專利名稱：一種醫(yī)療裝置基因涂層的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)療裝置，具體涉及一種在醫(yī)療裝置上制備基因涂層 的方法。
背景技術(shù)：
由于動脈粥樣硬化引起血管管腔狹窄,從而造成肌肉供血供氧障
礙而引起相應(yīng)部位的肌肉缺血壞死。1976年德國學(xué)者安德里亞.格隆 茨戈首次提出了動脈血管內(nèi)安裝支架的設(shè)想，到卯年代冠狀動脈支架 已廣泛地應(yīng)用于臨床治療的一種醫(yī)療器械。
目前常用的血管支架按照表面狀態(tài)可分為裸支架、藥物洗脫支 架、聚合物包被支架、金屬涂層支架、放射性支架和人造血管覆蓋支 架，為了克服植入帶來的炎癥反應(yīng)和高居不小的再狹窄率，人們開發(fā) 出放射性支架和藥物洗脫支架，其中所述藥物是各種起治療作用的藥 劑等，現(xiàn)在藥物洗脫支架已被公認(rèn)為在冠心病的介入治療中，解決冠 脈血管內(nèi)再狹窄問題的最有效的方法。
但現(xiàn)有的藥物洗脫支架大多釆用聚合物作為載體來攜帶藥物并 控制其釋放，典型的作法是將活性藥物和聚合物混合涂覆在裸支架 部分或全部表面上，聚合物一般最少要占涂層質(zhì)量的70%以上才能起 到載體的作用，支架本體上涂覆一層包含活性藥物的聚合物涂層，聚 合物涂層上又涂覆一層多聚物涂層。這種含有聚合物涂層的藥物支架 在臨床應(yīng)用中可以將再狹窄發(fā)生率降低到10%以下，但是，這種醫(yī)療 裝置在植入人體后，由于藥物的不斷減少而聚合物濃度相應(yīng)的不斷增 高，可能導(dǎo)致后期血栓的形成。
隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，許多疾病的發(fā)病機(jī)理在基因水平上得以 闡明，這使得從基因水平診斷和根治疾病成為可能。在醫(yī)治心臟病、
5腫瘤、糖尿病等方面的基因轉(zhuǎn)移和調(diào)位的治療方法正在成為研究熱 點(diǎn)，例如將促進(jìn)內(nèi)皮修復(fù)和抑制內(nèi)膜增殖的基因?qū)胄难軆?nèi)，使之 在血管內(nèi)表達(dá)，從而達(dá)到抑制血管再狹窄的目的。
但基因治療方面存在的主要問題還在于不能將安全性好的質(zhì)粒 DNA有效、足量地運(yùn)送到體內(nèi)細(xì)胞，并提高其轉(zhuǎn)染效率以得到基因 的高效表達(dá)；對心血管內(nèi)基因治療來說，主要問題還在于很難把基因 專一性遞送到血管組織中，而不進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)或進(jìn)入血液循環(huán)系 統(tǒng)，從而不產(chǎn)生毒性或僅有得極小的毒性。有研究表明，采用球囊導(dǎo) 管向血管內(nèi)灌注轉(zhuǎn)基因病毒的懸浮液，灌注到血管中的病毒顆粒大部 分隨血液進(jìn)入全身循環(huán)系統(tǒng)，最后被截留在肝和肺中，很難在冠脈病 灶局部血管中達(dá)到有效的基因濃度，此外病毒在體內(nèi)器官中的廣泛擴(kuò) 散，潛伏著致命的全身毒副作用，無論安全性還是有效性都不符合臨 床應(yīng)用的要求。
因此，人們開展了大量可攜載治療性基因的載體的研究，如藥物 洗脫支架常用的聚合物載體，但雖然有許多載體系統(tǒng)在研究和使用， 但是沒有一個(gè)載體可以達(dá)到導(dǎo)向、高效地把基因?qū)塍w內(nèi)的靶細(xì)胞，
如與高分子接觸的細(xì)胞發(fā)生過度的增殖，將質(zhì)粒DNA包埋在明膠海 綿體中植入骨中可成功地轉(zhuǎn)入核酸，但是大部分的DNA在短時(shí)間內(nèi) (<1小時(shí))逃逸。其他的DNA運(yùn)載體系包括包載核酸的微球，都存 在遞送效率的問題。不少臨床治療方案失敗的原因是使用不適當(dāng)?shù)妮d 體。因此缺乏高效、局部的基因?qū)胂到y(tǒng)是基因治療面臨的主要技術(shù) 難關(guān)。
