專利名稱：關于使用陽離子脂質體介導的核酸遞送產生免疫應答的方法
關于使用陽離子脂質體介導的核酸遞送產生免疫應答的方
法發(fā)明背景 發(fā)明領域本發(fā)明在藥物遞送且特別地基于陽離子脂質體的疫苗領域中。在實施方案中，本 發(fā)明提供了制備用于遞送分子以誘導針對病毒抗原的免疫應答或者治療或預防病毒疾病 的配體靶向的(例如，抗體或抗體片段靶向的)脂質體的方法。遞送系統(tǒng)的特異性得自靶 向性配體。
背景技術：
疫苗代表針對可高度傳播的感染性病原體的強大武器，并且在過去一個世紀中已 用于顯著減少感染性疾病的負擔。然而，由感染性疾病造成的對全球健康的威脅并未后退， 而是已變成全國和全球優(yōu)先考慮的事情。病毒病原體例如結核和瘧疾的影響繼續(xù)在全球規(guī) 模上感受到，并且新出現(xiàn)的病原體例如HIV/AIDS、SARS冠狀病毒和最近出現(xiàn)的大流行性流 感或‘禽流感’病毒對公共衛(wèi)生提出新挑戰(zhàn)。大多數(shù)疫苗技術涉及滅活的疫苗制劑、基于蛋白質亞單位或在性質方面活減毒 的。例如，關于流感疫苗的目前生產和制造技術基于雞蛋接種并且仍是時間和成本密集過 程。其為活減毒病毒的天花疫苗與免疫妥協(xié)群體中的嚴重不利事件相關。因此，目前的疫 苗技術是過時的并且不足以滿足關于疫苗的全國或全球需求。因此，存在開發(fā)新疫苗技術的迫切需要，所述新疫苗技術將解決由高度易變和新 出現(xiàn)的病原體造成的挑戰(zhàn)。本發(fā)明通過提供基于陽離子脂質體的藥物遞送系統(tǒng)滿足了這些 需要，所述藥物遞送系統(tǒng)用于在誘導針對抗原的免疫應答中使用以及用于治療或預防患者 中的病毒疾病。發(fā)明概述在一個實施方案中，本發(fā)明提供了制備配體靶向的(例如，蛋白質/肽靶向的、抗 體或抗體片段靶向的)陽離子脂質體的方法。在合適的實施方案中，此種方法包括制備配 體(例如，轉鐵蛋白、半乳糖、L-37pA、抗體或抗體片段)，并且使配體與陽離子脂質體混合， 以形成配體靶向的陽離子脂質體。適當?shù)?，配體與陽離子脂質體直接結合/復合，但不與陽 離子脂質體化學綴合。在其他實施方案中，配體可以與陽離子脂質體化學綴合。隨后，配體 靶向的陽離子脂質體與編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分子，和/或編碼一 種或多種白介素的一種或多種核酸分子混合，以形成配體靶向的陽離子脂質體復合物。在 合適的實施方案中，使用抗體片段，例如，F(xiàn)ab片段、或單鏈Fv片段，例如抗轉鐵蛋白受體單 鏈Fv (TfRscFv)。在進一步的實施方案中，該方法可以進一步包括使配體靶向的陽離子脂質 體與包含1([1(01)1(1(1(]5-1(01)1(此0101(0 (SEQ ID NO 1)肽的肽混合。適當?shù)?，配體(例如，蛋白質/肽、抗體或抗體片段)與陽離子脂質體以約1 1 至約1 100、適當?shù)丶s1 10至約1 50(w W)、更適當?shù)丶s1 20至約1 40范圍 的比混合。在示例性實施方案中，陽離子脂質體包含二油?；谆姿徜@(D0TAP)與二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)和/或膽固醇(chol)的混合物；或雙十八烷基二甲基溴化銨 (DDAB)與二油?；字Ｒ掖及泛?或膽固醇的混合物。核酸適當?shù)匾约s0. 1摩爾編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分子比 約10摩爾編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子；至約10摩爾編碼一種或多種病 毒蛋白質的一種或多種核酸分子比約0. 1摩爾編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸 分子的摩爾比存在。例如，可以利用約1摩爾編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核 酸分子比約1摩爾編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子的比。在示例性實施方案 中，陽離子免疫脂質體與編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分子、和編碼一種 或多種白介素的一種或多種核酸分子，以約1 1至約1 40(yg總核酸yg脂質體)、 適當?shù)丶s1 5至約1 20(yg總核酸yg脂質體)，例如約1 10(yg總核酸yg 脂質體)的重量比混合?？梢杂珊怂岱肿泳幋a的病毒蛋白質例子包括但不限于，選自下述的病毒蛋白質 HIV病毒蛋白質，流感病毒蛋白質，甲型、乙型或丙型肝炎病毒蛋白質、SARS病毒蛋白質，禽 流感病毒蛋白質，埃博拉病毒蛋白質，西尼羅病毒蛋白質，和天花病毒蛋白質。可以由核酸 分子編碼的白介素例子包括但不限于，選自IL-l、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、 IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18 和 IL-23 的白介素。在合適的實施方案中， 核酸編碼IL-2、IL-12和IL-15。本發(fā)明還提供了通過本發(fā)明的各種方法制備的陽離子免 疫脂質體復合物。在進一步的實施方案中，本發(fā)明提供了配體靶向的(例如，蛋白質/肽、抗體或抗 體片段靶向的)陽離子脂質體復合物，其包含陽離子脂質體、配體(例如，蛋白質/肽、抗體 或抗體片段)、編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分子、和編碼一種或多種白介 素的一種或多種核酸分子，其中配體與陽離子脂質體直接復合但不化學綴合。在進一步的 實施方案中，配體可以與脂質體化學綴合。本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的各種脂質體復合物的藥物組合物。本發(fā)明的另外的 藥物組合物包括第一配體靶向的陽離子脂質體復合物，其包括陽離子脂質體、配體(例如， 蛋白質/肽、抗體或抗體片段)和編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分子，其 中配體與陽離子脂質體直接復合但不化學綴合。在進一步的實施方案中，配體可以與陽離 子脂質體化學綴合。在合適的實施方案中，藥物組合物還進一步包括第二配體靶向的陽離 子脂質體復合物，其包括陽離子脂質體、配體(例如，蛋白質/肽、抗體或抗體片段)和編碼 一種或多種白介素的一種或多種核酸分子，其中配體與陽離子脂質體直接復合但不化學綴 合。在進一步的實施方案中，配體可以與陽離子脂質體化學綴合。在另外的實施方案中，本發(fā)明提供了將一種或多種活性劑遞送給哺乳動物的抗原呈遞細胞(APCs)的方法，其包括給哺乳動物施用抗轉鐵蛋白受體單鏈Fv(TfRscFv)靶向的 陽離子免疫脂質體復合物，所述復合物包括陽離子脂質體、TfRscFv和一種或多種活性劑， 其中TfRscFv與陽離子脂質體直接結合/復合，但不化學綴合。在進一步的實施方案中， TfRscFv可以與陽離子脂質體化學綴合。適當?shù)?，該方法將試?例如，核酸)遞送給專業(yè) 和非專業(yè)APCs，包括位于肝、脾、淋巴結、腸和/或呼吸道中的APCs。本發(fā)明還提供了在哺乳動物中誘導針對病毒抗原的免疫應答的方法，其包括給哺 乳動物施用本發(fā)明的各種陽離子脂質體復合物、或本發(fā)明的藥物組合物。
在進一步的實施方案中，本發(fā)明提供了治療或預防哺乳動物中的病毒疾病的方法，其包括給哺乳動物施用本發(fā)明的各種陽離子脂質體復合物、或本發(fā)明的藥物組合物。附圖簡述本專利或申請文件包含以彩色作出的至少一個附圖。本專利或專利申請公開物與 一個或多個彩色附圖的拷貝將在請求且支付必要費用后由USPTO或事務所提供。

圖1顯示在用脂質體(包括或不包括HoKC肽)轉染的H印3B細胞中的螢光素酶 活性，所述脂質體與抗轉鐵蛋白受體單鏈抗體片段(sc)和螢光素酶報道基因復合。圖2顯示在用3種不同脂質體(A、D和G)轉染的原代黑猩猩肝細胞中的螢光素酶 表達，所述脂質體與sc、Gal或L-37-pA和表達螢光素酶報道基因的DNA復合。所有數(shù)據(jù)顯 示為平均值+SD (η = 3)。圖3顯示蛋白質印跡，其顯示與未處理小鼠(UT)比較，在來自用20-25 μ g表達 EGFP的DNA接種的一式兩份小鼠的肝提取物中的GFP表達，所述表達EGFP的DNA和與脂質 A 綴合的 TfRscFv 配體(sc) (scLA)、與脂質 A 和 HoKC 綴合的 TfRscFv 配體(sc) (scLAHK)、 與脂質D和HoKC綴合的TfRscFv配體(sc) (scLDHK)、與脂質G和HoKC綴合的TfRscFv配 體(sc) (scLGHK)、與脂質A綴合的半乳糖(GalLA)和與脂質A綴合的L_37pA (L_37pALA)復
合O圖4顯示用表達HCV抗原NS3-NS5B的DNA質粒(pAG410)轉染的細胞的蛋白質印 跡。印跡用針對NS5B的單克隆抗體(左)和來自慢性感染的黑猩猩的血清(右)進行探 測。圖5顯示在pSCMV和CMV啟動子下的IL_2的比較表達。圖6顯示在i. v.注射scL復合的或游離的PAG410后小鼠肝中的NS3的DNA PCR 擴增。圖7顯示在用SCL-HCV/SCL-IL12接種的小鼠中HCV重組痘苗病毒復制的抑制。圖8A和8B顯示在首次用于實驗的動物(Chl601)和恢復的動物(Chl587)的疫 苗接種和用HCV攻擊過程中的HCV抗HVRl抗體(條)和RNA譜(黑色三角)?？笻VRl表 示為P/N比。P/N通過將測試血清的0D405除以對于來自相同黑猩猩的疫苗前樣品獲得的 0D405進行計算。截斷值是P/N = 2。圖9A-9C顯示在2只恢復的黑猩猩(Chl588和Chl606)和1只首次用于實驗的黑 猩猩(Ch6394)的基于T細胞的疫苗接種和用HCV攻擊過程中的疾病曲線圖。RNA滴度(黑色 方塊)、ALT水平(黑色三角)。免疫接種的動物的HCV攻擊在第O周時執(zhí)行(100CID5(1cHCV)。圖10A-10C顯示在用scL-HCV免疫接種且用重組腺病毒加強的(Chl611和 Ch6407)，或用scL-空載體免疫接種且用非重組腺病毒加強的(Ch0257)黑猩猩中針對肽庫 的elispot應答。圖1IA-IIC顯示在攻擊前和后在免疫接種的(Ch6407和1611)和對照(Ch 0257) 黑猩猩中的Elispot應答。圖12A-12C顯示在疫苗接種的(Ch6407和1611)和對照(Ch 0257)黑猩猩中的肝 內細胞因子mRNA水平。圖13顯示在對照(Ch 0257)和疫苗接種的(Ch6407和1611)黑猩猩中在攻擊后 的HCV RNA滴度。
圖14顯示在對照(Ch 0257)和疫苗接種的(Ch6407和1611)黑猩猩中在攻擊后 的血清ALT水平。圖15顯示在慢性感染的黑猩猩中的PBMC T細胞應答。圖16A-16C顯示在IN施用質粒DNA，隨后進行后續(xù)螢光素底物注射后的BALB/c小 鼠的光學圖像，所述質粒DNA表達螢光素酶基因，且作為游離(裸露)質粒DNA (LUC) (B)或 封裝在scL納米免疫脂質體復合物中(scLLUC) (C)。小圖A代表未處理對照。圖17A-17C顯示在IV施用質粒DNA，隨后進行后續(xù)螢光素底物注射后的BALB/c小 鼠的光學圖像，所述質粒DNA表達螢光素酶基因，且作為游離(裸露)質粒DNA (LUC) (B)或 封裝在scL納米免疫脂質體復合物中(scLLUC) (C)。小圖A代表未處理對照。發(fā)明詳述在一個實施方案中，依照本發(fā)明實施方案的配體靶向的(例如，蛋白質/肽、抗體 或抗體片段靶向的)陽離子脂質體或陽離子聚合物復合物適當?shù)赝ㄟ^簡單有效的非化學 綴合方法進行制備，其中所需復合物的組分以限定比和限定順序混合在一起。在另外的實 施方案中，配體靶向的陽離子脂質體或陽離子聚合物復合物可以通過化學綴合方法進行制 備，其中配體經由化學鍵與陽離子脂質體的表面化學綴合。術語“免疫復合物”、“免疫脂質體”、“復合物”、“納米復合物”、“免疫納米復合物”、 “脂質體復合物”和“納米免疫脂質體”自始至終可互換用于指本發(fā)明的陽離子脂質體。用 于在本發(fā)明的實踐中使用的示例性陽離子脂質體及其生產方法公開于2006年9月14日提 交的美國公開專利申請?zhí)?003/0044407和美國專利申請?zhí)?1/520，796中，所述申請各自 的公開內容通過弓I用整體合并入本文。如本文所使用的，術語“約”指所述值以及在所述值10%內的值。例如，“約lOOnm” 包括90nm至IlOnm的值，包括在這個范圍之間的值。如本文所使用的，術語“配體”指任何合適的靶向性部分，其可以與陽離子脂質體 化學綴合，或直接結合/復合但不化學綴合。用于在本發(fā)明的實踐中使用的示例性配體包 括但不限于，蛋白質(例如，轉鐵蛋白或葉酸)、肽(例如，L-37pA)、抗體、抗體片段(包括 Fab'片段和單鏈Fv片段)和糖(例如，半乳糖)、以及其他靶向性分子。其中依照本發(fā)明實施方案的復合物通過簡單有效的非化學綴合進行制備的示例 性方法和組合物公開于2006年9月14日提交的美國公開專利申請?zhí)?003/0044407和美國 專利申請?zhí)?1/520,796中。其中依照本發(fā)明實施方案的復合物經由化學綴合進行制備的 示例性方法和組合物公開于2001年10月1日提交的美國專利申請?zhí)?9/914，046中。這 些專利申請各自的公開內容通過弓I用整體合并入本文。在示例性實施方案中，完整抗體或抗體片段可以用作配體以制備本發(fā)明的復 合物。在一個合適的實施方案中，使用抗體片段，包括抗體的Fab片段和單鏈Fv片段 (scFv)。一種合適的抗體是抗轉鐵蛋白受體(抗TfR)單克隆抗體，并且合適的抗體片段 是基于抗TfR單克隆抗體的scFv。合適的抗TfR單克隆抗體是5E9(參見例如，Hayes, B. F.,等人， “Characterization of a Monoclonal Antibody (5E9) that Defines a Human Cell Surface Antigen of Cell Activation, " J. Immunol. 127 347-352 (1981)； Batra, J.K., 等 人’ “Single-chainImmunotoxins Directed at the Human Transferrin ReceptorContaining Pseudomonas Exotoxin A or Diphther ia Toxin Anti-TFR(Fv)-PE40 and DT388-Anti_TFR(Fv)，“ Mol. Cell. Biol. 11 =2200-2205 (1991)； 其公開內容通過引用合并入本文)?；?E9抗體的scFv包含關于由這種MAb識別的TfR 表位的完全抗體結合位點(作為分子量約26，000的單條多肽鏈)。scFv通過使來自重和 輕鏈的組分VH和VL可變結構域分別與適當設計的肽連接而形成，所述適當設計的肽使第 一個可變區(qū)的C末端與第二個的N末端橋接，順序為VH-肽-VL或VL-肽-VH0另外的配體 例如本文中描述的那些也可以在本發(fā)明的實踐中使用。在一個實施方案中，將半胱氨酸部分加入scFv的C末端中。盡管不希望受理論束 縛，但相信提供游離巰基的半胱氨酸可能增強在化學綴合和非化學綴合實施方案中抗體和 脂質體之間的復合物形成。無論用或不用半胱氨酸，蛋白質可以在大腸桿菌(E. coli)包含 體中表達并且隨后重折疊以產生活性形式的抗體片段。除非希望在復合物形成中使用立體穩(wěn)定免疫脂質體，否則在制備本發(fā)明的示例性 非化學綴合復合物中的第一個步驟包括使陽離子脂質體或脂質體組合與選擇的抗體或抗 體片段混合。廣泛多樣的陽離子脂質體在本發(fā)明復合物的制備中有用。公開的PCT申請 TOggAsszo描述了數(shù)種陽離子脂質體的制備。合適脂質體的例子包括磷脂酰膽堿(PC)、 磷脂酰絲氨酸(PS)以及包含二油?；谆姿徜@(DOTAP)與二油酰基磷脂酰乙醇胺 (DOPE)和/或膽固醇(chol)的混合物；雙十八烷基二甲基溴化銨(DDAB)與二油酰基磷脂 酰乙醇胺和/或膽固醇的混合物的那些?？梢愿淖冎|的比例以對于特定靶細胞類型最 佳化治療分子的攝取效率。脂質體可以包含一種或多種陽離子脂質和一種或多種中性或 輔助脂質的混合物。一種或多種陽離子脂質與一種或多種中性或輔助脂質的所需比為約 1 (0.5-3)，優(yōu)選1 (1_2)(摩爾比)。合適的配體，例如蛋白質/肽、抗體或抗體片段，是與靶細胞的表面結合，并且優(yōu) 選與在靶細胞上差異表達的受體結合的那些。配體在室溫下以及以約1 10至約1 50、 適當?shù)丶s1 20至約1 40(w w)范圍的配體(例如，蛋白質)脂質比(重量重 量)與陽離子脂質體或聚合物混合。允許配體(例如，蛋白質/肽、抗體或抗體片段)和脂質體在室溫下溫育短時間 段，一般約10-15分鐘，隨后使混合物與選擇的治療或診斷劑混合?？梢耘c脂質體復合物復 合的治療分子或試劑的例子包括基因、高分子量DNA(基因組DNA)、質粒DNA、反義寡核苷 酸、肽、核酶、核酸(包括siRNA和反義)、小分子、病毒顆粒、免疫調節(jié)劑、用于成像的造影 齊U、蛋白質和化學試劑。配體(例如，蛋白質/肽、抗體或抗體片段)和脂質體組合與治療試劑以在 約0.5 1至約1 40(yg試劑nmol總脂質)、適當?shù)丶s1 10至約1 20 (μ g 試劑nmol總脂質)范圍中的比混合，并且在室溫下溫育短時間段，一般約10-15 分鐘。脂質體復合物的大小一般在約50-500nm范圍內，如通過動態(tài)光散射使用 Malvern ZETASIZER 3000 或 Malvern ZETASIZER NANO-ZS 測量的。參見美國公開 專利申請?zhí)?003/0044407和美國專利申請?zhí)?1/520，796，其公開內容通過引用整體合并 入本文。在本發(fā)明的一個實施方案中，用于形成復合物的脂質體是立體穩(wěn)定脂質體。立 體穩(wěn)定脂質體是親水聚合物例如PEG、聚(2-乙基丙烯酸)、或聚(η-異丙基丙烯酰胺 (PNIPAM)已整合到其內的脂質體。當與治療劑復合時，此種修飾的脂質體可以是特別有用的，因為它們一般不象未如此修飾的可比較脂質體一樣快速地通過網狀內皮系統(tǒng)從血流中 清除。為了制備本發(fā)明的立體穩(wěn)定脂質體復合物，抗體或抗體片段、脂質體和治療或診斷劑 的混合順序與上文闡述的順序相反。在第一個步驟中，如上所述的陽離子脂質體首先如上 所述以在約0.5 1至約1 40(yg試劑nmol脂質)、適當?shù)丶s1 10至1 20 ( μ g 試劑nmol脂質)范圍中的比與治療劑混合。以約0.1 100 (nmol PEG nmol脂質)、 適當?shù)丶s0.5 50，例如1 40(nmol PEG nmol脂質)的比，向這種脂復合物中加入溶 于生理學上可接受的緩沖液中的PEG聚合物溶液。所得到的溶液在室溫下溫育足以允許聚 合物整合到脂質體復合物內的時間。配體(例如，蛋白質/肽、抗體或抗體片段)隨后在室 溫下和以在約1 5至約1 40(w w)范圍中的配體(例如，蛋白質)脂質比與穩(wěn)定 脂質體復合物混合。依照本發(fā)明制備的脂質體復合物可以配制為藥理學上可接受的制劑用于體內施 用。復合物可以與藥理學上相容的媒介物或載體組合。組合物可以配制例如用于靜脈內施 用于哺乳動物，例如待通過施用在復合物中的治療分子或其他有效負荷獲益的人患者。復 合物具有如此合適的大小，使得它們在靜脈內施用后遍及機體分布。備選地，復合物可以經 由其他施用途徑進行遞送，例如瘤內(IT)、損傷內(IL)、氣溶膠、透皮、經口、內窺鏡、局部、 肌內(IM)、皮內(ID)、眼內(10)、腹膜內(IP)、經皮(TD)、鼻內(IN)、大腦內(IC)、器官內 (例如，肝內)、緩慢釋放埋植劑或皮下施用，或經由使用滲透或機械泵的施用。用于經由此 種方法遞送的制劑的制備和使用此種方法的遞送是本領域眾所周知的。復合物可以就靶細胞類型進行最佳化，通過脂質的選擇和比、配體(例如，蛋白質 /肽、抗體或抗體片段)與脂質體的比、配體和脂質體與治療劑的比、以及配體和治療劑的 選擇。依照本發(fā)明的方法制備的復合物可以以試劑盒形式提供，用于在核酸、治療分子 或經由復合物的其他有效負荷的系統(tǒng)遞送中使用。合適的試劑盒可以在分別的合適容器中 包括脂質體、配體(例如，蛋白質/肽、抗體或抗體片段)、和核酸、治療或診斷劑。組分可以 在無菌條件下以合適順序混合，并且在合理時間段內施用于患者，一般在制備后約30分鐘 至約24小時。試劑盒組分優(yōu)選作為溶液或作為干粉提供。以溶液形式提供的組分優(yōu)選連 同合適緩沖劑、滲透性控制試劑等一起在無菌注射用水中配制。完整的復合物還可以配制 為干粉(凍干的)(參見例如，美國公開專利申請?zhí)?005/0002998，其公開內容通過引用整 體合并入本文)。
如其公開內容通過引用合并入本文的美國公開專利申請?zhí)?003/0044407和美 國專利申請?zhí)?1/520，796中自始至終討論的，自始至終描述的陽離子免疫脂質體復合 物已成功地將各種治療和診斷劑遞送給腫瘤細胞，經由使用抗轉鐵蛋白單鏈抗體片段 (TfRscFv)靶向。特別地，核酸分子例如反義和siRNA以及質粒DNA (例如p53和RB94)已 使用本發(fā)明的免疫脂質體復合物成功地遞送(參見美國公開專利申請?zhí)?003/0044407和 美國專利申請?zhí)?1/520，796)。小分子也已通過自始至終公開的方法和脂質體遞送(參見， 2007年5月11日提交的美國專利申請?zhí)?1/798，296，其公開內容通過引用整體合并入本 文)。如自始至終討論的，目前已發(fā)現(xiàn)疫苗構建體可以進行制備、靶向且有效轉染無論存在 于機體何處中的抗原呈遞細胞(APCs)，包括但不限于，肝臟肝細胞、枯否細胞、肝竇狀上皮 細胞(LSEC)和樹突細胞(使用TfRscFv作為靶向性部分)。
用于疫苗接種的陽離子脂質體復合物
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于在哺乳動物(如本文所使用的，哺乳動物 包括犬、貓、豬、綿羊、馬、牛、大鼠、小鼠、黑猩猩、猴、類人猿等以及人)中使用陽離子脂質 體復合物在病毒復制的原始位點處誘導針對病毒抗原的免疫應答的方法，所述原始位點例 如具有丙型肝炎病毒(HCV)的肝，且特別地抗原呈遞細胞(APC)。作為一個例子，在HCV中， T細胞應答已確定為在感染后的病毒復制位點(肝)處更快速和更有效。因此，本發(fā)明提供 了模擬在HCV恢復的哺乳動物中發(fā)生的T細胞初敏的方法，其通過陽離子脂質體以遞送重 組質粒DNA和病毒載體化免疫接種而在體內誘導靶向位于肝中的細胞(例如，枯否細胞、肝 竇狀上皮細胞、樹突細胞和肝細胞)的免疫應答(例如，預防疫苗)。本發(fā)明還提供了用作 免疫治療劑的疫苗以用于預防和治療慢性(和急性)病原體感染。將各種配體靶向的陽離 子脂質體復合物遞送給機體的正常細胞(即，非腫瘤細胞)的能力是出乎意料和令人驚訝 的結果。應當理解盡管本發(fā)明的示例性方法用于治療哺乳動物(例如，人)，但本發(fā)明的方 法、脂質體制劑和組合物還可以用于治療其他動物，包括鳥類、魚類等。本發(fā)明的陽離子免疫脂質體復合物適當?shù)卦谄浔砻嫔习罐D鐵蛋白受體單鏈 抗體分子(TfRscFv)。已確定這種靶向性分子增強表達病毒蛋白質的封裝/結合核酸(例 如，質粒DNA)的遞送和經由APCs的攝取。參見例如，美國公開專利申請?zhí)?003/0044407 和美國專利申請?zhí)?1/520,796。此外，本發(fā)明提供了在相同免疫脂質體復合物中表達白介 素(IL)佐劑的核酸的同時施用以刺激免疫應答。免疫應答的細胞因子增強細胞因子是由機體中的細胞響應激活刺激釋放的小蛋白質( 25kDa)。它們 通過與特定受體結合以自分泌和旁分泌的方式誘導應答，以調節(jié)先天性和適應性免疫應 答。通過共施用純化的蛋白質(Berzofsky J.A.，等人，Immunological Reviews, 170 151-172(1999))或表達所需細胞因子產物的DNA質粒(Toka F.N.，等人，Immunological Reviews, 199 :100_112 (2004))，它們已廣泛用于改善疫苗活性。關于這些佐劑的基因遞送 的大多數(shù)研究已集中于肌內或皮內施用途徑，靜脈內遞送未得到廣泛評估(參見Toka)。 CD4細胞基于其細胞因子基因轉錄和分泌分成個2個主要類型。Thl細胞的特征在于它們 分泌IL-2和γ干擾素(IFN-γ)，而Th2細胞產生IL-4、IL-5和IL-10。佐劑可以誘導向 Thl或Th2方向傾斜的T細胞應答，這可能對疫苗的結果產生深遠影響。為了改善免疫接種 且刺激有效的Thl類型應答，表達IL-2、IL-12或IL-15的核酸例如質粒適當?shù)卦陉栯x子脂 質體中結合/封裝，如自始至終描述的。IL-2 大部分IL_2(15. 5_kDa糖蛋白)由CD4Thl型細胞產生，并且它的主要作用 是刺激輔助和細胞毒性T細胞(CTL)生長、自然殺傷(NK)細胞、淋巴因子活化的殺傷細胞、 單核細胞和巨噬細胞。已知IL-2在抗原特異性免疫應答的起始和維持中起重要作用，并且 已顯示其增強由數(shù)種DNA疫苗誘導的免疫應答。機制看起來是DCs中的⑶48和⑶80表達 上調以及其在⑶8+T細胞上各自的配體⑶2和⑶28的上調(參見Toka)。IL-12 人IL-12是由2個亞單位p35和p40組成的異二聚體。它是由巨噬細胞和 DCs響應病原體感染而產生的促炎細胞因子，并且誘導IFN- γ產生。這種細胞因子支持Thl 超過Th2細胞的分化，并且使先天性抗性與適應性免疫連接。在用基于DNA的HCV疫苗免 疫接種的小鼠中，IL-12DNA的遞送改善CTL應答和核_rVV的清除。
