專利名稱：雙取代苯基雙胍誘導(dǎo)惡性腫瘤細(xì)胞失巢凋亡的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥理實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)領(lǐng)域，涉及使用一系列雙取代苯基雙胍類化合物引 起惡性腫瘤細(xì)胞失巢凋亡方面的應(yīng)用，更具體的說是一種具有抗腫瘤活性的雙取代苯基 雙胍類化合物以及含有此類化合物的藥物組合物在抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移以及治療整合素 a v日3高表達(dá)的人黑色素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肺癌、胃癌、前列腺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤方 面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
整合素a V0 3是由a v和0 3兩個亞基組成的，其中a v亞基(⑶51)有1018個 氨基酸殘基，分子量125 kD，0 3亞基(⑶61)有762個氨基酸殘基，分子量105 kD。它是 細(xì)胞表面一類重要的粘附分子，它一方面介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附，另一方面參與細(xì) 胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，影響細(xì)胞的分化、增殖、生存和遷移。整合素av03對細(xì)胞的生存、生長，和 細(xì)胞周期均有重要作用，同時(shí)，它與許多重要的疾病密切相關(guān)，包括腫瘤、心血管疾病、骨質(zhì) 疏松，和風(fēng)濕性疾病。而且，它在細(xì)胞表面的表達(dá)具有一定的局限性，它不在內(nèi)皮細(xì)胞上廣 泛表達(dá)，只是在激活的內(nèi)皮細(xì)胞、破骨細(xì)胞，侵襲性的腫瘤細(xì)胞(人黑色素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、 肺癌、胃癌、前列腺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤)上高表達(dá)。因此，它是一個備受關(guān)注的藥物 治療新靶點(diǎn)。很多腫瘤患者在治療后難免出現(xiàn)復(fù)發(fā)和廣泛轉(zhuǎn)移，腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的三個關(guān)鍵步驟 為腫瘤細(xì)胞與基底膜的粘附，細(xì)胞外基質(zhì)的降解，以及細(xì)胞移行。在這個過程中有許多階 段特異的粘附過程，其中一些細(xì)胞粘附分子的表達(dá)，尤其是整合素a 3與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn) 移潛力密切相關(guān)，它通過促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵潤能力使腫瘤的惡性表型增加，可以作為許 多侵襲的腫瘤細(xì)胞的一個標(biāo)志。例如在轉(zhuǎn)移性最強(qiáng)的腫瘤之一人類黑色素瘤中，腫瘤細(xì)胞 對許多組織和細(xì)胞外基質(zhì)的侵襲能力很大程度上歸因于表面粘附受體介導(dǎo)的作用，其中， 整合素a 3在黑色素瘤的轉(zhuǎn)移和增殖中發(fā)揮了重要作用，它能通過與其配體的粘附，介 導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞向許多組織轉(zhuǎn)移。又如局部侵潤是惡性膠質(zhì)瘤的特點(diǎn)之一，這也與整合素 av^3的異常表達(dá)密切相關(guān)，侵潤的膠質(zhì)瘤細(xì)胞可以通過a 3的作用，沿著含有基質(zhì)蛋 白的某些結(jié)構(gòu)(如血管壁基底膜的內(nèi)側(cè)面)進(jìn)行播散。整合素a v 0 3受體可特異性的識別精氨酸_甘氨酸_天冬氨酸(Arg-Gly-Asp， RGD)，并通過共價(jià)鍵與之結(jié)合，從而介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)粘附，并通過一定的信號傳導(dǎo) 通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞生存、生長、移行等。競爭性拮抗劑與整合素受體結(jié)合后，整合素 a v日3受體不能與其正常配體結(jié)合，上述正常的功能被抑制，從而誘導(dǎo)細(xì)胞失巢凋亡(失 巢凋亡是指細(xì)胞由于失去與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附而引起凋亡，其最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的死亡， 使腫瘤不能繼續(xù)生長或轉(zhuǎn)移)。目前針對整合素a v 0 3的抑制劑主要有37種，均為RGD類似物，分為RGD肽類及 其肽類模擬物、單克隆抗體、非肽類小分子抑制劑三類，其中有兩種在進(jìn)行II期臨床實(shí)驗(yàn)， 一種在進(jìn)行I期臨床實(shí)驗(yàn)，主要用來治療腫瘤、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動脈硬化、骨質(zhì)疏松等。目前正在研究非肽類小分子的主要是苯并二氮雜卓類，包括SB223245等，能夠顯著抑制整合素 a v 3 3介導(dǎo)的細(xì)胞粘附。肽類在體內(nèi)易受酶的降解，半衰期短，開發(fā)相應(yīng)的非肽類小分子抑 制劑的藥物，不但在體內(nèi)作用時(shí)間長，而且可以口服使用，是未來的發(fā)展方向之一。