目前將能夠促進(jìn)內(nèi)皮修復(fù)和抑制內(nèi)膜增殖的不同階段信號因子 及其相關(guān)基因，包括能產(chǎn)生血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)的基因、 一氧化氮合酶的一氧化氮合酶基因、雌激素、17P雌二醇等涂敷在植 入支架的表面成為研究熱點(diǎn)，這些支架在動物實(shí)驗(yàn)階段大部分都表現(xiàn) 了較好的抑制再狹窄和促進(jìn)內(nèi)皮修復(fù)的結(jié)果。2006年1月美國PNAS雜志報(bào)道了費(fèi)城大學(xué)Levy研究小組用聚乙烯亞胺雙磷酸酯在金屬支
架表面形成亞胺雙磷酸酯單分子層，結(jié)合反義腺病毒抗體再偶聯(lián)病毒 基因，植入實(shí)驗(yàn)兔體內(nèi)，顯著地有效抑制了血管的增殖。
中國專利申請02136779.5提供了一種攜載基因支架及其制備方 法和應(yīng)用，所述攜載基因支架包括支架、涂覆在支架表面的吸附基因 的蛋白吸附層和吸附層表面的載體治療基因?qū)?，其特征在于吸附層?括97-100wt。/。的經(jīng)過交聯(lián)處理的分子量大于10000的蛋白質(zhì)，0-3wt%
的添加劑。
中國專利申請200610148261.3提供了 一種用于植入到體內(nèi)血管 和管腔結(jié)構(gòu)中的生物支架的制備方法，是將支架表面的基質(zhì)涂層為載 體，將治療性基因通過電泳的方法負(fù)載到涂層支架表面。
以上器械或裝置的特點(diǎn)是均在裝置本體表面涂布了基質(zhì)層，利用 基質(zhì)的連接作用把基因或寡核苷酸或藥物涂覆和/或固定在基質(zhì)涂層 上。但由于基質(zhì)的存在，增加了基質(zhì)帶來的炎癥和再狹窄發(fā)生的幾率。

發(fā)明內(nèi)容
基于上述缺點(diǎn)，本發(fā)明提供一種在醫(yī)療裝置上攜載基因涂層的方 法。該方法無需涂覆基質(zhì)，就能在金屬材質(zhì)的醫(yī)療裝置的表面攜載基 因活性物質(zhì)，充分發(fā)揮所涂覆的基因活性物質(zhì)的促進(jìn)內(nèi)皮修復(fù)和抑制 平滑肌增殖的作用。
本發(fā)明所提供的攜載基因涂層醫(yī)療裝置的制備方法，是將醫(yī)療裝 置本體作為陽極，將其與陰極一起，置于基因或寡核苷酸的溶液中進(jìn)
行陽極極化反應(yīng)，基因或寡核苷酸在電源電場力的作用下，電離而帶 負(fù)電，向醫(yī)療裝置陽極移動，均勻地涂覆在醫(yī)療裝置的表面，得到表 面攜載基因?qū)拥尼t(yī)療裝置。
本發(fā)明所述的攜載基因涂層醫(yī)療裝置的制備方法，還包括將涂覆 基因?qū)雍蟮尼t(yī)療裝置自然晾干，經(jīng)預(yù)冷凍后，放入真空冷凍干燥機(jī)干 燥。
7其中，所述的醫(yī)療裝置本體的材質(zhì)為不銹鋼、鈷鉻合金、鎂合金、 Ni-Ti合金或其它醫(yī)用金屬材料。
所述的醫(yī)療裝置本體為冠脈血管支架、頸動脈血管支架、外周血 管支架、腎動脈血管支架、顱內(nèi)動脈血管支架、移植片固定膜、移植 片固定膜移植物、合成的人造血管、心臟瓣膜、血管修補(bǔ)篩、起搏器、
起搏器導(dǎo)子、除纖顫器、PFO隔膜封閉裝置、血管夾、動脈血管瘤閉
鎖器、血液透析移植物、血液透析導(dǎo)管、房室吻合分流、大動脈血管 瘤移植物裝置、靜脈瓣、血管接合夾、留置式動脈導(dǎo)管、血管護(hù)鞘、 藥物輸送口中的一種或多種的組合，優(yōu)選表面具有載藥孔洞的醫(yī)療裝 置，更優(yōu)選具有納米載藥孔洞的醫(yī)療裝置，所述納米載藥孔洞的尺寸
優(yōu)選100-800nm。所述孔洞可參照本公司的專利(CN 101161299 )進(jìn)行。
所述的醫(yī)療裝置本體優(yōu)選包括冠脈血管支架、頸動脈血管支架、
外周血管支架、腎動脈血管支架、顱內(nèi)動脈血管支架的支架；更優(yōu)選