IL-15 :IL_15是以多效性和多功能方式起作用的14kDa糖蛋白。它由廣泛多樣的 細胞表達，包括單核細胞、巨噬細胞、DCs、枯否細胞、肝細胞和內皮細胞。它具有與IL-2共 同的許多生物活性，因為2種細胞因子使用相同的受體組分。IL-15可以增強NK細胞的細 胞裂解活性和CTL，并且誘導來自NK和T細胞的IFN- γ產生。此外，當誘導抗病毒⑶8+記 憶T細胞應答時，它誘導CD8+記憶和效應T細胞的增殖，使得它成為用于包括作為佐劑的 吸引人的候選物。在示例性實施方案中，陽離子脂質體包括單鏈轉鐵蛋白受體抗體，含或不含HK肽 (scL 或 scLHK)以及表達 HCV 基因組的 NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和 NS5B (NS3-NS5B)部分的一 種或多種質粒(scL-HCV或scLHK-HCV)。然而，應當指出，如自始至終描述的，表達任何一種 或多種病毒蛋白質的任何核酸分子都可以與本發(fā)明的脂質體一起封裝/結合。在疫苗接種的首次用于實驗的黑猩猩中的結果表明，全身性scL-HCV方法(包括表達作為佐劑的IL-12的質粒DNA，且用重組腺病毒加強)可以觸發(fā)HCV特異性免疫應答。 HCV復制在攻擊后顯著抑制并且與HCV特異性T細胞應答相關。在評估T細胞應答的小 鼠細胞免疫實驗中，在接種后用表達HCV NS3蛋白質的重組痘苗病毒的“攻擊”還顯示在 scL-HCV/IL組中病毒復制的抑制，這些結果支持這種方法用于預防疫苗接種以誘導針對病 毒抗原的免疫應答的用途。在一個示例性實施方案中，本發(fā)明提供了制備配體靶向的(例如，蛋白質/肽、抗 體或抗體片段靶向的)陽離子脂質體復合物的方法。在合適的實施方案中，此種方法包括 制備配體(例如，蛋白質/肽、抗體或抗體片段)，并且使配體與陽離子脂質體混合，以形成 配體靶向的陽離子脂質體，其中配體與陽離子脂質體直接結合/復合，但不化學綴合。配體 靶向的陽離子脂質體隨后與編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分子、和編碼一 種或多種白介素的一種或多種核酸分子混合，以形成配體靶向的陽離子脂質體復合物。在 另一個示例性實施方案中，本發(fā)明提供了制備配體靶向的(例如，蛋白質/肽、抗體或抗體 片段靶向的)陽離子脂質體復合物的方法。在合適的實施方案中，此種方法包括制備配體 (例如，蛋白質/肽、抗體或抗體片段)，并且使配體與陽離子脂質體混合，以形成配體靶向 的陽離子脂質體，其中配體經由化學綴合與陽離子脂質體直接復合。配體靶向的陽離子脂 質體隨后與編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分子、和/或編碼一種或多種白 介素的一種或多種核酸分子混合，以形成配體靶向的陽離子脂質體復合物。如本文所描述的，通過在加工過程中使一種或多種核酸分子與脂質體簡單混合， 核酸分子適當?shù)赜帽景l(fā)明的脂質體復合物封裝、包含或復合/結合。核酸分子脂質體復 合物的合適比由普通技術人員容易地確定。在示例性實施方案中，核酸以約1摩爾編碼一 種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分子比約1摩爾編碼一種或多種白介素的一種或 多種核酸分子的摩爾比存在。例如，編碼一種或多種病毒蛋白質的核酸分子與編碼一種或 多種白介素的核酸分子以約0. 1 10至約10 0.1、適當?shù)丶s0.5 1至約2 1、和更 適當?shù)丶s1 1范圍中的摩爾比混合在一起，以形成核酸溶液，例如，在與脂質體復合前，盡 管也可以使用在這些范圍外的另外的摩爾比。在其他實施方案中，核酸分子可以分開地與 脂質體復合(即，在不同溶液中)，同時仍維持所需摩爾比。適當?shù)?，核酸分子與脂質體復合物的摩爾比在約0.5 1至約1 40(yg總核 酸Pg脂質體)、適當?shù)丶s1 5至約1 20(yg總核酸yg脂質體)、更適當?shù)丶s1 10(yg總核酸yg脂質體)范圍中。如本文所使用的，核酸分子與脂質體復合物的 摩爾比包括兩種核酸“群體”，即核酸總量包括編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核 酸分子、和編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子。如自始至終描述的，用于遞送核酸分子的所需陽離子脂質體的例子包括包含二油 酰基三甲基磷酸銨(DOTAP)與二油?；字Ｒ掖及?DOPE)和/或膽固醇(chol)的混合 物；和雙十八烷基二甲基溴化銨(DDAB)與DOPE和/或膽固醇的混合物的那些。可以改變 脂質的比例以對于特定靶細胞類型最佳化核酸分子的攝取效率。脂質體可以包含一種或多 種陽離子脂質和一種或多種中性或輔助脂質的混合物。一種或多種陽離子脂質與一種或多 種中性或輔助脂質的所需比為約1 (0.5-3)，優(yōu)選1 (1_2)(摩爾比)。在本發(fā)明的實 踐中有用的各種脂質的比的例子包括但不限于LipA D0TAP/D0PE1 1 摩爾比LipB DDAB/D0PE1 1 摩爾比LipC DDAB/D0PE1 2 摩爾比LipD DOTAP/Chol1 1 摩爾比LipE DDAB/Chol1 1 摩爾比LipG DOTAP/DOPE/Chol 2:1: 1 摩爾比LipH DDAB/DOPE/Chol 2:1: 1 摩爾比(D0TAP = 二油酰基三甲基磷酸銨，DDAB =雙十八烷基二甲基溴化銨；DOPE = 二油 ?；字Ｒ掖及?；chol =膽固醇)。如自始至終討論的，在合適的實施方案中，在本發(fā)明的組合物和方法中使用的配 體是抗體片段，例如單鏈Fv片段，例如抗轉鐵蛋白受體單鏈Fv(TfRscFv)。適當?shù)?，抗體或 抗體片段與陽離子脂質體以在約1 1至約1 100、適當?shù)丶s1 10至約1 50(w W)、 更適當?shù)丶s1 30或約1 33(抗體或抗體片段脂質)范圍中的比混合，以形成靶向的 陽離子免疫脂質體。在另外的實施方案中，脂質體還可以包含與脂質體結合的內體破裂肽， 例如由 Sigma-Genosys (The Woodlands, TX)制造的 K[K(H)KKK] 5_K(H)KKC(HoKC) (HK) (SEQ ID N0:1)肽。內體破裂肽HoKC可以幫助試劑在細胞的細胞質中釋放。在示例性實施方案中，陽離子脂質體制劑A(以1 1摩爾比的DOTAP DOPE)、 Β(以 ι IWDDAB DOPE)、G(以 ι ι ι 的dotap DOPE 膽固醇)禾口Η(以 Ι Ι Ι 的DDAB DOPE 膽固醇)或自始至終討論的任何脂質制劑，使用如本文所描述的乙醇注 射法進行制備。每種脂質體制劑還適當?shù)匕ㄒ钥傊|的5摩爾百分比的MPB-D0PE。因 為HoKC肽(K [K (H) KKIC5-K(H) KKC)攜帶末端半胱氨酸，所以MPB-DOPE包括在所有脂質體 組合物中，以允許肽與脂質體綴合。Lip-HoKC脂質體使用攜帶馬來酰亞胺基團的陽離子脂 質體(Lip-MPB)和肽之間的偶聯(lián)反應進行制備。將在半胱氨酸上具有游離巰基的0. Immol 肽等分試樣加入溶于IOmM HEPES, pH 7.4溶液中的2讓01 Lip-MPB，并且在室溫下旋轉 (20-30r. p. m.) 2小時。所得到的Lip-HoKC具有1. 4mM的脂質濃度。 完全復合物以與用于產生不含HoKC的TfRscFv Lip DNA復合物等同的方 式形成。此處，還通過輕輕倒轉以特定比使抗轉鐵蛋白受體單鏈抗體片段(TfRscFv)與 Lip-HoKC混合，并且在室溫下溫育10分鐘。隨后將DNA加入TfRscFv Lip-HoKC溶液中， 通過輕輕倒轉混合，并且再次在室溫下溫育15分鐘，這之后加入右旋糖或蔗糖至5-10%的終濃度，并且再次通過輕輕倒轉混合。關于TfRscFv Lip-HoKC DNA復合物的合適比是 0.3mg 7nmol Img0在另外的實施方案中，本發(fā)明的方法包括制備配體(例如，蛋白質/肽、抗體或抗 體片段)，并且使配體與陽離子脂質體的表面化學綴合，以形成陽離子免疫脂質體。陽離子 脂質體隨后與編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分子、和編碼一種或多種白介 素的一種或多種核酸分子混合，以形成配體靶向的脂質體復合物。用于使配體(例如，蛋白 質/肽、抗體或抗體片段)與陽離子脂質體化學綴合的示例性方法、組合物、比和條件公開 于2001年10月1日提交的美國專利申請?zhí)?9/914，046，其公開內容通過引用整體合并入 本文。用于在本發(fā)明的實踐中使用的示例性核酸分子包括DNA和RNA，包括質粒和載體。 編碼一種或多種病毒蛋白質的核酸分子可以編碼任何病毒蛋白質。如本文所使用的，術語 “蛋白質”、“肽”和“多肽”可互換用于意指2個或更多個氨基酸的任何一條或多條鏈，并且 不指特定長度的產物。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白質”、“氨基酸鏈”或用于指2個或 更多個氨基酸的一條或多條鏈的任何其他術語，包括在術語“蛋白質”、“多肽”和“肽”的定 義內。可以由使用本發(fā)明遞送的核酸編碼的病毒肽/蛋白質的例子包括病毒病原體(例如，流感、HIV、埃博拉、痘病毒(天花)、西尼羅病毒、SARS等)等?？梢杂杀景l(fā)明中利用的 核酸編碼的病毒蛋白質的另外例子包括但不限于，腺病毒多肽，甲病毒多肽，杯狀病毒多肽 例如杯狀病毒衣殼抗原，冠狀病毒多肽，溫熱病病毒多肽，埃博拉病毒多肽，腸病毒多肽，黃 病毒多肽例如西尼羅病毒E糖蛋白，肝炎病毒(AE)多肽例如甲型肝炎、乙型肝炎和/或丙 型肝炎，皰疹病毒多肽例如單純皰疹病毒或水痘帶狀皰疹病毒糖蛋白，免疫缺陷病毒多肽 例如人免疫缺陷病毒包膜或蛋白酶，感染性腹膜炎病毒多肽，流感病毒多肽例如A型流感 多肽例如血凝素或胞外M2蛋白質(M2e)、神經氨酸酶或核蛋白，白血病病毒多肽，馬爾堡病 毒多肽，正粘病毒多肽，乳頭狀瘤病毒多肽，拉沙熱多肽，副流感病毒多肽例如血凝素/神 經氨酸酶，副粘病毒多肽，細小病毒多肽，瘟病毒多肽，細小RNA病毒多肽例如脊髓灰質炎 病毒衣殼多肽，痘病毒多肽例如痘苗病毒多肽(例如，天花)，狂犬病病毒多肽例如狂犬病 病毒糖蛋白G，呼腸病毒多肽，逆轉錄病毒多肽和輪狀病毒多肽。編碼此種病毒蛋白質的核 酸分子是本領域可獲得的，包括包含此種核酸分子的載體和質粒。例如，公共數(shù)據(jù)庫例如 GENBANK 包含可以在本發(fā)明的實踐中利用的核酸分子的各種例子。編碼一種或多種白介素的核酸分子也是本領域眾所周知的，并且可從公共數(shù)據(jù)庫 例如GENBANK 中容易獲得?？梢杂杀景l(fā)明實踐中有用的核酸分子編碼的示例性白介素 包括但不限于，IL-l、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、 IL-15、IL-17、IL-18和IL-23。在合適的實施方案中，核酸編碼IL_2、IL-12或IL-15。本發(fā)明還提供了根據(jù)自始至終描述的方法制備的陽離子免疫脂質體復合物。例 如，本發(fā)明提供了配體靶向的(例如，蛋白質/肽、抗體或抗體片段靶向的)陽離子脂質體 復合物，其包含陽離子脂質體、配體(例如，蛋白質/肽、抗體或抗體片段)、編碼一種或多種 病毒蛋白質的一種或多種核酸分子、和編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子，其 中配體與陽離子脂質體直接復合/結合，但不化學綴合。配體(例如，蛋白質/肽、抗體或 抗體片段)經由在配體和脂質體之間的相互作用(例如，靜電、范德華或其他非化學綴合的相互作用)與脂質體適當?shù)亟Y合。一般而言，當非化學綴合時，接頭或間隔分子(例如，聚 合物或其他分子)不用于使配體和脂質體附著。如本文所描述的，在另外的實施方案中，配體(例如，蛋白質/肽、抗體或抗體片 段)與陽離子脂質體化學綴合，例如經由在包含馬來酰亞胺基團或其他巰基反應基團的陽 離子脂質體和配體(例如，蛋白質/肽、抗體或抗體片段)上的硫原子之間的化學相互作 用。隨后將核酸加入脂質體中，以形成脂質體-DNA復合物，或可以首先加入核酸，并且隨后 與配體復合。此種方法公開于2001年10月1日提交的美國專利申請?zhí)?9/914，046中，其 公開內容通過引用整體合并入本文。包含核酸的轉鐵蛋白(Tf)綴合的脂質體(Tf-Lip-DNA)根據(jù)先前描述的配制方法(Xu,等人，“Transferrin-Iiposome-mediatedsystemic p53 gene therapy in combination with radiation resultsin regression of human head and neck cancer xenografts, “ HumGene Ther. 10(18) :2941_2952· (1999)，其公開內容通過引用整體合并 入本文)進行制備。與輻射組合的轉鐵蛋白-脂質體介導的全身性Ρ53基因療法導致人頭 與頸癌異種移植物的消退。簡言之，對于合適的制備，使25ml Tf(5mg/ml，鐵飽和的全-轉 鐵蛋白；Sigma, St. Louis, MO)和50ml Lip (2mM總脂質)加上75ml水在聚丙烯管中混合， 并且在室溫下溫育5-15分鐘，伴隨頻繁搖動。將在120ml 20mM HEPES緩沖液，pH 7. 4中的 10微克質粒DNA加入管中，立即且充分混合，并且在室溫下溫育20分鐘，伴隨頻繁搖動。隨 后將30微升50%右旋糖溶液加入管中。最終DNA 脂質Tf比為約1 10 12.5(mg/ nmol/mg)。在另外的實施方案中，HEPES緩沖液可以由水替換。核酸分子可以封裝在陽離子脂質體內，包含在陽離子脂質體的烴鏈區(qū)域內，與陽 離子脂質體的內部或外部單層(例如，首基區(qū)域)結合，或其任何組合。適當?shù)?，本發(fā)明的 陽離子免疫脂質體是單層脂質體(即，單個雙層)，盡管也可以使用包含數(shù)個同心雙層的多 層脂質體。本發(fā)明的單個雙層陽離子脂質體包含其中可以封裝核酸分子的內部水容積。它 們還包含具有烴鏈區(qū)域(即，脂質的脂質鏈區(qū)域)的單個雙層，其中可以包含已是中性或大 部分不帶電的核酸分子。此外，核酸分子可以與脂質體膜的任一或兩個，內部單層和/或外 部單層(即，脂質的首基區(qū)域)復合或結合，例如經由帶負電核酸分子和帶正電陽離子脂質 體之間的電荷-電荷相互作用。在進一步的實施方案中，核酸分子可以在本發(fā)明的陽離子 脂質體復合物的任何或所有這些區(qū)域中封裝/結合/復合。如自始至終討論的，適當?shù)睾怂岱肿右约s0. 1摩爾編碼一種或多種病毒蛋白質的 一種或多種核酸分子比約10摩爾編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子；至10摩 爾編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分子比約0.1摩爾編碼一種或多種白介 素的一種或多種核酸分子的摩爾比存在；特別地，約1摩爾編碼一種或多種病毒蛋白質的 一種或多種核酸分子比約1摩爾編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子可以在脂 質體復合物中使用。自始至終還描述了脂質、靶向性配體和核酸分子的合適量/比。在示例 性實施方案中，編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分子、編碼一種或多種白介 素的一種或多種核酸分子、和脂質體，以約0.5 1至約1 40(yg總核酸yg脂質)、適 當?shù)丶s1 5至約1 20(yg總核酸“8脂質)，例如約1 10(yg總核酸yg脂質) 的重量比存在。本發(fā)明的示例性脂質體組合物包括以約1 10 0.33(yg總核酸yg 脂質μ g單鏈抗體)重量比的總核酸、脂質和配體，例如單鏈抗體(例如，TfRscFv)。
可以由在本發(fā)明的陽離子脂質體中利用的核酸分子編碼的示例性病毒蛋白質包括自始至終討論的那些，例如，HIV病毒蛋白質，流感病毒蛋白質，SARS病毒蛋白質，甲型、 乙型和/或丙型肝炎病毒蛋白質，禽流感病毒蛋白質和天花病毒蛋白質，以及其他?？梢杂?在本發(fā)明的陽離子脂質體中利用的核酸分子編碼的示例性白介素包括自始至終描述的那 些，包括 IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、 IL-17、IL-18 和 IL-23,并且適當?shù)兀琁L-2、IL-12 和 IL-15。在示例性實施方案中，將用于在本發(fā)明的實踐中使用的編碼病毒蛋白質和/或白 介素的核酸置于核酸啟動子，例如，如美國公開專利申請?zhí)?007/0065432中描述的啟動子 下游。本發(fā)明還提供了包含自始至終描述的配體靶向的陽離子脂質體復合物的藥物組 合物。在合適的實施方案中，藥物組合物進一步包括選自下述的一種或多種賦形劑一種或 多種抗菌劑(例如，兩性霉素B、金霉素、慶大霉素、新霉素)、一種或多種防腐劑(例如，芐 索氯銨、EDTA、甲醛、2-苯氧乙醇)、一種或多種緩沖劑(例如，磷酸鹽緩沖劑、硼酸鈉、氯化 鈉)、一種或多種表面活性劑(聚山梨醇酯20、80)、一種或多種蛋白質穩(wěn)定劑(例如，白蛋 白、乳糖、谷氨酸鉀)、糖例如蔗糖或右旋糖、和佐劑(例如，氫氧化鋁、磷酸鋁)。另外的賦 形劑是本領域眾所周知的，并且可以容易地在本發(fā)明的實踐中使用。本發(fā)明還提供了包括第一配體靶向的陽離子脂質體復合物的藥物組合物，所述復 合物包括陽離子脂質體、配體(例如，蛋白質/肽、抗體或抗體片段)、和編碼一種或多種病 毒蛋白質的一種或多種核酸分子，其中配體與陽離子脂質體直接復合/結合，但不化學綴 合。在進一步的實施方案中，配體可以與陽離子脂質體化學綴合。藥物組合物還適當?shù)匕?括第二配體靶向的陽離子脂質體復合物，所述復合物包括陽離子脂質體、配體(例如，蛋白 質/肽、抗體或抗體片段)、和編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子，其中配體與 陽離子脂質體直接復合/結合，但不化學綴合。在進一步的實施方案中，配體可以與陽離子 脂質體化學綴合。在特定的此種實施方案中，編碼一種或多種病毒蛋白質的核酸分子在與編碼一種 或多種白介素的核酸相同的組合物中遞送，而不是與相同陽離子脂質體封裝/結合，它們 與2種(或更多種)不同陽離子脂質體結合，并且隨后在相同組合物(即，2種不同脂質體 群體混合在一起)中遞送。在其他實施方案中，編碼一種或多種病毒蛋白質和編碼一種或 多種白介素的核酸分子可以一起包含在相同質粒載體內。本發(fā)明還包含給哺乳動物施用2 種分開的免疫脂質體組合物，一種包含編碼病毒蛋白質的核酸，并且一種包含編碼白介素 的核酸。自始至終描述了本發(fā)明的藥物組合物使用的合適脂質、靶向性分子和核酸分子的 例子、以及此種組分的比。本發(fā)明還提供了將一種或多種活性劑遞送給哺乳動物的抗原呈遞細胞(APCs) 的方法。在合適的實施方案中，此種方法包括給哺乳動物施用抗轉鐵蛋白受體單鏈 Fv(TfRscFv)靶向的陽離子免疫脂質體復合物，其包括陽離子脂質體、TfRscFv和一種或多 種活性劑，其中TfRscFv與陽離子脂質體直接復合/結合，但不化學綴合。在進一步的實施 方案中，TfRscFv與陽離子脂質體化學綴合。本發(fā)明的此種方法可以用于將試劑遞送給在機 體的任何器官或組織中的APCs，例如肝、淋巴結、腸和/或呼吸道中的APCs。適當?shù)兀珹PCs 可以是例如專業(yè)或非專業(yè)APCs?！皩I(yè)APCs”指在其表面上表達MHCII類分子的那些。
在合適的實施方案中，遞送的試劑是核酸分子，盡管也可以遞送其他試劑，例如化學試劑，包括小分子，以及肽和蛋白質。試劑可以遞送給專業(yè)以及非專業(yè)APCs，包括位于肝、 脾、淋巴結、腸和/或呼吸道中的APCs。在示例性實施方案中，遞送的試劑編碼一種或多種 病毒蛋白質(例如，HIV病毒蛋白質、埃博拉病毒蛋白質、流感病毒蛋白質、SARS病毒蛋白 質、禽流感病毒蛋白質或天花病毒蛋白質)和/或一種或多種白介素(例如，IL-1、IL-2、 IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18 或 IL-23)。在進一步的實施方案中，本發(fā)明提供了在哺乳動物中誘導針對病毒抗原的免疫應答的方法，其包括給哺乳動物施用配體靶向的陽離子脂質體復合物。在合適的實施方案中， 陽離子脂質體復合物包括陽離子脂質體；與陽離子脂質體直接復合/結合但不化學綴合的 配體；與陽離子脂質體結合的編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分子；和與陽 離子脂質體結合的編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子。在進一步的實施方案 中，配體與陽離子脂質體化學綴合，例如，通過配體上(例如，在抗體或抗體片段上)的硫基 團和脂質體上的基團例如馬來酰亞胺基團之間的化學綴合。自始至終描述了示例性配體， 并且包括但不限于半乳糖、L-37pA、抗體和抗體片段(例如，scFv抗體片段例如抗轉鐵蛋白 受體單鏈 Fv (TfRscFv))。如本文所使用的，“誘導針對病毒抗原的免疫應答”指通過其觸發(fā)哺乳動物(例如 任何哺乳動物，例如人)的免疫系統(tǒng)，以鑒定且去除或以其他方式響應病毒抗原的存在的 過程?？乖ㄒ疳槍ζ涞目贵w產生的任何病毒物質。通過誘導針對一種或多種特定病 毒抗原的免疫應答，哺乳動物從而接種疫苗，并且通過抗原的任何進一步妥協(xié)將導致抗原 的應答/清除。可以產生針對其的免疫應答的病毒抗原例子包括本領域已知的任何病毒抗原，包括自始至終描述的那些，例如與肝炎(甲型、乙型或丙型)病毒、流感病毒、HIV病毒、埃博 拉病毒、SARS病毒、禽流感病毒、天花病毒等相關的抗原。陽離子脂質體靶向APCs的能力 使得核酸分子能夠直接且有效地遞送給參與引發(fā)免疫應答的細胞，從而提供在哺乳動物中 誘導針對病毒抗原的免疫應答的非常有效和有力的方法。自始至終描述了可以由在本發(fā)明的治療方法中利用的核酸分子表達的合適病毒蛋白質，并且包括但不限于HIV病毒蛋白質、埃博拉病毒蛋白質、流感病毒蛋白質、SARS病 毒蛋白質、禽流感病毒蛋白質和天花病毒蛋白質?？梢杂珊怂岱肿泳幋a的示例性白介素包 括自始至終描述的那些，例如 IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、 IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18和IL-23。在示例性實施方案中，在本發(fā)明的各種方法 中遞送的配體靶向的陽離子脂質體進一步包括這樣的肽，所述肽包括與陽離子脂質體結合 的 K [K (H) KKK] 5-K (H) KKC (HoKC) (SEQ ID NO 1)肽。在另外的實施方案中，本發(fā)明提供了治療或預防哺乳動物中的病毒疾病的方法。 適當?shù)?，該方法包括給哺乳動物施用陽離子脂質體復合物，其中陽離子脂質體復合物包括 陽離子脂質體；與陽離子脂質體直接復合但不化學綴合的配體；與陽離子脂質體結合的編 碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分子；和與陽離子脂質體結合的編碼一種或多 種白介素的一種或多種核酸分子。施用方法包括但不限于，靜脈內(IV)、瘤內(IT)、損傷內 (IL)、氣溶膠、透皮、經口、內窺鏡、局部、肌內(IM)、皮內(ID)、眼內(10)、腹膜內(IP)、經皮(TD)、鼻內(IN)、大腦內(IC)、器官內(例如，肝內)、緩慢釋放埋植劑或皮下施用，或經由使 用滲透或機械泵的施用。它們可以作為推注或作為輸注進行施用。在另外的實施方案中， 配體可以使用本文描述的各種方法或本領域已知的其他方法與陽離子脂質體化學綴合?？梢允褂帽景l(fā)明的方法治療或預防的病毒疾病例子包括本領域已知的任何病毒疾病，包括但不限于，自始至終描述的那些，例如肝炎(甲型、乙型或丙型)、流感、HIV、埃博 拉、SARS、禽流感、天花等。因此，除在哺乳動物中誘導針對病毒抗原的免疫應答外，本發(fā)明 還提供了治療或預防哺乳動物中的病毒疾病的方法。這包括已在近期時間段(例如，小于 約1年、適當?shù)匦∮诩s6個月或小于約1個月)內感染的哺乳動物，以及具有慢性感染的哺 乳動物(例如，已感染例如1年或更久的哺乳動物)。自始至終描述了用于在本發(fā)明的治療或預防方法中使用的示例性配體，并且包 括，各種肽和蛋白質，例如轉鐵蛋白、半乳糖、L-37PA、抗體和抗體片段(例如單鏈Fv抗體片 段，例如抗轉鐵蛋白受體單鏈Fv(TfRscFv))。自始至終描述了可以由核酸分子編碼的示例 性病毒蛋白質和白介素，所述核酸分子使用本發(fā)明的各種治療和預防方法遞送。在示例性 實施方案中，在本發(fā)明的各種治療和預防方法中遞送的配體靶向的陽離子脂質體進一步包 括這樣的肽，所述肽包括與陽離子脂質體結合的K[K (H) KKIC5-K(H) KKC(HoKC) (SEQ ID NO 1)肽。本發(fā)明還提供了在哺乳動物中誘導針對病毒抗原的免疫應答的方法，其包括給哺 乳動物施用通過自始至終描述的各種方法制備的配體靶向的陽離子脂質體復合物。此外， 治療或預防哺乳動物中的病毒疾病的方法包括給哺乳動物施用通過本發(fā)明的各種方法/ 過程制備的配體靶向的陽離子脂質體復合物。自始至終描述了用于在這些方法中使用的合 適配體、脂質體和核酸。在本發(fā)明的各種治療/預防方法中(包括誘導免疫應答和治療或預防病毒疾病， 以及遞送給APCs)，本發(fā)明的各種脂質體復合物可以經由任何所需途徑施用。示例性遞送途 徑包括但不限于，靜脈內、經口、局部、經由吸入、肌內注射、瘤內注射、皮內注射、經皮注射、 皮下注射、腹膜內注射、鼻內注射、眼內注射或滴劑、顱內注射、器官內施用(例如肝內)或 其他途徑，例如緩慢釋放埋植劑或經由滲透或機械泵。它們可以作為推注或作為輸注進行 施用。本發(fā)明還提供了包括本發(fā)明的各種配體靶向的陽離子脂質體復合物的藥物組合 物。本發(fā)明的藥物組合物還可以進一步包括一種或多種賦形劑，例如一種或多種抗菌劑、一 種或多種防腐劑、一種或多種緩沖劑和/或一種或多種表面活性劑。在另外的實施方案中，本發(fā)明還提供了包含2種或更多種配體靶向的陽離子脂質 體復合物的藥物組合物。例如，組合物可以包括第一配體靶向的陽離子脂質體復合物，其包 括陽離子脂質體、配體和編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分子。在合適的實 施方案中，配體與陽離子脂質體直接復合，但不化學綴合。在其他實施方案中，配體與陽離 子脂質體化學綴合。組合物可以進一步包括第二配體靶向的陽離子脂質體復合物，其包括陽離子脂質 體、配體和編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子。適當?shù)?，配體與所述陽離子脂質 體直接復合，但不化學綴合，而在其他實施方案中，配體與陽離子脂質體化學綴合。雖然下文闡述的實施例描述了用于遞送丙型肝炎病毒(HCV)蛋白質的免疫脂質體復合物的產生，以及HCV感染的哺乳動物的預防性疫苗接種/治療，但應當理解編碼任何病毒蛋白質的核酸分子都可以在本發(fā)明的各種方法中利用，并且在自始至終描述的免疫脂 質體復合物中結合/封裝。由核酸分子編碼的最終病毒蛋白質對形成本發(fā)明的免疫脂質體 復合物的能力沒有影響。簡單地，核酸分子的負電荷看起來允許核酸分子在陽離子免疫脂 質體中結合/封裝。因此，本發(fā)明并不限于HCV蛋白質的遞送，并且相反，包括編碼任何病 毒蛋白質和/或任何一種或多種白介素的任何核酸(例如，質粒、載體)的遞送。此外，編碼不同病毒蛋白質的數(shù)種不同核酸可以與免疫脂質體復合物一起封裝/ 結合，并且，本發(fā)明因此提供了用于疫苗接種/治療廣泛多樣的病毒感染的復合物和方法， 所述復合物和方法使用單個脂質體系統(tǒng)，或使用多個不同的脂質體復合物。對于相關領域中的普通技術人員顯而易見的是，無需背離本發(fā)明的范圍或其任何 實施方案，即可對本文描述的方法和應用進行其他合適的修飾和改變。目前已詳細描述了 本發(fā)明，這通過參考下述實施例將更容易理解，所述實施例僅用于舉例說明的目的并且不 希望是本發(fā)明的限制。實施例1基于陽離子脂質體的丙型肝炎病毒(HCV)疫苗接種和治療系統(tǒng)的制備和使用與在黑猩猩中天然感染不誘導不受HCV再感染的保護(Farci P.，等人，Science 258 140 (1992) ；Prince A.M.，等人，J. Infect. Dis.