本發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的雙取代苯基雙胍類化合物在制備誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞失 巢凋亡、抑制惡性腫瘤生長、侵襲轉(zhuǎn)移，以及治療整合素av 3 3高表達(dá)的人黑色素瘤、卵 巢癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肺癌、胃癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤的藥物方面，顯示出有效的藥理活 性，為尋找新的有效的抗腫瘤藥物開辟了一條新的途徑。在本發(fā)明以前，雙取代苯基雙胍類化合物3，5-二氯苯基雙胍曾被做為5-羥色胺 受體 3 激動劑進(jìn)行研究。Mol Pharmacol. 1994,46(4) :732_742，Br J Pharmacol. 1998, 124(8) 1667-1674 ；Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 2002,26(3) 463-471 中報(bào)道了其作為5-羥色胺受體激動劑的這一藥理作用。但是雙取代苯基雙胍類化合物其 在抗腫瘤方面，尤其是誘導(dǎo)失巢凋亡、抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移方面的應(yīng)用一直未被研究過。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的在于公開了雙取代苯基雙胍類化合物在制備抗惡性腫瘤藥物 方面的應(yīng)用。本發(fā)明另一個目的在于公開了雙取代苯基雙胍類化合物在制備抑制誘導(dǎo)腫瘤細(xì) 胞失巢凋亡藥物方面的應(yīng)用。本發(fā)明還一個目的在于公開了雙取代苯基雙胍類化合物在制備抑制腫瘤生長藥 物方面的應(yīng)用。本發(fā)明還一個目的在于公開了雙取代苯基雙胍類化合物在制備抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn) 移藥物方面的應(yīng)用。本發(fā)明再進(jìn)一步公開了雙取代苯基雙胍類化合物在制備治療人黑色素瘤、卵巢 癌、肺癌、胃癌、前列腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等惡性腫瘤的藥物方面的應(yīng)用。本發(fā)明提供了雙取代苯基雙胍類化合物及其藥用鹽和含它們的藥物組合物在制 備抗惡性腫瘤藥物方面的應(yīng)用；其中的雙取代為苯環(huán)2、3、4、5、6位中任意兩個位置的取 代，取代基為鹵素、烷基或鹵素取代的烷基。其中公開了雙取代苯基雙胍類化合物在制備誘 導(dǎo)惡性腫瘤細(xì)胞失巢凋亡方面的應(yīng)用。在抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移藥物方面的應(yīng)用。在制備抑 制腫瘤生長藥物方面的應(yīng)用。以及在制備治療人黑色素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肺癌、胃癌、前列腺 癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤藥物方面應(yīng)用。本發(fā)明包括上述化合物的藥學(xué)上可接受的無機(jī)酸和有機(jī)酸鹽，包括鹽酸鹽、磷酸 鹽、硫酸鹽、醋酸鹽、馬來酸鹽、枸櫞酸鹽、苯磺酸鹽、甲基苯磺酸鹽、富馬酸鹽或酒石酸鹽 等。本發(fā)明所述化合物選自如下化合物中的一種或多種
編號化合物1N-(3，5-二氯苯基)雙胍 本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于治療惡性腫瘤的藥物組合物，它包含作為上述活性成分 的化合物以及一種或多種藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。含有本發(fā)明所述的作為活性成分的雙取代苯基雙胍類化合物的藥物組合物可以 按照常規(guī)藥物配制技術(shù)，通過將雙取代苯基雙胍類化合物與可藥用載體組合來制備。載體 可以采用各種各樣的形式，這取決于希望的給藥途徑(例如口服、腸胃外給藥)。因此對于 口服液體制劑，合適的載體和添加劑包括水、乙二醇、油、乙醇、調(diào)味劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、著 色劑等等；對于口服固體制劑如散劑、膠囊劑或片劑，合適的載體和添加劑包括乳糖、淀 粉、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮等稀釋劑、潤滑劑、粘合劑、崩解劑等等?？诜腆w制劑也可以用 如丙烯酸樹脂等物質(zhì)包衣或包腸溶衣以便調(diào)整吸收的主要部位。對于腸胃外投藥，如局部給藥、透皮給藥和粘膜給藥等制劑，載體通常包括高分子材料如卡波姆、吸收促進(jìn)劑氮酮等 等。注射液也可利用水載體與適當(dāng)添加劑如支架劑甘露醇、甘氨酸、增溶劑丙二醇、抗氧劑 焦亞硫酸鈉等等制備。因?yàn)橐子诮o藥，片劑和膠囊劑代表最方便的口服單元劑量形式。本發(fā)明的藥物組合物每劑量單位例如片、膠囊、注射劑等等應(yīng)包含必需釋放如上 所述的有效劑量的雙取代苯基雙胍類化合物。例如普通壓片成分如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、 山梨醇、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸鎂、磷酸二鈣或膠、以及其他藥用稀釋劑。例如水混合，以形 成包含本發(fā)明雙取代苯基雙胍類化合物的固體處方設(shè)計(jì)組合物。對于液體形式包括水溶 液、適當(dāng)?shù)脑鱿愕奶菨{劑、水或含有食用油，例如棉花子油、芝麻油的增香的乳劑、以及酏劑 和相似的藥用載體。本發(fā)明對上述雙取代苯基雙胍類化合物進(jìn)行生物學(xué)活性進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)它們對腫 瘤細(xì)胞具有誘導(dǎo)凋亡、抑制粘附的作用。