專利名稱：：制造脂質(zhì)體的系統(tǒng)和方法制造脂質(zhì)體的系統(tǒng)和方法相關(guān)申請的交叉參考本申請是要求于2005年7月27日遞交的題目為"制造脂質(zhì)體的系統(tǒng)和方法(SYSTEMSANDMETHODSFORMANUFACTURINGLIPOSOMES)"的美國申請?zhí)?0/703,380的利益的非臨時申請，將其通過參考全部結(jié)合于此。發(fā)明背景己經(jīng)知道許多用于將活性物質(zhì)施用到細胞中的系統(tǒng)，諸如脂質(zhì)體、納米顆粒、聚合物顆粒、免疫-和配體-復(fù)合體以及環(huán)糊精(參見，抗微生物和抗癌化學(xué)治療中的藥物轉(zhuǎn)運(DrugTransportinantimicrobialandanticancerchemotherapy).C.Papadakou編，CRC出版社，1995)。脂質(zhì)體典型地在實驗室中通過聲處理、洗滌劑透析、乙醇注射或稀釋、French壓力擠出(Frenchpressextrusion)、醚輸注和反相蒸發(fā)制備而成。已知具有多個雙層的脂質(zhì)體是多層脂質(zhì)囊(multilamellarlipidvesicles,MLVs)。由于捕獲在層間的流體只在每層膜降解時釋放，所以MLVs是延時釋放藥物的候選。己知具有單一雙層的脂質(zhì)體是單層脂質(zhì)囊(UV)。UVs可以制成小的(SUVs)或大的(LUVs)。上述用于脂質(zhì)體生產(chǎn)的一些方法利用可以導(dǎo)致磷脂原材料和包封的藥物變性的苛刻的或極端的條件。另外，這些方法對于大量脂質(zhì)體的大規(guī)模生產(chǎn)不容易縮放(scalable)。此外，通過常規(guī)乙醇稀釋形成脂質(zhì)囊涉及將脂質(zhì)注射或逐滴加入到水性緩沖劑中。這樣得到的囊典型地在大小上不均勻，并且含有單層和多層囊的混合物。將常規(guī)脂質(zhì)體配制成攜帶包含在水性內(nèi)部空間(水溶性藥物)或參與脂質(zhì)雙層(水不溶性藥物)的治療劑。在血流中具有短半衰期的活性劑特別適合通過脂質(zhì)體遞送。例如，已知許多抗腫瘤藥在血流中具有短半衰期，以致它們的腸胃外應(yīng)用是不可行的。然而，經(jīng)由血流用于活性劑的部位特異性遞送的脂質(zhì)體的應(yīng)用受到網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)的細胞將脂質(zhì)體從血液中快速清除的嚴重限制。美國專利號5，478,860，其于1995年12月26日授予Wheeler等，并且通過引用結(jié)合于此，公開了用于遞送疏水性化合物的微乳組合物。這樣的組合物具有許多用途。在一個實施方案中，所述疏水性化合物是包含藥物的治療劑。該專利還公開體外和體內(nèi)遞送疏水性化合物到細胞的方法。Knopov等的PCT公布WO01/05373,其通過引用結(jié)合于此，公開了用提供湍流環(huán)境(例如，雷諾數(shù)>2000)的靜態(tài)混合器(staticmixer)利用乙醇注射-型方法制備脂質(zhì)囊的技術(shù)。然后，可以在囊形成之后負載治療劑。公布的美國申請2004/0142025，其通過引用結(jié)合于此，公開了使用順序的逐步稀釋方法形成脂質(zhì)顆粒的技術(shù)。所公開的方法在非湍流的攪拌環(huán)境中產(chǎn)生具有低于200nm的大小的脂質(zhì)顆粒。然而，所公開的方法傾向于產(chǎn)生不太最佳的囊大小和低于最佳的均勻性，特別是對于包封siRNA的脂質(zhì)體。此外，對于包封的質(zhì)粒，需要酸性緩沖溶液。盡管在美國專利號5,478,860，US20040142025和WO05373中公開的進展，還存在對于用于配制和生產(chǎn)脂質(zhì)囊，特別是包封治療劑諸如核酸的脂質(zhì)囊的改進的方法和裝置的需要。本發(fā)明實現(xiàn)了這些及其它需要。發(fā)明概述本發(fā)明提供用于制備任選地包含治療劑的脂質(zhì)囊的方法和裝置。所述治療劑可以包括，例如，蛋白質(zhì)、核酸、反義核酸、藥物等。本發(fā)明可以用于形成包含包封的核酸或小分子藥物的脂質(zhì)囊。在一方面，脂質(zhì)囊在低壓下快速制備，并且方法是完全可以縮放的。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述方法不包括靜態(tài)混合器或?qū)ｉT的擠出設(shè)備。按照一個實施方案，本發(fā)明提供用于生產(chǎn)脂質(zhì)體的方法。所述方法典型地包括，在第一儲蓄器(reservoir)中提供水溶液，所述第一儲蓄器與第二儲蓄器中的有機脂質(zhì)溶液流體連通，并且將所述水溶液與所述有機脂質(zhì)溶液在第一混合區(qū)域混合以產(chǎn)生脂質(zhì)體溶液。有機脂質(zhì)溶液與所述水溶液混合，以便基本上瞬時產(chǎn)生包封治療產(chǎn)品的脂質(zhì)體。而后立即將該脂質(zhì)體溶液與緩沖溶液混合，以產(chǎn)生稀釋的脂質(zhì)體溶液?？梢詫⑺鲋|(zhì)體溶液引入到緩沖溶液儲蓄器中，或者所述脂質(zhì)體溶液可以與緩沖劑在第二混合區(qū)域中混合。在某些方面，水溶液如緩沖劑，包含治療產(chǎn)品，以致所述治療產(chǎn)品被包封在脂質(zhì)體中。在其它方面，所述有機脂質(zhì)溶液包含治療產(chǎn)品。適當?shù)闹委煯a(chǎn)品包括，但不限于，蛋白質(zhì)、核酸、反義核酸、核酶、tRNA、snRNA、siRNA(小干擾RNA)、shRNA、ncRNA、預(yù)先濃縮的DNA、適體和抗原。在某些優(yōu)選的方面，所述治療產(chǎn)品是核酸。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供用于生產(chǎn)包封治療產(chǎn)品的脂質(zhì)體的系統(tǒng)。所述系統(tǒng)典型地包括容納水溶液的第一儲蓄器，和容納有機脂質(zhì)溶液的第二儲蓄器，其中所述水溶液和有機脂質(zhì)溶液中的一種包含治療產(chǎn)品。所述系統(tǒng)還典型地包括泵機構(gòu)，其設(shè)置成將水溶性溶液和有機脂質(zhì)溶液以基本上相等的流速泵抽到混合區(qū)域中，其中所述有機脂質(zhì)溶液與所述水溶液在混合區(qū)域中混合，從而基本上瞬時形成包封治療產(chǎn)品的脂質(zhì)體溶液。所述系統(tǒng)還典型地包括收集儲蓄器，所述收集儲蓄器包含緩沖溶液，與混合區(qū)域流體連通，其中所述脂質(zhì)體溶液基本上在形成后立即引入到收集儲蓄器中，由此形成稀釋的脂質(zhì)體溶液。在又一個實施方案中，本發(fā)明提供用于生產(chǎn)包封治療產(chǎn)品的脂質(zhì)體的系統(tǒng)。所述系統(tǒng)典型地包括容納水溶液的第一儲蓄器，和容納有機脂質(zhì)溶液的第二儲蓄器，其中所述水溶液和有機脂質(zhì)溶液中的一種包含治療產(chǎn)品。所述系統(tǒng)還典型地包括第一泵機構(gòu)，其設(shè)置成將水溶性溶液和有機脂質(zhì)溶液以基本上相等的流速泵抽到混合區(qū)域中，其中所述有機脂質(zhì)溶液與所述水溶液在第一混合區(qū)域中混合，從而基本上瞬時形成包封治療產(chǎn)品的脂質(zhì)體溶液。