜新生血管增加，相反，眼球內(nèi)注射重組Vasohibin基因能強(qiáng)烈 抑制視網(wǎng)膜新生血管形成；通過腺病毒載體轉(zhuǎn)染Vasohibin基因還可以抑制人臍 靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和微管形成。因此，Vasohibin可能為肺纖維化防治 提供新的方法和藥物。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種基于Vasohibin基因的免疫脂質(zhì) 體，可以特異性作用于肺血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制血管生成和肺纖維化形成，具有靶 向性強(qiáng)、毒副作用小、半衰期長等優(yōu)點(diǎn)。
為達(dá)到此目的，在本發(fā)明的第一方面，提供了一種基于Vasohibin基因的免 疫脂質(zhì)體，由Vasohibin基因重組真核表達(dá)載體、脂質(zhì)體和抗第WI因子相關(guān)抗原 單克隆抗體組成，所述脂質(zhì)體內(nèi)包裹Vasohibin基因重組真核表達(dá)載體，脂質(zhì)體 表面連接抗第VIfl因子相關(guān)抗原單克隆抗體。
進(jìn)一步，所述Vasohibin基因重組真核表達(dá)載體含有核苷酸序列如SEQ ID No.l所示的Vasohibin基因；
進(jìn)一步，所述Vasohibin基因重組真核表達(dá)載體采用p3xFLAG-CMV-14真 核表達(dá)載體；
進(jìn)一步，所述脂質(zhì)體由磷脂和膽固醇組成；
進(jìn)一步，所述磷脂為卵磷脂。
本發(fā)明的目的之二在于提供所述基于Vasohibin基因的免疫脂質(zhì)體的制備方 法，操作簡便易行。
為達(dá)到此目的，在本發(fā)明的第二方面，提供了所述基于Vasohibin基因的免 疫脂質(zhì)體的制備方法，包括以下步驟
a、 Vasohibin基因重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建提取人脾臟組織血管內(nèi)皮細(xì)胞總RNA;合成PCR上下游引物上游引物序 列如SEQ IDNo.2所示，下游引物序列如SEQ ID No.3所示；以人脾臟組織血管 內(nèi)皮細(xì)胞總RNA為才莫板進(jìn)行Vasohibin基因的逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條 件為溫度95X:預(yù)變性IO分鐘，然后溫度94。C變性1分鐘、58"退火1分鐘、 72。C延伸4分鐘，共30個(gè)循環(huán)，最后溫度72。C延伸10分鐘；PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂 糖凝膠電泳鑒定后，切膠回收純化目的片段，即得Vasohibin基因；將所得 Vasohibin基因用限制性內(nèi)切酶Notl和Xbal進(jìn)行雙酶切，再與同樣經(jīng)Notl和Xbal 雙酶切的真核表達(dá)載體p3xFLAG-CMV-14在T4 DNA連接酶的作用下進(jìn)行連 接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，用含有氨卡青霉素的LB平板篩 選陽性克隆，小量提取重組質(zhì)粒，采用雙酶切法和PCR法鑒定陽性克隆質(zhì)粒并 測序，測序結(jié)果顯示在p3xFLAG-CMV-14的Notl和Xbal位點(diǎn)之間插入有與SEQ ID No.l所示核苷酸序列完全一致者，即為構(gòu)建成功的Vasohibin基因重組真核 表達(dá)載體p3xFLAG-CMV-14八/ksohibin;取含有p3xFLAG-CMV-14/Vasohibin的 大腸桿菌DH5a，接種于含有氨千青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在溫度37。C振搖
培養(yǎng)，待培養(yǎng)液的OD49。nm達(dá)到1 1.5，大量抽提重組質(zhì)粒，用超純水溶解制成
P3xFLAG-CMV-14/Vasohibin溶液，置溫度-20。C保存，備用；
b、 包裹Vasohibin基因重組真核表達(dá)載體的脂質(zhì)體的制備 將卵磷脂和膽固醇用乙醚溶解制成溶液，在攪拌條件下向該溶液中緩慢加