在此，為了表明目標(biāo)化合物的實(shí)用性，下面給出本 發(fā)明N-(3，5- 二氯苯基)雙胍、N-(3，4- 二氯苯基)雙胍、N-(2-氯-5-三氟甲烷基苯基) 雙胍、N-(2-甲烷-5-氯苯基)雙胍、N-(2，4-二氯苯基)雙胍、N-(2，3-二氯苯基)雙胍、 N-(3-氯-4-氟苯基)雙胍、N-(2，5-二氯苯基)雙胍中的對腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡、抑制粘附 的藥理實(shí)驗(yàn)情況。特別以N-(3，5-二氯苯基)雙胍作為典型化合物代表，提供如下的藥理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。藥理實(shí)驗(yàn)一失巢凋亡的測定實(shí)驗(yàn)原理失巢凋亡是指由于細(xì)胞失去與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附而引起的凋亡。本方 法用于測定藥物對腫瘤細(xì)胞失巢凋亡的影響。應(yīng)用Armexin V/PI雙標(biāo)及流式檢測的方法 檢測凋亡細(xì)胞的百分率。選擇整合素av 0 3高表達(dá)的人黑色素瘤細(xì)胞系作為受試細(xì)胞 系，選擇整合素a 3的特異性配體蛋白vitronectin包被培養(yǎng)板，BSA包被培養(yǎng)板作為 對照。細(xì)胞用粘附緩沖液重懸后接種于培養(yǎng)板，待細(xì)胞粘附于培養(yǎng)板后加入受試藥物及對 照藥物，藥物作用一段時(shí)間后收取包括懸浮和貼壁的全部細(xì)胞，進(jìn)行PI/Armexin V雙標(biāo)記， 并進(jìn)行流式檢測。Armexin V選擇性結(jié)合磷酯酰絲氨酸(phosphatidylserine，簡稱PS)。 磷酯酰絲氨酸主要分布在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，即與細(xì)胞漿相鄰的一側(cè)。在細(xì)胞發(fā)生凋亡的早期， 不同類型的細(xì)胞都會把磷酯酰絲氨酸外翻到細(xì)胞表面，即細(xì)胞膜外側(cè)。用帶有綠色熒光的 熒光探針FITC標(biāo)記的Armexin V，即Armexin V-FITC，就可以用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡 非常簡單而直接地檢測到磷酯酰絲氨酸的外翻這一細(xì)胞凋亡的重要特征。碘化丙啶可以 染色壞死細(xì)胞或凋亡晚期喪失細(xì)胞膜完整性的細(xì)胞，呈現(xiàn)紅色熒光。用Armexin V-FITC 和碘化丙啶染色后，正常的活細(xì)胞不被Armexin V-FITC和碘化丙啶染色；凋亡早期的細(xì)胞 僅被Armexin V-FITC染色，碘化丙啶染色呈陰性；壞死細(xì)胞和凋亡晚期的細(xì)胞可以同時(shí)被 Annexin V-FITC和碘化丙啶染色。實(shí)驗(yàn)方法受試藥物N_ (3，5-二氯苯基)雙胍。實(shí)驗(yàn)共分8組，5個vitronectin包被組，包 括cRGDfv陽性對照組(34 u M)、苯基雙胍陰性對照組(60 u M)、不加藥組、N-(3, 5- 二氯苯 基)雙胍30 iiM組、N-(3，5-二氯苯基)雙胍60 iiM組，3個非vitronectin包被組，包括不 加藥組、N-(3，5-二氯苯基)雙胍30 iiM組、N-(3，5-二氯苯基)雙胍60yM組。(1) 35mm培養(yǎng)皿中加入2ug/ml vitronectin，每孔2. 5ml，4°C過夜。對照孔用 5 u g/mlBSA包被，每孔2. 5ml，排除非特異性結(jié)合的影響。
(2)次日吸出包被液，加入1 % BSA封閉，每孔2. 5ml，室溫孵育1小時(shí)，磷酸緩沖液 (PBS)洗兩次。(3)以粘附緩沖液(無血清RPMI培養(yǎng)基加入1 % BSA, ImM CaCl2，1M MgCl2， andlOOnM MnCl2)懸浮M21人黑色素瘤細(xì)胞，每個培養(yǎng)皿加入2. 5 X 105細(xì)胞，37°C 5 % C02 孵箱內(nèi)孵育4小時(shí)。(4)每個培養(yǎng)皿按要求分別加入藥物，繼續(xù)37°C 5% C02孵箱內(nèi)孵育。(5)加藥后24h收取細(xì)胞，注意每個培養(yǎng)皿中懸浮的和貼壁的細(xì)胞都要收集。(6)用PBS洗滌細(xì)胞2次，最后離心后棄去上清，按照碧云天Armexin V-FITC凋亡 試劑盒進(jìn)行操作，加入195 ill Armexin V-FITC結(jié)合液(IX)輕輕重懸細(xì)胞。(7)加入 5ii 1 Annexin V-FITC，輕輕混勻。(8)室溫(20_25°C )避光孵育lOmin?？梢允褂娩X箔進(jìn)行避光。(9) lOOOg離心5分鐘，棄上清，加入190 u 1 Annexin V-FITC結(jié)合液(IX)輕輕重 懸細(xì)胞。(10)加入10 U 1碘化丙啶染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置。(11)隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。(12)三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，藥物作用24h后，vitronectin包被的5組中，不加藥組凋亡率為 5. 96%,陽性對照組37. 12%,N-(3, 5-二氯苯基)雙胍30 u M組和60 u M組分別為25. 23% 和37. 34% (后三者與vitronectin包被不加藥組相比，均是P < 0. 05)，陰性對照組與不 加藥組無明顯差別。然而，BSA包被的三組中，藥物處理與不處理組凋亡率無明顯差別。說 明N-(3，5_二氯苯基)雙胍能夠誘導(dǎo)M21失巢凋亡，該作用是由于該藥物影響了整合素a v 3 3 與 vitronectin 的結(jié)合。藥理實(shí)驗(yàn)二 caspase-3，_8，_9活性測定實(shí)驗(yàn)原理Caspase (Cysteine-requiring Aspartate Protease)是一個在細(xì)胞調(diào)亡過禾呈中 起重要作用的蛋白酶家族。Caspase 3也稱CPP32、Yama或apopain，有時(shí)被寫作caspase-3 或caspase3，屬于caspase家族的CED-3亞家族(CED_3subfamily)，是細(xì)胞凋亡過程中的 一個關(guān)鍵酶，它的活化代表著凋亡即將發(fā)生。