，165 :438_443 (1992))的先前想法形 成對比，目前顯而易見的是盡管再感染的確發(fā)生，但在恢復的人和黑猩猩中存在導致再感 染后病毒復制的立即控制和快速清除的記憶免疫應答。從HCV自發(fā)恢復后，靜止HCV特 異性記憶T細胞可以數(shù)十年地在外周血中檢測出，在許多情況下不存在可檢測的HCV抗 體(Takaki A.，等人，Nat. Med.，6 :578_582 (2000))。HCV特異性細胞免疫應答也在肝中 持續(xù)，如在恢復的黑猩猩中證實的，并且介導對再感染的保護性免疫(參見例如，Bassett S.E.，等人，Hepatology, 33 :479_1487 (2001))。與初次感染比較，二次感染具有短持續(xù) 時間且在血液和肝中具有減少的病毒滴度，并且減少肝炎癥，如通過丙氨酸氨基轉移酶 水平(ALT)指示的(Bassset等人)?；颊哐芯勘砻?，類似的記憶應答也在先前暴露后的 人中存在，所述記憶應答可以快速控制且清除HCV感染(MehtaS.H.，等人，Lancet, 359 1478-1483(2002))。如自始至終描述的，本發(fā)明提供了基于T細胞的疫苗，其集中于HCV的 非結構蛋白質，且有效遞送給APCs (包括但不限于在肝中的那些)用于預防和治療。肝是 HCV復制的主要位點，并且因此在肝中免疫應答的誘導模擬在天然感染過程中誘導的免疫 應答，并且在攻擊后導致保護或病毒的快速清除。丙型肝炎病毒(HCV)是具有單鏈、正義RNA基因組的包膜病毒。RNA長度是 9. 6kb，并且由 341個堿基的5'非翻譯區(qū)(NTR)、編碼所有病毒特異性蛋白質的長開放讀 碼框( 3011個氨基酸)和3' NTR組成?；蚪MRNA的翻譯不依賴于帽，并且由充當內 部核糖體進入位點的5' NTR介導。所得到的多聚蛋白通過2種宿主和2種病毒蛋白酶進 行共翻譯和翻譯后切割，以產生下述產物NH2-C-El-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5 B-C00H。結構蛋白質(C、E1和E2)位于N末端；非結構(NS)組分在其余部分中編碼(關于 綜述參見(Major Μ. Ε.，等人，Hepatitis C Viruses. In =FieldsVirology, Knipe D. Μ.和 Howley P.M.(編輯)，Lippincott, ffilliams& Wilkins，第 1127-1161 頁(2001)，其公開 內容通過引用整體合并入本文)。與所有RNA病毒一樣，HCV RNA復制是易錯的，導致變體的連續(xù)產生。此種變體提供可以快速適應選擇壓力例如由免疫應答施加的壓力的庫或“準 種”。這種變異性可能對于HCV存活和進化是重要的，但它也使得關于HCV分子生物學、發(fā) 病機理、免疫應答和最終疫苗開發(fā)的精確研究變得困難。HCV的傳播一般通過腸胃外途徑，但也的確發(fā)生粘膜傳播，例如性和母嬰傳播。在 慢性丙型肝炎的治療中已取得顯著進展。用聚乙二醇化IFN-α和利巴韋林的目前療法在 約50%病例中清除HCV感染，但治療仍是非常昂貴的，需要6-12個月的治療，并且攜帶嚴重 副作用的顯著危險。預防疫苗在美國和全世界對于HCV相關疾病的最后控制是重要的。還 需要免疫方法以進行治療。盡管具有嵌合人肝的SCID小鼠模型的開發(fā)，但黑猩猩仍是唯一建立的關于HCV感 染的動物模型(在Grakoui A.，等人，H印atoiogy，33 :489_495 (2001)中綜述)。因此，它 是其中可以施用實驗疫苗并且評估其有效性的唯一模型。參與黑猩猩免疫系統(tǒng)的許多蛋 白質與人直向同源物等同或非常緊密相關，從而使得檢測所需的試劑是可互換的。由于極 端的成本，不可能在黑猩猩中測試所有有希望的HCV疫苗方法。迄今為止的疫苗研究已使 用正常免疫能力小鼠以測試許多免疫接種策略(參見例如，F(xiàn)orns X.，等人，Vaccine, 17 1992-2002(1999))。表達人I類MHC分子的轉基因小鼠已用于特異性HCV表位分析和替代 保護系統(tǒng)(Qiao Μ.，等人，Hepatology, 37 :52_59 (2003))。迄今的疫苗策略已基于重組蛋 白質、病毒載體、病毒樣顆粒和基于DNA的免疫接種。存在急性感染的清除中涉及針對HCV NS3的免疫應答的強烈支持(Di印older H. Μ.，等人，J. Virol，71 :6011-6019 (1997))。這種 抗原目前視為任何HCV T細胞疫苗的重要組分。報告已指出在表達NS3蛋白質的構建體中 包括NS4A在小鼠中導致更佳的表達和改善的免疫應答(Frelin L.，等人，Gene Ther. , 10 686-699 (2003))。也已鑒定廣泛的多特異性T細胞應答在HCV感染的清除中是重要的，因 此NS5A和NS5B蛋白質將是重要的T細胞疫苗組分。HCV與美國40-60%的慢性肝病相關。在這些患者中，三分之一繼續(xù)發(fā)展進行性 纖維化和肝硬化(Liang Τ. J.，等人，· Ann. Intern. Med.，132 :296_305 (2000))。丙型肝炎 目前已取代乙型肝炎成為日本的肝細胞癌(HCC)主因，并且根據(jù)⑶C，每年僅在美國就存在 8，000-10，000例由于HCV相關肝硬化和癌癥的死亡。HCV相關HCC的機制未知。主要假定 它由經過多年感染的慢性免疫介導的肝細胞損傷和再生誘導。HCV核心基因產物已顯示與 許多細胞蛋白質相互作用。它包含核定位信號，具有RNA結合活性，并且已顯示在細胞中執(zhí) 行多種功能，例如反式激活和阻遏(Matsumoto M.，等人，J.Virol, 71 1301-1309 (1997))。 鑒定HCV核心的反式激活子或阻遏子功能的這些研究已使用比生物水平高數(shù)個數(shù)量級的 體外表達水平。然而，此種蛋白質以低水平表達數(shù)十年可能在受感染細胞中導致不利事件， 這可能對HCC進展起作用。對抗HCC的最佳方法是通過預防、早期檢測和更佳治療。因此， 通過預防丙型肝炎病毒感染，還可以預防HCC。關于HCV復制的主要儲庫被認為是肝，與受感染個體中的肝病理學一致，盡管仍未鑒定支持HCV復制的特定細胞類型。正常肝在介導免疫應答中起重要作用。與大多數(shù)器 官不同，存在抗原在肝中的呈遞可以導致幼稚T細胞激活的證據(jù)(Bertolino P.，等人，Cell Biol,80 :84-92(2002))。在進入肝后，血液中的抗原首先與竇狀細胞群體——肝竇狀上皮 細胞(LSEC)和枯否細胞接觸。抗原遞送給肝導致T細胞的局部激活(可能通過上述2種 細胞，這兩者已顯示充當抗原呈遞細胞)?？乖诟沃械某蔬f可以導致T細胞初敏或T細胞耐受。與陽離子免疫脂質體用于癌癥治療和腫瘤靶向的用途(如在美國公開專利申請 號2003/0044407和美國專利申請?zhí)?1/520，796中)相反，呈現(xiàn)的實施例利用TfRscFv-脂 質體(包括或不包括HK肽)復合物，以將待有效攝取的表達HCV蛋白質的DNA(受體介導 的內吞作用和增強的內體釋放)和呈遞的抗原遞送給T細胞，無論它們存在于機體內何處 (包括在肝中)。TfRscFv的存在提供了受體介導的內吞作用，以使陽離子脂質體復合物有效移動 到細胞內，同時HK肽增強(盡管不是必需的)DNA內體釋放到細胞質內。已執(zhí)行在體外使用數(shù)種脂質體復合物以測定在體內用于肝細胞的最合適制劑的 比較研究。測試了 2種肝細胞特異性配體——半乳糖(GAL)(與去唾液酸糖蛋白受體結合) 和L-37pA (與清道夫受體SR-Bl——關于HCV的假定受體結合)。這些與未修飾的脂質體制 劑和用轉鐵蛋白(Tf)受體的單鏈Fv片段(TfRscFv)修飾的復合物進行比較。在這些分析 中使用3種脂質類型脂質ΑΦ0ΤΑΡ DOPE, 1 1摩爾比)；脂質D(D0TAP Choi, 1 1 摩爾比)；和脂質G(D0TAP DOPE Choi, 1 1 1摩爾比)。比較了 3種樣品制備方 法。方法A 其中使DNA與配體修飾的脂質體直接混合的預包被法。方法B:其中在配體與 脂復合物的表面綴合前，使DNA與脂質體混合以形成陽離子脂質/DNA核心(脂復合物)的 后包被法。方法C:其中使DNA與脂質體或具有組氨酰化寡聚賴氨酸(HoKC)肽修飾的脂質 體混合以形成脂復合物，這之后加入攜帶特定配體的陰離子(PSchol)或中性(PCchol)脂 質體以封裝脂復合物。A.方法1.復合物形成通過化學綴合的復合物形成用于制備包含抗體或抗體片段的陽離子免疫脂質體的示例性方法公開于2001年 10月1日提交的美國專利申請?zhí)?9/914，046中，所述抗體或抗體片段與脂質體的表面直 接化學綴合，所述美國專利申請的公開內容通過引用整體合并入本文。例如，4-(對馬來酰 亞胺基苯基)丁酸鹽-DOPE (MPB-DOPE) (Avanti Polar Lipids)包括在上文描述的7種脂 質體制劑中，至5-8%摩爾的總脂質。MPB-脂質體通過本領域眾所周知的方法進行制備。 例如，從 Campbell MJ (Biotechniquesl995 Jun ； 18 (6) 1027-32)描述的那種改良的乙醇 注射法可以在本發(fā)明中使用。簡言之，使所有脂質溶解于乙醇中且混合，用Hamilton注射 器注入50-60°C的渦旋純水內。使溶液渦旋另外10-15分鐘。終濃度是l_2mM總脂質。加 入IM HEPES，pH 7. 5 (pH7. 0-8. 0)至10_20mM的終濃度。因為馬來酰亞胺基團在pH > 7的 水溶液中不穩(wěn)定，所以脂質體應在水(PH 5-6.5)中制備。在與scFv-SH連接前，pH可以用 1MHEPES緩沖液，pH7. 0-8. 0調整至7. 0-8. 0,以促進后包被反應。 以約1 1至約1 100、適當?shù)丶s1 10至約1 50 (w W)、更適當?shù)丶s1 20 至約1 40的蛋白質/脂質比，將SCFv-SH加入MPB-脂質體中。溶液通過輕輕旋轉( 20-30RPM)在室溫下混合30分鐘，以產生scFv-Lip。scFv-Lip無需純化而使用，盡管它也可 以通過S印har0SeCL-4B柱層析進行純化。將質粒DNA稀釋于水中，并且以約0. 5 1至約 1 40(yg總核酸“8脂質)、適當?shù)丶s1 5至約1 20&8總核酸“8脂質)，例如 約1 10 ( μ g總核酸μ g脂質)的DNA/脂質比加入scFv-Lip中，以產生scFv-Lip-DNA復合物。scFv-Lip-DNA無需純化而使用，盡管它也可以通過S印haroseCL-4B柱層析進行 純化?？梢灶A期80-100% scFv與脂質體綴合。通過簡單混合的復合物形成綴合的TfRscFv-免疫脂質體保留其免疫活性。也已確定cys-TfRscFv可以與脂 復合物化學綴合(參見2001年10月1日提交的美國專利申請?zhí)?9/914，046)，并且可以在 體外和體內有效轉染人前列腺腫瘤細胞。使用各種化學綴合方法使單鏈抗體片段與脂質體 附著是通常的實踐。也已確定cys-TfRscFv和陽離子脂質體(其不包含任何具有可還原基 團的脂質例如馬來酰亞胺DOPE或任何可還原基團)的簡單混合，而非化學綴合，導致免疫 活性復合物形成，其中配體與脂質體直接結合，無需使用接頭或化學綴合分子，所述復合物 仍與腫瘤細胞有效結合且轉染腫瘤細胞(參見例如美國公開專利申請?zhí)?003/0044407，其 公開內容包括其中公開的組合物和方法通過引用合并入本文)。通過在混合的復合物中使cys-TfRscFv與脂質體復合物A以在自始至終描述 的范圍中的單鏈蛋白質比脂質體和DNA比η moles(或ug)總脂質的限定比混合，制備 cys-TfRscFv-免疫脂質體復合物。下文描述的復合物制備依照下述一般操作。使合適量的 2mM脂質體(上文描述的A-H)與所需的任何水(例如，DI水)混合，以給出所需體積，并且 倒轉以混合。向脂質體-水混合物中，加入合適量的cys-TfRscFv，以給出所需比，并且通過 輕輕倒轉混合約1秒至約2分鐘。使這種混合物保持在室溫下約10分鐘至約20分鐘(在 約5分鐘后輕輕倒轉5-10秒)。同時，通過倒轉使合適量的DNA與所需的任何水混合約1 秒至約2分鐘，以給出所需體積。一般地，對于在體外測定法中的使用，希望DNA濃度在約 0. Olyg至約2 μ g/孔的范圍中；對于體內使用，希望提供約5 μ g至約IOOyg DNA/注射。 將DNA溶液快速加入cys-TfRscFv-脂質體溶液中，并且使混合物倒轉約1秒至約2分鐘。 使最終的混合物維持在室溫下約10分鐘至約20分鐘，在約5分鐘后輕輕倒轉5-10秒。對 于體內使用，加入50%右旋糖或50%蔗糖至1-20% (V V)、適當?shù)?-20% (V V)終濃 度，并且通過輕輕倒轉混合約1秒至約2分鐘。以1 30 (cys-TfRscFv 脂質體，w w)和 1 14 ( UgDNA nmole總脂質)的合適比的具體例子如下。對于終體積800 μ 1的40 μ g DNA,使183 μ 1水與280 μ 1 2mM脂質體溶液混合。加入34 μ 1 cys-TfRscFv (具有0. 4 μ g/ ml的濃度)。使183 μ 1水與40 μ 1 1 μ g/1 μ 1 DNA混合。加入80 μ 1 50%右旋糖作為最 后一個步驟。通過本發(fā)明的方法制備的最終復合物大小為約100至400 (nm)，具有正ζ電位，如 通過動態(tài)光散射使用 Malvern ZETASIZER 3000 或 Malvern ZETASIZER NANO-ZS 測 定的。這個大小足夠小以有效經過腫瘤毛細血管床并且到達腫瘤細胞，并且也足夠小以有 效經過毛細血管床并且到達靶APC細胞。2.評估針對HCV特異性抗原的免疫應答靶HCV抗原在疫苗研究中包括的HCV抗原是NS3直到NS5B。這些序列得自基因型laH77株 系。參見 Major Μ. Ε.，等人，！fepatitis CViruses. In =Fields Virology, Knipe D. Μ.和 Howley P.M.(編輯)，Lippincott, Williams & Wilkins，第 1127-1161 頁(2001)，其公開 內容通過引用整體合并入本文。在恢復的動物中單獨針對這種抗原的T細胞應答的增強導 致短暫、臨床上不顯著的感染(參見下文)。對于在CMV啟動子的控制下表達抗原的質粒，已使用293-T和Huh 7. 5細胞。對于腺病毒載體，使用AD-293細胞系。通過免疫熒光染色 且通過用特異性抗體的蛋白質印跡測定表達。腺病毒載體使用ADEASY 系統(tǒng)表達HCV基因的人腺病毒血清型5重組體適當?shù)卦诒景l(fā)明中 使用(Stratagene，CA)。這個載體已通過El和E3基因的缺失使得復制有缺陷。通過在大 腸桿菌中重組將目的基因引入腺病毒主鏈。隨后將重組質粒轉化到AD-293細胞內，在其中 補充缺失的病毒裝配基因以產生病毒顆粒。腺病毒也是關于HCV治療的吸引人的病毒載 體，因為這種病毒可以在肝中有效表達轉基因。白介素-12 (免疫增強)白介素-12(IL_12)誘導IFN-γ產生，支持Thl超過Th2細胞的分化，并且使先天 性抗性與適應性免疫連接。在感染過程中DCs和吞噬細胞響應病原體產生IL-12。為了改 善免疫接種且刺激有效的Thl型應答，在陽離子免疫脂質體制劑中包括表達IL-12的質粒。 已制備表達小鼠和人IL-12的質粒，以便達到小鼠和靈長類動物研究之間的一致性。小鼠接種研究涉及使用表達HCV抗原的重組載體的DNA引發(fā)/腺病毒加強。在第0和4周 時用在本文公開的脂質體復合物中的20-30 μ g DNA接種小鼠，并且在10-12周時用重組腺 病毒(IO8感染單位，皮下(s. c.))加強。這次加強后4周，通過流式細胞術分析肝和脾，以 測定在肝中的T細胞特征。T細胞可以使用Ficoll梯度與肝細胞分開，并且使用標記抗體 就特異性表面標記進行染色。作為對照，包括PBS處理的小鼠，肌內(i.m.) (1至50yg/小 鼠)、腹膜內(i.P.)、靜脈內(i.v.)和皮內(i.d.) (1-50 μ g/小鼠)注射的無配體脂質體 /DNA復合物、攜帶空載體的復合物、裸露DNA，和用復合物i.m.或i. d.接種的小鼠。最佳 化劑量和時機，并且評估經過6個月時期T細胞在肝中的持續(xù)和回憶，以基于肝內T細胞數(shù) 目和標記確定最佳系統(tǒng)。因為轉鐵蛋白受體在樹突細胞上表達，并且通過受體介導的內吞 作用攝取復合的DNA，scL-HCV或scLHK-HCV復合物的i. m.和/或i. d.接種預期導致比裸 露質粒DNA更佳的全身應答。T細胞群體可以基于⑶45RA、⑶62L、⑶27和CCR7的表達進 行鑒定。IL-7Ra提供了可以區(qū)分短效的效應細胞與發(fā)育成功能記憶細胞的那些的有用標 記。這些標記在初步小鼠研究中使用，以分析候選疫苗建立長期免疫的潛力。存在關于在 黑猩猩中HCV清除后記憶CD8+T細胞在肝中的選擇性保留的證據(jù)，與在清除后6個月的血 液比較，在肝中具有高 10倍的水平。脾和肝內T細胞的特異性通過體外免疫測定法進行評估。最初，使用純化的HCV 抗原或重疊18肽的Elispot測定法用于分析分泌IFN- γ或IL-4的細胞。還使用從免疫 接種小鼠的脾中分離的細胞和購自Mikroger^Germany)的全蛋白質執(zhí)行增殖測定法。利用 HLA-A2轉基因小鼠。這些小鼠表達HLA-A2MHC分子，并且可以呈遞HLA-A2表位。這些轉基 因小鼠可以使用與用于BALB/c小鼠的那種相同的方案進行免疫接種，但可以在免疫學測 試中使用由HLA-A2單元型識別的肽。對于這些分析，使用對于這種單元型特異的NS5A和 NS5B鑒定的HLA-A2四聚體和表位。在FACS緩沖液(1 % BSA,在不含鈣的PBS中的0. 1 %疊 氮化鈉)中，用呈遞特異性肽的四聚體-藻紅蛋白(PE)和對于表面標記(CD4，CD8)特異的 FITC標記的抗體在室溫下或在冰上染色肝衍生細胞30分鐘。使用軟件Cellquest (Becton Dickenson)在 FACS-Calibur (Becton Dickenson)上獲得事件用于分析，使用 7AAD(BDPharmigen)以排除死細胞。使用得自首次用于實驗或模擬接種小鼠的T細胞測定非特異性背景染色。對于克隆，淋巴細胞進行抗原刺激且以有限稀釋與Y輻射的同基因APCs加上 IL-2和IL-7共培養(yǎng)，并且就HCV特異性增殖進行測試。B.結果1.在體外使脂質體復合物靶向人肝細胞癌0fep3B)細胞。使H印3B HCC細胞(5X IO4)種在24孔皿中，并且用如上述所述的與DNA質粒 (0. 05ug/孔)復合的脂質體轉染，所述DNA質粒在哺乳動物啟動子的控制下表達螢光素酶 基因。用于 scL-HCV 的比是 0. 33ug 10ug(14nmol) lug(TfRscFv LipA DNA)，并 且對于 scLHK-HCV，它們是 0. 33ug Ynmol lug (TfRscFv LipA-HoKC DNA)。轉染后 24 小時，使用 Luciferase Assay System(Promega，Madison，WI)測定螢光素酶活性。結 果在圖1中作為平均值+SD(n = 3)顯示。使用與抗轉鐵蛋白受體單鏈抗體片段(sc)復 合的脂質體獲得有效轉染，對于sc/LipA和sc/LipA-HoKC復合物分別具有257，815RLU和 1，120，643RLU的螢光素酶值(圖1)。使這與對于與未修飾的脂質A (LipA)復合的螢光素 酶質粒的538. 9RLU/μ g蛋白質的螢光素酶值比較。當HoKC肽摻入脂質體復合物時，DNA進 入這種肝細胞系內的轉染效率的這種增加與使用前列腺和胰腺細胞系的先前觀察一致。2.在體外使脂質體復合物靶向原代黑猩猩肝細胞。正常肝細胞不具有與肝細胞癌細胞相同的受體水平，因此在原代黑猩猩肝細胞 中比較與TfRscFv (sc)、半乳糖(GAL)和L_37pA配體綴合的脂質復合物組。將50，000個 原代黑猩猩肝細胞種在24孔板中，并且用含或不含HoKC肽的攜帶螢光素酶報道基因的 復合物轉染(0. Iyg DNA質粒/孔)。通過上文公開的簡單混合方法制備sc/Lip-HoKC/ DNA(泳道 1-3)和 sc/Lip/DNA(泳道 7-9)復合物，即，以 0. 33ug sc 7nm Lip-HoKC 和
0.33ug sc 14nmol Lip的比，使TfRscFv與合適脂質體(含或不含HoKC)混合，通過用 手輕輕倒轉10次或在20-30PRM下旋轉15-60秒混合，并且在室溫下保持10-15分鐘。隨 后將 DNA 加入 sc/Lip-HoKC 或 sc/Lip 混合物(以 lug DNA 7nmol (對于 Lip-HoKC)禾口 lug DNA 14nmol (對于Lip)的比)，并且通過用手輕輕倒轉10次或在20-30PRM下旋轉 15-60秒混合溶液，并且在室溫下保持10-15分鐘。無配體的復合物也以相同比并且根據(jù)相 同操作制備為對照(泳道4-6和10-12)。通過使L-37pA配體與脂質體(A，D或G)化學綴 合形成使用L-37pA配體的復合物(泳道19-21)，所述脂質體包含6. 7%摩爾比的Lip-馬 來酰亞胺。Lip-Mal 與 L-37pA 以 14 7(nmol nmol) (Lip L_37pA)的比混合，并加入
1.5mM HEPES緩沖液(終濃度)，并且在20-30RPM下在室溫下旋轉3小時。然后，以Iug DNA 14nmol Lip的比加入DNA，如上所述混合，并且在室溫下保持15分鐘。為了比較，還 使用不同方法以形成具有GAL配體的復合物(泳道13-18)。此處，將DNA加入任何所需水 中，并且如上混合。將脂質體A、D或G (含或不含HoKC)加入任何所需水中，并且如上混合。 使2種溶液在室溫下保持15分鐘，隨后加在一起，如上混合并且在室溫下保持15分鐘，以 形成陽離子脂質體/DNA核心。GAL配體先前以1 1 0. 05 (PS chol GAL)的摩爾 比與陰離子(磷脂酰絲氨酸膽固醇)脂質體綴合。這種PScholGAL混合物隨后加入預形 成的陽離子脂質體/DNA復合物，溶液如上混合并且在室溫下保持15分鐘，以封裝陽離子脂 質體/DNA核心。用于這些復合物的組分比是7nmol Ynmol lug(PScholGAL Lip-HoK C DNA)禾口 7nmol 14nmol lug(PScholGAL Lip DNA)。轉染后 48 小時，使用如上所述的螢光素酶測定系統(tǒng)測定螢光素酶活性。圖2顯示在原代黑猩猩肝細胞中通過螢光素 酶RLU/ μ g蛋白質測定的轉染效率。用所有3種方法且使用所有3種配體形成的復合物能 夠轉染這些原代黑猩猩肝細胞。使用原代黑猩猩肝細胞，與使用的脂質無關，與sc復合的 脂質體給出比使用不同方法與GAL (15，509RLU)或L_37pA(19，662RLU)復合的最佳脂質體 幾乎高10倍的轉染效率( 150，000RLU)。如預期的，由于在正常肝細胞上假定的低數(shù)目 Tf受體，sc/脂質體的總體轉染效率比相同復合物在H印3B細胞中時低直至16倍。然而， HoKC肽的包括使得使用TfRscFv的轉染效率增加10倍。如先前使用!fep3B細胞觀察到的， 當HoKC肽與GAL配體一起包括時，觀察到用GAL和L_27pA配體的最佳轉染效率。因此，這 些研究證實scLHK-DNA復合物在將DNA遞送到正常肝細胞內方面高度有效，并且其他配體 也可以在復合物中用于轉染正常肝臟肝細胞。
3.在體內使脂質體復合物靶向肝臟細胞。在體外實驗后，使用非荷瘤BALB/c小鼠和特定脂質體復合物在體內執(zhí)行測試。用 在400 μ 1脂質體復合物中的表達EGFP的20-25 μ g DNA質粒經由尾部靜脈i. v.接種6_9 周大的動物，所述脂質體復合物如上所述以上文給出的比制備，經過24小時的時間段接種 2-3次。在最后一次接種后24-48小時時，使來自肝、脾、腎、肺和心臟的組織小片在液氮 中速凍并且貯存于-70°C。此外，使肝組織小片在福爾馬林中固定用于組織學分析。對于 蛋白質印跡分析，使用包含蛋白酶抑制劑混合物(Sigma)的T-PER組織提取試劑(Pierce， Rockford, IL)提取肝組織，并且在離心后收集上清液以去除細胞碎片。使用BCA蛋白質 測定試劑試劑盒(Pierce，Rockford, IL)評估蛋白質濃度，并且使用單克隆抗GFP抗體 (BAbCo)和 ECL 蛋白質印跡試劑盒(Yu W，等人，Nucleic Acids Research，32. e48 (2004)) 分析40 μ g總蛋白質。用抗GAPDH抗體處理相同膜以建立相等蛋白質裝載/孔。圖3顯 示與未處理小鼠(UT)比較，來自用與脂質A(scLA)、脂質A和HoKC (scLAHK)、脂質D和 HoKC(scLDHK)、脂質G和HoKC(ScLGHK)綴合的TfRscFv配體(sc)、與脂質A綴合的半乳糖 (GalLA)和與脂質A綴合的L-37pA(L-37pALA)接種的一式兩份小鼠的肝提取物的蛋白質印 跡。左手泳道顯示關于GFP和GAPDH的陽性對照(PC)。所有脂質體復合物導致GFP在接 種的小鼠的肝中的表達。當使用脂質A時(比較scLA和scLAHK)，HoKC肽的包括改善DNA 至小鼠肝的遞送。用scLGHK脂質體復合物觀察到最高水平的表達，盡管這僅在2只小鼠的 1只中出現(xiàn)，并且scLAHK復合物看起來在重復動物中給出更一致強烈的GFP蛋白質表達。 GalLA和L-37pALA修飾的脂質體也導致GFP的表達，但處于更低的水平?？傊@個數(shù)據(jù)表明，盡管可以使用所有3種配體，但在脂質體中包含靶向性配 體TfRscFv和HoKC肽的基因遞送媒介物對于肝臟細胞比半乳糖或L-37pA肽更佳。這 些結果是出乎意料的，因為半乳糖通常用于靶向肝臟細胞(Wu，J.，等人，“Targeting Hepatocytes for Drugand Gene Delivery :Emerging Novel Approaches and Applications, " Frontiers in Bioscience 7 :d717_725(2002)。4.誘導針對HCV的免疫應答的DNA和病毒載體的構建使用本領域技術人員眾所周知的標準克隆方法，已構建DNA載體以在高表達啟動 子(pAG410)的控制下表達HCV的NS3直到NS5B蛋白質。用于表達這些HCV特異性蛋白 質的主鏈載體已由FDA批準用于臨床使用，并且目前處于使用癌癥特異性制劑的患者I期 臨床試驗中。已在體外使用293T和Huh7.5(肝細胞)細胞測試表達，并且通過蛋白質印跡(圖4)和免疫熒光(數(shù)據(jù)未顯示)分析顯示特異性表達HCV抗原。使用制造商的方案使用 Lipofectindnvitrogen, CA)轉染6孔皿中的細胞。48小時后，細胞就特異性基因表達進 行分析。對于蛋白質印跡分析，使用包含蛋白酶抑制劑混合物(Sigma)的250ylM-PER試 劑(Pierce，Rockford，IL)裂解細胞。使用 8-20% SDS-PAGE 梯度凝膠(Invitrogen)通過 蛋白質印跡分析80微克總蛋白質。將蛋白質轉移至PVDF膜，并且用1 500稀釋的針對 NS5B的單克隆抗體或1 500稀釋的慢性黑猩猩血清探測。使用抗人或抗小鼠IgG HRPO 綴合物和化學發(fā)光(West Pico system, Pierce, Rockford，IL)顯現(xiàn)蛋白質。圖4顯示與 用pAGVec(空載體)轉染的細胞比較，對于NS3、NS4B、NS5A和NS5B觀察到的特異性條帶。 也已使用標準克隆方法構建腺病毒重組體，以個別表達這些相同抗原中的每一種。來自這 些病毒載體的每一個的表達也通過蛋白質印跡分析加以驗證(數(shù)據(jù)未顯示)。5.