所述系統(tǒng)還典型地包括容納緩沖溶液的緩沖劑儲蓄器，和第二泵機構(gòu)，其設(shè)置成將所述緩沖溶液以可控的流速泵抽到第二混合區(qū)域中，其中所述脂質(zhì)體溶液基本上在第一混合區(qū)域中形成之后立即引入到第二混合區(qū)域中，由此在第二混合區(qū)域中形成稀釋的脂質(zhì)體溶液。參考本說明書的其余部分，包括附圖和權(quán)利要求，將了解本發(fā)明的其它特點和優(yōu)點。本發(fā)明的其它特點和優(yōu)點，以及本發(fā)明的各種實施方案的結(jié)構(gòu)和操作，將參考附圖在下文詳細描述。在附圖中，相同的參考數(shù)字表示同一或功能相似的元件。附圖簡述圖1說明用于制備SNALP的方法的示意圖。圖2提供按照本發(fā)明的一個實施方案制備脂質(zhì)體的方法的示意圖。圖3a和3b分別顯示按照本發(fā)明的兩個實施方案的裝置300和裝置302的實施例。圖4是按照本發(fā)明的一個實施方案的裝置400的代表性示意圖的實例。圖5顯示按照一個實施方案的T形連接器和相關(guān)的流動動力學(xué)。發(fā)明詳述I.定義術(shù)語"核酸"是指含有至少兩個核苷酸的聚合物。"核苷酸"包含糖脫氧核糖(DNA)或核糖(RNA)，堿基，和磷酸基團。核苷酸通過磷酸基團連接在一起(盡管合成的核酸可以使用核苷酸接頭而不是磷酸基團制備)。"堿基"包括嘌呤和嘧啶，其進一步包括天然化合物腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、肌苷、和天然類似物，以及嘌呤和嘧啶的合成衍生物，其包括但不限于，放置新的反應(yīng)基團諸如但不限于胺、醇、硫醇、羧化物和垸基鹵化物的修飾。DNA可以以下列形式反義、質(zhì)粒DNA、質(zhì)粒DNA的部分、預(yù)先濃縮的DNA、聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)的產(chǎn)物、載體(Pl，PAC,BAC，YAC，人工染色體)、表達盒、嵌合序列、染色體DNA、或這些基團的衍生物。RNA可以以下列形式寡核苷酸RNA、tRNA(轉(zhuǎn)運RNA)、snRNA(小核RNA)、rRNA(核糖體RNA)、mRNA(信使RNA)、反義RNA、siRNA(小干擾RNA)、shRNA(短發(fā)夾RNA)、ncRNA(非編碼RNA)、適體、核酶、嵌合序列、或這些基團的衍生物。"反義"是干擾DNA禾口/或RNA功能的多核苷酸。這可以導(dǎo)致表達的抑制。天然核酸具有磷酸骨架，人工核酸可以包含其它類型的骨架和堿基。這些包括PNAs(肽核酸)、硫代磷酸酯(phosphothioates)、和天然核酸磷酸骨架的其它變體。另外，DNA和RNA可以是單鏈、雙鏈、三鏈或四鏈的。術(shù)語"基因"是指包含產(chǎn)生多肽或前體(例如，單純皰疹病毒)必需的編碼序列的核酸(例如，DNA)序列。多肽可以由全長編碼序列或由編碼序列的任何部分所編碼，只要保留全長或片段的需要的活性或功能特性(例如，酶促活性、配體結(jié)合、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、等等)。當用于本文時，術(shù)語"水溶液"是指完全或部分包含水的組合物。當用于本文時，術(shù)語"有機脂質(zhì)溶液"是指完全或部分包含具有脂質(zhì)的有機溶劑的組合物。術(shù)語"脂質(zhì)"是指一組脂肪酸的酯的有機化合物，并且特征是在水中不溶，但是在許多有機溶劑中是可溶的。通常將它們分成至少三類(l)"簡單脂質(zhì)"其包括脂肪和油以及蠟；(2)"化合物脂質(zhì)"其包括磷脂和糖脂；(3)"衍生的脂質(zhì)"諸如類固醇。術(shù)語"兩親性脂質(zhì)"部分地指任何適合的材料，其中脂質(zhì)材料的疏水部分定向到疏水相中，而親水部分定向到水相。兩親性脂質(zhì)通常是脂質(zhì)囊的主要成分。親水性質(zhì)來自極性或帶電基團諸如糖類，磷酸酯合，羧基、硫酸根合、氨基、巰基、硝基、羥基和其它類似基團的存在。疏水性可以通過包含非極性基團而賦予，所述基團包括，但不限于，長鏈飽和和不飽和脂族烴基團和由一個或多個芳族、脂環(huán)族或雜環(huán)基團取代的這樣的基團。兩親性化合物的實例包括，但不限于，磷脂、氨基脂和鞘脂類。磷脂的代表性實例包括，但不限于，磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕櫚酰油酰磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二油酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿或二亞油酰磷脂酰膽堿。缺乏磷的其它化合物，諸如鞘脂、鞘糖脂家族、二?；视秃?3-酰氧基酸也在被稱為兩親性脂質(zhì)的組中。另外，上述的兩親性脂質(zhì)可與其它脂質(zhì)混和，所述脂質(zhì)包括甘油三酯類和固醇類。術(shù)語"中性脂質(zhì)"指在選定的pH值以不帶電荷或中性兩性離子形式存在的許多脂質(zhì)種類中的任何一種。在生理pH值下，這樣的脂質(zhì)包括，例如，二?；字Ｄ憠A、二?；字Ｒ掖及?、神經(jīng)酰胺、鞘磷脂、腦磷脂、膽固醇、腦苷脂和二酰基甘油。術(shù)語"非陽離子脂質(zhì)"指如上所述的任何中性脂質(zhì)以及陰離子脂質(zhì)。有用的非陽離子脂質(zhì)包括，例如，二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)、二油酰磷脂酰膽堿(DOPC)、二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕櫚酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕櫚酰油酰磷脂酰膽堿(POPC)、棕櫚酰油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)、和二油酰-磷脂酰乙醇胺4-(N-馬來酰亞胺基甲基)-環(huán)己垸-l-羧酸酯(DOPE-mal)、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰-磷脂酰-乙醇胺(DSPE)、16-0-單甲基PE、16-0-二甲基PE、18-l-反式PE、l-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、和1,2-二反油酸基(didaidoyl)-sn-甘油基-3-磷乙醇胺(反式DOPE)。術(shù)語"陰離子脂質(zhì)"指在生理pH值下帶負電荷的任何脂質(zhì)。這些脂質(zhì)包括，但不限于，磷脂酰甘油、心磷脂、二?；字＝z氨酸、二?；字?、N-十二垸酰磷脂酰乙醇胺、N-琥珀酰磷脂酰乙醇胺、N-戊二酰磷脂酰乙醇胺，賴氨酰磷脂酰甘油、棕櫚酰油酰磷脂酰甘油(POPG)，和其它與中性脂質(zhì)連接的陰離子修飾基團。術(shù)語"陽離子脂質(zhì)"指許多脂質(zhì)種類中的任何一種，其在選定的pH值，諸如生理pH值下攜帶凈正電荷。這些脂質(zhì)包括，但不限于，N,N-二油基-N,N-二甲基氯化銨("DODAC");N-(2,3-二油基氧基)丙基)-N，N,N-三甲基氯化銨("DOTMA");N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化銨("DDAB");N-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N,N，N-三甲基氯化銨("DOTAP");3-(N-(N，，N，-二甲基氨基乙烷)-氨基甲?