Caspase-8和caspase-9的活化分別代表著 caspase依賴的外源和內(nèi)源凋亡途徑被激活。本實(shí)驗(yàn)中所使用的碧云天Caspase-3，_8，_9 活性檢測試劑盒是基于這三種caspase可以分別催化底物Ac-DEVD-pNA (acetyl-Asp-Gl u-Val-Aspp-nitroanilide), Ac-IETD-pNA(acetyl-Ile-Glu-Thr-Asp p-nitroanilide), 和 Ac-LEHD-pNA(acetyl-Leu-Glu-His-Asp p-nitroanilide)三種底物產(chǎn)生黃色的 pNA(p-nitroaniline)，從而可以通過測定吸光度來檢測對應(yīng)的caspase的活性。pNA在 405nm附近有強(qiáng)吸收。實(shí)驗(yàn)方法受試藥物N_ (3，5- 二氯苯基)雙胍(1)實(shí)驗(yàn)分組、細(xì)胞處理及藥物處理方法同藥理實(shí)驗(yàn)一，不同的是使用90mm培養(yǎng) 皿，每個培養(yǎng)皿接種2 X 106細(xì)胞)。
(2)細(xì)胞收取后，PBS洗滌一次，吸進(jìn)上清后按照每200萬細(xì)胞加入100ml裂解液 的比例加入裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解15min。(3) 4°C 16，000-20，OOOrpm 離心 10_15min。(4)把上清轉(zhuǎn)移到冰浴預(yù)冷的離心管中。(5)立即測定caspase-9的酶活性或-70°C保存樣品。同時(shí)可以取少量樣品用 Bradford法測定蛋白濃度，盡量使蛋白濃度達(dá)到l_3mg/ml，相當(dāng)于每10 yl待測樣品中含 有10-30 yg蛋白。(6)測定pNA標(biāo)準(zhǔn)曲線A.標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的配制按照每0. 9ml檢測緩沖液加入0. lml裂解液的比例配制 適量的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液。B.把試劑盒提供的pNA (10mM)用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液稀釋為0、10、20、50、100和 200 iiM，作為標(biāo)準(zhǔn)品。C.每個濃度取100 u 1用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測，或取適當(dāng)量用容量不超過100 u 1的分 光光度檢測杯進(jìn)行檢測，測定A405。D.每一個標(biāo)準(zhǔn)品的A405減去不含pNA的空白對照的A405計(jì)算出實(shí)際的因pNA而 導(dǎo)致的吸光度，并制作出pNA濃度相當(dāng)于A405的標(biāo)準(zhǔn)曲線。(7) caspase-3 酶活性的檢測。A.取出pNA和適量的Ac-DEVD-pNA (2mM)，置于冰浴上備用。B.如下設(shè)置反應(yīng)體系 注意在設(shè)置反應(yīng)體系時(shí)先加檢測緩沖液，再加待測樣品，適當(dāng)混勻，注意避免在 混勻時(shí)產(chǎn)生氣泡。隨后再加入10 ill Ac-DEVD-pNA (2mM)。C.加入Ac-DEVD-pNA (2mM)后混勻，注意避免在混勻時(shí)產(chǎn)生氣泡。37 °C孵育 60-120min。發(fā)現(xiàn)顏色變化比較明顯時(shí)即可測定A405。如果顏色變化不明顯，可以適當(dāng)延長 孵育時(shí)間，甚至可以孵育過夜。D.樣品的A405扣除空白對照的A405，即為樣品中caspase 3催化產(chǎn)生的pNA產(chǎn) 生的吸光度。通過同步驟(6)中獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線的對比就可以計(jì)算出樣品中催化產(chǎn)生了多 少量的pNA。這樣就可以計(jì)算出一個樣品單位重量蛋白中所含的caspase 3的酶活力單位。一 個酶活力單位定義為當(dāng)?shù)孜镲柡蜁r(shí)，在37°C可以剪切l(wèi)nmol Ac-DEVD-pNA產(chǎn)生InmolpNA的caspase 3的酶量。(8) caspase-8和caspase-9的測定方法與(7)完全相同(除底物種類不同外)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果
如圖3所示，在vitronectin包被的幾組中，陽性對照藥物能夠使 caspase-3，-8，-9的活性分別提高為不加藥組的3. 48-, 4. 84-, and 3. 97-倍；N-(3，5-二氯 苯基)雙胍30 ii M組使caspase-3，-8，-9的活性分別提高為不加藥組的2. 09-倍、2. 29-倍 和2. 33-倍；N-(3, 5- 二氯苯基)雙胍60 uM組使caspase-3, -8，-9的活性分別提高為不 加藥組的2. 79-倍、3. 86-倍和3. 50-倍。陰性對照組與不加藥組相比無明顯區(qū)別。在BSA 包被組中，經(jīng)N- (3，5- 二氯苯基)雙胍處理和不處理對caspase-3，-8，和_9的活性沒有明 顯影響。藥理實(shí)驗(yàn)三FAK，磷酸化FAK，Bax, Bcl-2, survivin蛋白水平的檢測。實(shí)驗(yàn)原理局部粘著斑激酶(Focal adhesion kinase, FAK)是一種酪氨酸激酶，它的激活與 局部粘著斑的形成有關(guān)17。在整合素av 0 3與其配體結(jié)合后，在局部粘著斑處，F(xiàn)AK能夠 直接或通過骨架蛋白talin，paxil 1 in等與0亞基的C末端相結(jié)合18-20。FAK激活后能夠 自身磷酸化397位的酪氨酸殘基，形成SH2結(jié)構(gòu)域，通過SH2結(jié)構(gòu)域與Src或Fyn結(jié)合21， 22，Src能磷酸化許多局部粘著斑成分，包括paxillin tensin和P130CAS。