專利名稱：：血管緊張素Ⅱ的1型受體拮抗劑在抗腫瘤中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，更具體的涉及沙坦類藥物在抗腫瘤方面的應(yīng)用?！冻袧h不據(jù)WHO統(tǒng)計，在全世界50多億人口中平均每年死于惡性腫瘤者達690萬人新發(fā)病例為870萬例，且數(shù)字還在逐年增加。國內(nèi)情況也基本如此，近20年間惡性腫瘤在死因中構(gòu)成比己由12.6%升至17.9%。因此，各國政府、研究機構(gòu)及制藥公司長期以來一直對腫瘤研究和抗腫瘤藥物予以高度重視，在抗腫瘤藥物的研究上，目前已取得重大進展。腫瘤的化學(xué)治療是應(yīng)用一種或數(shù)種化學(xué)藥物，通過口服或注射達到治療腫瘤的方法?；熗中g(shù)治療和放療相比，它不僅僅殺死局部的癌細胞，而且殺傷全身的轉(zhuǎn)移病灶，但化療并不是萬能的，其本身的巨大毒性使療效受到了極大的限制?；煏撬柚械陌准毎鸢准毎麥p少，導(dǎo)致患者易患感染性疾病，化療藥也會影響骨髓造血細胞和產(chǎn)生血小板的能力，使患者碰到很輕微的損傷，也會造成出血或內(nèi)出血，另外，化療引起的繼發(fā)性腫瘤可能會在許多年以后出現(xiàn)。目前，為了提高抗腫瘤藥物的療效，在實際應(yīng)用時大多采用聯(lián)合用藥。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在人體胰腺、卵巢、前列腺、乳腺等組織中均存在局部獨立的腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAS)，血管緊張素II是RAS中最具生物活性的因子，其對腫瘤增殖與生長的作用越來越引起人們的關(guān)注。血管生成是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移過程中的必需環(huán)節(jié)，而血管緊張素II及其受體參與并影響腫瘤生長、血管生成過程。血管緊張素II受體，主要是AT,亞型在腫瘤細胞、內(nèi)皮細胞上可見表達且在許多腫瘤組織中高表達。血管緊張素II及其受體在調(diào)控細胞增殖、炎癥反應(yīng)和腫瘤血管形成等方面顯示出了不可忽視的作用，為腫瘤治療開辟了新的藥物靶點。"沙坦"類藥物即血管緊張素II受體拮抗劑(angiotensinIIrec印torblocker,ARB)類抗高血壓藥物，問世10余年來，因其獨特的療效和安全性得以迅速發(fā)展。沙坦類藥物是一種血管緊張素II(ATII)的多肽類似物，可以通過與血管緊張素II受體1(AT,)型結(jié)合阻斷血管緊張素II效應(yīng)。除了有效的降血壓功效外，實驗證明，沙坦類藥物可以抑制腫瘤細胞的生長、遷移和血管形成，降低VEGF等細胞因子的分泌并促進腫瘤細胞的凋亡。血管緊張素II的1型受體拮抗劑作為抗高血壓藥己廣泛應(yīng)用于臨床，實驗表明其用于腫瘤治療也具有一定的療效，因此，血管緊張素n的i型受體拮抗劑作為一種新型的抗腫瘤藥物應(yīng)用于臨床，前景十分可喜。魏曉萍、惠起源等在《血管緊張素II及受體與腫瘤關(guān)系的研究進展》(臨床薈萃，2008年23巻11期，831-832)中發(fā)表了氯沙坦可抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的生長、替米沙坦抑制食管鱗癌細胞生長、纈沙坦可抑制宮頸鱗癌細胞生長、坎地沙坦可治療前列腺癌、卵巢癌、惡性黑色素瘤，故氯沙坦用于治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤；替米沙坦用于治療食管鱗癌；坎地沙坦用于治療前列腺癌、卵巢癌不在本專利保護范圍之內(nèi)。YoshifumiFujimoto在《AngiotensinIITypelReceptorExpressioninhumanPancreaticCancerandGrowthInhibitionbyAngiotensinIITypelReceptorAntagonist》(FEBSLetters2001，495，197-200)中發(fā)表了用氯沙坦抑制胰腺癌細胞生長，故氯沙坦用于治療胰腺癌不在本專利保護范圍之內(nèi)。AkiraMiyajima，Takeokosaka在《AngiotensinIITypelAntagonistPreventsPulmonaryMetastasisofMurineRenalCancerbyInhibitingTumorAngiogenesis》(CancerResearch2002，62,4176-4179)中提出坎地沙坦可治療腎細胞癌，故坎地沙坦用于治療腎細胞癌不在本專利保護范圍之內(nèi)。