；?膽固醇("DC-Chol")和N-(l，2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羥乙基溴化銨("DMRIE")。另外，許多陽離子脂質(zhì)商業(yè)制劑是可用的，其可以用于本發(fā)明。這些包括，例如，LIPOFECTIN0i購陽離子脂質(zhì)體，其包含DOTMA和l,2-二油酰j-3-磷乙醇胺("DOPE"),來自GIBCO/BRL,GrandIsland,紐約，美國)；LIPOFECTAMINE(商購陽離子脂質(zhì)體，其包含N-(l-(2,3-二油基氧基)-丙基)-N-(2-(精胺甲酰胺基)乙基)-N，N-二甲基三氟乙酸銨("DOSPA")和("DOPE")，來自GIBCO/BRL);和TRANSFECTAM⑧(商購陽離子脂質(zhì)，其包含在乙醇中的雙十八烷基酰氨基甘氨酰羧基精胺("DOGS")，來自普洛麥格公司(PromegaCorp.)，Madison,威斯康辛，美國)。下述脂質(zhì)是陽離子的并且在低于生理pH值時具有正電荷DODAP,DODMA,DMDMA，1,2-二亞油酸基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(1，2-DiLinoleyloxy-N,N-dimethylaminopropane)(DLinDMA)，1,2-亞油精基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(1,2-Dilinolenyloxy-N，N-dimethylaminopropane)(DLenDMA)等。除了陽離子和非陽離子脂質(zhì)之外，本發(fā)明的SNALP可以包括雙層穩(wěn)定組分(BSC)，諸如ATTA-脂質(zhì)或PEG-脂質(zhì)，諸如偶聯(lián)于二烷氧基丙基的PEG(PEG-DAA)，如在例如WO05/026372中所述，偶聯(lián)于二?；视偷腜EG(PEG-DAG)，如在例如美國專利公開號20030077829和2005008689中所述，偶聯(lián)于磷脂酰乙醇胺(PE)的PEG(PEG-PE)，或綴合于神經(jīng)酰胺的PEG，或其混合物(參見，美國專利號5,885，613)。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述BSC是抑制SNALP聚集的綴合的脂質(zhì)。在某些方面中，所述陽離子脂質(zhì)典型地構(gòu)成在所述顆粒中存在的總脂質(zhì)的約2%-約70%，約5%-約50%，約10%-約45%，約20°/。-約40%，或約30%-約40%。所述非陽離子脂質(zhì)典型地構(gòu)成在所述顆粒中存在的總脂質(zhì)的約5%-約90%，約10%-約85%，約20%-約80%，約30°/。-約70%，約40%-約60%，或約48%。PEG-脂質(zhì)綴合物典型地構(gòu)成在所述顆粒中存在的總脂質(zhì)的約0.5%-約20%，約1.5%-約18%，約4%-約15%，約5°/。-約12%，或約2%。本發(fā)明的核酸-脂質(zhì)顆粒還可以包含膽固醇。如果存在，膽固醇典型地構(gòu)成在所述顆粒中存在的總脂質(zhì)的約0°/。-約10%，約2%-約10%，約10%-約60%，約12%-約58%，約20%-約55%，或約48%。對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員將容易地是顯而易見的是，所述核酸-脂質(zhì)顆粒的成分的比例可以改變。在一些實施方案中，在形成的核酸-脂質(zhì)顆粒中的核酸脂質(zhì)的比例(質(zhì)量/質(zhì)量比例)將在約0.01-約0.2，約0.03-約0.01，或約0.01-約0.08范圍內(nèi)。起始材料的比例也落在這一范圍之內(nèi)。在另一個實施方案中，所述核酸-脂質(zhì)顆粒制劑使用約400嗎核酸/10mg脂質(zhì)，或核酸脂質(zhì)的比例為約0.01-約0.08或約0.04，其對應(yīng)1.25mg總脂質(zhì)/50嗎核酸。"脂質(zhì)囊"指可用于遞送化合物的任何脂質(zhì)組合物，其包括，但不限于，脂質(zhì)體，其中水體積被兩親性脂雙層所包封；或其中脂質(zhì)涂覆包含大分子組分的內(nèi)部，所述大分子組分諸如質(zhì)粒，具有減小的水性內(nèi)部；或脂質(zhì)聚集體或微團，其中被包封的成分包含在相對混亂的脂質(zhì)混合物中。當用于本文時，"包封的脂質(zhì)"可以指為化合物提供完全包封、部分包封或兩者的脂質(zhì)制劑。當用于本文時，術(shù)語"SNALP"指穩(wěn)定的核酸脂質(zhì)顆粒。SNALP代表涂覆包含核酸的內(nèi)部的脂質(zhì)囊，諸如具有減少的水性內(nèi)部的質(zhì)粒。II.概述本發(fā)明提供用于制備脂質(zhì)囊的方法和裝置。所述方法可以用于制備具有廣泛范圍的脂質(zhì)成分的脂質(zhì)囊，所述廣泛范圍的脂質(zhì)成分包括，但不限于，陽離子脂質(zhì)、陰離子脂質(zhì)、中性脂質(zhì)、聚乙二斷PEG)脂質(zhì)、親水性聚合物脂質(zhì)、促溶脂質(zhì)和固醇。疏水活性可以結(jié)合到含有脂質(zhì)的有機溶劑(例如，乙醇)中，并且核酸和疏水活性可以添加到水性成分中。在某些方面，本發(fā)明的方法可以用于制備微乳，其中脂質(zhì)單層包繞油基核。在某些方面，所述方法和裝置用于制備脂質(zhì)囊，或脂質(zhì)體，其中在脂質(zhì)體形成的同時在脂質(zhì)體內(nèi)部包封治療劑。III.制備方法圖1是本發(fā)明的方法的代表性流程圖100的實例。這一流程圖只是舉例說明，并且不應(yīng)該限制本發(fā)明權(quán)利要求的范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該認識到其它變化、改進和備選方案。在一個方面中，本方法提供脂質(zhì)溶液IIO，諸如在良好制備操作(GoodManufacturingPractice(GMP))下合成的臨床等級的脂質(zhì)，其隨后增溶在有機溶液120(例如，乙醇)中。類似地，在GMP下制備治療產(chǎn)品，例如，治療活性劑，諸如核酸112或其它試劑。然后，將含有緩沖劑(例如，檸檬酸鹽)的治療劑溶液(例如，核酸)115與增溶在低級垸醇中的脂質(zhì)溶液120混合，以形成脂質(zhì)體制劑130(在本文還稱為"脂質(zhì)體懸浮液"或"脂質(zhì)體溶液")。基本上在脂質(zhì)體形成的同時將治療劑捕獲在脂質(zhì)體中。典型地，在負電荷核酸和正電荷陽離子脂質(zhì)之間的靜電相互作用導(dǎo)致包封作用。例如，如果使用可滴定的陽離子脂質(zhì)，在接近或超過所述陽離子脂質(zhì)pKa的更高的pH值可以獲得低NA包封效率。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該意識到，本發(fā)明的方法和裝置同等適用于在所述囊形成之后脂質(zhì)體的活性捕獲或負載。在某些方面，所述脂質(zhì)體溶液基本上立即與緩沖溶液140混合，以稀釋脂質(zhì)體溶液(例如，脂質(zhì)體的懸浮液)。按照本發(fā)明的方法和系統(tǒng)，向攪拌環(huán)境諸如在攪拌室中連續(xù)引入脂質(zhì)和緩沖溶液的作用引起用所述緩沖劑溶液對所述脂質(zhì)溶液的連續(xù)稀釋，由此基本上在攪拌的同時產(chǎn)生脂質(zhì)體。