入p3xFLAG-CMV-14/Vasohibin溶液，超聲振蕩至7JC相和有機(jī)相混合均勻，減壓 蒸餾除去有機(jī)溶劑，離心，棄去上清液，收集沉淀，即得包裹Vasohibin基因重 組真核表達(dá)載體的脂質(zhì)體；
c、 包裹Vasohibin基因重組真核表達(dá)載體的脂質(zhì)體與抗第VI因子相關(guān)抗原 單克隆抗體的連接
將抗第Vi因子相關(guān)抗原單克隆抗體經(jīng)巰基化修飾后，與包裹Vasohibin基因 重組真核表達(dá)載體的脂質(zhì)體在室溫下輕搖連接過夜，用瓊脂糖凝膠柱分離除去 游離的抗第VDI因子相關(guān)抗原單克隆抗體，即得基于Vasohibin基因的免疫脂質(zhì)體。本發(fā)明的目的之三在于提供所述基于Vasohibin基因的免疫脂質(zhì)體的應(yīng)用。 為達(dá)到此目的，在本發(fā)明的第三方面，提供了所述基于Vasohibin基因的免 疫脂質(zhì)體在制備抗肺纖維化藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明提供了 一種基于Vasohibin基因的免疫脂質(zhì) 體及其制備方法和應(yīng)用，該免疫脂質(zhì)體可以特異性作用于肺血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制 血管生成和肺纖維化形成，具有靶向性強(qiáng)、毒副作用小、半衰期長等優(yōu)點(diǎn)，且 制備方法簡單，可以用于制備抗肺纖維化藥物，在肺纖維化防治領(lǐng)域具有良好 的應(yīng)用前景，可取得較好的社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益。


為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā) 明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，其中
圖1為Western blot檢測Vasohibin基因重組真核表達(dá)載體在真核細(xì)胞中的 表達(dá)；
圖2為瓊脂糖凝膠電泳檢測基于Vasohibin基因的免疫脂質(zhì)體； 圖3為免疫組4匕染色觀察肺組織中VEGF的定位和表達(dá)； 圖4為HE染色7見察肺組織病理改變。
具體實(shí)施例方式
Vasohibin應(yīng)用于肺纖維化防治須特異性作用于肺血管內(nèi)皮細(xì)胞。直接注射 Vasohibin基因重組腺病毒，因缺乏靶向性會(huì)對(duì)肺外其他器官組織的血管生成產(chǎn) 生不利影響。脂質(zhì)體是由 一層或多層同心的脂質(zhì)雙分子膜包封而成的球狀體， 可以包裹多種物質(zhì)(如藥物、核酸等)并將其轉(zhuǎn)入多種類型的細(xì)胞中，可以延 長包裹物的作用時(shí)間、降低毒性，但仍然缺少主動(dòng)靶向性。免疫脂質(zhì)體則是一 種表面結(jié)合有抗體或抗體片段等物質(zhì)的脂質(zhì)體，其借助抗體或抗體片段與靶細(xì) 胞表面抗原的特異性結(jié)合，可以特異性識(shí)別并結(jié)合靶細(xì)胞，使脂質(zhì)體在靶區(qū)釋;改包裹物，具有靶向性強(qiáng)、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)。第環(huán)因子相關(guān)抗原(vWF)主 要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，是血管生成標(biāo)志性抗原。本發(fā)明首先構(gòu)建Vasohibin基 因重組真核表達(dá)載體，再制備包裹Vasohibin基因重組真核表達(dá)載體的脂質(zhì)體， 最后將其與抗人vWF單克隆抗體偶聯(lián)，制得基于Vasohibin基因的免疫脂質(zhì)體， 具有靶向性強(qiáng)、毒副作用小、半衰期長等優(yōu)點(diǎn)。將該免疫脂質(zhì)體通過氣道給藥， 對(duì)其降低博來霉素致小鼠肺纖維化模型血管生成及肺纖維化形成的作用進(jìn)行了 考察，結(jié)果顯示，該免疫脂質(zhì)體能夠有效降低博來霉素致小鼠肺纖維化模型的 血管生成及肺纖維化形成，可以用于制備抗肺纖維化藥物。
以下將參照附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。優(yōu)選實(shí)施例中 未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第 三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年)中所述的條件， 或按照制造廠商所建議的條件。
