專利名稱：一種建立亞臨床肝性腦病的實驗?zāi)Ｐ偷姆椒?br> 技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及實驗?zāi)Ｐ偷慕⒎椒?，具體涉及一種建立亞臨床肝 性腦病的實驗動物模型的方法
背景技術(shù)：
肝病是當(dāng)今最為常見的嚴重影響人類健康的疾病之一，亞臨床肝性腦病(SHE)是 指慢性肝病病人無明顯肝性腦病的臨床表現(xiàn)，常規(guī)神經(jīng)精神功能檢查正常，但采用精細的 智力試驗和/或電生理檢測方能確診的肝性腦病。肝性腦病為慢性肝病的常見并發(fā)癥，在 肝硬化患者中發(fā)病率甚高，其潛隱性大，不易被發(fā)現(xiàn)。臨床患者通常雖形似正常，但其操作 能力和應(yīng)激能力有減低，尤其從事高空、機械、駕駛等精細工種的患者更易發(fā)生意外。隨著 我國人民生活水平提高，駕車者逐漸增加，若忽視了對SHE早期診斷和治療，對患者和社會 均會帶來不利影響。據(jù)臨床觀察報道，目前亞臨床肝性腦病(SHE)發(fā)病率呈增高趨勢，已引起臨床學(xué) 家的重視。SHE的防治研究正在起步，其發(fā)生機制亦在深入研究，但迄今尚無建立理想的 SHE的動物模型，阻礙了該疾患的研究進展。目前對亞臨床性肝性腦病(SHE)的研究，仍采用肝硬化動物模型。四氯化碳 (CCL4)高脂低蛋白復(fù)合因素造成的實驗性大鼠肝硬化模型是國內(nèi)外廣泛采用的經(jīng)典動物 模型，與人類壞死后性肝硬化病理改變相似。其發(fā)生發(fā)展大體可分為三期(1)變性壞死 期在實驗第一周，出現(xiàn)肝細胞氣球樣變、壞死與間質(zhì)輕度的炎癥反應(yīng)；第二周以嚴重的肝 脂肪變?yōu)樘卣鳎?2)纖維增生期在實驗第3-4周，以彌漫性纖維增生為特點；(3)假小葉形 成期在實驗第5-6周，特點是結(jié)節(jié)形成肝小葉改建。據(jù)國外亞臨床性肝性腦病的流行病學(xué) 報道肝硬化患者亞臨床性肝性腦病的發(fā)病率為10% _70%，這說明并不是所有的肝硬化 患者均發(fā)生亞臨床性肝性腦病?，F(xiàn)有技術(shù)公開的以四氯化碳(CCL4)高脂低蛋白復(fù)合因素 造成的實驗性大鼠肝硬化模型，這種模型在第5-6周假小葉形成期，是否就發(fā)生亞臨床性 肝性腦病，目前，尚未見有關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種建立亞臨床肝性腦病(SHE)的實 驗?zāi)Ｐ偷姆椒ū景l(fā)明根據(jù)無肝性腦病(HE)癥狀和體征的肝硬化患者，當(dāng)其智力測試和/或誘發(fā) 電位異常者既診斷為SHE的基礎(chǔ)上，采用肝硬化的動物模型進行動態(tài)的學(xué)習(xí)、記憶測試或 神經(jīng)系統(tǒng)和大腦功能的測試，直至動態(tài)監(jiān)測至其智力測試或誘發(fā)電位測試異常并與正常動 物比較有統(tǒng)計學(xué)意義，即為建立了 SHE動物模型。本發(fā)明方法包括如下步驟1)建立四氯化碳(CCL4)高脂低蛋白復(fù)合因素造成實驗性大鼠肝硬化的經(jīng)典動物 模型及對照組動物模型；