立即稀釋脂質(zhì)體懸浮液，例如，將脂質(zhì)體懸浮液與緩沖液混合，幫助防止脂質(zhì)體粒度增加，這是如果允許所述脂質(zhì)體懸浮液靜置延長的時間階段，例如數(shù)分鐘或數(shù)小時的典型的情形。此外，立即稀釋還提高脂質(zhì)體的均勻性，特別是在siRNA是所包封的治療劑的情形中。當用于本文時，短語"用緩沖溶液連續(xù)稀釋脂質(zhì)溶液"(及變化)一般意指所述脂質(zhì)溶液在水合過程中充分快速地稀釋，具有充分的力完成囊的產(chǎn)生。在本發(fā)明的方法中，所述有機脂質(zhì)溶液典型地包含有機溶劑，諸如低級烷醇。如上文提及，在一個方面中，將所述脂質(zhì)體立即用緩沖劑(例如，檸檬酸鹽)稀釋140，以增加核酸(例如，質(zhì)粒)捕獲并保持粒度。所述稀釋可以通過將脂質(zhì)體溶液立即引入到控制量的緩沖溶液中的方式進行，或者通過將脂質(zhì)體溶液與控制流速的緩沖劑在第二混合區(qū)域中混合而進行。在樣品濃縮160之前，通過使用例如陰離子交換柱體150而去除游離的治療劑(例如，核酸)。此外，通過使用超濾步驟170去除垸醇，濃縮所述樣品(例如，濃縮至約0.9mg/mL質(zhì)粒DNA)，去除烷醇，并且將緩沖劑用置換緩沖劑(例如，用鹽水緩沖劑)180取代。其后，將所述樣品過濾190并且裝入管瓶195?，F(xiàn)在將使用如在圖1中列出的步驟在下文中更詳細地討論本方法。1.脂質(zhì)增溶(solubilization)和治療劑溶解(dissolution)在一個實施方案中，按照本發(fā)明的方法生產(chǎn)的脂質(zhì)體囊包括穩(wěn)定的核酸脂質(zhì)顆粒(即，SNALP)制劑。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，下述描述只是舉例說明的目的。本發(fā)明的方法適用于廣泛范圍的脂質(zhì)囊類型和大小。這些脂質(zhì)囊包括，但不限于，己知為單層脂質(zhì)囊的單一雙層脂質(zhì)囊，其可以制成小的(SUVs)或大的(LUVs)，以及多層脂質(zhì)囊(MLVs)。其它囊包括，微團、脂質(zhì)-核酸顆粒、病毒體等。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該了解本發(fā)明的方法和裝置適用的其它脂質(zhì)囊。按照本方法和裝置制備的脂質(zhì)體的優(yōu)選大小為直徑在約50-200nm之間。在某些方面，脂質(zhì)體制劑具有這樣的大小分布，其中平均大小(例如，直徑)是約70nm至約200nm，并且更典型地平均大小為約100nm或更小。在某些方面，本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑(例如，SNALP制劑)包含4種脂質(zhì)成分磷脂；膽固醇；PEG-脂質(zhì)；和陽離子脂質(zhì)。在一個方面中，所述磷脂是DSPC，所述PEG-脂質(zhì)是PEG-S-DSG，并且所述陽離子脂質(zhì)是DODMA。在一個方面中，摩爾組成是約20:45:10:25的DSPC:Chol:PEG-DSG:DODMA。在另一個方面，所述SNALP制劑是20:48:2:30的DSPC:膽固醇PEG-C-DMA:DlinDMA。在某些實施方案中，脂質(zhì)增溶在其中的有機溶劑的濃度為約45。/。v/v-約100。/。v/v。在某些方面，所述有機溶劑是低級垸醇。適合的低級垸醇包括，但不限于，甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、它們的異構(gòu)體以及它們的組合。在一個實施方案中，所述溶劑是乙醇，其體積約為50-90y。v/v。在一個方面中，脂質(zhì)占約lmL/g-約5mL/g的體積。例如，在適當?shù)臏囟仁褂酶呒軘嚢杵鳎瑢⒅|(zhì)增溶120。在一個方面中，溶液的總脂質(zhì)濃度為約15.1(例如，對于SNALP制劑約11.6)mg/mL(20mM)。在某些方面，治療劑(例如，核酸)包含在水溶液中(例如，緩沖劑)并且稀釋至終濃度。在一個方面中，例如，所述終濃度為在檸檬酸鹽緩沖液中約0.9mg/mL，pH約4-6。在這種情形中，質(zhì)粒溶液的體積與烷醇-脂質(zhì)溶液的體積相同。應(yīng)該理解，當使用本發(fā)明的直接稀釋方法時，緩沖溶液不必是酸性的，例如，緩沖溶液的pH值可以是7.0或更高。在一個實施方案中，使用高架混合器在套層不銹鋼容器中進行治療劑(例如，核酸)溶液的制備。樣品不需要加熱進行制備，盡管在某些情形中，它是在與脂質(zhì)囊形成之前的脂質(zhì)溶液相同的溫度。在一個實施方案中，治療劑包含在脂質(zhì)溶液中。在某些方面，在脂質(zhì)溶液中的治療劑是親脂性的。適當?shù)挠H脂性試劑包括紫杉醇(taxol)，紫杉醇衍生物，其包括，例如，protaxIII和紫杉醇(paclitaxol)，親脂性苯并卟啉，維替泊芬膦甲酸的脂質(zhì)前藥，l-0沖八垸基-sn-甘油-3-膦?；姿狨?ODG-PFA)，二油酰[3H]碘代脫氧尿嘧啶([3H]IDU-012)，脂質(zhì)衍生的HIV蛋白酶抑制肽，諸如iBOC-[L-Phe]-[D-(3-Nal]-Pip-[a-(OH)-Leu]-Val(7194)和其它脂質(zhì)衍生的藥物或前藥。2.脂質(zhì)體形成在已經(jīng)制備溶液如脂質(zhì)溶液120和水性治療劑(例如，核酸)溶液115之后，將它們混合在一起130，例如，使用蠕動泵混合器或無脈動齒輪泵進行。在一個方面中，將所述溶液以基本上相等的流速泵入混合環(huán)境中，盡管也可以使用不相等的流速。在某些方面，所述混合環(huán)境包括"T"-型連接器或混合室。在這種情形中，優(yōu)選地，流體管道，并且因此流體流動在"T"-連接器內(nèi)的狹窄孔內(nèi)匯合，作為相對彼此以大約180。的相對流動。可以使用具有更狹窄的相對引入角度的其它混合室或連接器，諸如例如在27°和90°之間和在90°和180°之間。當溶液流在混合環(huán)境中匯合并且混合時，脂質(zhì)囊基本上瞬時形成。當包含溶解的脂質(zhì)的有機溶液和水溶液(例如，緩沖劑)同時并且連續(xù)地混合時形成脂質(zhì)囊。有利地并且意外地，通過混合所述水溶液和有機脂質(zhì)溶液，所述有機脂質(zhì)溶液經(jīng)歷連續(xù)的、順序的逐步稀釋，從而基本上同時產(chǎn)生脂質(zhì)體溶液(脂質(zhì)體的懸浮液)。泵機構(gòu)可以設(shè)置成將相等或不同流速的脂質(zhì)和水溶液提供到混合環(huán)境中，這在高烷醇環(huán)境中產(chǎn)生脂質(zhì)囊。有利地，并且意外地，如這里教導(dǎo)的用于混合脂質(zhì)溶液和水溶液的方法和裝置在基本上與脂質(zhì)體形成同時提供治療劑在所形成的脂質(zhì)體中的包封，包封效率達到約90%。如果需要，在這里討論的其它處理步驟可以用于進一步改進包封效率和濃度。在一個實施方案中，在將溶解在有機溶劑(例如，乙醇)中的脂質(zhì)通過與水溶液(例如，緩沖劑)混合以逐步方式稀釋時形成脂質(zhì)囊。這種受控的逐步稀釋通過將水性和脂質(zhì)流在孔如T-連接器中混合，并且隨后立即稀釋在緩沖溶液中而實現(xiàn)。如果需要，得到的脂質(zhì)，溶劑和溶質(zhì)濃度可以在囊形成過程中保持不變。在一個方面中，形成具有小于約150nm，例如，約IOOnm或更小的平均直徑的脂質(zhì)囊，其有利地不需要通過高能處理諸如膜擠出、聲處理或微流態(tài)化而進一步減小尺寸。