一、基于Vasohibin基因的免疫脂質(zhì)體(簡稱Anti-vWF-Lip-Vasohibin)的
制備
1 、 Vasohibin基因重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建及檢測 (1) Vasohibin基因重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建
取手術(shù)切除的人脾臟組織，加入液氮充分研磨，再稱取100 mg置無RNA 酶的離心管中，采用RNA提取試劑盒(TaKaRa公司)提^jk管內(nèi)皮細(xì)胞總RNA, 按照試劑盒說明書操作。
根據(jù)GenBank登錄號(hào)為NM—014909的Vasohibin基因序列設(shè)計(jì)1對(duì)特異性 引物，在每條引物的5，端加上保護(hù)堿基，再在其后引入限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列； 引物序歹'H口下F: 5，-gcggccgcagatccccataccgagtgtg國3， ( SEO ID No.2),下劃線 部分為NotI酶切位點(diǎn)；R: 5，-tctagagggcctctttggtcatttcc-3， ( SEQ ID No.3 )，下 劃線部分為Xbal酶切位點(diǎn)；設(shè)計(jì)的引物委托上海生工公司進(jìn)行合成。
以血管內(nèi)皮細(xì)胞總RNA為模板、引物F和R為PCR上下游引物，采用 RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增試劑盒(TaKaRa公司)進(jìn)行Vasohibin基因的逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增，按照試劑盒說明書操作，PCR反應(yīng)條件為溫度95。C預(yù)變性10分鐘，然 后溫度94。C變性1分鐘、58。C退火1分鐘、72。C延伸4分鐘，共30個(gè)循環(huán)，最 后溫度72。C延伸IO分鐘；PCR產(chǎn)物用濃度為10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒 定，鑒定正確的PCR產(chǎn)物采用膠回收試劑盒(TIANGEN公司)切膠回收純化 目的片段，按照試劑盒說明書操作，即得Vasohibin基因。
將Vasohibin基因用限制性內(nèi)切酶Notl和Xbal ( TaKaRa公司)進(jìn)行雙酶 切，雙酶切產(chǎn)物經(jīng)切膠回收純化后，與同樣經(jīng)NotI和XbaI雙酶切的真核表達(dá)載 體p3xFLAG-CMV-14 ( Sigma-Aldrich公司)在T4 DNA連接酶(TaKaRa公司) 的作用下進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a (TIANGEN公司)感受態(tài)細(xì) 胞，用含有氨千青霉素(AMP)的LB平板篩選陽性克隆，將單個(gè)陽性克隆接 種于含有AMP的LB液體培養(yǎng)基中，在溫度37。C振搖培養(yǎng)12小時(shí)后，用質(zhì)粒 小量提取試劑盒(TIANGEN公司)小量提取重組質(zhì)粒，按照試劑盒說明書操作， 所得重組質(zhì)粒采用雙酶切法和PCR法進(jìn)行鑒定，雙酶切法和PCR法均鑒定為陽 性的重組質(zhì)粒委托上海生工公司對(duì)插入片段進(jìn)行測序，測序結(jié)果顯示在 p3xFLAG-CMV-14的Notl和Xbal位點(diǎn)之間插入有與SEQ ID No.l所示核苦酸 序列完全一致的DNA片段，表明Vasohibin基因重組真核表達(dá)載體p3xFLAG-CMV-14/Vasohibin構(gòu)建成功。
取含有p3xFLAG-CMV-14/Vasohibin的大腸桿菌DH5a，接種于含有AMP 的LB液體培養(yǎng)基中，在溫度37。C振搖培養(yǎng)過夜，待培養(yǎng)液的光吸收值OD490nm 達(dá)到1-1.5，采用超純質(zhì)粒抽提試劑盒(TIANGEN公司)大量抽提重組質(zhì)粒， 按照試劑盒說明書操作，所得重組質(zhì)粒用超純水溶解制成p3xFLAG-CMV-14/ Vasohibin溶液，用紫外分光光度計(jì)測定純度和濃度，置溫度-20。C保存，備用。 (2 ) Vasohibin基因重組真核表達(dá)載體的檢測