FAK還能夠通過 Src激活PI-3激酶23-26。Src還能磷酸化FAK的925位的酪氨酸殘基，使FAK能通過Grb2 禾口 mSOS 與 Ras 相連，進(jìn)而激活 ERK(Ras-extracellular signal regulated kinase) -MAPK 級聯(lián)。我們通過檢測總FAK和磷酸化FAK的蛋白質(zhì)水平，進(jìn)而了解整合素a V0 3與配體的 結(jié)合被干擾后此信號通路是不是也因此被阻斷。Bcl-2和Bax內(nèi)源性凋亡途徑上的兩個重 要調(diào)節(jié)因子。在凋亡的信號通路上，Bcl-2使細(xì)胞免于凋亡，而Bax起相反的作用，Bcl-2/ Bax比值的降低是內(nèi)源性凋亡通路上一個早期信號，它能夠促進(jìn)線粒體釋放細(xì)胞色素C，這 將進(jìn)一步激活 casapase 級聯(lián)。Survivin 是 IAPs (inhibitor of apoptosis proteins)家 族成員，它能夠內(nèi)源性凋亡途徑的活化，從而保護(hù)細(xì)胞使其免于凋亡。實(shí)驗(yàn)方法受試藥物N_(3，5- 二氯苯基)雙胍(1)樣品制備實(shí)驗(yàn)分組、細(xì)胞處理及藥物處理方法同藥理實(shí)驗(yàn)二。收取各組細(xì)胞后，PBS洗兩遍，于冰上加入冷RIPA裂解液及蛋白酶抑制劑，混勻細(xì) 胞后，冰浴30min，用超聲細(xì)胞破膜儀破碎細(xì)胞，4°C，12000rpm，離心lOmin，移上清至另一 EP管中。(2)BCA法定蛋白樣品蛋白的測定取l-2iU待測蛋白提取物，以去離子水稀釋至25 yl，加入 200 u 1A、B混合液，混勻后混勻后37°C孵育30min，取出放置至室溫，于酶標(biāo)儀上測定546nm 下的0D值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白含量。(3)丙烯酰胺凝膠電泳樣品中加入6XSDS凝膠加樣緩沖液，100°C煮沸5min使蛋白質(zhì)變性。制膠配制10-12%分離膠，聚合后制備基層膠，聚合后可進(jìn)行電泳。電泳按蛋白測定結(jié)果調(diào)整上樣量以保證每個樣品上樣的蛋白量相等。在積層膠
12時(shí)電壓為8V/cm，當(dāng)染料前沿進(jìn)入分離膠時(shí)，調(diào)整電壓為15V/cm。當(dāng)載樣液中的溴芬蘭抵達(dá) 分離膠下邊緣時(shí)，斷開電源。(4)電轉(zhuǎn)移
根據(jù)凝膠面積按0. 65mA/cm2連接電源，恒流電轉(zhuǎn)移5h。取出NC膜，用5%脫脂奶 封閉過夜。(5)雜交將NC膜封入合適大小的塑料袋中，按0. lml/cm2的量加入封閉液和適量 特異性抗體。于搖床上，室溫反應(yīng)2h。用TBST漂洗NC膜三次，每次2-3min。加入標(biāo)有辣 根過氧化酶的二抗，繼續(xù)室溫孵育2h，用TBST漂洗NC膜三次。(6)ECL法顯色按1 1的比例混合底物試劑，于暗室中將NC膜浸泡于顯色液中 2-3min，可見熒光條帶，取膠片進(jìn)行顯影，10_30s后，將膠片依次在顯影液和定影液中浸泡， 可見清晰蛋白條帶，以自來水充分清洗膠片，自然晾干后永久保存。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，藥物處理24h后，vitronectin包被的幾個組中，陽性對照藥物與 不加藥物組相比，使總FAK水平無明顯變化，磷酸化FAK水平降低，Bcl-2/Bax水平降低， survivin水平降低。陰性對照藥物無上述變化。受試藥物N-(3，5-二氯苯基)雙胍30 μ M 組和60 μ M組成計(jì)量依賴性的使磷酸化FAK水平降低，Bcl-2/Bax水平降低，survivin水 平降低，總FAK水平無明顯變化；BSA包被組藥物處理和不處理上述幾個蛋白水平無明顯區(qū) 別。藥理實(shí)驗(yàn)四腫瘤細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)原理腫瘤細(xì)胞通過整合素等膜表面受體與細(xì)胞外基質(zhì)中相應(yīng)的配體粘附，粘附是腫瘤 細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的始動步驟，有利于腫瘤細(xì)胞侵犯基底膜等正常組織。本方法用于測定化合 物對腫瘤細(xì)胞與基底膜成分粘附能力的影響。選擇整合素α νβ 3高表達(dá)的人黑色素瘤細(xì) 胞系Μ21作為受試細(xì)胞系，選擇整合素α νβ 3的特異性配體蛋白vitronectin包被96孔 板，加入細(xì)胞的同時(shí)加入受試化合物，經(jīng)過一段時(shí)間的孵育后，沖洗掉未粘附的細(xì)胞，粘附 于板上的細(xì)胞數(shù)量用結(jié)晶紫方法測定的吸光值來反映。實(shí)驗(yàn)方法受試藥物N-(3，5-二氯苯基)雙胍，N-(3，4-二氯苯基)雙胍，N-(2_氯_5_三氟 甲烷基苯基)雙胍，N-(2-甲烷-5-氯苯基)雙胍，N-(2，4-二氯苯基)雙胍，N-(2，3-二氯 苯基)雙胍，N-(3-氯-4-氟苯基)雙胍，N-(2，5-二氯苯基)雙胍。實(shí)驗(yàn)分為兩組受試藥物和陰性對照化合物組。設(shè)定300，250，200，150，100， 50μΜ六個劑量。另設(shè)空白對照中加入等體積的溶劑，作為細(xì)胞100%粘附對照，計(jì)算實(shí)驗(yàn) 組中細(xì)胞粘附抑制率和半數(shù)抑制量(IC50)。
細(xì)胞漏抑制率二 (1 -值;χ 100O/O