本發(fā)明方法的一個實施方案顯示在圖2中。在一個方面中，使用本發(fā)明的方法，通過沒有梯度的兩階段逐步稀釋而制備囊。例如，在第一逐步稀釋中，在高烷醇(例如，乙醇)環(huán)境(例如，約20。/。-約55。/。v/v的乙醇)中形成囊。然后，可以通過以逐步方式將烷醇(例如，乙醇)濃度降低到小于或等于約25%v/v，諸如約17%v/v-約25。/。v/v而穩(wěn)定這些囊。在某些方面中，治療劑存在于水溶液中，或在脂質(zhì)溶液中，治療劑在脂質(zhì)體形成的同時被包封。如在圖2中所示，在一個實施方案中，脂質(zhì)最初溶解在約40%-約100%v/v，更典型地約65%-約90%v/v，并且最典型地約80°/。-約90%v/v的烷醇環(huán)境中(A)。接著，通過與水溶液混合而逐步稀釋所述脂質(zhì)溶液，這導(dǎo)致在約20.0-55%的烷醇(例如，乙醇)濃度中形成囊(B)。通過混合水溶液和有機脂質(zhì)溶液，所述有機脂質(zhì)溶液進行連續(xù)、順序的逐步稀釋，從而產(chǎn)生脂質(zhì)體。此外，可以通過將囊另外逐步稀釋到低于或等于約25%，優(yōu)選地約19-25。/。的垸醇濃度而進一步穩(wěn)定脂質(zhì)囊諸如SNALP(—種脂質(zhì)-顆粒)(C)。在某些方面，所述另外的順序稀釋(C)基本上在脂質(zhì)體形成后立即進行。例如，在脂質(zhì)體溶液形成和稀釋(C)之間經(jīng)過小于1分鐘是有利的，更有利地是小于10秒，并且甚至更有利地是小于1秒或2秒。在某些方面，對于兩種順序稀釋(A—B和B—C)，得到的乙醇、脂質(zhì)和溶質(zhì)濃度在接收容器中都保持不變。與通過在更低的乙醇濃度稀釋而形成的囊相比較，在初始混合步驟之后的這些更高的乙醇濃度，脂質(zhì)單體重排成雙層以更有序的方式進行。不受任何具體理論的限制，據(jù)信這些更高的乙醇濃度促進核酸與陽離子脂質(zhì)在雙層中的締合。在一個方面中，核酸包封發(fā)生在高于22%的烷醇(例如，乙醇)濃度范圍內(nèi)。在一個方面中，脂質(zhì)囊以約60-約400mL/分鐘的速率形成。在混合步驟130后，脂質(zhì)濃度為約1-12mg/mL,并且治療劑(例如，核酸)濃度為約0.05-0.23mg/mL。在某些優(yōu)選的方面中，脂質(zhì)濃度為約1.25mM0.72mg/mL并且治療劑(例如，核酸)濃度為約0.06mg/mL，從而提供約為12的脂質(zhì)核酸比例。緩沖劑濃度為約l-3mM，并且烷醇濃度為約45%v/v-約90。/。v/v。在優(yōu)選的方面中，緩沖劑濃度為約3mM，并且垸醇濃度為約45%v/v-約600/。v/v。3.脂質(zhì)體稀釋返回圖1，在囊形成步驟130后，通過在去除游離核酸之前立即稀釋140脂質(zhì)囊懸浮液(脂質(zhì)體溶液)，而提高治療劑(例如，核酸)包封程度，并且保持粒度，并且甚至減小粒度。例如，在稀釋步驟140之前，如果治療劑捕獲在約50-60%，在稀釋步驟140之后，它可以增加到約80-90%。在歩驟140中，通過與水溶液諸如緩沖劑混合(例如，1:1，20mM擰檬酸鹽緩沖液，300mMNaCl，pH6.0)，脂質(zhì)體制劑稀釋到約10%-約40%，優(yōu)選約20%的烷醇。然后，任選地允許稀釋的樣品在室溫下溫育。4.去除游離的治療劑在立即稀釋140之后，約70-80%或更多的治療劑(例如，核酸)被捕獲在脂質(zhì)囊(例如，SNALP)內(nèi)，并且游離的治療劑可以從制劑去除150。在某些方面，使用陰離子交換層析。有利地，使用陰離子交換樹脂導(dǎo)致高動力學(xué)的核酸去除能力，能夠單獨使用，可以預(yù)先滅菌和驗證，并且是完全可縮放的。另外，所述方法導(dǎo)致游離治療劑(例如，核酸，諸如大約總質(zhì)粒的25%)的去除。樣品體積在層析后沒有改變，并且治療劑(例如，核酸)和脂質(zhì)濃度分別為約0.04-0.05和0.7mg/mL。在這一點上，可以關(guān)于包封的治療劑檢測樣品。5.樣品濃縮在某些情形中，例如，使用超濾160(例如，切向流透析)，將脂質(zhì)體溶液任選地濃縮約5-50倍，優(yōu)選地10-20倍。在一個實施方案中，將樣品轉(zhuǎn)移到超濾系統(tǒng)的給料儲蓄器中，并且去除緩沖劑?？梢允褂酶鞣N方法諸如通過超濾去除所述緩沖劑。在一個方面中，使用裝滿聚砜中空纖維，例如具有約0.5mm-約l.Omm的內(nèi)徑和30，000標稱截留分子量(NMWC)的聚砜中空纖維的柱體，去除緩沖劑。還可以使用具有約l,OOOMWCO-約750,000MWCO的中空纖維。將脂質(zhì)體保留在所述中空纖維內(nèi)并且再循環(huán)，而溶劑和小分子通過流經(jīng)中空纖維的孔而從所述制劑去除。在這一步驟中，濾液稱為穿透溶液。當完成濃縮步驟時，治療劑(例如，核酸)和脂質(zhì)濃度分別可以增加到約2和60mg/mL。在一個實施方案中，烷醇濃度保持不變，但是烷醇.*脂質(zhì)的比例減小約50倍。6.垸醇去除在一個實施方案中，將濃縮的制劑對約5-20個體積的，優(yōu)選約10個體積的水溶液(例如，緩沖劑)(例如，pH4.0的檸檬酸鹽緩沖劑(25mM檸檬酸鹽，100mMNaC1))進行滲濾，以去除垸醇170。還可以使用中性緩沖劑或糖基緩沖劑。在完成步驟170的垸醇濃度小于約1%。脂質(zhì)和治療劑(例如，核酸)濃度保持不變，并且治療劑捕獲的水平也保持恒定。7.緩沖劑置換在已經(jīng)去除烷醇之后，然后通過對另一種緩沖劑(例如，對10個體積的鹽水，含有IOmMHepes或磷酸鹽的150mMNaCl，pH7.4)滲濾而置換水溶液180。可以使用任何種類的緩沖劑，例如，中性的、糖基的等。典型地，脂質(zhì)與治療劑(例如，核酸)的濃度比例保持不變，并且核酸捕獲的水平大約恒定。在某些情形中，通過用約為濃縮樣品10%體積的緩沖劑漂洗柱體可以提高樣品收率。在某些方面，然后將這種漂洗物添加到濃縮樣品中。8.無菌過濾在某些優(yōu)選的實施方案中，可以任選地進行脂質(zhì)濃度約12-120mg/mL的樣品的無菌過濾190。在某些方面，在低于約40psi的壓力下進行過濾，使用囊式濾器(capsulefilter)和具有加熱套層的加壓分配容器。稍微加熱樣品可以改善過濾的容易度。9.無菌填充使用與常規(guī)脂質(zhì)體配制方法相似的方法進行無菌填充步驟195。本發(fā)明的方法導(dǎo)致在最終產(chǎn)物中約50-60%的輸入治療劑(例如，核酸)。在某些方面，最終產(chǎn)物的治療劑與脂質(zhì)的比例為約0.01-0.2。IV.治療劑本發(fā)明的脂基藥物制劑和組合物用于全身或局部遞送治療劑或生物活性劑，并且還用于診斷檢測中。下述討論一般指脂質(zhì)體；然而，相同的討論完全適用于本發(fā)明其余的藥物遞送系統(tǒng)，這對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見的。如上文所討論，治療劑優(yōu)選地在囊形成過程中結(jié)合到脂質(zhì)囊內(nèi)。在一個實施方案中，疏水活性與脂質(zhì)一起結(jié)合到有機溶劑中，而核酸和親水治療劑可以添加到水性成分中。在某些情形中，所述治療劑包括下列各項的一種蛋白質(zhì)、核酸、反義核酸、核酶、tRNA、snRNA、siRNA、shRNA、ncRNA、預(yù)先濃縮的DNA、適體、抗原及它們的組合。在優(yōu)選的方面，所述治療劑是核酸。