Western blot檢測將cos-7細(xì)胞接種于6孔板中，用PRIM 1640培養(yǎng)液在 溫度為37。C、 C02氣體濃度為50mL/L的條件下培養(yǎng)24小時(shí)，待細(xì)胞融合率達(dá) 到約80%時(shí)，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000將p3xFLAG-CMV-14/Vasohibin或p3xFLAG-CMV-14轉(zhuǎn)染入cos-7細(xì)胞，按照試劑說明書操作，轉(zhuǎn)染 4小時(shí)后，將培養(yǎng)液更換為PRIM 1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，收集細(xì)胞， 用PBS洗滌并重懸，超聲裂解細(xì)胞，離心，收集上清液，用His Bind蛋白純化 試劑盒(Novage公司)純化Vasohibin，按照試劑盒說明書操作；取純化蛋白溶 液，采用質(zhì)量百分濃度為5%的濃縮膠、質(zhì)量百分濃度為12.5%的分離膠進(jìn)行 SDS-PAGE電泳，電泳完畢后電轉(zhuǎn)印PVDF膜，用脫脂奶粉溶液封閉1小時(shí)后， 加入兔抗小鼠Vasohibin單克隆抗體，溫度37。C孵育1小時(shí)，PBST洗膜后，再 加入羊抗兔IgG,溫度37。C孵育l小時(shí)，PBST洗膜后，再加入發(fā)光底物，溫度 37。C孵育l分鐘，暗室中用X光片曝光，顯影，定影，觀察p3xFLAG-CMV-14/ Vasohibin在真核細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果如圖1所示，其中M泳道為蛋白質(zhì)分子量 標(biāo)準(zhǔn)，1至3泳道為從p3xFLAG-CMV-14/Vasohibin轉(zhuǎn)染的cos-7細(xì)胞中提取純 化的蛋白溶液，4泳道為從p3xFLAG-CMV-14轉(zhuǎn)染的cos-7細(xì)胞中提取純化的蛋 白溶液；從圖可知，1至3泳道在分子量為40kD處均有一明顯的蛋白質(zhì)條帶， 與Vasohibin預(yù)期分子量大小一致，而4泳道無相應(yīng)條帶，表明構(gòu)建的p3xFLAG-
2、包裹Vasohibin基因重組真核表達(dá)載體的脂質(zhì)體(簡稱Lip-Vasohibin) 的制備及4全測
(1) Lip-Vasohibin的制備
采用逆向蒸發(fā)法制備取卵磷脂2g和膽固醇0.4g,加入乙醚60mL,攪拌 使完全溶解，再在攪拌條件下緩慢加入濃度為0.5 mg/mL的p3xFLAG-CMV-14/ Vasohibin溶液60 mL,超聲振蕩30分鐘至水相和有才幾相混合均勻，所得乳狀液 減壓蒸餾除去有機(jī)溶劑后，10000 r/min離心20分鐘，棄去上清液(含未包裹入 脂質(zhì)體的p3xFLAG-CMV-14八&sohibin),收集沉淀，即得Lip-Vasohibin。 (2 ) Lip-Vasohibin的檢測
透射電鏡檢測將Lip-Vasohibin用濃度為3g/L的磷鎢酸溶液負(fù)染后，滴至 專用銅網(wǎng)上，自然風(fēng)千，置透射電子顯微鏡下觀察脂質(zhì)體的形態(tài)結(jié)構(gòu)和粒徑分布。結(jié)果顯示，制備的Lip-Vasohibin為球形或近球形小嚢泡；粒徑均勻，分布 范圍為30 150nm，平均粒徑低于100nm。 3 、 Anti-vWF-Lip-Vasohibin的制備及檢測 (1) Anti-vWF-Lip-Vasohibin的制備
將抗vWF單克隆抗體(SantaCruz公司)經(jīng)巰基化修飾后，與Lip-Vasohibin 在室溫下輕搖連接過夜，用瓊脂糖凝膠CL-4B柱分離Anti-vWF-Lip-Vasohibin 和游離的抗vWF單克隆抗體，即得Anti-vWF-Lip-Vasohibin。 (2 ) Anti-vWF-Lip-Vasohibin的檢測