表面具有載藥孔洞的支架；進(jìn)一步優(yōu)選具有納米載藥孔洞的醫(yī)療裝 置，所述納米載藥孔洞的尺寸優(yōu)選100-800nm。所述孔洞可參照本公 司的專禾ll (CN 101161299)進(jìn)行。
所述電源陰極可釆用本領(lǐng)域常用的惰性電極，如Pt電極等。 所述基因或寡核苷酸溶液是以蒸餾水、生理鹽水、pH值為3.0-9.0 的硼酸鹽緩沖溶液、pH值為8.0-10.0碳酸鹽緩沖溶液、pH值為3.0-9.0 醋酸鹽緩沖溶液、濃度為1%-20%的乙醇溶液或pH值為3.0-9.0磷酸鹽 緩沖溶液為溶劑，濃度為0.00lmg/ml-lmg/ml的基因或寡核苷酸溶液； 所述基因是一氧化氮合成酶(eNOS、 nNOS、 iNOS)基因、血 管內(nèi)皮生長因子(VEGF)基因、成纖維細(xì)胞生長因子(HGF)基因、 胰島素樣生長因子(IGF)基因、細(xì)胞分裂調(diào)控基因(c-myc)、抗癌 基因(p53)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)基因、血小板衍生生長因子 (PDGF)基因、PTEN、 Keratin8基因、尿激酶前體(Pro-UK)基因、EGF基因或其片段中的一種或多種。
所述寡核苷酸是上述基因的寡核苷酸或反義寡核苷酸或其片段
中的一種或多種；
所述陽極極化反應(yīng)采用直流電進(jìn)行，電壓0.1-2.5V，反應(yīng)時(shí)間 l-100min;
所述基因?qū)拥闹亓渴轻t(yī)療裝置重量的1/102-1/106;.
本發(fā)明所提供的攜載基因涂層醫(yī)療裝置的制備方法，還包括醫(yī)療 裝置本體的預(yù)處理將醫(yī)療裝置本體用四氫呋喃、丙酮、乙醇或甲醇 超聲清洗，然后再用去離子水進(jìn)行清洗；
本發(fā)明所提供的攜載基因涂層醫(yī)療裝置的制備方法，在醫(yī)療裝置 本體的預(yù)處理之前，還包括將醫(yī)療裝置本體進(jìn)行前處理表面清洗和 防腐處理；其中，所述表面清洗的過程為
1) 用砂帶打磨醫(yī)療裝置本體表面，用于去除表面的氧化物，調(diào) 整表面粗糙度；
2) 利用超聲波，依次用75%的醫(yī)用乙醇溶液、99.5%的丙酮溶液、 去離子水清洗，超聲波頻率為28-100KHz,清洗時(shí)間為5-15min;
3) 將醫(yī)療裝置本體放入15-60g/L、 70-100。C的氫氧化鈉溶液中浸 泡5-10min,用于去除油脂和氧化皮；
4) 將清洗后的醫(yī)療裝置本體放置在真空干燥機(jī)中，溫度設(shè)定在 30-40°C，干燥30-60min后取出。
所述防腐處理是釆用化學(xué)氧化處理或陽極氧化處理的方法進(jìn)行， 其中，化學(xué)氧化處理的過程為將醫(yī)療裝置本體浸入含重鉻酸鉀15-20 g/L、硝酸15-25 g/L、氯化鈉0.75-1.25 g/L的混合溶液中，在70-80。C 下，氧化0.5-2.0min，在支架本體表面生成氧化膜；
陽極氧化處理的過程為釆用交流電氧化，在兩電極上分別安裝 完全相同的支架本體，陽極氧化處理用槽液為高錳酸鉀15-20g/L、磷 酸三鈉15-55g/L、氟化鉀25-55 g/L、氫氧化鉀65-165 g/L、氫氧化鋁
915-65 g/L的混合液，在20-60。C下，電流密度為O.l-lO A/dm2,交流電 壓為50-90V下，氧化10-50min，支架本體表面生成氧化膜。
除上方法外，還可采用離子注入、激光表面處理、熱擴(kuò)散、金屬 鍍層、氣相沉積、有機(jī)涂層等方式中的一種或多種對支架本體表面進(jìn) 行防腐處理。
具體的說，上述釆用陽極極化的方法涂覆生物支架，包括如下步
1、 醫(yī)療裝置本體的預(yù)處理用四氫吹喃、丙酮、乙醇或甲醇超 聲清洗，然后再用去離子水進(jìn)行清洗；
2、 基因或寡核苷酸涂覆液的配制以蒸餾水、生理鹽水、pH值 為3.0-9.0的硼酸鹽緩沖溶液、pH值為8.0-10.0碳酸鹽緩沖溶液、pH值 為3.0-9.0醋酸鹽緩沖溶液、濃度為1%-20%的乙醇溶液或pH值為 3.0-9.0磷酸鹽緩沖溶液為溶劑，加入基因或寡核苷酸使其終濃度為 0.001mg/ml隱lmg/ml;