所述核酸可以編碼蛋白質(zhì)，諸如例如，單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)、胞嘧啶脫氨酶、黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶、p53、嘌呤核苷磷酸化酶、羧酸酯酶、脫氧胞苷激酶、硝基還原酶、胸苷磷酸化酶、或細胞色素P4502B1。在某些方面，治療劑結(jié)合在有機脂質(zhì)成分中。在某些情形中，所述治療劑是親脂性的。適當?shù)挠H脂性試劑包括紫杉醇(taxol)，紫杉醇衍生物，其包括，例如，protaxIII和紫杉醇(Paclitaxol)，親脂性苯并卟啉，維替泊芬膦甲酸的脂質(zhì)前藥，l-0-十八烷基-sn-甘油-3-膦酰基甲酸酯(ODG-PFA)，二油酰[3H]碘代脫氧尿嘧啶([3H]IDU-012)，脂質(zhì)衍生的HIV蛋白酶抑制肽，諸如iBOC-[L-PheHD-卩-Nal]-Pip-[a-(OH)-Leu〗畫Val(7194)和其它脂質(zhì)衍生的藥物或前藥。在另一個實施方案中，本發(fā)明的脂質(zhì)囊可以在囊形成之后負載一種或多種治療劑。在某些方面，使用本發(fā)明施用的所述治療劑可以是為待治療的疾病選擇的適當療法的多種藥物的任何藥物。通常所述藥物是抗腫瘤劑，諸如長春新堿，多柔比星，米托蒽醌，喜樹堿，順鉑，博來霉素，環(huán)磷酰胺，甲氨蝶呤，鏈脲霉素(streptozotodn),等。特別優(yōu)選的抗腫瘤藥物包括，例如，放線菌素D,長春新堿，長春堿，半胱氨酸阿拉伯糖苷,蒽環(huán)霉素，烷基藥劑(alkyktiveagents),鉑化合物，抗代謝物，和核苷類似物，諸如甲氨蝶呤和嘌呤與嘧啶類似物。還可以理想地通過本方法將抗感染藥劑遞送到特定組織。本發(fā)明的組合物還可以用于其它藥物的選擇性遞送，所述其它藥物包括但不限于局部麻醉劑，例如，地布卡因和氯丙嗪;卩-腎上腺素阻斷劑，例如，普萘洛爾，噻嗎洛爾和拉貝洛爾；抗高血壓藥物，例如，可樂定和肼屈嗪；抗抑郁藥，例如，丙米嗪，阿米替林和多塞平(doxepim);抗驚厥藥(anti-conversants),例如，苯妥英；抗組月安藥，例如，苯海拉明，氯苯那敏和異丙嗪；抗生素/抗細菌藥，例如，慶大霉素(gentamycin),環(huán)丙沙星和頭孢西??；抗真菌藥，例如，咪康唑，特康唑,益康唑，異康唑，布他康唑(butaconazole),克霉唑，伊曲康唑，制霉菌素,萘替芬和兩性霉素B;抗寄生物藥，激素，激素拮抗劑，免疫調(diào)節(jié)劑，神經(jīng)遞質(zhì)拮抗劑，抗青光眼藥，維生素，麻醉品，和顯象劑。V.裝置在一個實施方案中，本發(fā)明提供用于實施本發(fā)明方法的系統(tǒng)和裝置。圖3a和3b分別顯示按照本發(fā)明的兩個實施方案的裝置300和裝置302的實例。這些圖表只是舉例說明，并且不應(yīng)該限制本文權(quán)利要求的范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該認識到其它的變化、改進和備選方案。如所示，裝置300和裝置302分別包括兩個儲蓄器，一個水溶液儲蓄器305和一個有機溶液儲蓄器310，分別用于容納水溶液和有機溶液。在某些方面，在低壓(例如，<10psi)快速制備脂質(zhì)囊制劑，并且本發(fā)明的裝置和方法是完全可縮放的(scaleable)(例如，0.5mL-5000L)。在1-L規(guī)模，以約0.4-0.8L/分鐘形成脂質(zhì)囊。在某些優(yōu)選的方面，所述裝置不使用靜態(tài)混合器也不使用專門的擠出設(shè)備。在一個實施方案中，混合室320包括T-連接器，其具有任選的軟管倒鉤，其中流體管道324和326以約180。相互影響。還可以改變混合的角度，并且可以在約90°-約180°或者甚至27°-約90°的角度形成小于約100nm的脂質(zhì)囊。在某些方面，使用基本上相等的流體管道流速制備充分限定和可再現(xiàn)平均直徑的脂質(zhì)囊。在其它方面，在一些情形中，通過改變流體管道的流速而制備充分限定的和可再現(xiàn)的平均直徑的脂質(zhì)囊，例如，以確保充分的混合。在某些方面中，流速之間的方差小于50%，更典型地小于約25%，并且甚至更典型地小于約5%。圖5顯示按照一個實施方案的T-連接器和相關(guān)的流動動力學(xué)。在實施例部分(下文)更詳細地顯示和討論流速的實例。與現(xiàn)有系統(tǒng)比較，本發(fā)明在低得多的(和基本上相等的)流速提供非湍流和提高的剪切速率。例如，在約500/s-約3300/s的剪切速率在約0.075-約0.4L/min的流速(兩個流動管道)的混合環(huán)境中，本發(fā)明有利地提供非湍流(N,.e<2000)。對于混合室的管下游計算這些值；難以預(yù)測在T-連接器的混合點發(fā)生什么?？赡墚a(chǎn)生湍流，但是只是在混合室中的混合點產(chǎn)生。例如，使用蠕動泵315，容積式泵，無脈動齒輪泵，通過給脂質(zhì)-乙醇和緩沖劑容器305、310加壓，或者通過組合兩種或多種這些和/或其它泵機構(gòu)，可以驅(qū)動所述兩種流體成分的混合。在一個方面中，使用配有505L泵頂?shù)腤atson-Marlow505Di/L泵；硅氧烷管道(例如，鉬處理的，3.2mm內(nèi)徑(ID),2.4mm壁厚；從WatsonMarlow獲得，貨號913A032024)可以用于進入聚丙烯或不銹鋼T-連接器中的流體管道(例如，具有l(wèi)/8"內(nèi)徑(ID))。典型地，脂質(zhì)囊在室溫下形成，但是按照本發(fā)明脂質(zhì)囊可以在升高的溫度形成。與其它現(xiàn)有方法不同，對于緩沖劑組成沒有一般要求。事實上，本發(fā)明的方法和裝置可以通過將烷醇中的脂質(zhì)與水混合而配制脂質(zhì)囊。在某些方面，本發(fā)明的方法和裝置形成直徑小于約100nm的脂質(zhì)囊。當制備包含核酸的脂質(zhì)囊(諸如SNALP)時，核酸與陽離子脂質(zhì)和反荷離子的比例可以最優(yōu)化。對于精制制劑，在混合和乙醇去除步驟后優(yōu)選70-95%的核酸("NA")包封。通過立即稀釋這一初始SNALP制劑，有利地提高NA包封的水平。令人驚訝地，當在混合環(huán)境中混合溶液(治療劑在一種溶液成分中)時，本發(fā)明的方法和裝置提供達到約90%的包封效率。在圖3a和3b中顯示兩種備選的稀釋方案，例如，直接稀釋。在圖3a中所示的實施方案中，將在混合區(qū)域320中形成的脂質(zhì)體溶液立即并且直接引入到收集容器360中，收集容器360中含有控制量的稀釋緩沖劑。在優(yōu)選的方面，容器360包括設(shè)置成攪拌容器360的內(nèi)容物以促進稀釋的一個或多個元件。在一個方面中，在容器360中存在的稀釋緩沖劑的量基本上等于向其中引入的脂質(zhì)體溶液的體積。例如，當45%乙醇中的脂質(zhì)體溶液引入到含有相等體積的乙醇的容器360中時，將有利地在22.5%的乙醇中產(chǎn)生更小的顆粒。在圖3b中所示的實施方案中，將含有稀釋緩沖劑的第三儲蓄器345流動性地偶聯(lián)到第二混合區(qū)域340。在該實施方案中，將在混合區(qū)域320中形成的脂質(zhì)體溶液立即并且直接與在第二混合區(qū)域340的稀釋緩沖劑混合。在某些方面，混合區(qū)域340包括排列的T-連接器，以致脂質(zhì)體溶液和稀釋緩沖劑流動作為反向180°的流動而匯合，然而，可以使用提供更狹窄角度例如，27°-約180°的連接器。泵機構(gòu)330將緩沖劑的可控流動遞送至混合區(qū)域340。