克隆到高表達啟動子內的人IL-2的增強效率對于充當有效佐劑分子的ILs，它們必須以足夠高的水平表達，以有效刺激Th-IT 細胞應答。將它們置于高表達啟動子的控制下是實現(xiàn)這點的一種方法。為了證實通過這種 方法可能實現(xiàn)ILs高水平表達，將人IL-2克隆到在高表達啟動子的控制下的pSCMV載體內 (參見公開的美國專利申請?zhí)?007/0065432，其公開內容通過引用并入本文)。測試在體內 的表達水平，并且與來自標準CMV啟動子的那種比較。在2種情況下，通過如本文所述制備 的不含HoKC肽的靶向的脂質體納米復合物遞送質粒。通過皮下接種PANC-I腫瘤組織，在 4-6周大的雌性無胸腺裸鼠中誘導PANC-I人胰腺癌異種移植物腫瘤。約3周后，腫瘤平均 為400-700mm3，并且動物經過6天用納米免疫脂質體復合物給予6次i. v.(尾部靜脈)注 射，所述復合物使用比(0. 33ug IOug lug(TfRscFv Lip DNA))并且通過如上所述 的簡單混合進行制備，攜帶在標準CMV啟動子或高表達啟動子的控制下的IL-2基因(40ug DNA/注射)。在最后一次注射后24小時處死小鼠。收集腫瘤和肺組織，在液氮中閃凍，并 且使用標準技術，通過使用針對hIL-2的商業(yè)多克隆抗體和ECL檢測的蛋白質印跡分析就 hIL-2蛋白質表達水平進行分析。如圖5中所示，來自接受攜帶psCMV-hIL-2質粒的復合物 的動物的所有腫瘤證實在腫瘤中的高表達水平。相比之下，hIL-2表達在其中hIL-2基因 處于標準CMV啟動子的控制下的腫瘤中不明顯。6.在經由scL i. v.遞送后在小鼠組織中的HCV DNA序列/表達的檢測執(zhí)行實驗以評估在scL-pAG410復合物的全身施用后，在各種非荷瘤小鼠組織中 編碼NS3直到NS5B的基因的存在。BALB/c小鼠(3只/組)用與scL(單鏈轉鐵蛋白抗體 靶向的陽離子脂質體)復合或作為游離質粒DNA的質粒pAG410DNA(25ug/小鼠/注射) i. v.注射2次(相隔8小時)。通過如上所述的簡單混合以(0. 33ug IOug lug (TfRscF ν Lip DNA))的比制備復合物。一組小鼠接受以相同方式和相同比制備的攜帶空pSCMV 載體的scL。注射后48小時處死動物。收集肝、肺、脾和胸腺，并且在液N2中閃凍。部分樣 品使用DNeasyExtraction Kit (Qiagen)用于分離DNA，以用于PCR。在分開的反應中使用 Taq Gold聚合酶執(zhí)行DNA PCR (lug DNA)，使用引物以擴增NS3、NS5A和NS5B。PCR條件如 下在 50ul 總體積中的 6ng DNA、2mMMgCl2 ；各 0. 2mM 的 dATP、dCTP、dGTP 和 dTTP ；300nM 各 種引物；和1. 25單位AmpliTaq。通過使反應混合物在94°C下溫育10分鐘，隨后為在94°C 下15秒和60°C 30秒的40個循環(huán)，然后60°C 7分鐘來執(zhí)行擴增。圖6顯示關于在肝中的 NS3基因的PCR數(shù)據(jù)，盡管信號差異對于NS5A和NS5B是相似的。在接受復合的對游離的PAG410的小鼠之間在所有器官中在拷貝水平上存在顯著差異。與肝相似(圖6)，在肺、脾 和胸腺中，scL-pAG410具有強PCR條帶，同時用游離DNA不存在檢測出的信號。如預期的， 不存在來自載體處理的小鼠的信號。因此，復合的HCV質粒DNA的i. v.遞送導致在肝和其 他器官中的細胞的有效攝取。這些結果證實且支持這種方法用于將HCV抗原全身遞送給正 常肝和其他正常細胞的可行性。7.小鼠的免疫應答小鼠無法被HCV感染。然而，為了評估誘導的T細胞應答的功效，表達HCV的NS3蛋白質的重組痘苗病毒(rVV)用作替代病毒攻擊模型。這種類型的rVV模型是本領域眾所 周知的，并且是評估T細胞應答的體內功效的公認方法。小鼠(3只/組)在0和4周時用 HCV和IL-12質粒DNA進行I. V.接種，所述質粒DNA是如上所述scL復合的或作為游離質 粒DNA。通過如上所述的簡單混合使用0. 33ug IOug lug (TfRscFv Lip DNA)的比 制備TfRscFv/Lip/DNA復合物。DNA以等摩爾量(總共50ug/小鼠/注射)混合。小鼠在8 周時用表達HCV的NS3蛋白質的IO6噬斑形成單位(pfu)rVV進行攻擊。在攻擊后5天時， 從小鼠中取出卵巢，在PBS中勻漿化，并且實施3輪凍/融和超聲處理。對于滴定，使卵巢 提取物(IOOul)與IOOul胰蛋白酶和IOOul PBS組合，并且在37°C下溫育30分鐘。在2% FBS/EMEM中執(zhí)行稀釋(從10—1到10_6的10倍稀釋)，并且250ul用于感染在12孔皿中的 一式兩份孔的BSC-I細胞。在轉染后2天時，去除培養(yǎng)基并且使細胞固定且用結晶紫(20% 乙醇、20%甲醛、0. 3%結晶紫)染色。組1接受PBSJi 2接受scL復合的pAG410和IL-12 質粒，組3接受scL復合的空載體和IL-12質粒，并且組4接受作為裸露DNA的pAG410和 IL-12質粒。圖7顯示在每個組中表示為pfu/卵巢的rVV滴度。點表示單獨的小鼠，并且 黑色條表示平均滴度/組。與PBS組比較，用scLpAG410/IL-12復合物的免疫接種導致病毒 滴度的高度顯著的減少(P = 0.002)，如使用斯氏T分布評估的。Gp2中的IO4平均滴度對 Gpl中的106。有趣的是，用scL復合的IL-12載體連同空主鏈載體一起接種小鼠也導致病 毒滴度的顯著減少(2X IO5Pfu/卵巢的平均滴度)，盡管不如與PAG410質粒組合時可見的 那種減少那么多。對病毒復制的這種作用是使用scL遞送的結果，因為用作為裸露DNA的 PAG410和IL-12的免疫接種(Gp 4)不導致病毒滴度的顯著減少。這個數(shù)據(jù)表明，用scL復 合的DNA免疫接種導致T細胞應答的誘導，這種T細胞應答可以保護免受病毒攻擊，并且這 些免疫應答優(yōu)于使用裸露DNA誘導的那些。這個數(shù)據(jù)表明表達細胞因子的質粒單獨的scL 遞送也可以誘導抑制病毒復制的免疫應答。8.在用scL復合的DNA免疫接種后的肝內T細胞浸潤為了評估用scL復合的DNA的免疫接種是否導致在用嗜肝病毒感染后更佳的肝內 T細胞浸潤，在免疫接種后8周用3 X IO8感染顆粒的表達NS3、NS5A和NS5B HCV蛋白質的 非復制腺病毒重組體I. V.攻擊上文描述的相同4組(在0和4周時用如上等同的復合物 進行免疫接種)。攻擊后10天，收獲肝組織，進行福爾馬林固定，并且使用本領域眾所周知 的標準方案包埋在石蠟塊中。切片進行H&E染色并且就T細胞浸潤進行分析。在不同小鼠 組中評估肝浸潤T細胞的數(shù)目。對于3只小鼠/組的每一只計數(shù)3個視野。使關于每個組 的計數(shù)組合且求平均值以給出T細胞數(shù)目/視野(fov)。數(shù)據(jù)通過斯氏T檢驗進行分析。 在接受scL pAG410/IL-12的小鼠中的平均T細胞浸潤顯著高于在接受PBS的小鼠中的那 種，118. 8個T細胞/fov對70. 2個T細胞/fov (ρ = 0.000007)。這與關于接受scL-載體/IL-12的小鼠的71. 5個T細胞/fov比較。在接受裸露pAG410/IL_12的小鼠中也存在顯 著更高水平的T細胞浸潤，108. 75個T細胞/fov(p = 0. 001)，但以比用scL-pAG410/IL_12 少的程度。這些觀察證實用表達HCV抗原的scL復合的質粒的免疫接種導致在用重組嗜肝 病毒感染后在肝中更佳的T細胞應答。9.關于HCV特異性RNA、抗原和免疫應答的表達和測試的工具的開發(fā)。使用Sindbis表達系統(tǒng)，已改造表達重組病毒以表達HCV的核心、E1E2和NS3蛋 白質。這些蛋白質隨后進行組氨酸標記，以促進使用鎳柱的純化。執(zhí)行有效純化并且通過 蛋白質印跡分析測定特異性(使用小鼠單克隆或兔多克隆抗體)。已從具有針對HCV的 E1E2、NS3和NS5A蛋白質的高滴度抗體的受感染黑猩猩鑒定慢性期血清。這種滅活血清已 在數(shù)種蛋白質印跡和免疫熒光測定法中用于成功檢測來自重組DNA和病毒載體的HCV抗原 表達。從Mikrogen(Germany)商購可得的NS3、NS5A和NS5B蛋白質也已用于檢測在黑猩 猩中針對HCV的T細胞應答(使用ELISpot、增殖測定法和流式細胞術分析)。已也從NIH AIDSResearch and Reference Reagent Program 獲得與 la H77 基因型序列對應的一組重 疊18肽，所述la H77基因型序列也已在使用黑猩猩外周血單核細胞(PBMCs)的Elispot 測定法中成功使用。已開發(fā)ELISA s用于測試針對大多數(shù)HCV抗原，核心、E1E2、NS2、NS3、 NS5A和NS5B的抗體。近期研究已顯示使用ELISA獲得的抗E1E2滴度已證明是在受感染黑 猩猩中的中和抗體滴度的良好指示物。已也開發(fā)巢式和實時PCR測定法，以檢測且定量在 血清中的HCV RNA。已評估了這些測定法的靈敏度和特異性，并且使用巢式PCR可以檢測出 少至40個RNA拷貝/mL，并且使用實時PCR可以檢測出少至200個RNA拷貝/mL(74WH0IU/ mL)。所有這些試劑和檢測系統(tǒng)對于來源于在黑猩猩中在感染的早期急性期過程中收集的 血漿的單克隆病毒特異，所述黑猩猩用由HCV基因型Ia(HCV-H)感染性克隆轉錄的RNA接 種。10.在HCV攻擊前首次用于實驗和恢復的黑猩猩的預防疫苗接種已檢查了疫苗引發(fā)糖蛋白特異性或非結構蛋白質特異性免疫應答以改變HCV感 染病程的能力。這些研究顯示中和抗體(nAb)和疫苗誘導的T細胞可以改變在黑猩猩模型 中的HCV感染。a)基于包膜的疫苗改變HCV感染。已開發(fā)了產生用于在疫苗實驗中使用的HCV E1E2蛋白質的表達和純化系統(tǒng)。使用 Sindbis表達系統(tǒng)表達組氨酸標記的E1E2蛋白質，并且使用GNL凝集素和鎳柱——本領域 良好建立的方法純化至>80%純度。通過使用針對El和E2的單克隆抗體的蛋白質印跡和 SDS PAGE凝膠的銀染色評估特異性和純度。2只黑猩猩，一只首次用于實驗(Chl601)和一 只從急性HCV感染恢復(Chl587)，用肌內遞送的25 μ grElE2蛋白質進行免疫接種，并且用 100黑猩猩感染劑量(CID5tl)的克隆HCV進行攻擊(圖8A和8B)。攻擊結果與未接種疫苗 的對照動物中的感染進行比較。除強和特異性T細胞增殖應答外，2只動物的免疫接種產生 針對E1E2的高抗體滴度，包括針對E2的高變區(qū)(HVRl)的抗體。這個區(qū)域已顯示在天然分 離株中是最可變的，并且也認為代表nAb表位。使用完整蛋白質E1E2和HVRl肽ELISA測 定法測量抗體，所述ELISA測定法利用由BSC-I細胞純化的生物素化HVRl肽或E1E2蛋白 質開發(fā)，所述BSC-I細胞用表達E1E2的重組痘苗病毒感染。在2只接種疫苗的動物中病毒 血癥延遲3周。在Chl601中，HCV RNA滴度維持在5 X IO4拷貝/ml以下，并且ALT水平被最低限度升高。肝內細胞因子mRNA水平的增加與HCV RNA下降至無法定量水平一致。不 管這個對照，隨著抗體滴度減弱病毒血癥再現(xiàn)，并且動物被慢性感染，這個再現(xiàn)與免疫逃逸 無關。從急性HCV感染恢復的黑猩猩不發(fā)展nAbs。將nAb加入原發(fā)感染中誘導的已存在 的記憶T細胞應答，產生能夠保護動物不受再感染的免疫應答。在Chl587中，病毒血癥在 3周時在唯一一份樣品中可檢測(< IO4拷貝/ml)，無肝炎的證據(jù)。b) T細胞疫苗改變HCV感染構建不使用本發(fā)明的方法的疫苗，其僅包含HCV NS抗原NS3、NS5A和NS5B。恢復 的黑猩猩(Chl588)用DNA引發(fā)/rVV(重組痘苗病毒)加強方案針對NS3進行免疫接種。 第二只恢復的黑猩猩(Chl606)用包括NS3、NS5A和NS5B的疫苗進行免疫接種。黑猩猩用 IOOCID5ci的克隆HCV進行攻擊。在2只動物中，在疫苗接種后加強T細胞應答。2只動物的 攻擊導致亞臨床感染(在注射(p. i.)后6周時僅持續(xù)1 (Chl606)或2(Chl588)周的低水 平病毒血癥(圖9A-9C))。相比之下，未接種疫苗的恢復的黑猩猩在p. i. 1周時發(fā)展病毒血 癥，這在至少直到14周時可檢測。首次用于實驗的黑猩猩(Ch6394)隨后用NS3-NS5疫苗進行疫苗接種，并且用 IOOCID50的單克隆H77進行攻擊。使用采用完整抗原和重疊肽的增殖和Elispot測定法測 試T細胞應答。Ch6394在疫苗接種后發(fā)展針對所有疫苗抗原的特異性T細胞應答。在攻擊 后，這只動物在P. i. 1周時變得病毒血癥，但具有< IO5拷貝/ml的最大限度滴度和病毒復 制的立即控制(圖9A-9C)。在首次用于實驗的動物中，滴度每7天增加 2倍，而在Ch6394 中，滴度在相同時期內減少30倍。然而，在第10周時，喪失病毒控制，并且動物發(fā)展慢性感 染。這種喪失伴隨NS3特異性免疫應答(IFN-Y產生T細胞頻率和增殖)的喪失，并且與2 個氨基酸突變的出現(xiàn)相關，2個突變一個在NS3區(qū)中并且一個在NS5A區(qū)中。Elispot測定 法已顯示與野生型肽比較，攜帶這些突變的肽不再由來自Ch6394的PBMCs識別，表明這些 改變代表免疫逃逸突變。從⑶4T細胞逃逸可能已導致輔助功能的喪失，這可以解釋NS3特 異性應答在這個動物中的喪失。這些結果暗示基于T細胞的針對HCV的疫苗具有控制感染 的潛力。11.在HCV攻擊前首次用于實驗的黑猩猩的預防疫苗接種a)使用i. v.配體-脂質體納米復合物(scL-HCV)疫苗策略在首次用于實驗的黑 猩猩中引發(fā)特異性T細胞應答，并且其在攻擊后增強。已執(zhí)行在首次用于實驗的黑猩猩中使用如自始至終描述的scL-HCV納 米復合物的疫苗研究。使用scL-HCV復合物在0、4和8周時進行注射以引發(fā)免 疫應答，隨后為重組腺病毒(rAd)加強(16周)。用于給動物接種疫苗的復合物 0. 33ug IOug lug(TfRscFv Lip DNA)的比制備，用5%右旋糖作為賦形劑，以約 0. 164mgDNA/Kg/注射使用(基于黑猩猩的重量)。將制備的復合物注入250ml5%右旋糖的 袋內用于i. v.輸注，并且施用于動物。動物在32周(加強后16周)時進行攻擊。用納米 復合物的輸注和腺病毒加強是良好耐受的，在任何動物中無不良反應。疫苗接種后=Elispot研究在2只接種疫苗的動物(Chl611、Ch6407)中在疫苗接種后16周時顯示強烈、廣泛反應的HCV特異性IFN-Y應答(圖10A-10C)，在接受空載 體納米復合物和非-rAd的對照動物(Ch0257)中具有最低限度或無法檢測的應答。在用 scIHK-HCV接種后在Chl611和Ch6407中可見低水平IFN- γ特異性T細胞應答，指示針對疫苗的這種引發(fā)組分的免疫應答。在免疫接種后在2只接種疫苗的動物中還觀察到肝內 IFN- γ和⑶3mRNA水平的增加(圖12A-12C，第12、16和32周)。數(shù)據(jù)表示為相對于第O周 (接種疫苗前)時的mRNA水平，并且對內源對照(GAPDH)進行標準化。在第16和32周時 CD3mRNA的增加也指示肝中的T細胞浸潤。對于對照動物(Ch0257)，在免疫接種后的任何時 間和在攻擊前(第32周)未見細胞因子的增加(圖12A-12C)。這個數(shù)據(jù)表明在使用本文 公開的復合物和方法接種疫苗后，在肝以及外周血中誘導T細胞應答，并且這個數(shù)據(jù)通過 在Ch6407和對照Ch0257中的血清細胞因子分析(使用TransSignal Cytokine Antibody Array試劑盒(Panomics))得到支持。第一次scL_HCV DNA納米復合物處理后2周，僅在 接種疫苗的黑猩猩中，而不是在對照動物中觀察到細胞因子的上調，包括ICAM-1、各種白介 素、TGF-α 禾口 IFN-γ 0攻擊后使用本領域眾所周知的標準方法在第32周時用100感染劑量的HCV攻擊 免疫接種的黑猩猩。在攻擊后，2只接種疫苗的動物都顯示病毒復制的立即控制，這與如通 過Elispot測定法測量的增加的HCV特異性T細胞應答(圖11A-11C)和增加的肝內細胞 因子應答(圖12A-12C) —致。在攻擊后，2只動物仍具有對疫苗抗原(NS3-NS5B)特異的 可檢測的T細胞應答。在攻擊后并且響應病毒復制，這些應答增加。使用來自對照黑猩猩 的PBMCs的Elispot測定法顯示無HCV特異性應答(圖11A-11C)。在首次用于實驗的受 感染動物的急性期中可檢測免疫應答的這種不存在與其他公開的觀察一致。在2只免疫接 種的動物中緊在攻擊后肝內IFN-γ mRNA水平增加(圖12A-12C)，如由在第34周(攻擊后 2周)時，對于Ch6407和Chieil分別超過基線8和10倍的增加證明的。這些增加指示在 肝中對病毒復制的立即免疫應答。肝內細胞因子水平在對照動物中僅在攻擊后數(shù)周開始增 力口，并且直至第41周時才達到與免疫接種動物中的那些可比較的水平。從第O到8周時使用實時PCR測定法測量病毒滴度，并且從第O到6周時測量血清ALT水平。圖13顯示2只接種疫苗的動物在攻擊后都顯示比在對照黑猩猩中觀察到的 那些明顯更低的病毒滴度。此外，滴度在前5周過程中并不指數(shù)增加(如在對照黑猩猩中 可見的以及如在所有首次用于實驗的動物中可見的)。事實上，在2只接種疫苗的動物中， 到第5周時病毒滴度比對照動物低超過41og1(l。2只接種疫苗的動物但不是對照黑猩猩，也 證實在感染后2周的ALT升高，證實指示在肝中早期的免疫應答的肝內細胞因子數(shù)據(jù)(圖 14)。如預期的，在對照動物中的ALT水平直至感染晚期時才增加。在攻擊后預期所有動物 的感染，因為這是T細胞疫苗，并且不設計為誘導中和抗體和消除性免疫。病毒的最初復制 是刺激先前誘導的T細胞應答所需的。這個數(shù)據(jù)表明這種I. V. scLHK-HCV疫苗策略誘導記 憶T細胞，所述記憶T細胞在用病毒感染后被回憶，并且這種回憶應答在立即控制病毒復制 方面是有效的。12.在慢性感染的黑猩猩中測試免疫治療策略構建包括HCV NS3、NS5A和NS5B的疫苗，以測定T細胞免疫治療疫苗是否可以證 明在慢性HCV感染的黑猩猩中是有效的。裸露DNA引發(fā)(非scL-HK)(i.m.)/重組痘苗病 毒(rVV)加強方案用于處理慢性感染的黑猩猩，所述黑猩猩用NS3、NS5A和NS5B疫苗進行 i. m.免疫接種，隨后為rVV加強，所述疫苗遞送與作為佐劑的CpGs組合的3劑量裸露DNA。 接種rVV后，在外周血中針對NS3、NS5A和NS5B的T細胞應答增加12-20倍(圖15)。然 而，HCV RNA和肝酶水平不受影響；RNA滴度保持在 IO4RNA拷貝/ml，類似于處理前水平。在分析肝內IFN-Y和TNF-mRNA后，未注意到這些細胞因子中任一種的增加，暗示在血液中 增加的T細胞活性不導致在HCV復制位點處的增加。無法控制病毒可能已起因于T細胞無 法在肝中起作用。4只不同的慢性感染的黑猩猩用本發(fā)明的scL-HCV復合物進行i. v.注 射，所述復合物通過如本文描述的簡單混合制備，封裝攜帶編碼NS3、NS4B、NS5A和 NS5B的基因，攜帶編碼IL-2的基因的pSCMV質粒DNA或空載體。通過簡單混合以 0. 33ug IOug lug (TfRscFv Lip DNA)的比以 0. 2mg/Kg/注射(基于體重)制備復 合物。加入5%右旋糖作為賦形劑。在復合物制備前，對于HCV IL-2以1 1摩爾比或 對于空載體IL-2以2. 5 1混合DNAs。3只動物用scL/HCV-IL-2進行疫苗接種，并且 1只接受攜帶空載體-IL-2的復合物。每只動物接受相隔4-6周的3次注射。在最后一次 疫苗接種后4周用重組腺病毒載體加強。研究涉及使用等摩爾量的表達HCV抗原和IL-2的重組載體i. v.遞送scL_DNA或 scLHK-DNA接種物。因為所有表達的基因在相同主鏈載體中，所以使DNA比基于摩爾量確 保所有表達的插入片段相等遞送。分開的HC V和IL DNAs以等摩爾比的載體插入片段混 合，并且封裝到scL或scLHK內。DNA作為不含內毒素的制劑(< 5EU/mg DNA)在GLP條件 下(Aldevr0n，ND)產生。DNA ( 7mg/動物/注射)在復合物中基于黑猩猩重量進行施用 (0. 17mg/kg)。這個劑量大致等價于施用于60kg人的那種，并且是先前用于疫苗接種首次 用于實驗的黑猩猩的劑量。制備復合物，凍干且送至動物場所用于重構和注射。scL-HCV/ IL-2或scLHK-HCV/IL-2在0、4、8和12周時在3只動物中i. v.遞送。使用這個時間表，以 便給予免疫系統(tǒng)響應接種的時間。如果在4周后未見對T細胞應答或RNA滴度的影響，那 么在無另外的接種的情況下將不預期看見任何新作用。第4只(對照動物)在相同時間點 時接受scL或scLHK復合的空載體和IL-2質粒。這區(qū)分這種細胞因子單獨對HCV感染的 作用。如果在4次劑量后未觀察到病毒應答，那么如在預防疫苗研究中使用的，給予用表達 HCV抗原NS3-NS5B的rAcKlO11感染單位)的加強，并且繼續(xù)監(jiān)控免疫應答和病毒滴度。嗜 肝病毒載體的使用還達到靶向肝區(qū)室的目的。C.取樣研究動物直至24周。樣品收集在第一次接種前4周開始；這些樣品用作基線和 陰性對照。取樣持續(xù)直至最后一次接種后8周時，允許其中測定處理是否產生陽性應答的 時間。研究自始至終，如通過NIRCSOPs限定的，通過Menghini技術每2周執(zhí)行肝活組織檢 查，并且每周經由股靜脈抽血用于在下文詳述的研究中使用。在偶數(shù)周(第-4、-2、0、2周 等)時獲得40mL全血，并且在奇數(shù)周(-3、-1、1等)時獲得5mL血漿。為了測定質粒的穩(wěn) 定性，在劑量前以及在第一次接種后15分鐘、1、3、8、24、48和72小時時收集ImL血液。抽 取所有其他血液，并且在接種前獲得肝活組織檢查。這個抽血時間表基于由NIRC產生的用 于在非人靈長類動物中的血液收集的指導。收集90mL/月，完全在可允許的限制內。用肝 素作為抗凝劑收集血液。血漿通過在2700rpm下離心10分鐘得自5mL和ImL體積。將血 漿樣品分成500ul等分試樣并且貯存于-80°C。一半肝活組織檢查在福爾馬林中固定，一半 分成2mm切片且在液N2中速凍。D.測定scL-HCV或scLHK-HCV復合物在肝中的存在和在血液中的穩(wěn)定性在小鼠中的初步研究表明封裝顯著增加在肝中發(fā)現(xiàn)的核酸量，并且延長其中它可以在血液中檢測出的時間。在黑猩猩中用封裝的HCVNS3-NS5B質粒證實這些發(fā)現(xiàn)。為了測 定在注射后HCV DNA在循環(huán)中存在多久，在劑量前和第一次注射后15分鐘、1、3、8、24、48和 72小時收集ImL血液。將血漿分成2個等分試樣并且在-80°C下冷凍。一個等分試樣用于 分離質粒(High Pure PCR Template Pr印aration試劑盒(Roche))。從一片2mm速凍肝組 織分離DNA (DNeasy ExtractionKit (Qiagen)) 0陰性對照樣品是來自相同動物的在接種前 獲取的血漿和肝組織。通過PCR評估外源HCV質粒。在不存在逆轉錄酶的情況下使用PCR 使質粒與由于慢性感染存在的任何病毒RNA區(qū)分。此外，使用位于pSCMV主鏈中的一個引 物和在HCV插入片段中的一個引物。因此，僅擴增外源DNA。這種方法已成功地用于pSCMV 載體中的其他插入片段(IND生物分布研究的p53)。為了定量，通過將已知量的NS3-NS5B 質粒加入來自未感染黑猩猩的血漿或肝組織中隨后提取來制備信號標準。FDA具有來自 使用的動物的大量存檔樣品。掃描的凝膠使用IMAGEQUANT 圖像分析軟件(Molecular Dynamics)進行定量，并且通過與標準比較計算質粒的量。從血漿的第二個等分試樣和第 二片速凍肝組織中分離DNA用于DNA分析，使用Stratagene DNAExtraction試劑盒。在 接種前獲取的血漿和肝組織作為陰性對照。使用Gene Image Alkaline Phosphatase DNA Labeling and DetectionSystem(Amersham)執(zhí)行雜交。如上，用于通過DNA分析檢測外源 DNA的探針跨越在載體和插入片段之間的連接處。這種探針由IDT，Inc. (Coralville, ΙΑ) 合成。這種方法也已用于分析在組織中的外源DNA。如上制備標準。隨后通過瓊脂糖凝膠、 印跡和雜交分析樣品。10至50倍過量的探針用于確保所有條帶的飽和。掃描的放射自顯 影照片使用IMAGEQUANT 軟件(Molecular Dynamics)進行定量，并且通過與標準比較