3、 涂覆液的涂覆釆用陽極極化包被的方式涂覆醫(yī)療裝置，以 醫(yī)療裝置本體為陽極，在直流電源下，控制電壓在0.1-2.5V,基因或 寡核苷酸電離帶負(fù)電，向陽極移動，均勻牢固地涂覆在醫(yī)療裝置本體 表面，涂覆時(shí)間為l-100min，涂覆量為醫(yī)療裝置重量的1/102-1/106。
陽極極化的原理當(dāng)把支架作為陽極，溶液中釆用基因或寡核苷 酸溶液時(shí)，該基因或寡核苷酸在溶液中電離變?yōu)殛庪x子，通電后基因 或寡核苷酸向陽極醫(yī)療裝置處移動，在靜電力作用下，克服醫(yī)療裝置 表面的液面張力，使基因或寡核苷酸與醫(yī)療裝置表面牢固均勻的結(jié) 合，與電鍍的原理基本相同。
此外，在醫(yī)療裝置本體表面涂覆基因或寡核苷酸前，可先涂覆治 療性藥物。其中，所述治療性藥物為肝素、阿司匹林、水蛭素、秋水 仙堿、抗血小板GPIIb/IIIa受體拮抗劑、白甲氨蝶呤、嘌呤類、嘧啶 類、植物堿類和埃坡破霉素(Epothilone)類、雷公藤系列化合物、
10抗生素、激素、抗體治癌藥物、環(huán)孢霉素、他克莫司及同系物(FK506)、
脫精胍菌素(15-deoxyspergualin)、霉酚酸脂(MMF)、雷帕霉素 (Rapamycin)及其衍生物、FR 900520、 FR 900523、 NK 86-1086、 戊酰胺(depsidomycin)、康樂霉素C (kanglemycin C )、斯博格埃林 (spergualin)、 靈菌*工素2 5 c(prodigiosin2 5 -c)、 曲尼斯凈寺(tranilast)、 多球殼菌素(myriocin)、 FR651814、 SDZ214-104、環(huán)孢霉素C、布 雷青霉素(bredinin)、麥考酚酸、布雷菲得菌素A、 WS9482、糖皮質(zhì) 類固醇、替羅非班(tirofiban)、埃替非巴肽(eptifibatide )、紫杉醇、 放線菌素-D等中的一種或多種。
上述治療性藥物溶液的涂覆處理，其過程為以甲醇作溶劑配置 濃度為l-15ug/ml的上述治療性藥物的溶液，對醫(yī)療裝置本體表面進(jìn) 行定向超聲噴涂，勻速旋轉(zhuǎn)醫(yī)療裝置本體，根據(jù)支架本體表面藥物含 量要求噴涂1-15次；
上述治療性藥物的涂覆處理，其過程也可為以四氫呋喃作有機(jī) 溶劑，加入濃度為l-15jag/ml的藥物，將醫(yī)療裝置本體浸泡在上述溶 液中5-10分鐘，重復(fù)浸涂1-10次。
本發(fā)明所提的基因涂層醫(yī)療裝置的制備方法，其具有如下有益效
果
1. 簡單易行，在醫(yī)療裝置本體原材料的表面，即直接與人體病 變組織接觸的表面上制備有孔洞或者沒有孔洞分布，無需額外制備載 藥涂層，無明顯界面，能夠在醫(yī)療裝置本體全部或者部分表面通過靜 電作用均勻包被一層基因；
2. 醫(yī)療裝置本體全部或者部分表面包被基因或寡核苷酸后，醫(yī) 療裝置本體上基因或寡核苷酸包被量穩(wěn)定性較好，體外沖刷實(shí)驗(yàn)和動 物實(shí)驗(yàn)研究證明納米孔支架攜帶基因由于其納米孔和靜電吸附作用 能夠耐受一定時(shí)間的血液沖刷，并作為基因傳遞系統(tǒng)提供治療基因， 隨沖刷時(shí)間基因或寡核苷酸量均平穩(wěn)減少，從而阻止支架內(nèi)再狹窄和潛在的血管疾??；
3. 使用安全，滿足臨床需要。基因包被所使用的藥品器材都是臨 床證明安全的醫(yī)用級藥品和器材，本身產(chǎn)品就比較安全，所使用的醫(yī) 療裝置為治療性基因，能夠直接作用于人體；
4. 工業(yè)實(shí)用性強(qiáng)。該種基因或寡核苷酸包被方式能夠進(jìn)行大規(guī)
模的工業(yè)化生產(chǎn)，且操作簡單，成本較低。
而且本發(fā)明是直接在裝置本體上涂覆治療性基因，無須引入負(fù)載 基因的基質(zhì)，也可以避免在本體和基因涂層之間設(shè)置一層基質(zhì)，從而 避免了基質(zhì)帶來的炎癥和再狹窄，降低了炎癥和再狹窄發(fā)生率。