在一個方面中，控制提供到混合區(qū)域340的稀釋緩沖劑的流速，使之基本上等于從混合區(qū)域320引入到其中的脂質(zhì)體溶液的流速。本實施方案有利地允許更多地控制與所述脂質(zhì)體溶液在第二混合區(qū)域340混合的稀釋緩沖劑流動，并且因此還更多地控制在整個第二混合過程的緩沖劑中脂質(zhì)體溶液的濃度。這種稀釋緩沖劑流速的控制有利地允許在減小的濃度形成小的粒度。參見，例如，下面的實施例部分。在某些方面中，本發(fā)明的脂質(zhì)體生成裝置300和302進一步包括用于控制儲蓄器305和310的溫度的溫度控制機構(gòu)(未顯示)。典型地，來自第一儲蓄器305和第二儲蓄器310的流體在分開的孔同時流入混合室320。裝置302進一步包括用于脂質(zhì)體收集的第二混合室340下游的收集儲蓄器350。此外，在某些方面，裝置300和302進一步包括儲蓄器305和310之一或兩者上游的存儲容器。此外，儲蓄器305和310之一或兩者可以包括裝有高架混合器的套層不銹鋼容器。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供具有超濾系統(tǒng)的裝置，用于實施本發(fā)明的方法。圖4是按照本發(fā)明的一個實施方案的裝置400的代表性示意圖的實例。這一示意圖只是舉例說明，并不應(yīng)該限制本文權(quán)利要求的范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該認識到其它的變化、改進和備選方案。在某些方面，裝置400包括多個儲蓄器，并且裝有超濾系統(tǒng)。水溶液儲蓄器440和有機溶液儲蓄器430每一個分別具有上游制劑囊(未顯示)。如在圖4中所示，收集容器450與流動超濾系統(tǒng)流體連通。在某些方面，超濾用來濃縮SNALP樣品，然后通過緩沖劑置換而將乙醇從制劑中去除。應(yīng)該理解，當進行按照圖3a的方法時，收集容器450可與包含需要量的稀釋緩沖劑。類似地，當進行按照'圖3b的過程時，容器450可以作用為圖3b的收集容器350(在圖4中未顯示的第二泵)。在一個操作實施方案中，將稀釋的SNALP轉(zhuǎn)移到超濾系統(tǒng)的給料儲蓄器中。通過去除緩沖劑和乙醇，例如，通過使用用擁有約0.5mm-約1.0mm內(nèi)徑和約l,000-約750,000截留分子量(MWCO)的聚砜中空纖維填充的錯流柱體，而進行濃縮。SNALP保持在所述中空纖維內(nèi)并且再循環(huán)，而乙醇和緩沖劑成分通過流經(jīng)這些中空纖維的孔而從所述制劑去除。這種濾液稱為穿透溶液，并且被丟棄。當SNALP濃縮到需要的質(zhì)粒濃度時，SNALP懸浮在其中的緩沖劑可以通過超濾去除，并且被等體積的最終緩沖劑置換。超濾可以用其它方法諸如常規(guī)透析代替。VI.實施例實施例l-現(xiàn)有方法與直接稀釋方法的比較SNALP由2摩爾。/。PEG-C-DMA，30%DlinDMA，20摩爾。/。DSPC和48摩爾。/。Chol"組成。WATSONMARLOW泵一505Di/L型—核酸未修飾的siRNA(在0.9。/。NaCl中復(fù)原)(0.225mg/mlsiRNA)—混合體積10mL核酸+100^脂質(zhì)-乙醇溶液(5mL脂質(zhì))—1.6mmT形連接器，3.2mm管道，每個通道40cm管長^流速200mL/分鐘條件1.將核酸與脂質(zhì)混合，然后在溫育延遲后使用泵稀釋SNALP(現(xiàn)有方法)。2.將核酸與脂質(zhì)混合，然后使用移液器添加緩沖劑而稀釋SNALP。3.將核酸和脂質(zhì)直接混合到含有稀釋緩沖劑的瓶中(圖3a，不攪動)。4.將核酸和脂質(zhì)直接混合在攪動的稀釋緩沖劑中(圖3a)。結(jié)果:<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>與用現(xiàn)有方法諸如在公布的美國申請2004/0142025中公開的方法制備的SNALP相比較，直接稀釋方法(圖3a)以類似的包封效率產(chǎn)生顯著更小的SNALP顆粒。實施例2-使用變化的方法參數(shù)比較本發(fā)明的方法。形成4x濃縮的SNALPSNALP2顯示在圖3a中的方法SNALP3顯示在圖3b中的方法<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>形成4x濃縮的SNALP直接稀釋(圖3a)相對管道中的稀釋(圖3b)<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>*在稀釋之前關(guān)于初始囊形成的速率的流速值，對于管道中的稀釋方法以600mL/min遞送的稀釋緩沖劑，以在得到的SNALP樣品中獲得20%的EtOH?？偨Y(jié)1.當泵流速增加時，可以在更高的初始脂質(zhì)和siRNA濃度(4x)制備SNALP，并且對所述siRNA溶液、脂質(zhì)溶液和稀釋緩沖劑進行修飾。這些SNALP具有良好的包封效率和粒度。2.使用管道中的稀釋方法(SNALP3-圖3b)，可以進一步控制這些SNALP的粒度，給出在尺寸上類似于以四分之一的初始脂質(zhì)和siRNA濃度制備的SNALP2(圖3a)的顆粒。VII.結(jié)論使用本發(fā)明的系統(tǒng)和方法可以生產(chǎn)的脂質(zhì)顆粒的其它特點、優(yōu)點和實例可以在美國臨時專利申請系列號[60/](代理人記錄號020801-002810US)中找到，所述美國臨時專利申請系列號[60/](代理人記錄號020801-002810US)題目為"ApoliproteinB的siRNA沉默(siRNASilencingofApoliproteinB)"，與本申請同時于2005年7月27日提交，其內(nèi)容通過引用結(jié)合于此。本文討論的所有專利、專利申請和其它參考文獻都通過引用結(jié)合于此。盡管本發(fā)明已經(jīng)通過實施例并且關(guān)于具體的實施方案進行了描述，但是應(yīng)該理解，本發(fā)明不限于所公開的實施方案。相反，意欲涵蓋對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的各種改進和類似的安排。因此'后附的權(quán)利要求的范圍應(yīng)該符合最廣泛的解釋，從而包括所有這樣的改進和類似的安排。權(quán)利要求1.生產(chǎn)包封治療產(chǎn)品的脂質(zhì)體的方法，所述方法包括在第一儲蓄器中提供水溶液；在第二儲蓄器中提供有機脂質(zhì)溶液，其中所述水溶液和所述有機脂質(zhì)溶液的一種包含治療產(chǎn)品；將所述水溶液和所述有機脂質(zhì)溶液在第一混合區(qū)域混合，以產(chǎn)生脂質(zhì)體溶液，其中所述有機脂質(zhì)溶液與所述水溶液混合，以便基本上瞬時產(chǎn)生包封所述治療產(chǎn)品的脂質(zhì)體；并且然后立即將所述脂質(zhì)體溶液與緩沖溶液混合，以產(chǎn)生稀釋的脂質(zhì)體溶液。2.權(quán)利要求1的方法，其中將所述脂質(zhì)體溶液與所述緩沖溶液混合包括將所述脂質(zhì)體溶液引入到含有所述緩沖溶液的第三儲蓄器中。3.權(quán)利要求2的方法，其中所述第三儲蓄器包含基本上等于或大于向其中引入的脂質(zhì)體溶液的量的一定量的緩沖溶液。4.權(quán)利要求2的方法，其中攪拌所述第三儲蓄器。5.權(quán)利要求1的方法，其中將所述脂質(zhì)體溶液與所述緩沖溶液混合包括在第二混合區(qū)域中混合。6.