TakayasuSuganu腿，KazuhikoIno在《FunctionalExpressionoftheAngiotensinllTypelReceptorinhumanOvariancarcinomaCellsanditsBlockadeTherapyResultinginSuppressionofTumorInvasion,Angiogensis，andPeritonealDissemination》(ClinCancerRes2005，11，7，2686-2694)中發(fā)表了坎地沙坦可抑制卵巢癌細胞的轉(zhuǎn)移與血管生長，故坎地沙坦用于治療卵巢癌不在本專利保護范圍之內(nèi)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就是提供新的治療方法，它們可有效的抑制腫瘤細胞的生長、遷移、浸潤，一定程度上可以治療腫瘤疾病。在本發(fā)明的第一方面，提供了血管緊張素II的l型受體拮抗劑的用途，其特征在于，用于治療腫瘤疾病，方法包括以下(a)確定患者為陽性腫瘤；(b)當確定患者為陽性腫瘤時，對患者進行血管緊張素II1型受體拮抗劑的治療；(c)對于接受治療的患者，血管緊張素II的1型受體拮抗劑可以幫助減少腫瘤生長、遷移和浸潤，抑制腫瘤血管的生成。在另一優(yōu)選例中，所述的腫瘤為原位癌與繼發(fā)癌。在另一優(yōu)選例中，所述的腫瘤包括胃癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌、膀胱癌、肝癌、腎癌、乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌等。在另一優(yōu)選例中，患者為陽性腫瘤是通過患者的組織樣本經(jīng)化驗確定的。在另一優(yōu)選例中，只有當患者確定為腫瘤病人時才可以用血管緊張素II的1型受體拮抗劑進行治療。在另一優(yōu)選例中，所述的血管緊張素II的1型受體拮抗劑為以下藥物中的一種氯沙坦鉀(losartanpotassium)、結(jié)砂坦(valsartan)、厄貝沙坦(irbesartan)、甲磺酸依普羅沙坦(eprosartanmesylate)、坎地沙坦(candesartancilexetil)、替米沙坦(telmisartan)、奧美沙坦酯(olmesartanmedoxomil)等藥物及其鹽類、前藥物以及有活性的代謝物。在另一優(yōu)選例中，所述的血管緊張素II的1型受體拮抗劑適合以片劑或膠囊的劑量單位形式給予。在另一優(yōu)選例中，所述藥物的每日給藥劑量在0.01100mg/kg范圍內(nèi)。在本發(fā)明的第二方面，提供了血管緊張素II的1型受體拮抗劑的用途，其特征在于，用于治療多種腫瘤疾病。具體實施例方式本發(fā)明人經(jīng)過深入而廣泛的研究，篩選了大量的化合物，發(fā)現(xiàn)血管緊張素II的1型受體拮抗劑適合用于治療腫瘤疾病。沙坦類藥物，又叫做血管緊張素n受體拮抗劑，是一類新型的降價藥，可以有效的抑制腫瘤生長和血管的形成，該類藥物口服吸收快，2小時內(nèi)達到峰值，在體內(nèi)無蓄積，因此適合作為治療腫瘤疾病的藥物，在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。血管緊張素n的i型受體拮抗劑適合于本發(fā)明的化合物是血管緊張素ii的i型受體拮抗劑，即沙坦類藥物。王京麗、賈秀虹在《國際藥學(xué)研究雜志》(2007，Vol34，6期)上發(fā)表了沙坦類藥物的作用機制、藥代動力學(xué)、臨床應(yīng)用及不良反應(yīng)；邱麗萍在《中國老年學(xué)報》(2008，28，414-416)上發(fā)表了沙坦類藥物在心血管疾病中的應(yīng)用；魏曉萍、惠起源等在《臨床荼萃》(2008,Vo123,11期)上發(fā)表了血管緊張素II及受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及與腫瘤生長的關(guān)系；劉玉琴在《基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床》(2004，Vo124，3期)上發(fā)表了腫瘤血管形成的機理以及一些作用因子。在此全部公開作為參考。治療機理本發(fā)明涉及用血管緊張素n的i型受體拮抗劑，及沙坦類藥物治療惡性腫瘤。沙坦類藥物能有效的抑制腫瘤血管的形成，減少腫瘤細胞的生長、遷移和浸潤，從而對多種腫瘤疾病起到治療作用。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)包括血管緊張素原、血管緊張素肽原酶、AngI、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)、AngII和AngII受體等。