圖l為表面具有納米載藥孔的醫(yī)療裝置本體的表面的掃描電鏡照片。
圖2為涂敷基因?qū)拥谋砻婢哂屑{米載藥孔的醫(yī)療裝置本體表面的
基因分布掃描電鏡照片。
圖3為陽極極化涂覆過程示意圖；圖中1、操控電腦2、陽極極 化儀3、儲液容器4、電極。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不 背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的 修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
本發(fā)明醫(yī)療裝置本體的材質(zhì)可為醫(yī)用316L不銹鋼，也可以為鈷絡(luò) 合金、鎂合金、Ni-Ti合金或其它醫(yī)用金屬材料，都可以通過激光雕 刻或機(jī)械加工制成血管支架，除此以外，還可制成骨縫合線、骨釘、 骨連接件，脊推骨盤、縫合用錨、止血鉗、止血螺絲、止血板、止血 夾，以及組織粘合劑、密封劑、人造骨等醫(yī)療設(shè)備。支架表面通過化 學(xué)或物理方法，如腐蝕、陽極氧化、微弧氧化、微弧氮化等方法或這 些方法的結(jié)合，在裝置本體原材料的局部表面直接制備形成孔洞，孔
12洞可以是載藥槽或孔結(jié)構(gòu)，孔洞的直徑優(yōu)選100-800nm。 實(shí)施例l iNOS基因涂層納米孔支架的制備
316L不銹鋼合金經(jīng)拋光后，用激光雕刻成血管支架，然后通過 酸液腐蝕和陽極氧化法的結(jié)合，在器械本體原材料的局部表面直接制 備載藥孔洞，孔洞的直徑為200-300 nm。
然后按照如下步驟制得基因或寡核苷酸涂層生物支架
1、 支架本體表面的清洗
(1) 砂帶打磨支架本體表面，機(jī)械去除表面的氧化物，調(diào)整表 面粗糙度；
(2) 利用超聲波，依次用75%的醫(yī)用乙醇溶液、99.5%的丙酮溶 液、去離子水清洗，超聲波頻率為lOOKHz，清洗時(shí)間為10min;
(3) 將支架本體放入30 g/L、 80 t:的氫氧化鈉溶液中浸泡10 min,去除油脂和氧化皮；
(4) 將清洗后的支架本體放置在真空干燥機(jī)中，溫度設(shè)定在40 。C，干燥45min后取出。
2、 支架本體表面的防腐處理采用交流電氧化，在兩電極上安 裝同樣的支架，陽極氧化處理用槽液成份為高錳酸鉀18g/L、磷酸 三鈉55g/L、氟化鉀40 g/L、氫氧化鉀165g/L、氫氧化鋁65 g/L;在 60°C，氧化50min,電流密度為10A/dm2，交流電壓為90V，支架本 體表面即可生成氧化膜。
3、 支架本體表面基因或寡核苷酸涂覆液的涂覆處理
(1) 支架本體的預(yù)處理用四氫呋喃超聲清洗，超聲波頻率為 lOOKHz，清洗時(shí)間為10min;再用去離子水清洗三次；
(2) iNOS基因涂覆液的配制以濃度為0.05mo1/1、 pH值為9.6 的碳酸鹽緩沖溶液為溶劑，加入iNOS基因使iNOS基因的終濃度為 0.1mg/ml;;
(3) 陽極極化涂覆如圖4所示，將支架本體串聯(lián)到陽極極化儀的陽極4上，將配制好的基因或寡核苷酸溶液注入陽極極化的基因或 寡核苷酸儲存容器3中，調(diào)節(jié)陽極電壓為2.5V，進(jìn)行極化，極化時(shí)間
為600s，通電后基因或寡核苷酸離子向陽極支架處移動，在陰陽相吸
作用下，克服支架表面的液面張力，使基因或寡核苷酸與支架表面牢
固均句的結(jié)合，在支架表面形成一層均勻的基因或寡核苷酸涂層；
(4)基因或寡核苷酸生物支架的干燥將支架自然稍晾干后， 冰箱中預(yù)冷凍后放入真空冷凍干燥機(jī)中干燥4 h。 實(shí)施例2
具有納米孔的iNOS基因與雷帕霉素藥物聯(lián)合涂層生物支架的制備
選用鈷鉻合金材質(zhì)經(jīng)拋光后，用激光雕刻成血管支架；然后通過 酸液腐蝕、微弧氧化和微弧氮化的結(jié)合，在支架表面制備載藥孔洞，