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2)以動物學(xué)習(xí)、記憶實驗方法觀察并記錄實驗動物入水后搜索目標所需的時間 (潛伏期)、采用的策略和它們的游泳軌跡，分析實驗動物的學(xué)習(xí)、記憶和空間認知等能力；3)對所造模型進行神經(jīng)電生理測試，檢測其神經(jīng)系統(tǒng)和大腦功能的變化，對照組 與模型組潛伏期出現(xiàn)異常且有統(tǒng)計學(xué)意義時，進行神經(jīng)電生理測試，直至誘發(fā)電位出現(xiàn)異 常，且與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義時，SHE模型即建立成功。常用的動物學(xué)習(xí)、記憶實驗方法有跳臺法、避暗法、穿梭箱和迷津等。Morris方法 是迷津之一。本發(fā)明中，所述的動物學(xué)習(xí)、記憶實驗方法選擇Morris水迷津法。本發(fā)明所涉及的學(xué)習(xí)和記憶是腦的重要功能之一。學(xué)習(xí)是指新行為(經(jīng)驗)的獲 得和發(fā)展。通過學(xué)習(xí)獲得的經(jīng)驗的保持和再現(xiàn)，即記憶。記憶包括識記、保存、再認和回憶 過程。其中，學(xué)習(xí)、記憶有賴于全腦的整合功能，也即完成記憶過程離不開知覺、情緒、注意、 意圖等心理功能，也離不開早已貯存的知識和經(jīng)驗?，F(xiàn)有技術(shù)公開了人和動物的內(nèi)部心理過程無法直接觀察到，只能根據(jù)可觀察到的 刺激反應(yīng)推測腦內(nèi)發(fā)生的過程，對腦內(nèi)記憶過程的研究只能從人類或動物學(xué)習(xí)或執(zhí)行某項 任務(wù)后間隔一定時間，測量它們的操作成績或反應(yīng)時間來衡量這些過程的編碼形式、貯存 量、保持時間和它們所依賴的條件等等。學(xué)習(xí)、記憶實驗方法的基礎(chǔ)是條件反射，各種方法 均由此衍化出來。本發(fā)明經(jīng)對實驗動物進行Morris水迷津潛伏期檢測，結(jié)果顯示，造模前兩組潛伏 期比較無顯著意義(P > 0. 05)，第6周及第8周，兩組潛伏期組間比較差異無顯著性(P > 0. 05)，第10周模型組與正常組比較，潛伏期明顯延長，組間比較有顯著意義(P < 0. 05)。人類記憶區(qū)分為三種存貯系統(tǒng)，即感覺記錄系統(tǒng)，短時存貯系統(tǒng)和長時存貯系統(tǒng)。 研究認為，“感覺記憶”即感知事物后在極短時間內(nèi)的記憶，與腦的電活動有關(guān)?！岸虝r記憶” 和“長時記憶”與腦的神經(jīng)細胞的突觸效能或腦的化學(xué)變化有關(guān)。本發(fā)明采用神經(jīng)系統(tǒng)的監(jiān)測技術(shù)檢測亞臨床肝性腦病實驗?zāi)Ｐ偷纳窠?jīng)系統(tǒng)和大 腦功能的變化。本發(fā)明中，優(yōu)選誘發(fā)電位記錄技術(shù)。所述的誘發(fā)電位(EPs)是指神經(jīng)系統(tǒng)(包括外周或中樞，感覺和運動系統(tǒng))接受 內(nèi)、外界“刺激”所產(chǎn)生的特定電活動，是了解神經(jīng)系統(tǒng)和大腦功能的重要工具。誘發(fā)電位 記錄的是CNS對外源性的刺激的反應(yīng)。神經(jīng)沖動幾乎在神經(jīng)系統(tǒng)的任一水平均可記錄或監(jiān) 測，如外周感受器的活動，中樞活動的活動以及運動反應(yīng)。誘發(fā)電位記錄的有效性、簡便性、 高信息值，均使其成為最重要的電生理學(xué)方法。本發(fā)明所述的誘發(fā)電位包括聽覺誘發(fā)電位和體表感覺誘發(fā)電位。所述的誘發(fā)電位(EPs)其產(chǎn)生的生理基礎(chǔ)，主要有下述三類電活動。