近年來的一些研究揭示RAS局部表達于一些成分不同的癌細胞和組織中，這其中包括腦腫瘤、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、皮膚癌和子宮頸癌等。因此AngII及其受體在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，而沙坦類藥物可以通過阻斷血管緊張素II的1型受體而抑制腫瘤生長和血管生成。給藥和劑量沙坦類藥物的給藥方式是口服給藥，劑量為不大于正常的治療高血壓的給藥劑量。可治療的腫瘤疾病本發(fā)明提供了一種血管緊張素II的1型受體拮抗劑治療腫瘤的方法。包括(a)確定患者為陽性腫瘤；(b)當確定患者為陽性腫瘤時，對患者進行血管緊張素II1型受體拮抗劑的治療;(c)對于接受治療的患者，血管緊張素II的1型受體拮抗劑可以幫助減少腫瘤生長、遷移和浸潤和腫瘤血管的生成。因為在本發(fā)明的治療方法中，通過口服血管緊張素n的i型受體拮抗劑，可以有效抑制腫瘤生長、遷移浸潤，并抑制腫瘤血管的形成。因此本發(fā)明可用于治療多種腫瘤。代表性腫瘤包括(但并不限于)胃癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌、膀胱癌、肝癌、腎癌、乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌等等。治療的評價血管緊張素II的1型受體拮抗劑治療的效果在體外上可用四甲基偶氮唑藍(MTT)法觀察各種沙坦類藥物對腫瘤細胞增殖的抑制作用，也可以通過流式細胞儀觀察細胞所處的時期。在體內(nèi)可通過動物模型觀測腫瘤大小情況。下面結(jié)合具體實施例，進一步闡明本發(fā)明，應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。實施例l:治療劑的制備本發(fā)明中所用治療劑為市售各種沙坦類藥物，溶于磷酸鹽緩沖液(PBS),4'C冰箱保存，用時以培養(yǎng)液稀釋成不同濃度的工作液。氯沙坦片劑，杭州默東制藥有限公司生產(chǎn)，國藥準字:X20000371,批號01067;纈沙坦:膠囊，麗珠集團麗珠制藥廠生產(chǎn)，國藥準字:H19991146;厄貝沙坦膠囊，廣東合鑫醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)，國藥準字X20000546;依普羅沙坦片劑，杭州科本藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；坎地沙坦片劑，杭州科本藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；替米沙坦片劑，浙江金立源藥業(yè)有限公司，國藥準字H20041252;奧美沙坦片劑，杭州科本藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。實施例2:1.血管緊張素II1型受體拮抗劑對人肝癌H印G2細胞體外生長的抑制作用受試細胞人肝癌H印G2細胞受試藥物氯沙坦、纈沙坦、厄貝沙坦、依普羅沙坦、坎地沙坦、替米沙坦、奧美沙坦實驗過程將處于對數(shù)生長期的細胞用胰酶消化后，用RPMI1460全培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為5X107L，于96孔板每孔接種人肝癌H印G2細胞lOOliL(5X103)，于37。C、5%0)2飽和濕度下培養(yǎng)過夜。次日每孔分別加入500ymol/L氯沙坦100yL,500umol/L纈沙坦100uL,500ymol/L厄貝沙坦100uL,500umol/L依普羅沙坦100uL，500umol/L坎地沙坦100uL，500ymol/L替米沙坦100uL，500ixmol/L奧美沙坦100uL，以不含藥物為對照組，以25mg/L順鉑溶液(DDP)設(shè)為陽性對照組，每組設(shè)4個復(fù)孔，培養(yǎng)24、48、72h，中止前4-6h棄懸液，每孔加MTT溶液20nL，培養(yǎng)4-6h，每孔加二甲基亞砜(DMSO)溶液150yL，混勻后靜置20min,酶聯(lián)免疫檢測儀測各孔在570nm處的吸光度值(A57。)，試驗重復(fù)3次。分別計算抑制率。腫瘤抑制率%=^^100°/。式中，T:給藥組平均A值；C:對照組平均A值結(jié)果見表1，發(fā)現(xiàn)七種沙坦類藥物均表現(xiàn)出一定的抗腫瘤活性。表1七種沙坦藥物對人肝癌H印G2細胞的抑制效果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2.