瓊脂糖凝膠電泳檢測在Anti-vWF-Lip-Vasohibin中加入濃度為5 g/L的SDS (SDS能夠破壞脂質(zhì)體的膜表面結(jié)構(gòu)，使其釋放內(nèi)部的包裹物)，混勻靜置，取 上清液進(jìn)行濃度為5 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，同時(shí)設(shè)置未加入SDS的Anti-vWF-Lip-Vasohibin 為對(duì)照。 結(jié)果見圖2，其中M泳道為DL 15000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)， 1泳道為未加入SDS的Anti-vWF-Lip-Vasohibin, 2泳道為加入SDS的Anti-vWF -Lip-Vasohibin;從圖可知，2泳道在分子量為5000 bp處有一明亮的DNA條帶， 與p3xFLAG-CMV-14/Vasohibin預(yù)期分子量大小一致，表明制備的Anti-vWF-Lip-Vasohibin 包裹有p3xFLAG-CMV-14/Vasohibin。
二、 Anti-vWF-Lip-Vasohibin對(duì)小鼠肺纖維化才莫型血管生成及肺纖維化形成 的影響
將8周齡的C57BL/6雄性小鼠(由中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 中心提供)隨^L分為3組生理鹽水對(duì)照組(A組)、博來霉素組(B組)、博來 霉素+Anti-vWF-Lip-Vasohibin組(C組)；小鼠用戊巴比妥鈉腹腔麻醉后，B組 按照每公斤體重1.5U的劑量氣管內(nèi)灌注博來霉素建立小鼠肺纖維化模型，A組 氣管內(nèi)灌注等體積生理鹽水，C組在氣管內(nèi)灌注博來霉素前7天，按照每公斤體 重5mg的劑量霧化吸入Anti-vWF-Lip-Vasohibin;于灌注博來霉素后第28天處 死各組小鼠，采集以下標(biāo)本:①用生理鹽水行左肺支氣管肺泡灌洗術(shù)，每次1 mL, 停留10秒后回抽，共灌洗5次，收集灌洗液(BALF),用300目尼龍網(wǎng)過濾除去上層粘液，備用；②取右肺組織，用體積百分濃度為10%的福爾馬林溶液固 定，石蠟包埋，連續(xù)4^m切片，備用；③取左肺組織，迅速置溫度為-80。C的 液氮中保存，備用。
1 、免疫組化染色觀察肺組織中VEGF的定位和表達(dá)
將各組肺組織石蠟切片脫蠟至水，用質(zhì)量百分濃度為3%的過氧化氫溶液在 室溫下孵育15分鐘以消除內(nèi)源性過氧化物酶，用蒸餾水洗滌10分鐘，置pH為 5的檸檬酸緩沖液中微波修復(fù)，自然冷卻，滴加兔抗小鼠VEGF多克隆抗體，溫 度4。C孵育過夜，PBS沖洗，再滴加山羊抗兔IgG,室溫孵育2小時(shí)，PBS沖洗， DAB顯色，蒸餾水洗滌，封片，顯微鏡下觀察。結(jié)果見圖3，從圖可知，VEGF 主要定位于肺間質(zhì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，其表達(dá)強(qiáng)度為A組〈C組〈B組，表明Anti-vWF-Lip-Vasohibin能夠降低肺間質(zhì)血管生成。
2、 羥脯氨酸法測定肺組織中膠原蛋白的含量
取各組左肺組織標(biāo)本，剪碎，脫脂，溫度110。C烘干至恒重，稱取2mg置 磨口試管中，加入濃度為6mol/L的HC1溶液lmL,溫度125。C高壓水解3小時(shí)， 冷卻后加入濃度為6 mol/L的NaOH溶液中和，加水稀釋至10 mL，取稀釋液1 mL,用氯胺T法測定肺組織中羥脯氨酸的含量(羥脯氨酸為膠原蛋白的特征成 份，占膠原蛋白氨基酸總量的13.4%,比值恒定，故羥脯氨酸的含量直接反映膠 原蛋白的含量)。結(jié)果顯示，各組小鼠肺組織中雍脯氨酸的含量分別為A組 (17.52±2.19)mg/g、 B組(37.83士3.76) mg/g、 C組(28,67士4.23) mg/g， B組顯著高 于A組，而C組較B組明顯降〗氐，表明Anti-vWF-Lip-Vasohibin能夠降低肺組 織中膠原蛋白的含量。
3、 HE染色XC察肺組織的病理改變
將各組肺組織石蠟切片常規(guī)行HE染色。結(jié)果見圖4，從圖可知，A組肺泡 腔及肺間質(zhì)未見炎性細(xì)胞浸潤，無肺泡壁水腫，未見肺泡炎及肺纖維化病變；B 組肺泡腔及肺間質(zhì)有大量炎性細(xì)胞浸潤，肺泡壁水腫，出現(xiàn)嚴(yán)重的肺泡炎改變， 肺纖維化形成；C組肺泡腔及肺間質(zhì)有少量炎性細(xì)胞浸潤，出現(xiàn)輕微的肺泡炎改變，有一定程度的肺纖維化形成；表明Anti-vWF-Lip-Vasohibin能夠減少肺間質(zhì) 炎性細(xì)胞的浸潤并在一定程度上抑制肺纖維化形成。
4、 光鏡下計(jì)數(shù)BALF中炎性細(xì)胞的數(shù)量