權(quán)利要求5的方法，其中所述第一混合區(qū)域包括第一T-連接器，其中將所述水溶液和所述有機脂質(zhì)溶液作為相對彼此基本上1S0。的相對流動引入到第一T-連接器中，其中第二混合區(qū)域包括第二T-連接器，并且其中將所述脂質(zhì)體溶液和所述緩沖溶液作為相對彼此基本上180°的相對流動引入到所述第二T-連接器中。7.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一混合區(qū)域包括第一T-連接器，并且其中將所述水溶液和所述有機脂質(zhì)溶液作為相對彼此基本上180°的相對流動引入到所述T-連接器中。8.權(quán)利要求1的方法，其中所述脂質(zhì)體溶液具有約20y。v/v至約55%v/v的有機溶劑濃度。9.權(quán)利要求8的方法，其中所述稀釋的脂質(zhì)體溶液具有小于約25%v/v的有機溶劑濃度。10.權(quán)利要求1的方法，其中所述脂質(zhì)體直徑小于約100nm。11.權(quán)利要求1的方法，其中所述治療產(chǎn)品選自由下列各項組成的組:蛋白質(zhì)、質(zhì)粒、適體、核酸、反義核酸、核酶、tRNA、snRNA、siRNA、shRNA、ncRNA、預(yù)先濃縮的DNA和抗原。12.權(quán)利要求l的方法，其中所述治療產(chǎn)品是核酸。13.權(quán)利要求12的方法，其中所述核酸編碼選自由下列各項組成的組的蛋白質(zhì)單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)、胞嘧啶脫氨酶、黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶、p53、嘌呤核苷磷酸化酶、羧酸酯酶、脫氧胞苷激酶、硝基還原酶、胸苷磷酸化酶、或細胞色素P4502B1。14.權(quán)利要求l的方法，其中所述治療產(chǎn)品是親脂性的。15.權(quán)利要求14的方法，其中所述親脂性產(chǎn)品選自由protaxIII、紫杉醇(Paclitaxol)、紫杉醇(taxol)、紫杉醇衍生物和脂質(zhì)衍生的前藥組成的組。16.用于生產(chǎn)包封治療產(chǎn)品的脂質(zhì)體的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括容納水溶液的第一儲蓄器；容納有機脂質(zhì)溶液的第二儲蓄器，其中所述水溶液和所述有機脂質(zhì)溶液中的一種包含治療產(chǎn)品；和泵機構(gòu)，將所述泵機構(gòu)設(shè)置成將所述水溶液和所述有機脂質(zhì)溶液以基本上相等的流速泵抽到混合區(qū)域中，其中所述有機脂質(zhì)溶液與所述水溶液在混合區(qū)域中混合，以基本上瞬時形成包封治療產(chǎn)品的脂質(zhì)體溶液；和收集儲蓄器，所述收集儲蓄器包括緩沖溶液，與所述混合區(qū)域流體連通，其中將所述脂質(zhì)體溶液在形成后基本上立即引入到收集儲蓄器中，由此形成稀釋的脂質(zhì)體溶液。17.權(quán)利要求16的系統(tǒng)，其中所述混合區(qū)域包括T-連接器，并且其中將所述水溶液和所述有機脂質(zhì)溶液作為相對彼此基本上180。的相對流動引入到所述T-連接器中。18.權(quán)利要求16的系統(tǒng)，其中所述收集儲蓄器含有基本上等于或大于向其中引入的脂質(zhì)體溶液的量的一定量的緩沖溶液。19.權(quán)利要求16的系統(tǒng)，其中攪拌所述第三儲蓄器。20.用于生產(chǎn)包封治療產(chǎn)品的脂質(zhì)體的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括容納水溶液的第一儲蓄器；容納有機脂質(zhì)溶液溶液的第二儲蓄器，其中所述水溶液和所述有機脂質(zhì)溶液中的一種包含治療產(chǎn)品；和第一泵機構(gòu)，將其設(shè)置成將所述水溶液和所述有機脂質(zhì)溶液以基本上相等的流速泵抽到第一混合區(qū)域中，其中所述有機脂質(zhì)溶液與所述水溶液在第一混合區(qū)域混合，以基本上瞬時形成包封治療產(chǎn)品的脂質(zhì)體溶液；容納緩沖溶液的緩沖儲蓄器；禾口第二泵機構(gòu)，將其設(shè)置成將所述緩沖溶液以控制的流速泵抽到第二混合區(qū)域中，其中在第一混合區(qū)域中形成以后，所述脂質(zhì)體溶液基本上立即引入到第二混合區(qū)域，由此在所述第二混合區(qū)域形成稀釋的脂質(zhì)體溶液。21.權(quán)利要求20的裝置，其中所述第一混合區(qū)域包括第一T-連接器，其中將所述水溶液和所述有機脂質(zhì)溶液作為相對彼此基本上180°的相對流動引入到第一T-連接器中，其中所述第二混合區(qū)域包括第二T-連接器，并且其中將所述脂質(zhì)體溶液和所述緩沖溶液作為相對彼此基本上180°的相對流動引入到所述第二T-連接器中。22.權(quán)利要求20的系統(tǒng)，其中控制所述緩沖溶液的流速基本上等同于或大于進入所述第二T-連接器的脂質(zhì)體溶液的流速。23.權(quán)利要求16或20的系統(tǒng)，其中所述脂質(zhì)體溶液具有約20%^^約55%v/v的有機溶劑濃度。24.權(quán)利要求23的系統(tǒng)，其中所述稀釋的脂質(zhì)體溶液具有小于約25%v/v的有機溶劑濃度。25.權(quán)利要求16或20的系統(tǒng)，其中所述脂質(zhì)體直徑小于約100nm。26.權(quán)利要求16或20的系統(tǒng)，其中所述治療產(chǎn)品選自由下列各項組成的組蛋白質(zhì)、質(zhì)粒、適體、核酸、反義核酸、核酶、tRNA、snRNA、siRNA、shRNA、ncRNA、預(yù)先濃縮的DNA和抗原。27.權(quán)利要求16或20的系統(tǒng)，其中所述治療產(chǎn)品是核酸。28.權(quán)利要求27的系統(tǒng)，其中所述核酸編碼選自由下列各項組成的組的蛋白質(zhì)單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)、胞嘧啶脫氨酶、黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶、p53、嘌呤核苷磷酸化酶、羧酸酯酶、脫氧胞苷激酶、硝基還原酶、胸苷磷酸化酶、或細胞色素P4502B1。29.權(quán)利要求16或20的系統(tǒng)，其中所述治療產(chǎn)品是親脂性的。30.權(quán)利要求29的系統(tǒng)，其中所述親脂性產(chǎn)品選自由protaxIII、紫杉醇(Paclitaxo)、紫杉醇(taxol)、紫杉醇衍生物和脂質(zhì)衍生的前藥組成的組。全文摘要本發(fā)明提供用于生產(chǎn)脂質(zhì)體的裝置和方法。通過在第一儲蓄器中提供緩沖溶液，和在第二儲蓄器中提供脂質(zhì)溶液，在混合室中用緩沖溶液連續(xù)稀釋所述脂質(zhì)溶液而產(chǎn)生脂質(zhì)體。將治療劑，諸如核酸，包含在所述緩沖溶液或所述脂質(zhì)溶液的一種中。當混合脂質(zhì)體時，基本上瞬時形成包封治療產(chǎn)品。然后，將形成的脂質(zhì)體溶液立即用緩沖溶液稀釋，以提高均勻性并且保持小的粒度。文檔編號A61K38/43GK101267805SQ200680034313公開日2008年9月17日申請日期2006年7月27日優(yōu)先權(quán)日2005年7月27日發(fā)明者伊恩·麥克拉克倫,勞埃德·B·杰夫斯,基尤·拉姆,愛德華·亞沃爾斯基申請人:普洛體維生物治療公司