(1)皮層Eps， 大部分是一組神經(jīng)元群產(chǎn)生的興奮性和抑制性突觸后電位(EPSP和IPSP)在時間和空間上 的綜合，該綜合電位穿透皮層表面、各種間質(zhì)、顱骨和頭皮，而產(chǎn)生表面電極可記錄到的電 場。(2)皮層下Eps，由各組皮層下中繼核團的神經(jīng)元群產(chǎn)生的突觸后電位(PSP)，與其傳 導(dǎo)通路的動作電位(AP)綜合而成。(3)感覺神經(jīng)或運動神經(jīng)所記錄到的電位，主要是復(fù)合 AP,由去極化波沿這類神經(jīng)纖維膜傳導(dǎo)而產(chǎn)生。AEPs的I、III、V波分別源自聽神經(jīng)、橋腦上橄欖核及中腦下丘的電活動，I"III> I-V, III-V波間期(IPL)則代表了上述相應(yīng)路段的中樞傳導(dǎo)時間，SEP的附3_20也反映中
4樞傳導(dǎo)。當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)或聽神經(jīng)病變時，可出現(xiàn)某電位PL、IPL的延長。本發(fā)明經(jīng)誘發(fā)電位記錄技術(shù)檢測，結(jié)果顯示模型組大鼠體表感覺誘發(fā)電位以及 聽覺誘發(fā)電位I波、III波與V波潛伏期(PL)與正常組比較，潛伏期均有明顯延長，組間比 較差異有顯著性(P < 0. 01)，說明模型動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)異常。本發(fā)明方法通過對四氯化碳(CCL4)高脂低蛋白復(fù)合因素造成的實驗性大鼠肝硬 化模型進行學(xué)習(xí)、記憶測試——Morris水迷津法和神經(jīng)系統(tǒng)、大腦功能的誘發(fā)電位測試， 監(jiān)測其學(xué)習(xí)、記憶和空間認知的障礙和神經(jīng)電生理測試異常并與正常動物比較有統(tǒng)計學(xué)意 義，建立了較為理想的SHE動物模型。建立的實驗動物模型為研究與診治亞臨床肝性腦病 提供了平臺，具有較大的臨床現(xiàn)實意義及價值。
具體實施例方式實施例11)建立四氯化碳(CCL4)高脂低蛋白復(fù)合因素造成實驗性大鼠肝硬化的經(jīng)典動物 模型試劑四氯化碳(CCL4，長海長江化工廠生產(chǎn)，批號201126，規(guī)格分析純)； 橄欖油(Olive oil，上海雙喜香料助劑廠生產(chǎn)，批號201022，規(guī)格化學(xué)純)；膽固醇 (Cholesterol，上海伯奧生物科技有限公司出品，批號201220，規(guī)格分析純)。配制試劑與飼料CCL4溶液將CCL4溶于橄欖油配制40% CCL4橄欖油溶液；高脂玉米粉飼料79. 5%玉米粉+20%豬油+0. 5%膽固醇。實驗動物SD雄性大鼠60只，SPF級，體重220士 14g (購自中科院上海實驗動物中 心)。造模隨機取9只大鼠為正常組，其余大鼠進行造模，首次以40% CCL4O. 5ml/100g 體重，以后以40% CCL4橄欖油溶液0. 3ml/100g皮下注射，每周兩次，以高脂玉米粉飼料飼 養(yǎng)。正常組以普通飼料喂養(yǎng)，生理鹽水皮下注射，劑量與次數(shù)同造模。2)以動物學(xué)習(xí)、記憶實驗方法Morris水迷津法觀察并記錄動物入水后搜索目標 所需的時間(潛伏期)、采用的策略和它們的游泳軌跡，分析大鼠的學(xué)習(xí)、記憶和空間認知 等能力。以上二組分別于造模前、造模后第六周以及第六周后每二周進行Morris水迷津 測試，測定其潛伏期，直至對照組與模型組潛伏期出現(xiàn)異常且有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果顯示，SHE 模型大鼠Morris水迷津潛伏期成績造模前兩組潛伏期比較無顯著意義(P > 0. 