計算質粒DNA的量。如果這種非放射性方法的靈敏度水平太低，那么可以使用由Y32P-ATP 標記的'5末端或可以如先前所述(Fernandez J.，等人，J. Virol，78，9782-9789 (2004)) 執(zhí)行巢式PCR。使用2種方法評估在血液和肝中的DNA幫助確保即使一種方法不成功也能 獲得結果。測試一式三份地執(zhí)行，并且使用t檢驗使來自每只動物的順次血漿樣品與在15 分鐘時觀察到的那種進行統(tǒng)計比較，以評估隨著時間過去DNA濃度的顯著減少。未對肝進 行統(tǒng)計比較，因為關于這種組織的研究是為了證實DNA在這種器官中的存在而不是隨著時 間的穩(wěn)定性。E.在慢性感染的黑猩猩I. V.接種后測試對scLHK-HCV復合物的應答1.評估在外周血中的免疫應答在接受治療疫苗的慢性HCV感染的黑猩猩的外周血中增加的特異性T細胞活性不一定導致在肝中更高的T細胞活性和減少的病毒滴度。因此，分析在這些動物的肝中的T 細胞浸潤和細胞因子應答是關鍵的。然而，外周血可以用作評估誘導的免疫應答的程度和 特異性的第一個來源。肝活組織檢查是昂貴且有限的，并且更多T細胞得自外周血。肝的 研究用于確定在外周血中增加的免疫應答是否與在肝中更大的T細胞活性相關。如本領域 先前描述的(Puig M.，等人，Vaccine，22，991-1000 (2004))，使用Ficoll梯度離心從每2 周獲得的全血中分離PBMCs。從梯度的頂端取出血漿，并且以ImL和200uL等分試樣貯存 于-80°C。約IO8PBMCs和15mL血漿得自40mL全血。解凍冷凍細胞(IO7AiL)的單個等分 試樣，并且在AIM-V培養(yǎng)基(Invitrogen)加上2%人AB血清(Biowhittaker)中洗滌。評 估活細胞數(shù)目，并且通過Elispot (Shoukry N. H.，等人 J. Exp. Med.，197，1645-1655 (2003)) 測試細胞。用于每種分析的細胞總數(shù)目依賴于在一次測定中測試的抗原數(shù)目。使用整組重疊肽(重疊Ilaa的18聚體，NIHReagent Program)，其覆蓋Ia基因組且與Ia基因組對應。 這些肽與用于感染黑猩猩的病毒以及在scL-HCV或scLHK-HCV中的HCV質粒中使用的序列 對應。使用包含30-45個重疊肽的10個肽庫以篩選樣品。在每種測定法中包括陰性卵白 蛋白肽對照、陽性植物血凝素對照和培養(yǎng)基對照。使用IO5細胞/孔一式三份地測試樣品。 樣品針對覆蓋整個病毒基因組的肽進行測試。盡管預期疫苗刺激針對抗原NS3-NS5B的應 答，但這種刺激可能導致改善的T輔助應答或增加的IL-2生產，這導致針對在疫苗中不包 括的病毒抗原的增強的應答。在96孔板中以1 μ g/ml每種單獨的肽和人Elispot測試試 劑盒(U-Cytech, Netherlands) (Shoukry N. H.，等人 J. Exp. Med.，197，1645-1655(2003)) 執(zhí)行PBMCs的預刺激以及產生IFN y、IL4、IL2和ILlO的細胞的Elispot分析。通過從一 式三份測試孔的平均值中扣除一式三份對照(無抗原)的平均值計算特異性點形成單位 (SFU)數(shù)目。如本領域先前所述的(Puig M.，等人，Vaccine，22，991-1000 (2004))，使用96 孔板(IO5細胞/孔，一式三份)對PBMCs執(zhí)行T細胞增殖測定法。用lug/mL蛋白質(NS3、 NS5A或NS5B) (Mikrogen, Germany)或肽刺激細胞。對于后期研究，使用抗人CD4+或CD8+ 免疫磁珠(Dynal) (Puig M.，等人，Hepatology, 44, 736-745 (2006))從總群體中耗盡 CD4+ 和CD8+T細胞，且進行測試以測定識別特異性抗原的特定細胞類型。由這些研究產生的數(shù) 據(jù)給出增強的HCV特異性T細胞應答的最佳指示。對于每只動物在疫苗前和后樣品之間比 較結果。t檢驗用于評估在疫苗接種后SFU的顯著增加。對外周血的研究結果與肝內T細 胞浸潤分析、細胞因子應答和病毒RNA水平的改變結合，以測定這種治療策略的功效。2.血漿細胞因子水平的改變的檢測。在用scL-HCV接種首次用于實驗的黑猩猩后血清細胞因子的分析顯示在接種疫 苗的動物而不是對照中的大量細胞因子(ICAM-l、TGF-i3和IFN-β)的改變。在治療疫苗接 種后檢查一組血清細胞因子的改變，并且與處理前樣品和對照動物比較。使用TransSignal HumanCytokine Antibody Array試劑盒，用在疫苗接種前和后獲取的l_2mL血漿分析細胞 因子。來自未感染黑猩猩的正常血漿作為陰性對照。在血清細胞因子(類型和水平)中可 見的改變與在肝中在mRNA水平下發(fā)現(xiàn)的那些比較。除mRNA的肝內分析外，對血清細胞因 子執(zhí)行這些研究。定量mRNA分析，進行統(tǒng)計分析，并且提供在肝中的細胞因子水平的指示。 重要的是使這些分析偶聯(lián)以測定外周血中的應答是否反映在肝中觀察到的那些。細胞因子 模式中的任何改變與記憶T細胞的持續(xù)關聯(lián)。正相關是關于發(fā)展測定與清除相關的特異性 T細胞的存在的更簡化方法的第一個步驟。3.通過組織學和細胞因子分析評估在肝中的HCV特異性應答a)關于肝浸潤T細胞的存在的測試。通過組織學分析和細胞因子應答測試關于肝中浸潤T細胞的存在。在接受治療疫 苗的慢性感染黑猩猩的外周血中增加的HCV特異性T細胞活性不一定導致在肝中更高的T 細胞活性和減少的病毒滴度。因此，分析在這些動物的肝中的T細胞浸潤和細胞因子應答 是關鍵的。
b)福爾馬林固定的肝組織的分析使福爾馬林固定的石蠟包埋組織切片，就特定蛋白質和細胞標記進行染色⑶4 ； CD8 ；穿孔素；IFN-γ ；IL-2 ；CD45RA/R0 禾口 CCR-7。基于 CD45RA 和 CCR7 的表達可以鑒定 T 細胞群體(Campbell J. J.，等人，Journal of Immunology, 166,877-884(2001) ；SallustoF.,等人 Nature，401，708-712 (1999) ；Seder R. Α.禾口 Ahmed R. , Naturelmmunology,4, 835-842(2003))。執(zhí)行肝切片的免疫組織學分析，以對于每個活組織檢查區(qū)分肝中存在的 淋巴細胞的數(shù)目、類型和定位。使切片在二甲苯中脫蠟，在乙醇中水合，隨后在PBS中洗滌。 對于抗原檢測，用IOmM檸檬酸緩沖液pH 6. 0在100°C下處理組織10分鐘。在與特異性抗 體溫育前，在組織切片上的非特異性位點用5%牛奶封閉。在感染前(歷史貯存樣品)和 在處理前得自相同動物的肝活組織檢查用于比較。用標記的鏈霉親和素_生物素技術和使 用DAB開發(fā)的產品執(zhí)行這些研究。對于處理前和后的切片分析6個視野，并且計數(shù)陽性細 胞類型。用這種染色方法，評估細胞在肝內相對于門靜脈的定位或特定肝細胞類型。使用 t檢驗就T細胞浸潤執(zhí)行統(tǒng)計分析。c)速凍肝組織的分析使用RNeasy Mini Kit (Qiagen，CA)從部分速凍組織中分離總RNA。使用First Strand cDNA Synthesis Kit(Pharmacia)逆轉錄 RNA，并且通過實時 PCR 就細胞因子 mRNA 水平進行測試，使用針對IFN- y、IL2、⑶3、⑶8和⑶4的特異性引物探針組，如本領域先前 所述的(Major M.E.，等人H印atology，39，1709-1720 (2004))。這些細胞因子的水平對內 源對照(GAPDH)進行標準化，并且與每只動物的處理前活組織檢查中的水平進行統(tǒng)計比較 (Thimme R.，等人Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 99,15661-15668 (2002))。同時，小部分冷凍 肝組織用于同時分析一組36種細胞因子的蛋白質水平，使用TransSignal Human Cytokine Antibody Array kit (Panomics)。F.評估毒性。研究在慢性感染個體中的肝相關治療疫苗的作用是特別重要的。盡管疫苗可以導 致減少的病毒滴度，但由于在肝中增強的免疫應答，它可能加重肝炎且導致肝病。來自黑猩 猩的血清和肝組織就肝特異性酶和指示毒性的組織病理學改變進行分析。通過商業(yè)實驗 室(ANTECHDiagnostics)就對肝功能特異的一組標記每周測試等分試樣(2mL)的血漿總 膽紅素、ALT、堿性磷酸酶(ALP)、血清白蛋白、Y-谷氨酰轉移酶(GGT)和谷胱甘肽-S-轉 移酶(GST)。在任何接種后這些標記水平超過正常范圍的增加持續(xù)<2周視為可接受的。 超過正常范圍的持續(xù)水平指示毒性。因為這是對肝病特異的少數(shù)測試之一(Mclntyre， N.禾口 Rosalki, S.Biochemical investigations in the managementof liver disease. In :0xford Textbook of Clinical HepatologyMcIntyre,Benhamou,Bircher,Rizzetto禾口 Rodes (編輯).OxfordUniversity Press, 293-309. (1991))，所以對于每只動物比較處理前 和后的ALT水平以統(tǒng)計評估毒性。為了評估細胞凋亡，用改良的熒光TUNEL測定法使組織染色，使用原位細胞死亡檢測試劑盒TMR Red(Roche)。這種信號在遠紅外范圍中發(fā)出，并且優(yōu)于FITC，因為在 肝切片中關于細胞凋亡的信號在氬激光器下為紅細胞自體熒光。使用Laser Scanning Cytometer(LSC)評估熒光強度和分布。這是基于載玻片的儀器，其以類似于流式細胞儀的 方式執(zhí)行，并且檢測FITC、PE、PI、Cy5和DAPI。最佳化掃描設置并且應用于所有樣品，用相 同方案測量背景、陰性和陽性信號。作為直方圖顯示的數(shù)據(jù)允許信號通過Compucyte程序 進行統(tǒng)計分析和定量評估組織中陽性細胞凋亡信號的百分比區(qū)域以及信號強度。H&E染色的肝切片通過委員會證明合格的獸醫(yī)病理學家就組織病理學改變進行評 估。處理前和后的切片使用用于評估慢性肝炎的Ishak評分系統(tǒng)(0-4級)(Ishak K.，等人，Journal of H印atology，22，696-699 (1995))進行分級。這是建立的用于分級肝活組 織檢查的方法并且在臨床背景中廣泛使用。分級包括門靜脈、門靜脈周圍和腺泡內的炎癥 細胞浸潤以及肝細胞損傷和壞死的評估。使用這3種方法分析肝毒性，提供了這種治療疫 苗對這種器官的作用的完全描述，以評估未來臨床使用的安全性。G.監(jiān)控病毒滴度的改變。免疫應答的初次測試和scL-HCV或scLHK-HCV治療方法的成功是血液中HCV RNA滴度的改變。這些使用內部的、實時RT-PCR測定法(Major Μ. Ε.，等人，J. Virol, 73, 3317-3325(1999) ；Major Μ· Ε·，等人，J. Virol, 73, 3317-3325 (1999))進行測定。使用 TriZol(Invitrogen)從來自處理前和后采血的200uL血清分離總RNA，并且如本領域先前 所述(Major Μ. Ε.，等人，J. Virol，73，3317-3325 (1999) ；Fernandez J.，等人，J. Virol，78， 9782-9789(2004))執(zhí)行RT PCR0使RNA分成重復孔(η = 4)，使用一組HCV RNA標準計算 RNA濃度并且表示為RNA拷貝/mL血漿。我們具有在干凈、受控條件下擴增HCV序列的廣泛 經驗(Major Μ. Ε.，等人，J. Virol，73，3317-3325 (1999) ；Fernandez J.，等人，J. Virol，78， 9782-9789(2004))。在分開的房間執(zhí)行操作以避免污染，并且在所有情況下使用指定的移 液管和試劑。在所有提取中，包括來自未感染黑猩猩的陰性對照血漿，并且在RT-PCR測定 法中使用提取的RNA。比較處理前和后的RNA滴度，以測定滴度的統(tǒng)計學顯著改變。血漿而 不是肝就病毒RNA滴度進行分析。肝活組織檢查是有限的，并且血漿中的滴度直接指示肝 中的水平。僅當動物顯示病毒的清除時，通過更靈敏的巢式PCR就病毒RNA測試肝，所述巢 式PCR檢測出少至 40 個 RNA拷貝 /mL (Major Μ. Ε.，等人!fepatology，39，1709-1720(2004)， Puig Μ.，等人 J. Virol Methods，105，253-263 (2002))。如果靶向的治療疫苗導致RNA滴度的減少，肝內T細胞、肝內細胞因子和外周HCVT細胞應答的增加，那么這是HCV特異性應答在肝中起作用的強烈指示，特別是當與對照動 物比較時。如果肝內T細胞和細胞因子水平增加但病毒RNA滴度不下降，那么這暗示由于 逃逸突變或T細胞功能障礙，誘導的T細胞不識別病毒表位。RNA滴度暫時下降隨后復發(fā)至 處理前水平指示在病毒中的突變發(fā)展，以逃逸新近誘導的T細胞應答。這通過在復發(fā)前和 后的病毒序列分析進行研究。如果觀察到突變，那么T細胞逃逸可以在體外使用PBMCs和 肽進行測試，所述肽代表跨越發(fā)現(xiàn)包含突變的區(qū)域的新和舊氨基酸序列。在慢性HCV感染的黑猩猩中的這些研究對于評估可以在慢性感染的患者中使用 的任何HCV特異性治療疫苗是關鍵的。重要的是顯示HCV特異性T細胞應答的增強不使肝 炎癥增加至臨床治療無法耐受的水平。實施例2免疫脂質體的鼻內(IN)施用經由IN途徑的疫苗施用對于特定類型的病毒例如具有頭與頸組織(這包括鼻和 咽喉)傾向的那些特別有用。例子包括誘導呼吸疾病的病毒，所述疾病不僅包括流感還包 括SARS和禽流感。然而，這個途徑也可以用于遞送其他類型的疫苗。為了比較scL復合物 當IN給予時靶向且轉染局部組織的能力，給予非荷瘤BALB/c小鼠封裝表達螢光素酶基因 的質粒DNA的scL納米免疫脂質體復合物(scLLUC)，或等量的游離、未復合(裸露)質粒 DNA(LUC)(對于2種處理IOug/小鼠/劑量)，或不處理(CTL)。scLLUC復合物如實施例1 中通過簡單混合以0. 33ug IOug lug(TfRscFv Lip DNA)的比制備，用5%右旋糖作為賦形劑。在24小時內施用2個劑量。最后一次劑量后48小時，用螢光素底物(ip施用)以 3mg/小鼠注射動物，并且使用IVIS 100光學成像系統(tǒng)(Kenogen，Alameda CA.) 在麻醉下顯現(xiàn)整個動物(圖16A-16C)。表達的信號強度在實際測量中通過顏色指示。紅 色/黃色具有對應于轉染的螢光素酶基因的最高表達水平的最高強度，同時藍色表示最低 限度表達，而綠色是中等表達。這些表達水平(高/中/低)已在圖16A-16C和17A-17C 上指出(代替顏色表示)。在圖16A-16C中顯而易見的是，與游離的裸露DNA(LUC)(小圖 B)比較，scL復合物(scLLUC)(小圖C)的IN施用導致在鼻區(qū)域中高得多的轉染/表達水 平。小圖A表示未處理對照。令人驚訝和出乎意料的是，當兩者直接施用于待轉染的組織 時(局部遞送)，scL納米免疫脂質體復合物將產生比裸露DNA(這將是目前使用的)好得 多的結果。A.在IV施用后，與裸露DNA比較，質粒DNA有效負荷的增強的分布和定位的證實還使用IVIS 100光學成像系統(tǒng)(Xenogen，Alameda CA)，使非荷瘤BALB/c小鼠成 像，所述小鼠經由IV尾部靜脈注射接受封裝表達螢光素酶基因的質粒DNA的SCL納米免疫 脂質體復合物(scLLUC)(如上)，或等量的游離、未復合(裸露)質粒DNA (LUC)(對于2種 處理25ug/小鼠/劑量)，或未處理(CTL)。在24小時內施用2個劑量。最后一次劑量后 48小時，用螢光素底物(ip施用)以 3mg/小鼠注射動物，并且在處于麻醉時顯現(xiàn)整個動 物。如圖17A-17C中所示，在接受裸露DNA的小鼠中(小圖B)任何地方都不存在明顯的信 號，除在尾部中的注射部位外(LUC)。(在嘴上的小量可能是由于在注射部位處舔而導致)。 相比之下，在攜帶相同量的質粒DNA的scL復合物的iv施用后(scLLUC)(小圖C)，動物幾 乎各處都存在中至高水平的信號。小圖A表示未處理對照。其中淋巴結和肝定位的位置更 強烈。這可能是由于樹突細胞和枯否細胞的確表達轉鐵蛋白受體并且因此可以攝取復合物 的事實。然而，在正常非腫瘤組織中的這種高水平攝取和表達是出乎意料且令人驚訝的。實施例3使用小鼠模型最佳化scL-HCV或scLHK-HCV對肝細胞的體內遞送。在小鼠研究中使用由脂質A配制的scL或scLHK。20至30微克DNA經由脂質體復 合物在脂質體復合物中經由尾部靜脈遞送給重復小鼠，經過24小時時期使用2-3次接種。 為了跟蹤內吞到特定細胞類型內的脂質體，用羅丹明-DOPE標記的磷脂以總脂質的0. 05摩 爾百分比使用(Avanti Polar Lipids，AL)。通過蛋白質印跡分析組織樣品，在注射后24-48 小時通過流式細胞術就HCV特異性蛋白質的表達進行細胞的組織學染色和高分辨率成像。 對于組織學分析，組織在Tissue-Tek培養(yǎng)基中進行速凍或進行福爾馬林固定。使用低溫恒 溫器或切片機使組織切片，并且就特定蛋白質或細胞標記進行染色。對于石蠟包埋的福爾 馬林固定的組織，使切片在二甲苯中脫蠟，并且在用PBS洗滌前在乙醇中水合。對于抗原檢 測，用IOmM檸檬酸緩沖液pH 6. 0在微波中在100°C下處理組織10分鐘。在冷卻和洗滌后， 使用0. 3% H2O2達到內源過氧化物酶活性的猝滅。在與特異性抗體溫育前，在組織切片上 的非特異性位點用5%牛奶或正常血清封閉。對于通過流式細胞術的肝細胞分析，已開發(fā)灌注技術用于從小鼠中分離總肝臟細 胞和居住T細胞，以用于流式細胞術分析。操作自始至終小鼠維持在麻醉下，從而使得血壓 最初得以維持。這防止靜脈萎陷并且因此增加后續(xù)套管插入術的成功。小鼠用異氟烷進 行麻醉，并且操作自始至終經由鼻錐附著維持麻醉。切開腹腔以暴露肝，并且將腸移位到小鼠的左側以暴露門靜脈。將24G IV輸注組插入門靜脈內。用預熱的Liver Perfusion Medium(Gibco ；配制用于清洗肝的血液、預防凝血且起始細胞與細胞接觸的松弛的緩沖平 衡鹽溶液)以3ml/分鐘輸注肝5分鐘。隨后灌注預熱的Liver Digest Medium (Gibco ；用于解離活肝細胞的合格Collagenase-Dispase培養(yǎng)基)，以3ml/分鐘通過肝，共10-12分 鐘。隨后從小鼠中取出肝，并且置于冰上。通過經過100 μ m篩隨后為低速離心來從細胞碎 片中取出和純化肝細胞。使用羅丹明標記的脂質體，細胞可以通過流式細胞術直接進行分 析，以測定脂質體/DNA復合物的轉染效率或細胞定位。使用流式細胞術使復合物到肝細胞 內的攝取與經由脾細胞的攝取或非靶向的脂復合物的攝取比較。通過低速離心使細胞與脾 細胞碎片分離。用ACK裂解緩沖液(BiowhittakenMD)使紅細胞裂解，洗滌后，使細胞經過 IOOym細胞濾網(Falcon，BD，NJ)。取出另外的組織以分析DNA到其他器官內的攝取。具 體地，取出腎、心臟和肺組織，并且通過蛋白質印跡分析蛋白質提取物。A. scL-HCV或scLHK_HCV針對體內功效的劑量最佳化BALB/c小鼠用于測定最佳生物劑量(OBD)，以在不存在持續(xù)肝酶升高的情況下達 到良好免疫應答。作為對照，使用游離(未復合)質粒、攜帶空載體的修飾脂質體和缺乏 HCV基因的非重組腺病毒。使用5只動物/組。施用的最高劑量是約50 μ g。小鼠組通過 i.v.注射接受包含1、5、10、20和50yg/注射的脂質體/DNA復合物(如實施例1中所述制 備)。它們接受在0和4周時的接種隨后為在10周時的腺病毒加強。這次加強后4周，通 過流式細胞術和體外測試分析肝和脾，以測定通過如上所述的免疫接種誘導的T細胞的特 征和特異性。為了簡化這個實驗，對照動物僅接受最高劑量的DNA和腺病毒。動物就肝酶 和肝中的組織學改變進行監(jiān)控。一旦已確定OBD后，這個劑量用于每次注射，同時注射次數(shù) 以4周間隔從1次到5次變化，隨后為在最后一次注射后6周的腺病毒加強。4周后，如上 分析肝和脾，以測定導致最佳應答的注射次數(shù)。B.誘導的T細胞應答的交叉反應性。盡管在美國占優(yōu)勢的HCV基因型是la，但在疫苗開發(fā)中需要解決來自超過1個 HCV基因型的病毒表位識別。在小鼠中評估誘導的免疫應答的交叉反應性，使用與來自基因 型Ib和2a的共有序列對應的重疊肽。與la H77基因組序列對應的整組重疊18肽已由NIH AIDSResearch and Reference Reagent Program 提供。這個 Program 具有可用的與 lb J4 基因型對應的相似重疊肽組。2型肽組購自Mimotopes (Washington，NC)。為了更好地評估 在患者群體中可能發(fā)生的交叉反應性，使用上文描述的HLA-A2轉基因小鼠執(zhí)行這些分析。 這些小鼠表達HLA-A2MHC分子，并且可以呈遞HLA-A2表位。使用Elispot測定法評估針對 代表不同基因型的肽庫的應答，并且用對應于用于免疫接種的la H77序列的肽平行執(zhí)行。 如果未觀察到交叉反應性，那么使用包含與所有3種基因型對應的DNA質粒的納米脂復合 物，隨后為使用各自與3種不同基因型對應的3種rAd的加強測試三價疫苗。評估針對每 種單獨的基因型的免疫應答，并且與當使用單獨的個別基因型序列時獲得的應答比較。C.體內安全性研究scL-HCV或scLHK_HCV的小鼠LDltl基于如上所述測定的0BD。由OBD開始，逐漸增 加劑量的質粒DNA(直至IOOyg) —周注射一次，共5周。由于復合物中的組分比已被設定， 增加質粒DNA的量也增加復合物(如實施例1中制備)中的TfRscFv和Lip或Lip-HK的 量。scL-HCV 或 scLHK-HCV i. v.、i. p.、i. m.或 i. d.注射到雄性和雌性 4-6 周大的 BALB/C小鼠內，10只小鼠/組。動物的重量每周評估2次，并且它們每天就毒性癥狀(例如，消瘦)進行監(jiān)控。接受游離質粒DNA或無配體脂質體-DNA的動物用作對照。為了評估短期 毒性，一半小鼠在最后一次注射后2天處死。其余在最后一次劑量后2周處死，以評估長期 毒性。組織學檢查各種器官和組織，包括肝、生殖腺、肺、胰腺、腎、心臟、皮膚、脾、腦、腸和骨 髓。肝酶水平也在每周基礎上進行監(jiān)控(Antech Diagnostics)。來自器官的組織樣品進行 速凍并且貯存于-70°C用于提取DNA。對所有組織樣品執(zhí)行PCR分析，以在接種后在所有組 織中評估scLHK-HCV的生物分布和DNA的持續(xù)。對HCV基因特異的引物是可獲得的。一旦已確定DNA/脂質體復合物的LDltl，該劑量就與漸增劑量的重組腺病毒組合用 于處理雄性和雌性BALB/c小鼠。每組10只小鼠接受scL-HCV或scLHK-HCV (如實施例1中 制備)的1或3次i.v.、i.p.、i.m.或i.d.注射/周，共5周，隨后為每周2次皮下(s. c.) 施用漸增劑量的重組腺病毒(IO8至IO9感染單位)，共3周。如上，一半小鼠在最后一次劑 量后2天處死，以評估短期應答，一半在2周后處死，以評估長期應答。組織學分析各種器官 和組織，包括生殖腺、肺、胰腺、腎、心臟、皮膚、脾、腦、腸和骨髓，并且特別重點關注肝組織 學。在這個研究過程中每周獲取血液并且評估肝酶。取出脾并且就T細胞應答進行分析， 以評估任何耐受誘導是否已在這些動物中出現(xiàn)。在雄性和雌性裸鼠中執(zhí)行血漿藥代動力學分析和生物分布研究。動物以OBD接受 scL-HCV或scLHK-HCV復合物(如實施例1中制備)的一次i. v.、i. p.、i. m.或i. d.注射。 在劑量前以及在復合物施用后5分鐘、15分鐘、30分鐘、1小時、2小時、4小時、8小時、24小 時、48和72小時時，經由心臟穿刺在麻醉下在包含肝素鈉作為抗凝劑的管中獲得血樣。對 小鼠實施安樂死，并且快速切割肝、胰腺、生殖腺、脾、腎、肺、心臟、淋巴結和腦，在冰冷的生 理鹽水中漂洗，并且在干冰上速凍。血樣在3000rpm下于4°C離心10分鐘，以使血漿與細胞 分離。血漿和組織樣品都貯存于-80°C。測定在血漿和組織樣品中的HCV質粒濃度。簡言之，使用苯酚_氯仿提取法從血漿 樣品中，并且使用DNA提取試劑盒(Stratagene，La Jolla, CA)從組織樣品中分離質粒DNA。 通過將已知量的質粒加入空白血漿或空白組織樣品中隨后進行提取來制備HCV濃度標準。 隨后通過瓊脂糖凝膠、印跡和雜交分析提取物。使用Gene ImageAlkaline Phosphatase DNA Labeling and Detection System(Amersham)執(zhí)行雜交,使用 HCV 序列作為探針。10 至 50
倍過量的探針用于確保所有條帶的飽和。掃描放射自顯影照片并且使用IMAGEQUANT 軟件(Molecular Dynamics)進行定量，并且通過與標準比較計算各種樣品中的質粒DNA的 量。備選地，探針用Y32P-ATP進行5'末端標記或執(zhí)行對HCV特異的巢式PCR。通過標準 方法(參見例如，Gokhale，P. C，等人，Gene Therapy 4 1289-1299 (1997))評估血漿藥代動 力學參數(shù)。在靈長類動物中評估肝靶向的安全性和功效。在恒河猴中用scL-HCV或scLHK-HCV (如實施例1中制備)和腺病毒重組體執(zhí)行 劑量應答研究。誘導攜帶特異性記憶標記的最佳HCV特異性T細胞的免疫接種系統(tǒng)和劑量 用作猴模型中的起始劑量。用scL-HCV或scLHK-HCV接種恒河猴，并且用s. c.遞送的直至 IO12感染單位的重組腺病毒加強。提議的疫苗接種方案由在0和3個月時的DNA引發(fā)和加 強，隨后為在6個月時的腺病毒組成。對照組用與空載體、游離質粒DNA復合的scL-HCV或 scLHK和非重組腺病毒接種。
第一個研究使用4個組(3個疫苗和1個對照)，2只動物/組。組1-3接受漸增 劑量的納米復合物scL-HCV或scLHK-HCV，同時維持由在上文描述的小鼠中的劑量最佳化 研究測定的水平下的rAd接種。組4是對照組，接受scL或scLHK-空載體，隨后為用非重 組腺病毒的加強。如果觀察到應答中的穩(wěn)定期，那么使用其余4只動物以在穩(wěn)定期中間的 scL-HCV或scLHK-HCV劑量執(zhí)行免疫接種研究，并且使rAd劑量增加0. 51og1(1。(2組動物， 2只動物/組，2個增加劑量的rAd)。在研究1中來自對照組的數(shù)據(jù)提供用于這些動物的對 照數(shù)據(jù)。如果未觀察到穩(wěn)定期，并且相對于劑量擴大免疫應答增加并且具有最低限度ALT 升高，那么使用增加劑量的scLHK-HCV，在其余4只動物中執(zhí)行第二個研究。在疫苗接種的獼猴中，在外周血和肝中評估特異性免疫和記憶T細胞的存在，使 用Elispot、流式細胞術和組織學分析。透皮肝活組織檢查每月執(zhí)行2次；一半組織樣品置 于培養(yǎng)基中，四分之一在液氮中速凍，并且四分之一在甲醛中固定。執(zhí)行肝切片的免疫組織 學分析，以在每次接種后以2-4周間隔區(qū)分在肝中存在的淋巴細胞數(shù)目、類型和定位。評估 ⑶95、⑶45RA/⑶45R0、⑶62L和⑶28的表達，特別地，這看起來是這個物種中記憶T細胞亞 群的鑒定中的有用標記。測定恒河猴的單元型，并且在外周血中使用鑒定的T細胞表位。制備四聚體，并且 如上所述通過用于小鼠T細胞分析的流式細胞術分析用于顯示記憶T細胞的特異性。用已 知T細胞表位和多色流式細胞術表型，可以使用極小數(shù)目的細胞評估與T細胞相關的細胞 因子和細胞裂解分子。就ALT升高分析血液，并且針對凋亡標記使組織染色，以測定肝中的 細胞是否由于在引發(fā)過程中誘導的對HCV抗原特異的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的作用而 經歷凋亡。E.用脂質體/DNA復合物處理慢性黑猩猩scL-HCV或scLHK-HCV/腺病毒疫苗在慢性黑猩猩中用作治療疫苗。4只慢性感染 的黑猩猩最初都被與基因型la(H77株系)對應的單個序列單克隆病毒感染。這些動物已 慢性感染3. 5-5年。HCV是RNA病毒，并且因此基因組在復制過程中經歷突變。來自在用 這種相同單克隆儲備物接種后持續(xù)感染的動物的病毒在感染約6個月后積累突變(可能由 于免疫壓力)。已制備了在感染后38周時從Ch6412分離的病毒的序列數(shù)據(jù)。整個編碼區(qū) 的分析揭示9個氨基酸改變，其中6個位于NS3、NS5A和NS5B區(qū)中。盡管在循環(huán)病毒基因 組中的這些突變，在這些動物中在治療疫苗中還是使用野生型序列。使用與許多良好保守 的表位對應的野生型序列在減少病毒滴度方面是有效的。作為第一終末點，在每只動物的 血清中評估病毒RNA滴度的減少，相對于處理前水平(作為第二終末點)。在肝中測量增 加的T細胞活性，并且肝內的細胞因子mRNA水平增加。與處理前水平比較，RNA滴度超過
0.51og10的減少和T細胞數(shù)目或細胞因子mRNA水平超過2倍的增加視為顯著的。2只動物 用治療疫苗接種，并且2只動物用載體對照接種。對于治療疫苗，scL-HCV或scLHK-HCV(如實施例1中制備)以OBD以3周間隔