血管緊張素H1型受體拮抗劑對人胃癌MKN-28細胞體內(nèi)的抑制作用受試細胞人胃癌MKN-28細胞受試藥物氯沙坦、纈沙坦、厄貝沙坦、依普羅沙坦、坎地沙坦、替米沙坦、奧美沙坦實驗過程無菌條件下于小鼠右前肢腋側(cè)皮下接種胃癌MKN-28細胞，待腫瘤長至直徑4-6mm時，選取生長良好、無潰瘍具半球狀單一腫瘤的小鼠，按同窩同性別隨機分組，每組8只，小鼠分別給予氯沙坦、纈沙坦、厄貝沙坦、依普羅沙坦、坎地沙坦、替米沙坦、奧美沙坦5mg/kg灌胃，以生理鹽水作為空白對照，每天一次，共30天，喂藥后開始每天觀察小鼠飲食、活動、大小便以及腫瘤生長等情況。至第32天實驗結(jié)束，小鼠稱重后以頸椎脫臼法處死，剪開皮膚，取下完整腫瘤，稱重，并與對照組比較抑制率。腫瘤抑制率%=￡^><100%式中，T:給藥組平均瘤重；C:對照組平均瘤重實驗結(jié)果見表2,七種沙坦類藥物對腫瘤具有一定的抑制作用表2七種沙坦類藥物對人胃癌MKN-28細胞的抑制效果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>3.血管緊張素ni型受體拮抗劑對人胰腺癌Pane-1細胞的抑制作用受試細胞人胰腺癌Panc-l細胞受試藥物氯沙坦、纈沙坦、厄貝沙坦、依普羅沙坦、坎地沙坦、替米沙坦、奧美沙坦實驗過程將處于對數(shù)生長期的細胞用胰酶消化后，用RPMI1460全培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為5X107L，于96孔板每孔接種Pane-1細胞lOOnL(5X103)，于37'C、5%(:02飽和濕度下培養(yǎng)過夜。次日每孔分別加入500ymol/L氯沙坦100uL，500ixmol/L纈沙坦100uL，500umol/L厄貝沙坦100wL，500umol/L依普羅沙坦100uL，500umol/L坎地沙坦100uL，500umol/L替米沙坦100nL,500umol/L奧美沙坦lOOnL，以不含藥物為對照組，以25rag/L順鉑溶液(DDP)設(shè)為陽性對照組，每組設(shè)4個復(fù)孔，培養(yǎng)24、48、72h，中止前4-6h棄懸液，每孔加MTT溶液20yL，培養(yǎng)4-6h,每孔加二甲基亞砜(DMSO)溶液150uL，混勻后靜置20min，酶聯(lián)免疫檢測儀測各孔在570咖處的吸光度值(A57。)，試驗重復(fù)3次。分別計算抑制率。腫瘤抑制率^早x100^式中，T:給藥組平均A值；C:對照組平均A值結(jié)果見表3，發(fā)現(xiàn)七種沙坦類藥物均表現(xiàn)出一定的抗腫瘤活性。表3七種沙坦藥物對人胰腺癌Pane-1細胞抑制率(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>4.血管緊張素ii1型受體拮抗劑對人結(jié)腸癌sw480細胞的抑制作用受試細胞人結(jié)腸癌sw480細胞受試藥物氯沙坦、纈沙坦、厄貝沙坦、依普羅沙坦、坎地沙坦、替米沙坦、奧美沙坦實驗過程將處于對數(shù)生長期的細胞用胰酶消化后，用rpmi1460全培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為5X107l，于96孔板每孔接種人結(jié)腸癌sw480細胞100ul(5x103)，于37°c、5%0)2飽和濕度下培養(yǎng)過夜。次日每孔分別加入500wmol/L氯沙坦100uL,500umol/L纈沙坦100uL，500uraol/L厄貝沙坦100uL，500ymol/L依普羅沙坦100uL，500umol/L坎地沙坦100yL，500iimol/L替米沙坦100uL，500umol/L奧美沙坦100yL，不含藥物的為對照組，以25mg/L順鉑溶液(DDP)設(shè)為陽性對照組，每組設(shè)4個復(fù)孔，培養(yǎng)24、48、72h,中止前4-6h棄懸液，每孔加MTT溶液20pL，培養(yǎng)4-6h,每孔加二甲基亞砜(DMS0)溶液150yL，混勻后靜置20min,酶聯(lián)免疫檢測儀測各孔在570nm處的吸光度值(A57。)，試驗重復(fù)3次。分別計算抑制率。腫瘤抑制率%-^><10()%式中，T:給藥組平均A值；C:對照組平均A值結(jié)果見表4，發(fā)現(xiàn)七種沙坦類藥物對人結(jié)腸癌sw480細胞均表現(xiàn)出一定的抑制作用。表4七種沙坦藥物對人結(jié)腸癌sw480細胞抑制率(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>5.血管緊張素II1型受體拮抗劑對人肺癌A549細胞的抑制作用受試細胞人肺癌A549細胞受試藥物氯沙坦、纈沙坦、厄貝沙坦、依普羅沙坦、坎地沙坦、替米沙坦、奧美沙坦實驗過程用500ymol/L濃度的氯沙坦、纈沙坦、厄貝沙坦、依普羅沙坦、坎地沙坦、替米沙坦、奧美沙坦分別處理人肺癌A549細胞48h，以等量完全培養(yǎng)基為空白對照，利用流式細胞儀進行細胞周期分析，結(jié)果表5顯示人肺癌A549細胞在G。