空白對照孔OD值-BSA包被孔OD值“(1)96孔板中加入5μ g/ml玻璃體粘連蛋白(vitronectin)每孔100 μ 1，4°C過 夜。對照孔用5μ g/ml牛血清白蛋白(BSA)包被，每孔100μ 1，排除非特異性結(jié)合的影響。(2)次日吸出包被液，加入1 % BSA封閉，每孔100 μ 1，室溫孵育1小時(shí)，磷酸緩沖液(PBS)洗兩次。 (3)以含有 BSA、lmM CaCl2UmM MgCl2UmM MnCl2 的 RPMI1640 無血清培養(yǎng)液 懸浮M21人黑色素瘤細(xì)胞，每孔加入8 X IO4細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組加入受試藥物，空白對照組加入溶 劑PBS作為對照，37°C 5% CO2孵箱內(nèi)孵育1小時(shí)。(4)吸出培養(yǎng)基，每孔加入200 μ 1 PBS,輕輕沖洗三遍，以去除未粘附的細(xì)胞。(5)棄去PBS，每孔加入100 μ 1 10%戊二醛固定30分鐘。(6)用去離子水洗滌至戊二醛徹底洗凈，置37°C烘箱徹底干燥。(7)加入0. 的結(jié)晶紫對細(xì)胞進(jìn)行染色，振搖30min。(8)用蒸餾水洗滌，至多余的結(jié)晶紫沖洗干凈，置37°C烘箱徹底干燥。(9)加入10%的乙酸對細(xì)胞吸收的結(jié)晶紫進(jìn)行提取。(10) 1小時(shí)后在酶標(biāo)儀上進(jìn)行測定，波長為595nm。實(shí)驗(yàn)結(jié)果各種雙取代苯基雙胍化合物對M21細(xì)胞粘附抑制作用的IC50見下表，可見上述8 種受試化合物均能不同程度的抑制腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附。因粘附抑制是失巢凋亡 的原因，所以這8種化合物都和N-(3，5- 二氯苯基)雙胍一樣能夠誘導(dǎo)惡性腫瘤細(xì)胞失巢 凋亡和抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。
6 H H
J2 NH NH
X 丫
No.X/CiO (μΜ)
3,5-Cl236.42 土 1.43
23，4-Cl238.52 ±1.66
52,4-Ch66.88 士 5,27
62,3-Cl287.26 士 3.56
73-C1,4-F97.28 士 3.55
82，5-Cl2100.24 ±8.44
32C1,5-CF3127.20 士 7.50
42-CH3,5-C1334.92 土 13.97
H>3000藥理實(shí)驗(yàn)五體內(nèi)藥效初步研究利用整合素高表達(dá)的人黑色素瘤細(xì)胞建立裸鼠實(shí)驗(yàn)性轉(zhuǎn)移模型，用以評價(jià)化合物 在體內(nèi)的抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用。受試藥物N-(3，5-二氯苯基)雙胍。
(1)裸鼠實(shí)驗(yàn)性轉(zhuǎn)移模型的建立BALB/Cnu/nu裸小鼠，6周齡，15. 5-18g，雌性，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有 限公司。購買后飼養(yǎng)于我單位SPF級動物實(shí)驗(yàn)室。裸小鼠經(jīng)400&7的137(^-^射線全身照 射，隨機(jī)分成4組生理鹽水對照組、1 X IO6組、2 X IO6組和3 X IO6組，每組6只動物。6_24h
內(nèi)用號注射針頭經(jīng)尾靜脈緩緩注入對應(yīng)數(shù)目的M21細(xì)胞或生理鹽水。療效觀察 觀察裸鼠的一般狀況，每兩天稱量一次體重。于接種后50天斷頸處死動物，有的 鼠未到50天即出現(xiàn)嚴(yán)重惡液質(zhì)，在它自發(fā)死亡前短頸處死。稱體重后解剖出裸鼠完整的肺 臟，再將其用Bouin氏液(飽和苦味酸75ml+40%甲醛25ml+冰醋酸5ml)固定，24h后肺組 織呈黃色，腫瘤轉(zhuǎn)移灶成白色隆起。用解剖顯微鏡觀察并記錄肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)目和大小，并按轉(zhuǎn) 移灶的大小分級。I級轉(zhuǎn)移灶直徑小于0. 5mm ；II級轉(zhuǎn)移灶直徑0. 5-lmm ；III級轉(zhuǎn)移灶 直徑lmm-2mm ；IV級轉(zhuǎn)移灶直徑大于2mm。按下面公式計(jì)算總轉(zhuǎn)移灶數(shù)=I級轉(zhuǎn)移灶數(shù) +11級轉(zhuǎn)移灶數(shù)X2+III級轉(zhuǎn)移灶數(shù)X3+IV級轉(zhuǎn)移灶數(shù)X4。由兩名研究者獨(dú)立計(jì)數(shù)肺表 面轉(zhuǎn)移灶，計(jì)算平均值。肺臟及其它所取臟器(肝、脾、腎、腦)經(jīng)常規(guī)石蠟切片，HE染色， 進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果顯示IX IO6組、2X IO6組和3X106組均能100 %成瘤，癌結(jié)節(jié)數(shù)目均值分別 為84士8，70士6，88士 12，三組之間沒有明顯差異，陰性對照組未形成轉(zhuǎn)移灶。均未見其它 臟器轉(zhuǎn)移。如圖5所示，A和B為黑色素瘤接種組裸鼠肺組織，表面有大小不一的白色轉(zhuǎn)移 灶，圖B為A垂直方向旋轉(zhuǎn)180°。圖C為陰性對照組鼠肺組織。如圖6所示，A.肺內(nèi)瘤 結(jié)節(jié)，B.肺內(nèi)微小腫瘤浸潤灶，C.瘤細(xì)胞沿肺邊緣浸潤，D.E.瘤細(xì)胞核大、核膜清晰、核仁 明顯，分裂相多見。F.對照組正常肺組織，圖中可見支氣管。(放大倍數(shù)A/B:X80，C/D/ E :X160, F :X40)。(2)毒理實(shí)驗(yàn)昆明鼠36只，6周齡，隨機(jī)分成6組，每組6只。六組分別尾靜脈給予300、250、 200、150、100、5011^/1^的^(3，5-二氯苯基)雙胍。計(jì)算 LD50。實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果顯示LD50為120mg/kg。(3)初步體內(nèi)抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)分為陰性對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組。每組6只BALB/C nu/nu 裸小鼠(其條件同“裸鼠實(shí)驗(yàn)性轉(zhuǎn)移模型的建立”部分)，均于400cGy的137Cs-γ射線全身 照射后給予尾靜脈接種1X106M21細(xì)胞。5天后經(jīng)尾靜脈給予藥物陰性對照組給予生理 鹽水，低劑量組、中劑量組和高劑量組分別給予6mg/Kg、12mg/Kg、24mg/Kg N-(3，5- 二氯苯 基)雙胍(為上述LD50的1/20，1/10和1/5)。