1.v.遞送3次，或空DNA載體用于對照動物。最后一次DNA接種后4周(第13周)，施用 表達相同HCV抗原的重組腺病毒(1012感染單位i. v.)或非重組病毒。動物將跟蹤直至6 個月。研究自始至終，每2周獲得活組織檢查，并且每周獲得血液(20-50mL)，就血清ALT升 高、HCV RNA滴度和肝內T細胞浸潤監(jiān)控動物。使用實時RT-PCR測定法測定HCV RNA滴度， 使用靶向HCV的5' UTR和核心區(qū)的引物和探針。在外周血和肝中檢查增強的特異性免疫和記憶T細胞的存在，使用Elispot、流式細胞術和組織學分析。通過Klatskin技術執(zhí)行透 皮肝活組織檢查；一半組織樣品置于培養(yǎng)基中，四分之一在液氮中速凍，并且四分之一在甲 醛中固定。F.新鮮肝組織的分析通過機械勻漿從肝活組織檢查中分離淋巴細胞，隨后為洗滌和計數(shù)。細胞用 針對 CD4、CD8、CD45RA/CD45R0、CD95、CD62L 和 CD28 的抗體(BD Pharmingen)進行染 色，并且通過流式細胞術測定數(shù)目。使用FACS-Calibur(Becton Dickenson)使用軟件 Cellquest (BectonDickenson)獲得事件用于分析，使用7AAD (BD Pharmigen)以排除死細 胞。如對于小鼠和獼猴研究描述的，四聚物用于研究來自處理的黑猩猩的特異性T細胞的 功能。在黑猩猩中，MHC單元型稱為Patr (黑猩猩屬(Pan Troglodytes))型。已針對黑 猩猩并且針對慢性動物鑒定這些Patr等位基因中的數(shù)種，已鑒定了由來自這些動物的各 自的T細胞識別的Patr等位基因和HCV表位序列。這些動物中的循環(huán)病毒在持續(xù)感染過 程中可能在先前鑒定的表位中已摻入突變。在T細胞表位的詳細分析后，用T細胞表位合 成新四聚體用于在流式細胞術分析中使用。T細胞克隆還已在體外開發(fā)用于長期分析。用 100，000 γ 輻射的 PBMCs、0. 01g/ml 抗 CD3 和 100U/ml IL-2 克隆淋巴細胞。G.速凍肝組織的分析使用RNeasy Mini Kit (Qiagen，CA)從速凍組織中分離總RNA。使用First Strand cDNA Synthesis Kit(Pharmacia)逆轉錄 RNA，并且通過實時 PCR 就細胞因子 mRNA 水平進行測試，使用針對IFN-γ、⑶3、⑶8和⑶4的特異性引物探針組(Perkin-Elmer AppliedBiosystems,CA) 0這些細胞因子的水平對內源對照(GAPDH)進行標準化，并且與每 只動物處理前活組織檢查中的水平進行比較。細胞因子mRNA水平超過2倍的增加或減少 視為顯著的。H.福爾馬林固定的組織的分析使用切片機使福爾馬林固定的組織切片，并且就特定蛋白質、細胞標記或凋亡標 記進行染色，以測定肝中的細胞是否由于在疫苗接種過程中誘導的對HCV抗原特異的CTLs 的作用而經歷凋亡。對肝切片執(zhí)行免疫組織學分析，以區(qū)分對于每個活組織檢查在肝中存 在的淋巴細胞數(shù)目、類型和定位。使切片在二甲苯中脫蠟，并且在用PBS洗滌前在乙醇中水 合。對于抗原檢測，用IOmM檸檬酸緩沖液pH 6. O在微波中在100°C下處理組織10分鐘。 在與特異性抗體溫育前，在組織切片上的非特異性位點用5%牛奶或正常血清封閉。在感染 前(歷史貯存樣品)和在處理前得自相同動物的肝活組織檢查用于比較。I.在I期臨床試驗的準備中的正式藥代動力學和毒理學研究用1個對照組(30只小鼠)和2個處理組(各30只小鼠，一半雄性和一半雌性) 用低(比OBD或LD10低IOx)和高(比OBD或LD10高10倍)劑量的如實施例1中所述制備 的scL-DNA或scL-HK-DNA復合物執(zhí)行毒理學研究。以上文確定的給藥時間表在第1天時 開始注射復合物。在最后一次注射后2天、3周和6周處死來自每個組的10只小鼠。每天 監(jiān)控體重和食物攝取。評估關于對照和處理組的臨床病理學(尿血液學、臨床化學、特別是 肝酶)和組織病理學。包括下述器官注射部位、腦、胰腺、腹股溝淋巴結、骨髓(組織和涂 片)、肝、腎、睪丸/卵巢、脾、肺、心臟。
生物分布研究這個研究包括在復合物的單次注射后的4個時間點(2天、2周、4 周和6周)以最高劑量的1個對照(10只小鼠)和4個處理組(各10只小鼠)。在所有組 中對下述器官執(zhí)行如上通過DNAPCR的分析肝、骨髓、胰腺、腎、脾、注射部位、睪丸/卵巢、 腹股溝淋巴結、肺、心臟、腦。實施例4通過經由化學綴合制備的納米免疫脂質體在人中誘導針對病毒抗原的免疫應答本發(fā)明還提供了用于在人(以及其他哺乳動物和動物)中誘導針對病毒抗原的免 疫應答的方法，其包括給個體施用配體靶向的陽離子脂質體復合物，所述復合物包含編碼 病毒蛋白質和白介素的核酸分子，例如一種或多種質粒包含編碼充當抗原的病毒蛋白質的 基因、編碼一種或多種白介素的基因。包含各種靶向配體的復合物可以與脂質體的表面直 接化學綴合，并且基本上如上文實施例1中所述如下制備MPB-脂質體通過由 Campbell MJ (Biotechniques 1995 Jun ； 18 (6) 1027-32)描 述的那種改良的乙醇注射法制備。4-(對馬來酰亞胺基苯基)丁酸鹽-DOPE(MPB-DOPE) (Avanti Polar Lipids)包括在脂質體制劑中[脂質A(D0TAP DOPE, 1 1摩爾比)； 脂質B(DDAB DOPE, 1 1摩爾比)；脂質D(D0TAP Choi, 1 1摩爾比)；和脂質 G(D0TAP DOPE Choi, 1 1 1摩爾比)]，至5-8%摩爾的總脂質。簡言之，使所有脂 質溶解于乙醇中并且混合，用Hamilton注射器注50-60°C的渦旋純水內。使溶液渦旋另外 10-15分鐘。終濃度是l_2mM總脂質。加入IM HEPES, pH7. 5 (pH7. 0-8. 0)至10_20mM的終濃 度。因為馬來酰亞胺基團在PH>7的水溶液中不穩(wěn)定，所以脂質體適當?shù)卦谒?pH 5-6. 5) 中制備。在與scFv-SH連接前，pH可以用1MHEPES緩沖液，ρΗ7· 0-8. 0調整至7. 0-8. 0，以 促進后包被反應。以約1 1至約1 100、適當?shù)丶s1 10至約1 50 (w W)、更適當?shù)丶s 1 20至約1 40例如1 30的蛋白質/脂質比，將ScFv-SH或具有-SH基團的任何抗 體或抗體片段(包括Fab ‘或Mab)加入MPB-脂質體中。溶液通過輕輕旋轉( 20-30RPM) 在室溫下混合30分鐘，以產生scFv-Lip。scFv-Lip無需純化而使用，盡管它也可以通過 SepharoseCL-4B柱層析進行純化。為了產生scFv-Lip-DNA復合物，必要時將質粒DNA稀 釋于水中，并且以約0.5 1至約1 40(yg總核酸yg脂質)、適當?shù)丶s1 5至約 1 20 ( μ g總核酸μ g脂質)，例如1 10 ( μ g總核酸Pg脂質)的DNA/脂質比加 入scFv-Lip中，并且使混合物倒轉5-10秒，或對于更大體積在20-30RPM下旋轉1_2分鐘。 最終的混合物在室溫下保持10-15分鐘，在約5分鐘后再次輕輕倒轉5-10秒。對于在體內 的使用，加入50%右旋糖或50%蔗糖至5-20% (V V)的終濃度，并且通過輕輕倒轉5-10 秒混合，或對于更大體積在20-30RPM下旋轉1-2分鐘。scFv-Lip-DNA無需純化而使用，盡 管它也可以通過S印harose CL-4B柱層析進行純化。預期80-100%的scFv(或具有-SH基 團的任何抗體)與脂質體綴合。在與復合物結合/封裝前，使編碼病毒抗原和白介素的質?；旌显谝黄?，以0. 1摩 爾編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分子比10摩爾編碼一種或多種白介素的 一種或多種核酸分子；至10摩爾編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分子比0. 1 摩爾編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子的插入片段比插入片段摩爾比。例如， 使用1摩爾編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分子的插入片段比1摩爾編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子的插入片段的比。如果待針對其接種疫苗的疾病是HIV，那么使用的質粒DNA適當?shù)厥前幋a包膜蛋白質(Vanniasinkam, Τ.禾口 Ertl, H. C. (2005) :Adenoviral gene delivery for HIV-I vaccination. Current GeneTherapy, 5 :203_212. ；Ferrantelli, F.禾口 Ruprecht, R.Μ. (2002) !Neutralizing antibodies against HIV-back in the majorleagues ？ Current Opinion in Immunology, 14 495-502.)禾口/ 或 Nef 蛋白質(Vanniasinkam, Τ.禾口 Ertl, H.C. (2005) :Adenoviral genedelivery for HIV-I vaccination. Current Gene Therapy, 5 203-212. ；Lichterfeld, Μ.，Yu, X. G.，Cohen, D.，Addo, Μ. Μ.，Malenfant, J.， Perkins, B. , Pae, Ε. , Johnston, Μ. N. , Strick, D. , Allen, Τ. Μ. , Rosenberg, Ε. S. , Korber, B. ,Walker,B. D.和Altfeld，M. (2004) =HIV-I Nef is preferentially recognized byCD8 T cells in primary HIV-I infection despite a relatively highdegree of genetic diversity. AIDS, 18 1383-1392.)；禾Π / 或 gpl40(Smith，S. Μ. (2002) :HIV vaccine development in the nonhumanprimate model of AIDS. Journal of Biomedical Science, 9:100-111.)中的一種或多種的一種或多種基因的那種。由這種DNA編碼的一種或多種蛋 白質充當抗原以誘導免疫應答。此外，相同復合物適當?shù)匕|粒，所述質粒包含編碼任何 白介素、適當?shù)匕捉樗?和/或白介素12和/或白介素15的基因。如果待針對其接種疫苗的疾病是流感，那么使用的質粒DNA適當?shù)厥前?石馬血凝素(HA) (Tamura, S.，Tanimoto，T.禾口 Kurata，Τ. (2005) :Mechanisms of broad cross-protection provided byinfluenza virus infection and their application to vaccines. Japanese Journal of Infectious Diseases，58 :195_207· ；Cox, Μ. M. (2005) Cell-based protein vaccines for influenza. CurrentOpinion in Molecular Therapeutics，7 24~29. ；Ze, C，Kurata, T.禾口 Tamura，S. (2000) !identification of effective constituentsof influenza vaccine by immunization with plasmid DNAs encodingviral proteins.Japanese Journal of Infectious Diseases，53 219-228.)、和 / 或神經氨酸酶(NA) (Tamura, S.，Tanimoto，Τ.和 Kurata, Τ. (2005) Mechanisms of broad cross-protectionprovided by influenza virus infection and their application tovaccines.Japanese Journal of Infectious Diseases, 58 195-207. ；Cox, Μ. M. (2005) :Cell_based protein vaccines for influenza. Current Opinion in Molecular Therapeutics，7 24~29. ；Ze, C，Kurata, T.禾口 Tamura， S. (2000) !identification of effectiveconstituents of influenza vaccine by immunization with plasmidDNAs encoding viral proteins. Japanese Journal of InfectiousDiseases，53 :219_228.)、和 / 或核衣殼(Cox,Μ. Μ. (2005) :Cell-basedprotein vaccines for influenza. Current Opinion in MolecularTherapeutics，7 :24_29·)禾口 / 或基質蛋白 M2 (Cox，M. Μ. (2005) Cell-based protein vaccines for influenza. Current Opinion inMolecular Therapeutics，7 :24_29.)的一種或多種基因的那種。由這種 DNA編 碼的一種或多種蛋白質充當抗原以誘導免疫應答。此外，相同復合物適當?shù)匕|粒，所述 質粒包含編碼任何白介素、適當?shù)匕捉樗?和/或白介素12和/或白介素15的基因。如果待針對其接種疫苗的疾病是SARS，那么使用的質粒DNA適當?shù)厥前幋a 剌突糖蛋白、和/或核衣殼和/或結構蛋白質Si、和/或結構蛋白質M、和/或結構蛋白質N(Weiss,S. R.禾口Navas-Martin,S. (2005) Coronavirus pathogenesis and the emerging pathogensevere acute respiratory syndrome coronavirus. Microbiology Molecular Biology Reviews，69 :635-664.)的一種或多種基因的那種。由這種DNA編碼的一種或多 種蛋白質充當抗原以誘導免疫應答。此外，相同復合物適當?shù)匕|粒，所述質粒包含編碼 任何白介素、適當?shù)匕捉樗?和/或白介素12和/或白介素15的基因。
如果待針對其接種疫苗的疾病是禽流感(也稱為H5N1)，那么使用的質粒DNA 適當?shù)厥前幋a血凝素(Wong，S. S.和 Yuen，K. Y. (2006) =Avian influenza virus infections in humans. Chest, 129 156-168. ；Stephenson, I. , Bugarini, R. , Nicholson, K. G. , Podda, A. , Wood, J. Μ. , Zambon, M. C 禾口 Katz, J. M. (2005) :Cross_reactivity to highly pathogenic avian influenza H5Nlviruses after vaccination with nonadjuvanted andMF59_adjuvanted influenza A/Duck/Singapore/97(H5N3)vaccine a potential priming strategy. Journal of Infectious Diseases,191 1210-1215.； Treanor, J. J. , Wilkinson, B. Ε. , Masseoud, F. , Hu-Primmer, J. , Battaglia, R., 0' Brien, D. ，Wolff, M. ，Rabinovich, G. ，Blackwelder, W.禾口 Katz，J. M. (2001) =Safety andimmunogenicity of a recombinant hemagglutinin vaccine for H5influenza in humans. Vaccine, 19 :1732-1737.)的一種或多種基因的那種。由這種DNA編碼的一種或多 種蛋白質充當抗原以誘導免疫應答。此外，相同復合物適當?shù)匕|粒，所述質粒包含編碼 任何白介素、適當?shù)匕捉樗?和/或白介素12和/或白介素15的基因。如果待針對其接種疫苗的疾病是埃博拉、馬爾堡、或絲狀病毒科(filoviridae) 中的任何一種，那么使用的質粒DNA適當?shù)厥前幋aVP24、和/或VP30、和/或VP35、和/ 或 VP40、和 / 或 sGP、和 / 或糖蛋白和 / 或核蛋白質(Hart，M. K. (2003) =Vaccine research effortsfor filoviruses. International Journal for Parasitology,33 583-595.； Wilson, J. A. , Bosio, CM.禾口 Hart, M. K. (2001) :Ebola virus :the search for vaccines and treatments. Cellular& Molecular Life Sciences, 58 :1826-1841.)的一種或多種基 因的那種。由這種DNA編碼的一種或多種蛋白質充當抗原以誘導免疫應答。此外，相同復 合物適當?shù)匕|粒，所述質粒包含編碼白介素2和/或白介素12和/或白介素15的基 因。如果待針對其接種疫苗的疾病是乙型肝炎，那么使用的質粒DNA適當?shù)厥前?編碼乙型肝炎表面抗原(HBsAg) (Hanke，T. (2006) :0n DNA vaccines and prolonged expression of immunogens. European Journal of Immunology, 36 806-809. ；Zuckerman, J. N. (2006) :Vaccination against hepatitis A and B !developments, deployment and delusions. Current Opinion in InfectiousDiseases, 19 456-459.)、禾口 / 或核 衣殼(HBc)(Michel, Μ. L.禾口 Mancini-Bourgine, Μ. (2005) Therapeutic vaccination againstchronic hepatitis B virus infection. Journal of ClinicalVirology,34 Suppl 1 :S108-S114.)的一種或多種基因的那種。由這種DNA編碼的一種或多種蛋白質充 當抗原以誘導免疫應答。此外，相同復合物適當?shù)匕|粒，所述質粒包含編碼任何白介 素、適當?shù)匕捉樗?和/或白介素12和/或白介素15的基因。如果待針對其接種疫苗的疾病是西尼羅病毒、登革熱、黃熱病、或黃病毒科 (flaviviridae)中的任何一種，那么使用的質粒DNA適當?shù)厥前幋aE糖蛋白的一種或多種基因的那種，所述蛋白質引發(fā)大多數(shù)病毒中和抗體(參見Sampathkumar，P.，“ West Nile Virus :Epidemiology，Clinical Presentation，Diagnosis and Prevention，" Mayo Clinic Processings 78 1137-1144 (2003) ；King, N.J.C, “ Immunopathology of Flavivirus Infections， Immunology, “ Immunology and Cell Biology 85 33-42(2007))。由這種DNA編碼的一種或多種蛋白質充當抗原以誘導免疫應答。此外，相 同復合物適當?shù)匕|粒，所述質粒包含編碼任何白介素、適當?shù)匕捉樗?和/或白介素12 和/或白介素15的基因。如上制備的最終復合物的大小適當?shù)卦诩s50-500 (nm)之間，具有正ζ電位，如通過動態(tài)光散射使用 Malvern ZETASIZER NANO-ZS 或 Malvern ZETASIZER 3000 測定 的。這個大小足夠小以有效經過毛細血管床并且到達靶APC細胞。如上制備的復合物作為預防或治療疫苗使用。對于預防，將如上制備的配體靶向 的陽離子脂質體復合物納米脂復合物疫苗靜脈內注射到哺乳動物內，例如先前未暴露于病 毒疾病的人。使用復合物在0、4和8周時進行注射。用于給受試者接種疫苗的復合物適當?shù)?以0. 33ug IOug lug(TfRscFv Lip DNA)的比制備，用5%右旋糖作為賦形劑。復合 物中的DNA總量為0. 01至10mg/kg/注射。合適量是0. 164mg/kg/注射，這是7_12mg DNA/ 注射(基于受試者的重量)。將制備的復合物注入250ml 5%右旋糖的袋內用于i. v.輸注， 或作為推注注射，通過靜脈內(IV)、瘤內(IT)、損傷內(IL)、氣溶膠、透皮、經口、內窺鏡、局 部、肌內(IM)、皮內(ID)、眼內(10)、腹膜內(IP)、經皮(TD)、鼻內(IN)、大腦內(IC)、器官 內(例如，肝內)、緩慢釋放埋植劑或皮下施用，或經由使用滲透或機械泵的施用。對于治療用途，將如上制備的配體靶向的陽離子脂質體復合物納米脂復合物疫苗 靜脈內注射到哺乳動物內，例如慢性感染病毒疾病(例如，乙型肝炎)的人，或急性暴露于 病毒疾病(例如，埃博拉、SARS、H5N1、天花、西尼羅病毒)的人。包含在與用于預防用途相 同的范圍中的量的DNA的復合物在250ml 5%右旋糖溶液中i. v.遞送，或作為推注遞送，在 第0、4和8周時3次，通過靜脈內(IV)、瘤內(IT)、損傷內(IL)、氣溶膠、透皮、經口、內窺 鏡、局部、肌內(IM)、皮內(ID)、眼內(10)、腹膜內(IP)、經皮(TD)、鼻內(IN)、大腦內(IC)、 器官內(例如，肝內)、緩慢釋放埋植劑或皮下施用，或經由使用滲透或機械泵的施用。實施例5通過經由簡單混合制備的納米免疫脂質體復合物在人中誘導針對病毒抗原的免 疫應答本發(fā)明還提供了用于在人(以及其他哺乳動物和動物)中誘導針對病毒抗原的免 疫應答的方法，其包括給個體施用配體靶向的陽離子脂質體復合物，所述復合物包含編碼 病毒蛋白質和白介素的核酸分子，例如一種或多種質粒包含編碼充當抗原的病毒蛋白質的 基因、編碼一種或多種白介素的基因。包含與脂質體的表面直接復合/結合但不化學綴合 的各種靶向性配體的復合物基本上如上文實施例1中所述如下制備通過由Campbell MJ (Biotechniques 1995 Jun ;18 (6) :1027_32)描述的那種改 良的乙醇注射法制備脂質體[脂質A(D0TAP DOPE, 1 1摩爾比)；脂質B(DDAB DOPE, 1 1 摩爾比)；月旨質 D(D0TAP Choi, 1 1 摩爾比)；和月旨質 G(D0TAP DOPE Chol, 1:1: 1摩爾比)]。簡言之，使所有脂質溶解于乙醇中并且混合，用Hamilton注射器注 入50-60°C的渦旋純水內。使溶液進一步渦旋10-15分鐘。終濃度是l_2mM總脂質。
通過在混合的復合物中使TfRscFv與脂質體組合物A (或任何上文給出的脂質體 組合物)以單鏈蛋白質比脂質體和DNA的限定比混合，制備TfRscFv或任何抗體或抗體片 段(包括任何scFv、Fab'或Mab)_免疫脂質體復合物。復合物的制備依照下述一般操作 使合適量的2mM脂質體(上文描述的A-H)與所需的任何水(例如，DI水)混合，以給出所 需體積，并且輕輕倒轉10次以混合，或對于更大體積在20-30RPM下旋轉1-2分鐘。向脂質 體-水混合物中，加入合適量的TfRscFv，以給出所需比，并且通過輕輕倒轉約5-10秒混合 或對于更大體積在20-30RPM下旋轉1分鐘。使這種混合物保持在室溫下約10-15分鐘(在 約5分鐘后再次輕輕倒轉5-10秒)。同時，合適量的DNA通過倒轉5-10秒或對于更大體積 在20-30RPM下旋轉1-2分鐘，與所需的任何水混合以給出所需體積。一般地，對于體內使 用，希望提供約5 ii g至約lOOmg DNA/注射。將DNA溶液快速加入TfRscFv-脂質體溶液中， 并且使混合物倒轉5-10秒或對于更大體積在20-30RPM下旋轉1-2分鐘。使最終的混合物 維持在室溫下10-15分鐘，在約5分鐘后再次輕輕倒轉5-10秒。對于體內使用，加入50% 右旋糖或50%蔗糖至5-20% (V V)終濃度，并且通過輕輕倒轉5-10秒混合，或對于更大 體積在20-30RPM下旋轉1-2分鐘。使用1 30 (TfRscFv 脂質體，w w)和1 14(u g DNA nmole總脂質)的合適比的具體例子如下。對于終體積800 yl中的40 y g DNA,使 183 u 1水與280 u 1 2mM脂質體溶液混合。加入34 u 1 TfRscFv (具有0. 4 y g/ml的濃度)。 使183 u 1水與40 ill 1 u g/1 u 1 DNA混合。加入80 u 1 50%右旋糖作為最后一個步驟。根據(jù)先前描述的體內配制法來制備Tf-Lip-DNA復合物。Xu等人，Human Gene Therapy, 10 (18) :2941_52 (1999)。與輻射組合的轉鐵蛋白-脂質體介導的全身性p53基因 療法導致人頭與頸癌異種移植物的消退。對于最佳體內制劑的一般制備，使25ml Tf(5mg/ ml，鐵飽和的全-轉鐵蛋白；Sigma, St. Louis, M0)和50ml Lip(2mM總脂質)加上75ml 水在聚丙烯管中混合，并且在室溫下保持5-15分鐘，伴隨頻繁搖動，或對于更大體積在 20-30RPM下旋轉1-2分鐘。將在120ml 20mM HEPES緩沖液，pH 7. 4中的10微克質粒DNA 加入管中，通過輕輕倒轉10次立即且充分混合，或對于更大體積在20-30RPM下旋轉1-2 分鐘，并且在室溫下保持10-20分鐘，伴隨頻繁搖動。隨后將30微升50%右旋糖溶液加入 管中，通過輕輕倒轉10次立即且充分混合，或對于更大體積在20-30RPM下旋轉1-2分鐘， 并且在室溫下保持10-15分鐘。最終DNA 脂質Tf 比為1 10 12. 5(mg/nmol/mg)0 HEPES緩沖液可以由水替換。A. Lip-HoKC 的制備當在復合物中包括(K[K(H)KKK]5_K(H)KKC}肽(HoKC)時，使用如上文所描述的 乙醇注射法制備陽離子脂質體制劑A(以1 1摩爾比的D0TAP D0PE)、B(以1 1 的 DDAB DOPE)、G (以 1 1 1 的 D0TAP DOPE 膽固醇)禾口 H (以 1 1 1 的 DDAB DOPE 膽固醇)(或上文給出的任何脂質體制劑)。每種脂質體制劑還包括總脂質 5摩爾百分比的MPB-D0PE。因為HoKC肽攜帶末端半胱氨酸，所以MPB-D0PE包括在所有脂 質體組合物中，以允許肽與脂質體綴合。Lip-HoKC脂質體如下使用攜帶馬來酰亞胺基團的 陽離子脂質體(Lip-MPB)和肽之間的偶聯(lián)反應進行制備。將在半胱氨酸上具有游離巰基的 0. lmmol肽等分試樣加入溶于10mM HEPES, pH 7. 4溶液中的2mmol Lip-MPB，并且在室溫下 旋轉(20-30r. p. m.) 2小時。所得到的Lip-HoKC具有1. 4mM的脂質濃度。當脂質體包含HoKC時，完全復合物以與用于產生不含HoKC的TfRscFv-Lip-DNACN 101801344 A