取各組BALF， 1000 r/min離心10分鐘，棄去上清液，沉淀用PBS 100 mL 重懸，加入紅細(xì)胞裂解液0.5 mL，室溫靜置8分鐘，1000 r/min離心10分鐘， 棄去上清液，沉淀用PBS0.5mL重懸，置光鏡下進(jìn)行炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示， 各組BALF中炎性細(xì)胞的數(shù)量分別為A組(2.4士0.3)xloVmL、 B組(24.3士 4.1)xl0VmL、 C組(15.2士2.7)xl()4/mL, B組顯著高于A組，而C組較B組明顯 降低，表明Anti-vWF- Lip-Vasohibin能夠降低BALF中炎性細(xì)胞的數(shù)量。
5、 考馬斯亮藍(lán)法測定BALF中總蛋白的含量
肺毛細(xì)血管通透性增高是肺纖維化的基本病理改變，表現(xiàn)為大量蛋白滲出， 故BALF中總蛋白含量是肺纖維化的重要檢測指標(biāo)。取各組BALF, 1000 r/min 離心10分鐘，取上清液，用考馬斯亮藍(lán)法測定總蛋白的含量。結(jié)果顯示，各組 BALF中總蛋白含量分別為A組(0.12士0.05)mg/mL， B組(0.81士0.13)mg/mL, C 組(0.47士0.11)mg/mL, B組顯著高于A組，而C組較B組明顯降低，表明Anti-vWF-Lip-Vasohibin能夠降低BALF中總蛋白含量。
6、 ELISA法測定BALF中轉(zhuǎn)化生長因子-pi (TGF-卩1)的含量
TGF-(31是很強(qiáng)的致纖維化細(xì)胞因子。取各組BALF ， 1000 r/min離心10分 鐘，取上清液，用ELISA雙抗體夾心法測定TGF-pi含量。結(jié)果顯示，各組BALF 中TGF-卩1含量分別為A組(40.84 ±5.32) pg/mL、 B組(63.17土8.43) pg/mL、 C 組(57.62士5.31) pg/mL， B組顯著高于A組，而C組較B組明顯降低，表明Anti-vWF-Lip-Vasohibin能夠降低BALF中TGF-卩1含量。
基于上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可得出如下結(jié)論本發(fā)明的基于Vasohibin基因的免疫 脂質(zhì)體能夠有效降低博來霉素致小鼠肺纖維化模型的血管生成及肺纖維化形 成，可以作為活性物質(zhì)，單獨(dú)或與其它藥物組成復(fù)方，再加入藥學(xué)上可接受的 輔料，按照藥學(xué)領(lǐng)域的常M4'J劑方法制成各種劑型的抗肺纖維化藥物，通過適當(dāng)途徑給藥，從而為肺纖維化的預(yù)防或治療提供一種理想策略。
最后說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管 通過參照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù) 人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離所 附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的精神和范圍。<110> 中國人民解力文軍第三軍醫(yī)大學(xué)
<120>基于Vasohibin基因的免疫脂質(zhì)體及其制備方法和應(yīng)用 <160> 3
<210> 1
<211> 1098
<212> DNA
<213> 智人(homo sapiens)
<220> <221> <222>
CDS
(1)…(觀)
1
<400> atgccagggg gcggccaccg agagatgagg tttgtcaacc gtggccaaga ctgcccaaga cgcctggaag ttcUtgaaa accaaagagg aacagcatgc tacttccgcc agtcggcgcg ctggacttcg cagagcgtgt gacgtggagc atgcggctca gatgtUctt agacggccct taccagatcc
ggaaga汪ggt ccccctctgg agccagaaga ggggtgggct tccaccccga tccccatacc ctgtgcagcg ttaagaagag ccctgccaat ccaccctgga acatcgtgct aggacctgat aggccgccta C8cacg8ccc gcctgggccg agattggcaa ccccgcagcg cgggtgacaa gggtctga