每4天尾靜脈給藥1次，共給藥5次。細(xì)胞 接種后50天實(shí)驗(yàn)結(jié)束。療效觀察觀察、解剖、固定以及計(jì)數(shù)癌結(jié)節(jié)的方法同上。實(shí)驗(yàn)結(jié)果陰性對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組的癌結(jié)節(jié)數(shù)目均值分別為139士26. 3548，53士4. 5753 (ρ < 0. 05vs 陰性對照組)，34士4. 0415 (ρ < 0. 05vs 陰性對照 組，ρ < 0. 05vs低劑量組組)，4· 7士2. 0111 (ρ < 0. 05vs陰性對照組，ρ < 0. 05vs低劑量 組，ρ < 0. 05vs中劑量組)。病理學(xué)分析可見，陰性對照組鏡下可見大小不等的腫瘤灶，多 見大片腫瘤灶，甚至整個肺尖部布滿腫瘤細(xì)胞；低劑量組可見多見灶性轉(zhuǎn)移灶，可見血管周 圍大量腫瘤細(xì)胞浸潤；中劑量和高劑量組多見灶性和小灶性腫瘤灶，有點(diǎn)腫瘤灶僅有幾個 腫瘤細(xì)胞組成，未見大片腫瘤灶。如圖7所示，A為陰性對照組肺的代表，可見整個肺尖部充 滿腫瘤細(xì)胞，B為低劑量組肺的代表，可見血管周圍腫瘤細(xì)胞浸潤，C為中劑量組和高劑量 組肺的代表，可見小灶性轉(zhuǎn)移灶。結(jié)果提示，N-(3，5-二氯苯基)雙胍能夠抑制腫瘤轉(zhuǎn)移， 由于N-(3，5_ 二氯苯基)雙胍對整合素α νβ 3的靶向作用，可以預(yù)計(jì)它對其它整合素αν β 3高表達(dá)的腫瘤也可能產(chǎn)生明顯的抗轉(zhuǎn)移活性。綜上所述，通過藥理的體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)可以進(jìn)一步的證明本發(fā)明的雙取代苯基雙 胍類化合物，例如N-(3，5-二氯苯基)雙胍，N-(3，4-二氯苯基)雙胍，N-(2-氯-5-三氟 甲烷基苯基)雙胍，N-(2-甲烷-5-氯苯基)雙胍，N-(2，4-二氯苯基)雙胍，N-(2，3-二 氯苯基)雙胍，N-(3-氯-4-氟苯基)雙胍，N-(2，5-二氯苯基)雙胍。均可以顯示出明顯 的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞失巢凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞生長和侵襲轉(zhuǎn)移的作用，同時(shí)具有高效、低毒的特 點(diǎn)，因此有望在抑制腫瘤生長、侵襲轉(zhuǎn)移以及治療整合素α νβ 3高表達(dá)的人黑色素瘤、卵 巢癌、肺癌、胃癌、前列腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等多種惡性腫瘤藥物方面應(yīng)用。


圖1為雙取代苯基雙胍類化合物中的代表N-(3，5-二氯苯基)雙胍的結(jié)構(gòu)式；圖2為細(xì)胞失巢凋亡實(shí)驗(yàn)圖；圖3為caspase3，8，9活性測定實(shí)驗(yàn)圖；圖4為藥物作用后相關(guān)蛋白測定實(shí)驗(yàn)圖；其中A為western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果， B為上述western blotting量化分析結(jié)果；圖5體內(nèi)藥效研究動物模型建立的實(shí)驗(yàn)圖。其中，A和B為黑色素瘤接種組裸鼠 肺組織，表面有大小不一的白色轉(zhuǎn)移灶，圖B為A垂直方向旋轉(zhuǎn)180°。圖C為陰性對照組 鼠肺組織。圖6為體內(nèi)藥效研究動物模型肺組織病理分析實(shí)驗(yàn)圖。其中，A.肺內(nèi)瘤結(jié)節(jié)，B.肺 內(nèi)微小腫瘤浸潤灶，C.瘤細(xì)胞沿肺邊緣浸潤，D.E.瘤細(xì)胞核大、核膜清晰、核仁明顯，分裂 相多見。F.對照組正常肺組織，圖中可見支氣管。(放大倍數(shù)A/B:X80，C/D/E:X160， F :X40)。圖7為體內(nèi)藥效研究肺組織病理分析實(shí)驗(yàn)圖。其中，A為陰性對照組肺的代表，可 見整個肺尖部充滿腫瘤細(xì)胞，B為低劑量組肺的代表，可見血管周圍腫瘤細(xì)胞浸潤，C為中 劑量組和高劑量組肺的代表，可見小灶性轉(zhuǎn)移灶。
具體實(shí)施方式

為了更充分的解釋本發(fā)明的實(shí)施，提供下述制劑實(shí)施例。這些實(shí)施例僅僅是解釋、 而不是限制本發(fā)明的范圍。制劑可以采用本發(fā)明中的任意一個化合物的活性成分。本發(fā)明 的化合物可以合成或從市場上買到。0132]制劑1
0133]每片含10mg活性成分的片劑制備如下
0134]用量/片重量濃度(％ )0135]化合物(2)lOOmg10. 00136]微晶纖維素35mg35. 00137]淀粉45mg45. 00138]聚乙烯吡咯烷酮4mg4. 00139]羧甲基淀粉鈉鹽4. 5mg4. 50140]硬脂酸鎂0. 5mg0. 50141]滑石粉lmg1. 00142]總計(jì)100100. 0 將活性成分，淀粉和纖維素過篩，并充分混合，將聚乙烯吡咯烷酮溶液與上述的粉 混合，過篩，制得濕顆粒于50-6CTC干燥，將羧甲基淀粉鈉鹽，硬脂酸鎂和滑石粉預(yù)先過篩， 然后加入到上述的顆粒中壓片。制劑2
注射劑的制備
化合物(1)200mg
甘露醇700mg
PEG400010mg
蒸餾水100ml
使PH值為7. 0-7. 5過濾濾液濃度為3mg/ml，按每安瓶2ml分裝，冷凍干燥后即得注射劑。
制劑3
每囊含lOOmg活性成分的膠囊的制備如下
用量/囊重量濃度(％ )
化合物(3)lOOmg30. 0
聚氧乙烯脫水山梨0.05mg0. 02
糖醇單油畫？酯
淀粉250mg69. 98
總計(jì)350. 05mg100.00。
實(shí)施例4
N-(2-氯-三氟甲烷基苯基)雙胍100g，加糊精100g，乳糖270g，用70%醇制粒，干燥，裝膠囊，制得1000粒膠囊劑。
實(shí)施例5
N-(3，5-二氯苯基)雙胍80g，加入2M NaOH調(diào)節(jié)pH 8. 0，加注射用水至2000ml，
0. 22um微孔濾膜微濾，分裝(每瓶2ml)，滅菌即得非布司他注射液。