說明書
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復合物的那種等同的方式形成。此處，同樣以特定比使TfRscFv或任何抗體或抗體片段 (包括Fab ‘或Mab)與Lip-HoKC混合(通過輕輕倒轉10次或對于更大體積在20-30RPM 下旋轉1-2分鐘)，并且在室溫下溫育10-15分鐘。隨后將DNA加入TfRscFv-Lip-HoKC溶 液中，通過輕輕倒轉10次混合或對于更大體積在20-30RPM下旋轉1-2分鐘，并且再次在室 溫下溫育10-15分鐘，這之后加入右旋糖或蔗糖至5-20%的終濃度，通過輕輕倒轉10次混 合或對于更大體積在20-30RPM下旋轉1分鐘，并且在室溫下溫育10-15分鐘。在復合物中 TfRscFv LipA-HoKC DNA 的比為 0.3mg 7nmol lmg。在復合物中封裝之前，使編碼病毒抗原和白介素的質?；旌显谝黄?，以0. 1摩爾 編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分子比10摩爾編碼一種或多種白介素的一 種或多種核酸分子；至10摩爾編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分子比0. 1摩 爾編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子的插入片段比插入片段摩爾比。例如，使 用1摩爾編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分子的插入片段比1摩爾編碼一種 或多種白介素的一種或多種核酸分子的插入片段的比。如果待針對其接種疫苗的疾病是HIV，那么使用的質粒DNA適當?shù)厥前幋a 包膜蛋白質(Vanniasinkam, T.禾口 Ertl, H. C. (2005) :Adenoviral gene delivery for HIV-1 vaccination. Current GeneTherapy, 5 :203_212. ；Ferrantelli, F.禾口 Ruprecht, R.M. (2002) :Neutralizing antibodies against HIV-back in the majorleagues ？ Current Opinion in Immunology, 14 495-502.)禾口 / 或 Nef 蛋白質(Vanniasinkam, T.禾口 Ertl, H. C. (2005) :Adenoviral genedelivery for HIV-1 vaccination. Current Gene Therapy, 5 203-212. ；Lichterfeld, M.，Yu, X. G.，Cohen, D.，Addo, M. M.，Mai enfant, J.， Perkins, B. , Pae, E. , Johnston, M. N. , Strick, D. , Allen, T. M. , Rosenberg, E. S. , Korber, B. ,Walker,B. D.和Altfeld，M. (2004) :HIV_1 Nef is preferentially recognized byCD8 T cells in primary HIV-1 infection despite a relatively highdegree of genetic diversity. AIDS，18 :1383-1392.)；和 / 或 gpl40(Smith, S. M. (2002) :HIV vaccine development in the nonhumanprimate model of AIDS. Journal of Biomedical Science, 9:100-111.)中的一種或多種的一種或多種基因的那種。由這種DNA編碼的一種或多種蛋 白質充當抗原以誘導免疫應答。此外，相同復合物適當?shù)匕|粒，所述質粒包含編碼任何 白介素、適當?shù)匕捉樗?和/或白介素12和/或白介素15的基因。如果待針對其接種疫苗的疾病是流感，那么使用的質粒DNA適當?shù)厥前幨R血凝素(HA) (Tamura，S.，Tanimoto，T.禾口 Kurata，T. (2005) :Mechanisms of broad cross-protection provided byinfluenza virus infection and their application to vaccines. Japanese Journal of Infectious Diseases，58 :195-207. ；Cox, M. M. (2005) Cell-based protein vaccines for influenza. CurrentOpinion in Molecular Therapeutics，7 24~29. ；Ze，C，Kurata, T.禾口 Tamura，S. (2000) Identification of effective constituentsof influenza vaccine by immunization with plasmid DNAs encodingviral proteins. Japanese Journal of Infectious Diseases，53 219-228.)、和 / 或神經氨酸酶(NA) (Tamura, S.，Tanimoto，T.和 Kurata, T. (2005) Mechanisms of broad cross-protectionprovided by influenza virus infection and their application tovaccines. Japanese Journal of Infectious Diseases,
5858 195-207. ；Cox, M. M. (2005) :Cell_based protein vaccines for influenza. Current Opinion in Molecular Therapeutics, 7 24~29. ；Ze, C, Kurata, T.禾口 Tamura, S. (2000) -Identification of effectiveconstituents of influenza vaccine by immunization with plasmidDNAs encoding viral proteins.Japanese Journal of InfectiousDiseases,53 :219_228.)、和 / 或核衣殼(Cox，M.M. (2005) :Cell_basedprotein vaccines for influenza. Current Opinion in MolecularTherapeutics, 7 24~29.)禾口 / 或基質蛋白 M2 (Cox,M. M. (2005) :Cell_based protein vaccines for influenza. Current Opinion inMolecular Therapeutics, 7 24~29.)白勺—禾中$$禾中白勺iP禾中。fig禾中 DNAH 碼的一種或多種蛋白質充當抗原以誘導免疫應答。此外，相同復合物適當?shù)匕|粒，所述 質粒包含編碼任何白介素、適當?shù)匕捉樗?和/或白介素12和/或白介素15的基因。如果待針對其接種疫苗的疾病是SARS，那么使用的質粒DNA適當?shù)厥前幋a 刺突糖蛋白、和/或核衣殼和/或結構蛋白質S1、和/或結構蛋白質M、和/或結構蛋白質 N(Weiss,S. R.禾口Navas-Martin,S. (2005) :Coronavirus pathogenesis and the emerging pathogensevere acute respiratory syndrome coronavirus. Microbiology Molecular Biology Reviews，69 :635-664.)的一種或多種基因的那種。由這種DNA編碼的一種或多 種蛋白質充當抗原以誘導免疫應答。此外，相同復合物適當?shù)匕|粒，所述質粒包含編碼 任何白介素、適當?shù)匕捉樗?和/或白介素12和/或白介素15的基因。如果待針對其接種疫苗的疾病是禽流感(也稱為H5N1)，那么使用的質粒DNA 適當?shù)厥前幋a血凝素(Wong，S.S.和 Yuen，K. Y. (2006) :Avian influenza virus infections in humans. Chest, 129 :156_168. ；Stephenson, I. , Bugarini, R. , Nicholson, K. G. , Podda, A. , Wood, J. M. , Zambon, M. C 禾口 Katz, J. M. (2005) :Cross_reactivity to highly pathogenic avian influenza H5Nlviruses after vaccination with nonadjuvanted andMF59_adjuvanted influenza A/Duck/Singapore/97(H5N3)vaccine a potential priming strategy. Journal of Infectious Diseases,191 1210-1215.； Treanor, J. J. , Wilkinson, B. E. , Masseoud, F. , Hu—Primmer, J. , Battaglia, R., 0' Brien, D. ，Wolff, M. ，Rabinovich, G. ，Blackwelder, ff.禾口 Katz，J. M. (2001) Safety andimmunogenicity of arecombinant hemagglutinin vaccine for H5influenza in humans. Vaccine, 19 :1732_1737.)的一種或多種基因的那種。由這種DNA編碼的一種或多 種蛋白質充當抗原以誘導免疫應答。此外，相同復合物適當?shù)匕|粒，所述質粒包含編碼 任何白介素、適當?shù)匕捉樗?和/或白介素12和/或白介素15的基因。如果待針對其接種疫苗的疾病是埃博拉、馬爾堡、或絲狀病毒科中的任何一種，那 么使用的質粒DNA適當?shù)厥前幋aVP24、和/或VP30、和/或VP35、和/或VP40、和/或 sGP、和 / 或糖蛋白和 / 或核蛋白質(Hart, M. K. (2003) :Vaccine research efforts for filoviruses. International Journal for Parasitology,33 583-595. ；Wilson, J. A., Bosio,CM.禾口Hart,M.K. (2001) :Ebola virus :the searchfor vaccines and treatments. Cellular & Molecular LifeSciences，58 :1826-1841.)的一種或多種基因的那種。由這 種DNA編碼的一種或多種蛋白質充當抗原以誘導免疫應答。此外，相同復合物適當?shù)匕?質粒，所述質粒包含編碼任何白介素、適當?shù)匕捉樗?和/或白介素12和/或白介素15的 基因。
如果待針對其接種疫苗的疾病是乙型肝炎，那么使用的質粒DNA適當?shù)厥前?編碼乙型肝炎表面抗原(HBsAg) (Hanke，T. (2006) :0n DNA vaccines and prolonged expression of immunogens. European Journal of Immunology, 36 806-809. ；Zuckerman, J. N. (2006) Vaccination against hepatitis A and B !developments, deployment and delusions. Current Opinion in InfectiousDiseases, 19 456-459.)、禾口 / 或核 衣殼(HBc)(Michel, Μ. L.禾口 Mancini-Bourgine, Μ. (2005) :Therapeutic vaccination againstchronic hepatitis Bvirus infection. Journal of Cl inicalVirology,34 Suppll :S108-S114.)的一種或多種基因的那種。由這種DNA編碼的一種或多種蛋白質充當 抗原以誘導免疫應答。此外，相同復合物適當?shù)匕|粒，所述質粒包含編碼任何白介素、 適當?shù)匕捉樗?和/或白介素12和/或白介素15的基因。如果待針對其接種疫苗的疾病是西尼羅病毒、登革熱、黃熱病、或黃病毒科中 的任何一種，那么使用的質粒DNA適當?shù)厥前幋aE糖蛋白的一種或多種基因的 那種，所述蛋白質引發(fā)大多數(shù)病毒中和抗體(參見Sampathkumar，P.，“ West Nile Virus :Epidemiology, Clinical Presentation, Diagnosis and Prevention, " Mayo ClinicProcessin gs 78 1137-1144(2003) ；King, N. J. C, “ Immunopa thologyof Flavivirus Infections, Immunology, " Immunology and CellBiology 85 33-42(2007))。由這種DNA編碼的一種或多種蛋白質充當抗原以誘導免疫應答。此外，相 同復合物適當?shù)匕|粒，所述質粒包含編碼任何白介素、適當?shù)匕捉樗?和/或白介素12 和/或白介素15的基因。通過這些方法制備的最終復合物的大小在約50-400 (nm)之間，具有正ζ電位，如 通過動態(tài)光散射使用 Malvern ZETASIZER 3000 或 Malvern ZETASIZER NANO-ZS 測 定的。這個大小足夠小以有效經過毛細血管床并且到達靶APC細胞。如上制備的復合物適當?shù)刈鳛轭A防或治療疫苗使用。對于預防，將如上制備的配 體靶向的陽離子脂質體復合物納米脂復合物疫苗靜脈內注射到哺乳動物內，例如先前未暴 露于病毒疾病的人。使用復合物在0、4和8周時進行靜脈內注射。用于給受試者接種疫苗 的復合物適當?shù)匾? 10 12. 5(mg/nmol/mg) (DNA 脂質Tf)的比制備，用5-210%右 旋糖或蔗糖作為賦形劑；當HoKC不是復合物的組分時，0.33ug IOug lug(TfRscFv LipDNA)，用5-20%右旋糖或蔗糖作為賦形劑；并且當復合物包含HoKC時，以0.3mg 7nmol Img(TfRscFv Lip-HoKC DNA)的比，用5%右旋糖或蔗糖。復合物中的DNA總量為0. 01 至10mg/kg/注射。合適量是0. 164mg/kg/注射，這是7_12mgDNA/注射(基于受試者的重 量)。將制備的復合物注入250ml 5%右旋糖的袋內用于i. v.輸注，或作為推注i. v.注射， 通過靜脈內(IV)、瘤內(IT)、損傷內(IL)、氣溶膠、透皮、經口、內窺鏡、局部、肌內(IM)、皮 內(ID)、眼內(10)、腹膜內(IP)、經皮(TD)、鼻內(IN)、大腦內(IC)、器官內(例如，肝內) 注射、緩慢釋放埋植劑或皮下施用，或經由使用滲透或機械泵的施用。對于治療用途，將如上制備的配體靶向的陽離子脂質體復合物納米脂復合物疫苗 注射到哺乳動物內，例如慢性感染病毒疾病(例如，乙型肝炎)的人，或急性暴露于病毒疾 病(例如，埃博拉、SARS、H5N1、天花、西尼羅病毒)的人。包含在與用于預防用途相同的范 圍中的量的DNA的復合物在250ml 5%右旋糖溶液中i. v.遞送，或作為推注遞送，在第0、 4和8周時3次，通過靜脈內(IV)、瘤內(IT)、損傷內(IL)、氣溶膠、透皮、經口、內窺鏡、局部、肌內(IM)、皮內(ID)、眼內(10)、腹膜內(IP)、經皮(TD)、鼻內(IN)、大腦內(IC)、器官 內(例如，肝內)、緩慢釋放埋植劑或皮下施用，或經由使用滲透或機械泵的施用。實施例6通過經由化學綴合制備的2種納米免疫脂質體復合物的共注射在人中誘導針對 病毒抗原的免疫應答本發(fā)明還提供了用于在人(以及其他哺乳動物和動物)中誘導針對病毒抗原的免 疫應答的方法，其包括給個體施用配體靶向的陽離子脂質體復合物，所述復合物包含編碼 病毒蛋白質和白介素的核酸分子，例如一種或多種質粒包含編碼充當抗原的病毒蛋白質的 基因、編碼一種或多種白介素的基因。包含與脂質體的表面直接化學綴合的各種靶向性配 體的復合物如上文實施例4中所述制備。攜帶編碼充當抗原的病毒蛋白質的一種或多種基因的一種或多種質粒DNA與實 施例4中描述的那種等同。使用與對于攜帶編碼病毒蛋白質的一種或多種基因的一種或多 種質粒DNA使用的等同的操作和比，制備含有包含編碼例如白介素2、白介素12和/或白介 素15的基因的質粒DNA的分開的配體靶向的陽離子脂質體復合物。如上制備的最終復合物的大小在約50-500 (nm)之間，具有正ζ電位，如通過動態(tài) 光散射使用 Malvern ZETASIZER 3000 或 Malvern ZETASIZER NANO-ZS 測定的。這 個大小足夠小以有效經過毛細血管床并且到達靶APC細胞。如上制備的復合物作為預防或治療疫苗使用。對于作為疫苗的用途，以反映每種 復合物中的質粒DNA插入片段摩爾比的復合物復合物比，使2種復合物混合在一起。因 此，2種復合物的比是包含0. 1摩爾編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分子的 復合物量比包含10摩爾編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子的復合物量；至包 含10摩爾編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分子的復合物量比包含0. 1摩爾 編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子的復合物量。例如，使用包含1摩爾編碼一 種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分子的復合物量比包含1摩爾編碼一種或多種白 介素的一種或多種核酸分子的復合物量的比。將包含編碼一種或多種病毒蛋白質的一種 或多種質粒DNA的復合物加入包含編碼一種或多種白介素的一種或多種質粒DNA的復合物 中，并且使溶液輕輕倒轉10次或在20-30RPM下旋轉1分鐘，以形成用于在人受試者中使用 的最終疫苗。對于預防，將如上制備的配體靶向的陽離子脂質體復合物納米脂復合物疫苗靜脈 內注射到哺乳動物內，例如先前未暴露于病毒疾病的人。使用復合物在0、4和8周時進行 注射。用于形成給受試者施用的疫苗的每種復合物(包含一種或多種病毒基因的那種和包 含一種或多種白介素基因的那種)適當?shù)匾?. 33ug IOug lug(TfRscFv Lip DNA) 的比制備，用5%右旋糖作為賦形劑。疫苗中的DNA總量為0.01至10mg/kg/注射。合適量 是0. 164mg/kg/注射，這是7-12mg DNA/注射(基于受試者的重量)。將制備的復合物注 入250ml 5%右旋糖的袋內用于i. v.輸注，或作為推注i. v.注射，通過靜脈內(IV)、瘤內 (IT)、損傷內(IL)、氣溶膠、透皮、經口、內窺鏡、局部、肌內(IM)、皮內(ID)、眼內(10)、腹膜 內(IP)、經皮(TD)、鼻內(IN)、大腦內(IC)、器官內(例如，肝內)、緩慢釋放埋植劑或皮下 施用，或經由使用滲透或機械泵的施用。對于治療用途，將如上制備的配體靶向的陽離子脂質體復合物納米脂復合物疫苗注射到哺乳動物內，例如慢性感染病毒疾病(例如，乙型肝炎)的人，或急性暴露于病毒疾 病(例如，埃博拉、SARS、H5N1、天花、西尼羅病毒)的人。制備的包含在與用于預防用途相 同的范圍中的量的DNA的復合物在250ml 5%右旋糖溶液中i. v.遞送，或作為推注遞送，在 第0、4和8周時3次，通過靜脈內(IV)、瘤內(IT)、損傷內(IL)、氣溶膠、透皮 、經口、內窺 鏡、局部、肌內(IM)、皮內(ID)、眼內(10)、腹膜內(IP)、經皮(TD)、鼻內(IN)、大腦內(IC)、 器官內(例如，肝內)、緩慢釋放埋植劑或皮下施用，或經由使用滲透或機械泵的施用。實施例7通過經由簡單混合制備的2種納米免疫脂質體復合物的共注射在人中誘導針對 病毒抗原的免疫應答本發(fā)明還提供了用于在人中誘導針對病毒抗原的免疫應答的方法，其包括給個體 同時施用配體靶向的陽離子脂質體復合物，所述復合物包含編碼病毒蛋白質和白介素的核 酸分子，例如一種或多種質粒包含編碼充當抗原的病毒蛋白質的基因、編碼一種或多種白 介素的基因。包含與脂質體的表面直接復合但不化學綴合的各種配體的復合物(含或不含 HoKC肽)如上文實施例5中所述制備。攜帶編碼充當抗原的病毒蛋白質的一種或多種基因 的一種或多種質粒DNA與實施例5中描述的那種等同。使用與對于攜帶編碼病毒蛋白質的 一種或多種基因的一種或多種質粒DNA使用的等同的操作和比，制備包含含有編碼任何白 介素例如白介素2、白介素12和/或白介素15的基因的質粒DNA的分開的配體靶向的陽離 子脂質體復合物。如上制備的最終復合物的大小在約50-400 (nm)之間，具有正ζ電位，如通過動態(tài) 光散射使用 Malvern ZETASIZER 3000 或 Malvern ZETASIZER NANO-ZS 測定的。這 個大小足夠小以有效經過毛細血管床并且到達靶APC細胞。對于作為疫苗的用途，以反映每種復合物中的質粒DNA插入片段摩爾比的復合 物復合物比，使2種復合物混合在一起。因此，2種復合物的比是包含0. 1摩爾編碼一種 或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分子的復合物量比包含10摩爾編碼一種或多種白介 素的一種或多種核酸分子的復合物量；至包含10摩爾編碼一種或多種病毒蛋白質的一種 或多種核酸分子的復合物量比包含0. 1摩爾編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分 子的復合物量。例如，使用包含1摩爾編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分子 的復合物量比包含1摩爾編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子的復合物量的比。 將包含編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種質粒DNA的復合物加入包含編碼一種或 多種白介素的一種或多種質粒DNA的復合物中，并且使溶液輕輕倒轉10次或在20-30RPM 下旋轉1分鐘，以形成用于在人受試者中使用的最終疫苗。如上制備的復合物作為預防或治療疫苗使用。對于預防，將如上制備的配體靶向 的陽離子脂質體復合物納米脂復合物疫苗注射到哺乳動物內，例如先前未暴露于病毒疾病 的人。使用復合物在0、4和8周時進行靜脈內注射。用于給受試者接種疫苗的復合物適當 地以1 10 12. 5(mg/nmol/mg) (DNA 脂質Tf)的比制備，用5-20%右旋糖或蔗糖作 為賦形劑；當HoKC不是復合物的組分時，0. 33ug IOug lug (TfRscFv Lip DNA)，用 5-20%右旋糖或蔗糖作為賦形劑；和當復合物包含HoKC時，以0.3mg 7nmol Img(TfRscF ν Lip-HoKC DNA)的比，用5%右旋糖或蔗糖。復合物中的DNA總量為0. 01至10mg/kg/ 注射。合適量是0. 164mg/kg/注射，這是7-12mg DNA/注射(基于受試者的重量)。將制備的復合物注入250ml 5%右旋糖的袋內用于i. v.輸注，或作為推注i. v.注射，通過靜脈內 (IV)、瘤內(IT)、損傷內(IL)、氣溶膠、透皮、經口、內窺鏡、局部、肌內(IM)、皮內(ID)、眼內 (10)、腹膜內(IP)、經皮(TD)、鼻內(IN)、大腦內(IC)、器官內(例如，肝內)、緩慢釋放埋植 劑或皮下施用，或經由使用滲透或機械泵的施用。對于治療用途，將如上制備的配體靶向的陽離子脂質體復合物納米脂復合物疫苗注射到哺乳動物內，例如慢性感染病毒疾病(例如，乙型肝炎)的人，或急性暴露于病毒疾 病(例如，埃博拉、SARS、H5N1、天花、西尼羅病毒)的人。包含在與用于預防用途相同的范 圍中的量的DNA的復合物在250ml 5%右旋糖溶液中i. v.遞送，或作為推注遞送，在第0、 4和8周時3次，通過靜脈內(IV)、瘤內(IT)、損傷內(IL)、氣溶膠、透皮、經口、內窺鏡、局 部、肌內(IM)、皮內(ID)、眼內(10)、腹膜內(IP)、經皮(TD)、鼻內(IN)、大腦內(IC)、器官 內(例如，肝內)、緩慢釋放埋植劑或皮下施用，或經由使用滲透或機械泵的施用。本說明書中提及的所有出版物、專利和專利申請通過引用合并入本文，其程度與明確且單獨地指出每個單獨的出版物、專利和專利申請通過引用合并入本文一樣。
權利要求
在哺乳動物中誘導針對病毒抗原的免疫應答的方法，其包括給所述哺乳動物施用配體靶向的陽離子脂質體復合物，其中所述陽離子脂質體復合物包括(a)陽離子脂質體；(b)與所述陽離子脂質體直接復合，但不與所述陽離子脂質體化學綴合的配體；(c)與所述陽離子脂質體結合的編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分子；和(d)與所述陽離子脂質體結合的編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子。
2.權利要求1的方法，其中所述病毒抗原來自選自流感病毒、HIV病毒、SARS病毒、禽 流感病毒、埃博拉病毒、乙型肝炎病毒和天花病毒的病毒。
3.權利要求1的方法，其中所述一種或多種病毒蛋白質選自HIV病毒蛋白質、埃博拉 病毒蛋白質、流感病毒蛋白質、SARS病毒蛋白質、禽流感病毒蛋白質、乙型肝炎病毒蛋白質 和天花病毒蛋白質。
4.權利要求1的方法，其中所述一種或多種白介素選自IL-l、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、 IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18 和 IL-23。
5.權利要求1的方法，其中所述復合物作為推注或作為輸注經由選自下述的途徑施 用靜脈內施用、經口施用、肌內施用、損傷內施用、皮內施用、經皮施用、眼內施用、腹膜內 施用、透皮施用、氣溶膠施用、鼻內施用、器官內施用、大腦內施用、局部施用、皮下施用、內 窺鏡施用、緩慢釋放埋植劑和經由滲透或機械泵的施用。
6.權利要求1的方法，其中所述配體選自轉鐵蛋白、半乳糖、L-37pA、抗體和抗體片段。
7.權利要求1的方法，其中所述配體是單鏈Fv抗體片段。
8.權利要求7的方法，其中所述單鏈Fv抗體片段是抗轉鐵蛋白受體單鏈 Fv(TfRscFv)。
9.權利要求1的方法，其中所述配體靶向的陽離子脂質體進一步包括這樣的肽，所述 肽包括與所述陽離子脂質體結合的K[K(H)KKK]5-K(H)KKC(HoKC) (SEQ ID NO 1)肽。