ggctgggggt ggtcaggcgt ggaaggggaa acctgtgg" tggagagaag gagtgtgcct ctacatcaga cagacctctg caaatgcctg gcgcttcccc gggggtg雄 gtacaagccg cggccgctgc gc織gcgtg cgatgacttc agggacgggc ggcccagtcc gaagacttcc
ggcagcagcg ttggagacca gaggacctgc gaggccacct gtggcgcaac acgttccagc gagctgcagt acagggctga gaagccgtga atcagct tea ttcgcgggcc cccgccttcc tggcacgtgc gagcagatcg egcaaggage cctccctctc agcccccacc gageccaaag
gtgccactcc gcgaaggaac gagaeggagg ggg纖ggat ggatccgtgg cgtctacacc acaatcacac tggacctggc tcctgggaat agacctactt gctacggtgc gcacgctcag tcaagaaggt agtggaagca tggagegeca ccaccaagga gcaggaacag ccatgccaga
aacgtccgct ctcagcccag cgtccccttc gtggaaacac ggccacagac tgtccctgag agggacacag caaggaaatg ttacctcacc ctcagggaac gctgggcatg egagctegtg gaagctgggc ctcggtgctg cgcccgcgac ccgg ccgcagtgaa ecttaaeggg
60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1098
<210> 2 <211> 28 <212> DNA<213>人工序列 <220>
<223>人工序列的描述引物F
<400> 2
gcggccgcag atccccatac cgagtgtg 28
<210> 3
<211> 26
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述引物R
<400> 3
tctagagggc ctctttggtc atttcc 2權(quán)利要求
1、基于Vasohibin基因的免疫脂質(zhì)體，其特征在于由Vasohibin基因重組真核表達(dá)載體、脂質(zhì)體和抗第VIII因子相關(guān)抗原單克隆抗體組成，所述脂質(zhì)體內(nèi)包裹Vasohibin基因重組真核表達(dá)載體，脂質(zhì)體表面連接抗第VIII因子相關(guān)抗原單克隆抗體。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于Vasohibin基因的免疫脂質(zhì)體，其特征在于所述Vasohibin基因重組真核表達(dá)載體含有核苦酸序列如SEQ ID No.l所示的Vasohibin基因。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于Vasohibin基因的免疫脂質(zhì)體，其特征在于所述Vasohibin基因重組真核表達(dá)載體采用p3xFLAG-CMV-14真核表達(dá)載體。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于Vasohibin基因的免疫脂質(zhì)體，其特征在于所述脂質(zhì)體由磷脂和膽固醇組成。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的基于Vasohibin基因的免疫脂質(zhì)體，其特征在于所述磷脂為卵磷脂。