/d期所占百分比明顯增加，而S和G2/M期的細胞所占百分比減少，說明細胞被阻滯在G。/G,期，細胞增殖被抑制。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>6.血管緊張素II1型受體拮抗劑對人肺癌H125細胞的抑制作用受試細胞人肺癌H125細胞受試藥物氯沙坦、纈沙坦、厄貝沙坦、依普羅沙坦、坎地沙坦、替米沙坦、奧美沙坦實驗過程無菌條件下于小鼠右側(cè)脅腹部近腋下皮下接種人肺癌H125細胞，待腫瘤長至直徑約3-4mm時，選取生長良好的小鼠，按同窩同性別隨機分組，每組8只，小鼠分別給予氯沙坦、纈沙坦、厄貝沙坦、依普羅沙坦、坎地沙坦、替米沙坦、奧美沙坦5rag/kg灌胃，以生理鹽水作為空白對照，每天一次，共30天，喂藥后開始每天觀察小鼠飲食、活動、大小便以及腫瘤生長等情況。至第32天實驗結(jié)束，小鼠稱重后以頸椎脫臼法處死，剪開皮膚，取下完整腫瘤，稱重，并與對照組比較抑制率。腫瘤抑制率%=^1><100%式中，T:給藥組平均瘤重；C:對照組平均瘤重實驗結(jié)果見表6，七種沙坦類藥物對人肺癌H125細胞具有一定的抑制作用表6七種沙坦類藥物對人肺癌H125細胞的抑制效果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>權(quán)利要求1.血管緊張素II的1型受體拮抗劑的用途，其特征在于，用于治療腫瘤疾病，方法包括以下(a)確定患者為陽性腫瘤；(b)當確定患者為陽性腫瘤時，對患者進行血管緊張素II的1型受體拮抗劑治療；(c)對于接受治療的患者，血管緊張素II的1型受體拮抗劑可以幫助減少腫瘤生長、遷移和浸潤，抑制腫瘤血管的生成。2.如權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于，所述的腫瘤為原位癌與繼發(fā)癌。3.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的腫瘤包括胃癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌、膀胱癌、肝癌、腎癌、乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌等。4.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，患者為陽性腫瘤是通過患者的組織樣本經(jīng)化驗確定的。5.如權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于，只有當患者確定為腫瘤病人時才可以用血管緊張素n的i型受體拮抗劑進行治療。6.如權(quán)利要求i所述的用途，其特征在于，所述的血管緊張素n的i型受體拮抗劑為以下藥物中的一種氯沙坦鉀(losartanpotassium)、纈沙坦(valsartan)、厄貝沙坦(irbesartan)、甲磺酸依普羅沙坦(eprosartanmesylate)、坎地沙坦(candesartancilexetil)、替米沙坦(telmisartan)、奧美沙坦酯(olmesartanmedoxomil)等藥物及其鹽類、前藥物以及有活性的代謝物。7.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的血管緊張素II的1型受體拮抗劑適合以片劑或膠囊的劑量單位形式給予。8.如權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于，所述藥物的每日給藥劑量在0.01-100mg/kg范圍內(nèi)。9.血管緊張素II的1型受體拮抗劑的用途，其特征在于，用于治療多種腫瘤疾病。全文摘要本發(fā)明公開了血管緊張素Ⅱ的1型受體拮抗劑用于治療腫瘤的新用途。血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)最重要的效應(yīng)因子，血管緊張素Ⅱ的1型受體在腫瘤細胞的增殖、遷移、浸潤和腫瘤血管生成中起重要作用。血管緊張素Ⅱ的1型受體拮抗劑可有效的抑制多種實體腫瘤，如前列腺癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、腎癌等腫瘤細胞的增殖、遷移以及腫瘤血管的生長。文檔編號A61K45/00GK101612400SQ20091005517公開日2009年12月30日申請日期2009年7月22日優(yōu)先權(quán)日2009年7月22日發(fā)明者丁志樓,達雅靜,陳志龍申請人:陳志龍