孔洞為載藥槽，孔洞的直徑為100-200nm。按照如下步驟制得基因涂 層生物支架
1、 支架本體表面的清洗
(1) 砂帶打磨支架本體表面，機(jī)械去除表面的氧化物，調(diào)整表 面粗糙度；
(2) 利用超聲波，依次用75%的醫(yī)用乙醇溶液、99.5%的丙酮溶 液、去離子水清洗，超聲波頻率為60KHz，清洗時(shí)間為15min;
(3) 將支架本體放入60g/L、 70 。C氫氧化鈉溶液中浸泡8min，
去除油脂和氧化皮；
(4) 將清洗后的支架本體放置在真空干燥機(jī)中，溫度設(shè)定在30 。C，干燥60min后取出。
2、 支架本體表面的防腐處理采用交流電氧化，上安裝同樣的 支架，陽極氧化處理用槽液成份為高錳酸鉀15g/L、磷酸三鈉15g/L、 氟化鉀25 g/L、氫氧化鉀65g/L、氫氧化鋁15 g/L;在25°C ,氧化10min, 電流密度為0.1A/dm2,交流電壓為50V，支架本體表面即可生成氧化 膜。3、 治療性藥物溶液的涂覆處理以四氫吹喃作溶劑，加入濃度 為15yg/ml的雷帕霉素對支架表面進(jìn)行定向超聲噴涂，句速旋轉(zhuǎn)支， 噴涂4次，使支架表面藥物含量達(dá)到支架重量的1/102。
4、 支架本體表面iNOS基因溶液的涂覆處理
(1) 支架本體的預(yù)處理用丙酮超聲清洗，超聲波頻率為100 KHz，清洗時(shí)間為15min;使用去離子水清洗三次；
(2) iNOS基因涂覆液的配制以濃度為0.1mo1/1、 pH值為6.0 的硼酸鹽緩沖溶液為溶劑，加入iNOS基因使iNOS基因的終濃度為 0.005mg/ml;
(3) 陽極極化涂覆如圖4所示，將支架本體串聯(lián)到陽極極化儀 的陽極4上，將配制好的iNOS基因溶液注入陽極極化的基因或寡核 苷酸儲存容器3中，調(diào)節(jié)陽極電壓為1.5v，極化時(shí)間為20min,通電后 基因或寡核苷酸離子向陽極支架處移動，在陰陽相吸作用下，克服支 架表面的液面張力，使iNOS基因與支架表面牢固均勻的結(jié)合。并在 支架表面形成一層均句的iNOS基因涂層；
(4) iNOS基因涂層生物支架的干燥將支架自然稍晾干后， 冰箱中預(yù)冷凍后放入真空冷凍干燥機(jī)中干燥4 h。
實(shí)施例3
具有納米孔的iNOS基因與雷帕霉素藥物聯(lián)合涂層生物支架的制備
選用鎳鉻合金材質(zhì)經(jīng)拋光后，用激光雕刻成血管支架；然后通過 酸液腐蝕、微弧氧化和微弧氮化的結(jié)合，在支架表面制備載藥孔洞， 孔洞為載藥槽，孔洞的直徑為150-300nm。按照如下步驟制得基因涂 層生物支架
1、支架本體表面的清洗
(1) 砂帶打磨支架本體表面，機(jī)械去除表面的氧化物，調(diào)整表 面粗糙度；
(2) 利用超聲波，依次用75%的醫(yī)用乙醇溶液、99.5%的丙酮溶液、去離子水清洗，超聲波頻率為28KHz，清洗時(shí)間為15min;
(3) 將支架本體放入30g/L、 100 'C氫氧化鈉溶液中浸泡5min，
去除油脂和氧化皮；
(4) 將清洗后的支架本體放置在真空干燥機(jī)中，溫度設(shè)定在40 。C，干燥35min后取出。
2、 支架本體表面的防腐處理采用化學(xué)氧化處理將支架浸入 含重鉻酸鉀20g/L、硝酸20g/L、氯化鈉l g/L的混合溶液中，在8(TC 下，氧化2min，在支架本體表面生成氧化膜；
3、 治療性藥物溶液的涂覆處理以甲醇作溶劑，加入濃度為15 yg/ml的雷帕霉素對支架表面進(jìn)行定向超聲噴涂，勻速旋轉(zhuǎn)支，噴涂 2次，使支架表面藥物含量達(dá)到支架重量的1/105。
4、 支架本體表面iNOS基因溶液的涂覆處理
(1) 支架本體的預(yù)處理用無水乙醇超聲清洗，超聲波頻率為 60KHz，清洗時(shí)間為15min;使用去離子水清洗三次；
(2) iNOS基因涂覆液的配制以濃度為10%的乙醇溶液為溶 劑，加入iNOS基因使iNOS基因的終濃度為lmg/ml;