05)，具有可比性；第6周及第8周，兩 組潛伏期組間比較差異無顯著性(P > 0. 05)，至第10周模型組與正常組比較，潛伏期明顯 延長，組間比較有顯著意義(P < 0. 05)。造模前、第6周、第8周以及第10周正常組的潛伏 期，各時段雖有較小波動，但無明顯差異；而模型組的潛伏期，隨著造模時間的延長，潛伏期 亦逐漸延長。表1是Morris水迷津潛伏期的變化(i ±s)。表 1
權(quán)利要求
一種建立亞臨床肝性腦病的實驗?zāi)Ｐ偷姆椒ǎ涮卣魇前ㄈ缦虏襟E1)建立四氯化碳高脂低蛋白復(fù)合因素造成實驗性大鼠肝硬化的動物模型及對照組動物模型；2)以動物學(xué)習(xí)、記憶實驗方法觀察并記錄實驗動物入水后的潛伏期、采用的策略和它們的游泳軌跡，分析實驗動物的學(xué)習(xí)、記憶和空間認知能力；3)對所造模型進行神經(jīng)電生理測試，檢測其神經(jīng)系統(tǒng)和大腦功能的變化，建立亞臨床肝性腦病實驗?zāi)Ｐ汀?br> 2.按權(quán)利要求1的方法，其特征是，所述步驟2)的動物學(xué)習(xí)、記憶實驗方法是Morris 水迷津法。
3.按權(quán)利要求1或2的方法，其特征是，所述步驟2)的實驗動物入水后的潛伏期是實 驗動物入水后搜索目標所需的時間。
4.按權(quán)利要求1的方法，其特征是，所述步驟3)的神經(jīng)電生理測試是在對照組與模型 組潛伏期出現(xiàn)異常且有統(tǒng)計學(xué)意義時進行。
5.按權(quán)利要求1或4的方法，其特征是，所述步驟3)的神經(jīng)電生理測試采用誘發(fā)電位 記錄技術(shù)。
6.按權(quán)利要求5的方法，其特征是，所述的誘發(fā)電位包括聽覺誘發(fā)電位和體表感覺誘 發(fā)電位。
7.按權(quán)利要求1或5的方法，其特征是步驟3)的神經(jīng)電生理測試中，直至誘發(fā)電位出 現(xiàn)異常，且與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義時，為亞臨床肝性腦病的實驗?zāi)Ｐ徒⒊晒Α?br> 全文摘要
本發(fā)明屬生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種建立亞臨床肝性腦病的實驗動物模型的方法。本發(fā)明方法通過對四氯化碳高脂低蛋白復(fù)合因素造成的實驗性大鼠肝硬化模型進行學(xué)習(xí)、記憶測試和神經(jīng)系統(tǒng)、大腦功能的誘發(fā)電位測試，監(jiān)測其學(xué)習(xí)、記憶和空間認知的障礙和神經(jīng)電生理測試異常并與正常對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義，建立了較為理想的SHE動物模型。建立的實驗動物模型為研究與診治亞臨床肝性腦病提供了平臺，具有較大的臨床現(xiàn)實意義及價值。
文檔編號A61B5/04GK101961489SQ20091005519
公開日2011年2月2日 申請日期2009年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月22日
發(fā)明者劉龍民, 朱喜英, 梁賢棟, 殷佩浩, 王靈臺, 虞勝, 陳建杰, 高月球 申請人:上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院