6、 權(quán)利要求1所述的基于Vasohibin基因的免疫脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于包括以下步驟a、 Vasohibin基因重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建提取人脾臟組織血管內(nèi)皮細(xì)胞總RNA;合成PCR上下游引物上游引物序列如SEQ IDNo.2所示，下游引物序列如SEQ ID No.3所示；以人脾臟組織血管內(nèi)皮細(xì)胞總RNA為模板進(jìn)行Vasohibin基因的逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為溫度95。C預(yù)變性IO分鐘，然后溫度94。C變性1分鐘、58。C退火1分鐘、72。C延伸4分鐘，共30個(gè)循環(huán)，最后溫度72。C延伸IO分鐘；PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，切膠回收純化目的片段，即得Vasohibin基因；將所得Vasohibin基因用限制性內(nèi)切酶NotI和XbaI進(jìn)行雙酶切，再與同樣經(jīng)NotI和Xbal雙酶切的真核表達(dá)載體p3xFLAG-CMV-14在T4 DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，用含有氨芐青霉素的LB平板篩選陽性克隆，小量提取重組質(zhì)粒，釆用雙酶切法和PCR法鑒定陽性克隆質(zhì)粒并測序，測序結(jié)果顯示在p3xFLAG-CMV-14的Notl和Xbal位點(diǎn)之間插入有與SEQID No.l所示核苷酸序列完全一致者，即為構(gòu)建成功的Vasohibin基因重組真核表達(dá)載體p3xFLAG-CMV-14八&sohibin;取含有p3xFLAG-CMV-14/Vasohibin的大腸桿菌DH5a，接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在溫度37。C振搖培養(yǎng)，待培養(yǎng)液的OD49。固達(dá)到1~1.5，大量抽提重組質(zhì)粒，用超純水溶解制成p3xFLAG-CMV-14/Vasohibin溶液，置溫度-20。C保存，備用；b、 包裹Vasohibin基因重組真核表達(dá)載體的脂質(zhì)體的制備將卵磷脂和膽固醇用乙醚溶解制成溶液，在攪拌條件下向該溶液中緩慢加入p3xFLAG-CMV-14/Vasohibin溶液，超聲振蕩至水相和有機(jī)相混合均勻，減壓蒸餾除去有機(jī)溶劑，離心，棄去上清液，收集沉淀，即得包裹Vasohibin基因重組真核表達(dá)載體的脂質(zhì)體；c、 包裹Vasohibin基因重組真核表達(dá)載體的脂質(zhì)體與抗第VID因子相關(guān)抗原單克隆抗體的連接將抗第VI1I因子相關(guān)抗原單克隆抗體經(jīng)巰基化修飾后，與包裹Vasohibin基因重組真核表達(dá)載體的脂質(zhì)體在室溫下振搖連接過夜，用瓊脂糖凝膠柱分離除去游離的抗第WI因子相關(guān)抗原單克隆抗體，即得基于Vasohibin基因的免疫脂質(zhì)體。
7、權(quán)利要求1所述的基于Vasohibin基因的免疫脂質(zhì)體在制備抗肺纖維化藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了基于Vasohibin基因的免疫脂質(zhì)體及其制備方法和應(yīng)用，該免疫脂質(zhì)體由Vasohibin基因重組真核表達(dá)載體、脂質(zhì)體和抗第VIII因子相關(guān)抗原單克隆抗體組成，脂質(zhì)體內(nèi)包裹Vasohibin基因重組真核表達(dá)載體，脂質(zhì)體表面連接抗第VIII因子相關(guān)抗原單克隆抗體；其制備方法包括Vasohibin基因重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建、包裹Vasohibin基因重組真核表達(dá)載體的脂質(zhì)體的制備、包裹Vasohibin基因重組真核表達(dá)載體的脂質(zhì)體與抗第VIII因子相關(guān)抗原單克隆抗體的連接共3個(gè)步驟；該免疫脂質(zhì)體可特異性作用于肺血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制血管生成和肺纖維化形成，靶向性強(qiáng)、毒副作用小，可用于制備抗肺纖維化藥物。
文檔編號(hào)A61K48/00GK101579315SQ20091010365
公開日2009年11月18日 申請(qǐng)日期2009年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月21日
發(fā)明者吳學(xué)玲, 崔社懷, 曹國強(qiáng), 曌 楊, 楊雪梅, 王興勝, 趙云峰 申請(qǐng)人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)