(3) 陽極極化涂覆如圖4所示，將支架本體串聯(lián)到陽極極化儀 的陽極4上，將配制好的iNOS基因溶液注入陽極極化的基因或寡核 苷酸儲存容器3中，調(diào)節(jié)陽極電壓為0.5v,極化時(shí)間為100min,通電 后基因或寡核苷酸離子向陽極支架處移動，在陰陽相吸作用下，克服 支架表面的液面張力，使iNOS基因與支架表面牢固均勻的結(jié)合。并 在支架表面形成一層均勻的iNOS基因涂層；
(4) iNOS基因涂層生物支架的干燥將支架自然稍晾干后， 冰箱中預(yù)冷凍后放入真空冷凍干燥機(jī)中干燥4 h。
權(quán)利要求
1、一種攜載基因涂層醫(yī)療裝置的制備方法，是將醫(yī)療裝置本體作為陽極，將其與陰極一起，置于基因或寡核苷酸的溶液中進(jìn)行陽極極化反應(yīng)，得到表面攜載基因?qū)拥尼t(yī)療裝置。
2、 如權(quán)利要求l所述的制備方法，其特征在于，還包括醫(yī)療裝置 本體的預(yù)處理將醫(yī)療裝置本體用四氫呋喃、丙酮、乙醇或甲醇超聲 清洗，然后再用去離子水進(jìn)行清洗；還包括將表面攜載基因?qū)拥尼t(yī)療 裝置自然晾干，經(jīng)預(yù)冷凍后，放入真空冷凍干燥機(jī)干燥。
3、 如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，在醫(yī)療裝置本體 的預(yù)處理之前，還包括將醫(yī)療裝置本體進(jìn)行前處理表面清洗和防腐 處理。
4、 如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述表面清洗的 過程為1) 用砂帶打磨醫(yī)療裝置本體表面，用于去除表面的氧化物，調(diào) 整表面粗糙度；2) 利用超聲波，依次用75%的醫(yī)用乙醇溶液、99.5%的丙酮溶液、 去離子水清洗，超聲波頻率為28-100KHz,清洗時(shí)間為5-15min;3) 將醫(yī)療裝置本體放入15-60g/L、 70-100'C的氫氧化鈉溶液中浸 泡5-10min，用于去除油脂和氧化皮；4) 將清洗后的醫(yī)療裝置本體放置在真空干燥機(jī)中，溫度設(shè)定在 30-40°C，干燥30-60min后取出；所述防腐處理是釆用化學(xué)氧化、陽極氧化、離子注入、激光表面 處理、熱擴(kuò)散、金屬鍍層、氣相沉積、有機(jī)涂層中的一種或多種來進(jìn) 行。
5、 如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述化學(xué)氧化處 理的過程為將醫(yī)療裝置本體浸入含重鉻酸鉀15-20 g/L、硝酸15-25 g/L、氯化鈉0.75-1.25 g/L的混合溶液中，在70-80。C下，氧化0.5-2.0min，在支架本體表面生成氧化膜；陽極氧化處理的過程為釆用交流電氧化，在兩電極上分別安裝完全相同的支架本體，陽極氧化處理用槽液為高錳酸鉀15-20g/L、磷 酸三鈉15-55g/L、氟化鉀25-55 g/L、氫氧化鉀65-165 g/L、氫氧化鋁 15-65 g/L的混合液，在20-6(TC下，電流密度為O.l-lO A/dm2,交流電 壓為50-卯V下，氧化10-50min，支架本體表面生成氧化膜。
6、 如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述的醫(yī)療裝置 本體的材質(zhì)為包括不銹鋼、鈷鉻合金、鎂合金、Ni-Ti合金的醫(yī)用金 屬材料；所述的醫(yī)療裝置本體為冠脈血管支架、頸動脈血管支架、外周血 管支架、腎動脈血管支架、顱內(nèi)動脈血管支架、移植片固定膜、移植 片固定膜移植物、合成的人造血管、心臟瓣膜、血管修補(bǔ)篩、起搏器、 起搏器導(dǎo)子、除纖顫器、PFO隔膜封閉裝置、血管夾、動脈血管瘤閉 鎖器、血液透析移植物、血液透析導(dǎo)管、房室吻合分流、大動脈血管 瘤移植物裝置、靜脈瓣、血管接合夾、留置式動脈導(dǎo)管或血管護(hù)鞘和 藥物輸送口中的一種或多種的組合，優(yōu)選表面具有載藥孔洞的醫(yī)療裝 置，更優(yōu)選具有納米載藥孔洞的醫(yī)療裝置，所述納米載藥孔洞的尺寸 優(yōu)選100-800nm;所述的醫(yī)療裝置本體優(yōu)選包括冠脈血管支架、頸動脈血管支架、 外周血管支架、腎動脈血管支架、顱內(nèi)動脈血管支架的支架；更優(yōu)選 表面具有載藥孔洞的支架；進(jìn)一步優(yōu)選具有納米載藥孔洞的醫(yī)療裝置，所述納米載藥孔洞的尺寸優(yōu)選100-800nm。