在詳細(xì)說明的較佳實(shí)施例之后，熟悉該項(xiàng)技術(shù)人士可清楚地了解，在不脫離上述 申請專利范圍與精神下可進(jìn)行各種變化與修改，凡依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對以上實(shí)施例所 作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍。且本發(fā)明亦不受說明書中所舉實(shí)例實(shí)施方式的限制。
權(quán)利要求
雙取代苯基雙胍類化合物及其藥用鹽和含它們的藥物組合物在制備抗惡性腫瘤藥物方面的應(yīng)用；其中的雙取代為苯環(huán)2、3、4、5、6位中任意兩個位置的取代；取代基為鹵素、烷基或鹵素取代的烷基。
2.權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中的雙取代苯基雙胍類化合物在制備誘導(dǎo)惡性腫瘤細(xì)胞 失巢凋亡方面的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中的雙取代苯基雙胍類化合物在制備抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移 藥物方面的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中的雙取代苯基雙胍類化合物在制備抑制腫瘤生長藥物 方面的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中的雙取代苯基雙胍類化合物在制備治療人黑色素瘤、 神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肺癌、胃癌、前列腺癌或卵巢癌惡性腫瘤藥物方面應(yīng)用。
6.權(quán)利要求1-5所述的應(yīng)用，其特征在于所述化合物選自如下化合物的一種或多種 N-(3，5-二氯苯基)雙胍N-(3，4-二氯苯基)雙胍N- (2-氯-5-三氟甲烷基苯基)雙胍N-(2-甲烷-5-氯苯基)雙胍N-(2，4-二氯苯基)雙胍N-(2，3-二氯苯基)雙胍N-(3-氯-4-氟苯基)雙胍N-(2，5-二氯苯基)雙胍；N-(3，5-二氯苯基)雙胍鹽酸鹽N-(3，5-二氯苯基)雙胍苯磺酸鹽N-(3，5-二氯苯基)雙胍甲基苯磺酸鹽N-(3，5-二氯苯基)雙胍富馬酸鹽N-(3，5-二氯苯基)雙胍酒石酸鹽N-(3，5-二氯苯基)雙胍馬來酸鹽；N-(3，4-二氯苯基)雙胍鹽酸鹽N-(3，4-二氯苯基)雙胍苯磺酸鹽N-(3，4-二氯苯基)雙胍甲基苯磺酸鹽N-(3，4-二氯苯基)雙胍富馬酸鹽N-(3，4-二氯苯基)雙胍酒石酸鹽N-(3，4-二氯苯基)雙胍馬來酸鹽；N- (2-氯-5-三氟甲烷基苯基)雙胍鹽酸鹽N- (2-氯-5-三氟甲烷基苯基)雙胍苯磺酸鹽N-(2-氯-5-三氟甲烷基苯基)雙胍甲基苯磺酸鹽N- (2-氯-5-三氟甲烷基苯基)雙胍富馬酸鹽N- (2-氯-5-三氟甲烷基苯基)雙胍酒石酸鹽N- (2-氯-5-三氟甲烷基苯基)雙胍馬來酸鹽；N-(2-甲烷-5-氯苯基)雙胍鹽酸鹽N-(2-甲烷-5-氯苯基)雙胍苯磺酸鹽 N-(2-甲烷-5-氯苯基)雙胍甲基苯磺酸鹽 N-(2-甲烷-5-氯苯基)雙胍富馬酸鹽 N-(2-甲烷-5-氯苯基)雙胍酒石酸鹽 N-(2-甲烷-5-氯苯基)雙胍馬來酸鹽； N-(2，4-二氯苯基)雙胍鹽酸鹽 N-(2，4-二氯苯基)雙胍苯磺酸鹽 N-(2，4-二氯苯基)雙胍甲基苯磺酸鹽 N-(2，4-二氯苯基)雙胍富馬酸鹽 N-(2，4-二氯苯基)雙胍酒石酸鹽 N-(2，4-二氯苯基)雙胍馬來酸鹽； N-(2，3-二氯苯基)雙胍鹽酸鹽 N-(2，3-二氯苯基)雙胍苯磺酸鹽 N-(2，3-二氯苯基)雙胍甲基苯磺酸鹽 N-(2，3-二氯苯基)雙胍富馬酸鹽 N-(2，3-二氯苯基)雙胍酒石酸鹽 N-(2，3-二氯苯基)雙胍馬來酸鹽； N- (3-氯-4-氟苯基)雙胍鹽酸鹽 N- (3-氯-4-氟苯基)雙胍苯磺酸鹽 N-(3-氯-4-氟苯基)雙胍甲基苯磺酸鹽 N-(3-氯-4-氟苯基)雙胍富馬酸鹽 N- (3-氯-4-氟苯基)雙胍酒石酸鹽 N-(3-氯-4-氟苯基)雙胍馬來酸鹽； N-(2，5-二氯苯基)雙胍鹽酸鹽 N-(2，5-二氯苯基)雙胍苯磺酸鹽 N-(2，5-二氯苯基)雙胍甲基苯磺酸鹽 N-(2，5-二氯苯基)雙胍富馬酸鹽 N-(2，5-二氯苯基)雙胍酒石酸鹽 N-(2，5-二氯苯基)雙胍馬來酸鹽。
7. 一種用于治療惡性腫瘤的藥物組合物，它包含作為活性成分的權(quán)利要求1或6的化 合物以及一種或多種藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及雙取代苯基雙胍類化合物及含它們的藥物組合物在誘導(dǎo)惡性腫瘤細(xì)胞失巢凋亡和抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移方面的應(yīng)用。本發(fā)明的雙取代苯基雙胍類化合物經(jīng)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，顯示出明顯的誘導(dǎo)惡性腫瘤細(xì)胞失巢凋亡、啟動caspase級聯(lián)，抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的作用，同時(shí)具有高效、低毒的特點(diǎn)，因此作為藥物化合物有望應(yīng)用在抑制腫瘤生長和侵襲轉(zhuǎn)移以及治療整合素αvβ3高表達(dá)的人黑色素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肺癌、胃癌、前列腺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤藥物方面應(yīng)用。
文檔編號A61K31/155GK101862315SQ200910068498
公開日2010年10月20日 申請日期2009年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月17日
發(fā)明者周圓, 張永慈, 彭輝, 朱惠芳, 楊純正, 楊銘, 熊冬生, 紀(jì)慶, 高瀛岱 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院(血液學(xué)研究所)