7、 如權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征在于，所述基因或 寡核苷酸溶液是以蒸餾水、生理鹽水、pH值為3.0-9.0的硼酸鹽緩沖溶 液、pH值為8.0-10.0碳酸鹽緩沖溶液、pH值為3.0-9.0醋酸鹽緩沖溶液、 濃度為l。/。-20。/。的乙醇溶液或pH值為3.0-9.0磷酸鹽緩沖溶液為溶劑， 濃度為O.OOl -111^/1111的基因或寡核苷酸溶液；所述基因是一氧化氮合成酶基因、血管內(nèi)皮生長因子基因、成纖 維細(xì)胞生長因子基因、胰島素樣生長因子基因、細(xì)胞分裂調(diào)控基因、 抗癌基因、肝細(xì)胞生長因子基因、血小板衍生生長因子基因、PTEN、Keratin8基因、尿激酶前體基因、EGF基因或其片段中的一種或多種；所述寡核苷酸是上述基因的寡核苷酸或反義寡核苷酸或其片段 中的一種或多種。
8、 如權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征在于，如權(quán)利要求l 所述的制備方法，其特征在于，所述陽極極化反應(yīng)釆用直流電進(jìn)行， 電壓0.1-2.5V,反應(yīng)時(shí)間l-100min。
9、 如權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征在于，在醫(yī)療裝 置本體表面涂覆基因前，可先涂覆治療性藥物。
10、 如權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征在于，所述治療性藥 物為肝素、阿司匹林、水蛭素、秋水仙堿、抗血小板GPIIb/IIIa受體 拮抗劑、白甲氨蝶呤、嘌呤類、嘧啶類、植物堿類和埃坡破霉素類、 雷公藤系列化合物、抗生素、激素、抗體治癌藥物、環(huán)孢霉素、他克 莫司及同系物、脫精胍菌素、霉酚酸脂、雷帕霉素及其衍生物、FR 900520、 FR900523、 NK 86-1086、戊酰胺、康樂霉素C、斯博格埃 林、靈菌紅素25c、曲尼斯特、多球殼菌素、FR651814、 SDZ214-104、 環(huán)孢霉素C、布雷青霉素、麥考酚酸、布雷菲得菌素A、 WS9482、 糖皮質(zhì)類固醇、替羅非班、埃替非巴肽、紫杉醇、放線菌素-D等中 的一種或多種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種攜載基因涂層醫(yī)療裝置的制備方法。本發(fā)明利用陽極極化原理，將醫(yī)療裝置本體作為陽極，將其與電源陰極一起，置于基因或寡核苷酸的溶液中進(jìn)行陽極極化反應(yīng)，得到表面攜載基因?qū)拥尼t(yī)療裝置。該方法簡單易行，無需引入負(fù)載基因的基質(zhì)，避免了因基質(zhì)而帶來的炎癥及副作用；裝置本體上均勻包被基因或者寡核苷酸，基因或者寡核苷酸包被穩(wěn)定性好，活性不受工藝過程的影響，基因或者寡核苷酸容易緩慢釋放到血管細(xì)胞中，從而在血管壁細(xì)胞中表達(dá)，該種醫(yī)療裝置能夠更加有效地預(yù)防和治療醫(yī)療裝置內(nèi)的炎癥反應(yīng)和再狹窄。
文檔編號A61F2/82GK101491468SQ20091007853
公開日2009年7月29日 申請日期2009年2月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月25日
發(fā)明者余占江, 冉玉鳳, 張正才, 王長青, 蒲忠杰, 陳永強(qiáng) 申請人:樂普(北京)醫(yī)療器械股份有限公司