10.在哺乳動物中誘導針對病毒抗原的免疫應答的方法，其包括給所述哺乳動物施用 配體靶向的陽離子脂質體復合物，其中所述陽離子脂質體復合物包括(a)陽離子脂質體；(b)與所述陽離子脂質體化學綴合的配體；(c)與所述陽離子脂質體結合的編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分子；禾口(d)與所述陽離子脂質體結合的編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子。
11.權利要求10的方法，其中所述病毒抗原來自選自流感病毒、HIV病毒、SARS病毒、 禽流感病毒、埃博拉病毒、乙型肝炎病毒和天花病毒的病毒。
12.權利要求10的方法，其中所述一種或多種病毒蛋白質選自HIV病毒蛋白質、埃博拉 病毒蛋白質、流感病毒蛋白質、SARS病毒蛋白質、禽流感病毒蛋白質、乙型肝炎病毒蛋白質 和天花病毒蛋白質。
13.權利要求10的方法，其中所述一種或多種白介素選自IL-1、IL-2、IL_3、IL-4、 IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18 和 IL-23。
14.權利要求10的方法，其中所述復合物作為推注或作為輸注經由選自下述的途徑施用靜脈內施用、經口施用、肌內施用、損傷內施用、皮內施用、經皮施用、眼內施用、腹膜 內施用、透皮施用、氣溶膠施用、鼻內施用、器官內施用、疑為大腦內施用、局部施用、皮下施 用、內窺鏡施用、緩慢釋放埋植劑和經由滲透或機械泵的施用。
15.權利要求10的方法，其中所述配體選自轉鐵蛋白、半乳糖、L-37pA、抗體和抗體片段。
16.權利要求10的方法，其中所述配體是單鏈Fv抗體片段。
17.權利要求16的方法，其中所述單鏈Fv抗體片段是抗轉鐵蛋白受體單鏈 Fv(TfRscFv)。
18.權利要求10的方法，其中所述配體靶向的陽離子脂質體進一步包括這樣的肽，所 述肽包括與所述陽離子脂質體結合的K[K(H)KKIC5-K(H)KKC(HoKC) (SEQ ID NO=D肽。
19.治療或預防哺乳動物中的病毒疾病的方法，其包括給所述哺乳動物施用陽離子脂 質體復合物，其中所述陽離子脂質體復合物包括(a)陽離子脂質體；(b)與所述陽離子脂質體直接復合，但不與所述陽離子脂質體化學綴合的配體；(c)與所述陽離子脂質體結合的編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分子；禾口(d)與所述陽離子脂質體結合的編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子。
20.權利要求19的方法，其中所述病毒疾病選自流感、HIV、SARS、禽流感、埃博拉、乙型 肝炎和天花。
21.權利要求19的方法，其中所述一種或多種病毒蛋白質選自HIV病毒蛋白質、埃博拉 病毒蛋白質、流感病毒蛋白質、SARS病毒蛋白質、禽流感病毒蛋白質、乙型肝炎病毒蛋白質 和天花病毒蛋白質。
22.權利要求19的方法，其中所述一種或多種白介素選自IL-1、IL-2、IL_3、IL-4、 IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18 和 IL-23。
23.權利要求19的方法，其中所述復合物作為推注或作為輸注經由選自下述的途徑施 用靜脈內施用、經口施用、肌內施用、損傷內施用、皮內施用、經皮施用、眼內施用、腹膜內 施用、透皮施用、氣溶膠施用、鼻內施用、器官內施用、大腦內施用、局部施用、皮下施用、內 窺鏡施用、緩慢釋放埋植劑和經由滲透或機械泵的施用。
24.權利要求19的方法，其中所述配體選自轉鐵蛋白、半乳糖、L-37pA、抗體和抗體片段。
25.權利要求19的方法，其中所述配體是單鏈Fv抗體片段。
26.權利要求25的方法，其中所述單鏈Fv抗體片段是抗轉鐵蛋白受體單鏈 Fv(TfRscFv)。
27.權利要求19的方法，其中所述配體靶向的陽離子脂質體進一步包括這樣的肽，所 述肽包括與所述陽離子脂質體結合的K[K(H)KKIC5-K(H)KKC(HoKC) (SEQ ID NO=D肽。
28.治療或預防哺乳動物中的病毒疾病的方法，其包括給所述哺乳動物施用陽離子脂 質體復合物，其中所述陽離子脂質體復合物包括(a)陽離子脂質體；(b)與所述陽離子脂質體化學綴合的配體；(C)與所述陽離子脂質體結合的編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分子；禾口(d)與所述陽離子脂質體結合的編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子。
29.權利要求28的方法，其中所述病毒疾病選自流感、HIV、SARS、禽流感、埃博拉、乙型 肝炎和天花。
30.權利要求28的方法，其中所述一種或多種病毒蛋白質選自HIV病毒蛋白質、埃博拉 病毒蛋白質、流感病毒蛋白質、SARS病毒蛋白質、禽流感病毒蛋白質、乙型肝炎病毒蛋白質 和天花病毒蛋白質。
31.權利要求28的方法，其中所述一種或多種白介素選自IL-1、IL-2、IL_3、IL-4、 IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18 和 IL-23。
32.權利要求28的方法，其中所述復合物作為推注或作為輸注經由選自下述的途徑施 用靜脈內施用、經口施用、肌內施用、損傷內施用、皮內施用、經皮施用、眼內施用、腹膜內 施用、透皮施用、氣溶膠施用、鼻內施用、器官內施用、大腦內施用、局部施用、皮下施用、內 窺鏡施用、緩慢釋放埋植劑和經由滲透或機械泵的施用。
33.權利要求28的方法，其中所述配體選自轉鐵蛋白、半乳糖、L-37pA、抗體和抗體片段。
34.權利要求28的方法，其中所述配體是單鏈Fv抗體片段。
35.權利要求35的方法，其中所述單鏈Fv抗體片段是抗轉鐵蛋白受體單鏈 Fv(TfRscFv)。
36.權利要求28的方法，其中所述配體靶向的陽離子脂質體進一步包括這樣的肽，所 述肽包括與所述陽離子脂質體結合的K[K(H)KKIC5-K(H)KKC(HoKC) (SEQ ID NO=D肽。
37.將一種或多種活性劑遞送給哺乳動物的抗原呈遞細胞(APCs)的方法，其包括給所 述哺乳動物施用抗轉鐵蛋白受體單鏈Fv(TfRscFv)靶向的陽離子免疫脂質體復合物，所述 復合物包括陽離子脂質體、TfRscFv和一種或多種活性劑，其中所述TfRscFv與所述陽離子 脂質體直接復合，但不化學綴合。
38.權利要求37的方法，其中所述APCs是專業(yè)APCs。
39.權利要求37的方法，其中所述APCs是非專業(yè)APCs。
40.權利要求37的方法，其中所述活性劑包含一種或多種核酸分子。
41.權利要求40的方法，其中所述核酸分子編碼一種或多種病毒蛋白質。
42.權利要求40的方法，其中所述核酸分子編碼一種或多種白介素。
43.權利要求40的方法，其中所述核酸分子編碼一種或多種病毒蛋白質和一種或多種 白介素。
44.權利要求41或權利要求43的方法，其中所述一種或多種病毒蛋白質選自HIV病毒 蛋白質、埃博拉病毒蛋白質、流感病毒蛋白質、SARS病毒蛋白質、禽流感病毒蛋白質、乙型肝 炎病毒蛋白質和天花病毒蛋白質。
45.權利要求42或權利要求43的方法，其中所述一種或多種白介素選自IL-1、IL-2、 IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18 和 IL-23。
46.權利要求37的方法，其中所述復合物作為推注或作為輸注經由選自下述的途徑施用靜脈內施用、經口施用、肌內施用、損傷內施用、皮內施用、經皮施用、眼內施用、腹膜內 施用、透皮施用、氣溶膠施用、鼻內施用、器官內施用、大腦內施用、局部施用、皮下施用、內 窺鏡施用、緩慢釋放埋植劑和經由滲透或機械泵的施用。
47.權利要求37的方法，其中所述APCs位于肝、脾、淋巴結、腸和/或呼吸道中。
48.將一種或多種活性劑遞送給哺乳動物的抗原呈遞細胞(APCs)的方法，其包括給所 述哺乳動物施用抗轉鐵蛋白受體單鏈Fv(TfRscFv)靶向的陽離子免疫脂質體復合物，所述 復合物包括陽離子脂質體、TfRscFv和一種或多種活性劑，其中所述TfRscFv與所述陽離子 脂質體化學綴合。
49.權利要求48的方法，其中所述APCs是專業(yè)APCs。
50.權利要求48的方法，其中所述APCs是非專業(yè)APCs。
51.權利要求48的方法，其中所述活性劑包含一種或多種核酸分子。
52.權利要求51的方法，其中所述核酸分子編碼一種或多種病毒蛋白質。
53.權利要求51的方法，其中所述核酸分子編碼一種或多種白介素。
54.權利要求51的方法，其中所述核酸分子編碼一種或多種病毒蛋白質和一種或多種 白介素。
55.權利要求52或權利要求54的方法，其中所述一種或多種病毒蛋白質選自HIV病毒 蛋白質、埃博拉病毒蛋白質、流感病毒蛋白質、SARS病毒蛋白質、禽流感病毒蛋白質、乙型肝 炎病毒蛋白質和天花病毒蛋白質。
56.權利要求53或權利要求54的方法，其中所述一種或多種白介素選自IL-l、IL-2、 IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18 和 IL-23。
57.權利要求48的方法，其中所述復合物作為推注或作為輸注經由選自下述的途徑施 用靜脈內施用、經口施用、肌內施用、損傷內施用、皮內施用、經皮施用、眼內施用、腹膜內 施用、透皮施用、氣溶膠施用、鼻內施用、器官內施用、大腦內施用、局部施用、皮下施用、內 窺鏡施用、緩慢釋放埋植劑和經由滲透或機械泵的施用。
58.權利要求48的方法，其中所述APCs位于肝、脾、淋巴結、腸和/或呼吸道中。
59.在哺乳動物中誘導針對病毒抗原的免疫應答的方法，其包括給所述哺乳動物施用 配體靶向的陽離子脂質體復合物，所述復合物通過下述過程制備(a)制備配體；(b)使所述配體與陽離子脂質體混合，以形成配體靶向的陽離子脂質體，其中所述配體 與所述陽離子脂質體直接復合，但不化學綴合；和(c)使所述配體靶向的陽離子脂質體與下述混合編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分子；和編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子，以形成所述配體靶向的陽離子脂質體 復合物。
60.權利要求59的方法，其中所述配體選自轉鐵蛋白、半乳糖、L-37pA、抗體和抗體片段。
61.權利要求60的方法，其中所述配體是單鏈Fv片段。
62.權利要求61的方法，其中所述單鏈Fv抗體片段是抗轉鐵蛋白受體單鏈Fv(TfRscFv)。
63.權利要求60的方法，其中所述抗體片段在羧基末端處包括半胱氨酸部分。
64.權利要求59的方法，其中所述配體靶向的陽離子脂質體進一步包括這樣的肽，所 述肽包括與所述陽離子脂質體結合的K[K(H)KKIC5-K(H)KKC(HoKC) (SEQ ID NO=D肽。
65.權利要求59的方法，其中所述陽離子脂質體包括一種或多種陽離子脂質和一種或 多種中性或輔助脂質的混合物。
66.權利要求59的方法，其中所述配體和所述陽離子脂質體以約1 1至約 1 100 (w w)范圍中的比混合。
67.權利要求66的方法，其中所述配體和所述陽離子脂質體以約1 10至約 1 50(w w)范圍中的比混合。
68.權利要求67的方法，其中所述配體和所述陽離子脂質體以約1 20至約 1 40(w w)范圍中的比混合。
69.權利要求59的方法，其中所述陽離子脂質體包括二油酰基三甲基磷酸銨與二油酰 基磷脂酰乙醇胺和/或膽固醇的混合物；或雙十八烷基二甲基溴化銨與二油?；字Ｒ?醇胺和/或膽固醇的混合物。
70.權利要求59的方法，其中所述核酸分子以約0.1摩爾編碼一種或多種病毒蛋白質 的一種或多種核酸分子比10摩爾編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子；至10摩 爾編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分子比約0.1摩爾編碼一種或多種白介 素的一種或多種核酸分子的摩爾比存在。
71.權利要求60的方法，其中所述核酸以約1摩爾編碼一種或多種病毒蛋白質的一種 或多種核酸分子比約1摩爾編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子的摩爾比存在。
72.權利要求59的方法，其中所述編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分 子、所述編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子、和所述陽離子脂質體以約0.5 1 至約1 40(yg總核酸yg脂質體)的重量比存在。
73.權利要求72的方法，其中所述編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分 子、所述編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子、和所述陽離子脂質體以約1 5至 約1 20(yg總核酸yg脂質體)的重量比存在。
74.權利要求73的方法，其中所述編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸 分子、所述編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子、和所述陽離子脂質體以約 1 10(yg總核酸yg脂質體)的重量比存在。
75.權利要求59的方法，其中所述一種或多種病毒蛋白質選自HIV病毒蛋白質、埃博拉 病毒蛋白質、流感病毒蛋白質、SARS病毒蛋白質、禽流感病毒蛋白質、乙型肝炎病毒蛋白質 和天花病毒蛋白質。
76.權利要求59的方法，其中所述一種或多種白介素選自IL-1、IL-2、IL_3、IL-4、 IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18 和 IL-23。
77.治療或預防哺乳動物中的病毒疾病的方法，其包括給所述哺乳動物施用配體靶向 的陽離子脂質體復合物，所述復合物通過下述過程制備(a)制備配體；(b)使所述配體與陽離子脂質體混合，以形成配體靶向的陽離子脂質體，其中所述配體與所述陽離子脂質體直接復合，但不化學綴合；和(c)使所述配體靶向的陽離子脂質體與下述混合編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分子；和編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子，以形成所述配體靶向的陽離子脂質體 復合物。
78.權利要求77的方法，其中所述配體選自轉鐵蛋白、半乳糖、L-37pA、抗體和抗體片段。
79.權利要求77的方法，其中所述配體是單鏈Fv片段。
80.權利要求79的方法，其中所述單鏈Fv片段是抗轉鐵蛋白受體單鏈Fv(TfRSCFv)。
81.權利要求78的方法，其中所述抗體片段在羧基末端處包括半胱氨酸部分。
82.權利要求77的方法，其中所述配體靶向的陽離子脂質體進一步包括這樣的肽，所 述肽包括與所述陽離子脂質體結合的K[K(H)KKK]5-K(H)KKC(HoKC) (SEQ ID N0:1)肽。
83.權利要求77的方法，其中所述陽離子脂質體包括一種或多種陽離子脂質和一種或 多種中性或輔助脂質的混合物。
84.權利要求77的方法，其中所述配體和所述陽離子脂質體以約1 1至約 1 100 (w w)范圍中的比存在。
85.權利要求84的方法，其中所述配體和所述陽離子脂質體以約1 10至約 1 50(w w)范圍中的比存在。
86.權利要求85的方法，其中所述配體和所述陽離子脂質體以約1 20至約 1 40(w w)范圍中的比存在。
87.權利要求77的方法，其中所述陽離子脂質體包括二油?；谆姿徜@與二油酰 基磷脂酰乙醇胺和/或膽固醇的混合物；或雙十八烷基二甲基溴化銨與二油?；字Ｒ?醇胺和/或膽固醇的混合物。
88.權利要求77的方法，其中所述核酸分子以約0.1摩爾編碼一種或多種病毒蛋白質 的一種或多種核酸分子比10摩爾編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子；至10摩 爾編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分子比約0. 1摩爾編碼一種或多種白介 素的一種或多種核酸分子的摩爾比存在。
89.權利要求88的方法，其中所述核酸以約1摩爾編碼一種或多種病毒蛋白質的一種 或多種核酸分子比約1摩爾編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子的摩爾比存在。
90.權利要求77的方法，其中所述編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分 子、所述編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子、和所述陽離子脂質體以約0.5 1 至約1 40(iig總核酸Pg脂質體)的重量比存在。
91.權利要求90的方法，其中所述編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分 子、所述編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子、和所述陽離子脂質體以約1 5至 約1 20(iig總核酸Pg脂質體)的重量比存在。
92.權利要求77的方法，其中所述編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸 分子、所述編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子、和所述陽離子脂質體以約 1 10(yg總核酸Pg脂質體)的重量比存在。
93.權利要求77的方法，其中所述一種或多種病毒蛋白質選自HIV病毒蛋白質、埃博拉病毒蛋白質、流感病毒蛋白質、SARS病毒蛋白質、禽流感病毒蛋白質、乙型肝炎病毒蛋白質 和天花病毒蛋白質。
94.權利要求77的方法，其中所述一種或多種白介素選自IL-1、IL-2、IL_3、IL-4、 IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18 和 IL-23。
95.在哺乳動物中誘導針對病毒抗原的免疫應答的方法，其包括給所述哺乳動物施用 配體靶向的陽離子脂質體復合物，所述復合物通過下述過程制備(a)制備配體；(b)使所述配體與陽離子脂質體化學綴合，以形成配體靶向的陽離子脂質體；和(c)使所述配體靶向的陽離子脂質體與下述混合編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分子；和編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子，以形成所述配體靶向的陽離子脂質體 復合物。
96.權利要求95的方法，其中所述配體選自轉鐵蛋白、半乳糖、L-37pA、抗體和抗體片段。
97.權利要求95的方法，其中所述配體是單鏈Fv片段。
98.權利要求97的方法，其中所述單鏈Fv片段是抗轉鐵蛋白受體單鏈Fv(TfRSCFv)。
99.權利要求96的方法，其中所述抗體片段在羧基末端處包括半胱氨酸部分。
100.權利要求95的方法，其中所述配體靶向的陽離子脂質體進一步包括這樣的肽，所 述肽包括與所述陽離子脂質體結合的K[K(H)KKK]5-K(H)KKC(HoKC) (SEQ ID N0:1)肽。
101.權利要求95的方法，其中所述配體經由硫原子與所述陽離子脂質體化學綴合，所 述硫原子是在所述化學綴合前在所述配體上的羧基末端處的巰基的部分。
102.權利要求95的方法，其中所述陽離子脂質體包括一種或多種陽離子脂質和一種 或多種中性或輔助脂質的混合物。
103.權利要求95的方法，其中所述配體和所述陽離子脂質體以約1 1至約 1 100(w w)范圍中的比存在。
104.權利要求103的方法，其中所述配體和所述陽離子脂質體以約1 10至約 1 50(w w)范圍中的比存在。
105.權利要求104的方法，其中所述配體和所述陽離子脂質體以約1 20至約 1 40(w w)范圍中的比存在。
106.權利要求95的方法，其中所述陽離子脂質體包括二油?；谆姿徜@與二油 ?；字Ｒ掖及泛?或膽固醇的混合物；或雙十八烷基二甲基溴化銨與二油?；字?乙醇胺和/或膽固醇的混合物。
107.權利要求95的方法，其中所述核酸分子以約0.1摩爾編碼一種或多種病毒蛋白質 的一種或多種核酸分子比10摩爾編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子；至10摩 爾編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分子比約0. 1摩爾編碼一種或多種白介 素的一種或多種核酸分子的摩爾比存在。
108.權利要求107的方法，其中所述核酸以約1摩爾編碼一種或多種病毒蛋白質的一 種或多種核酸分子比約1摩爾編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子的摩爾比存 在。
109.權利要求108的方法，其中所述編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分 子、所述編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子、和所述配體靶向的陽離子脂質體 以約0.5 1至約1 40(iig總核酸Pg脂質體)的重量比存在。
110.權利要求109的方法，其中所述編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分 子、所述編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子、和所述配體靶向的陽離子脂質體 以約1 5至約1 20(iig總核酸Pg脂質體)的重量比存在。
111.權利要求110的方法，其中所述編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分 子、所述編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子、和所述配體靶向的陽離子脂質體 以約1 10(iig總核酸Pg脂質體)的重量比存在。
112.權利要求95的方法，其中所述一種或多種病毒蛋白質選自HIV病毒蛋白質、埃博 拉病毒蛋白質、流感病毒蛋白質、SARS病毒蛋白質、禽流感病毒蛋白質、乙型肝炎病毒蛋白 質和天花病毒蛋白質。
113.權利要求95的方法，其中所述一種或多種白介素選自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、 IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18 和 IL-23。
114.治療或預防哺乳動物中的病毒疾病的方法，其包括給所述哺乳動物施用配體靶向 的陽離子脂質體復合物，所述復合物通過下述過程制備(a)制備配體；(b)使所述配體與陽離子脂質體化學綴合，以形成配體靶向的陽離子脂質體；和(c)使所述配體靶向的陽離子脂質體與下述混合編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分子；和編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子，以形成所述配體靶向的陽離子脂質體 復合物。
115.權利要求114的方法，其中所述配體選自轉鐵蛋白、半乳糖、L-37pA、抗體和抗體 片段。
116.權利要求114的方法，其中所述配體是單鏈Fv片段。
117.權利要求114的方法，其中所述單鏈Fv片段是抗轉鐵蛋白受體單鏈 Fv(TfRscFv)。
118.權利要求115的方法，其中所述抗體片段在羧基末端處包括半胱氨酸部分。
119.權利要求114的方法，其中所述配體靶向的陽離子脂質體進一步包括這樣的肽， 所述肽包括與所述陽離子脂質體結合的K[K(H)KKK]5-K(H)KKC(HoKC) (SEQ ID N0:1)肽。
120.權利要求114的方法，其中所述配體經由硫原子與所述陽離子脂質體化學綴合， 所述硫原子是在所述化學綴合前在所述配體上的羧基末端處的巰基的部分。
121.權利要求114的方法，其中所述陽離子脂質體包括一種或多種陽離子脂質和一種 或多種中性或輔助脂質的混合物。
122.權利要求114的方法，其中所述配體和所述陽離子脂質體以約1 1至約 1 100 (w w)范圍中的比存在。
123.權利要求122的方法，其中所述配體和所述陽離子脂質體以約1 10至約 1 50(w w)范圍中的比存在。
124.權利要求123的方法，其中所述配體和所述陽離子脂質體以約1 20至約140(w w)范圍中的比存在。
125.權利要求114的方法，其中所述陽離子脂質體包括二油酰基三甲基磷酸銨與二油 ?；字Ｒ掖及泛?或膽固醇的混合物；或雙十八烷基二甲基溴化銨與二油酰基磷脂酰 乙醇胺和/或膽固醇的混合物。
126.權利要求114的方法，其中所述核酸分子以約0.1摩爾編碼一種或多種病毒蛋白 質的一種或多種核酸分子比約10摩爾編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子；至 10摩爾編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分子比約0. 1摩爾編碼一種或多種 白介素的一種或多種核酸分子的摩爾比存在。
127.權利要求126的方法，其中所述核酸以約1摩爾編碼一種或多種病毒蛋白質的一 種或多種核酸分子比約1摩爾編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子的摩爾比存 在。
128.權利要求114的方法，其中所述編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分 子、所述編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子、和所述配體靶向的陽離子脂質體 以約0.5 1至約1 40(iig總核酸Pg脂質體)的重量比存在。
129.權利要求128的方法，其中所述編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分 子、所述編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子、和所述配體靶向的陽離子脂質體 以約1 5至約1 20(1!8總核酸Pg脂質體)的重量比存在。
130.權利要求129的方法，其中所述編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分 子、所述編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子、和所述配體靶向的陽離子脂質體 以約1 10(i!g總核酸Pg脂質體)的重量比存在。
131.權利要求114的方法，其中所述一種或多種病毒蛋白質選自HI V病毒蛋白質、埃 博拉病毒蛋白質、流感病毒蛋白質、SARS病毒蛋白質、禽流感病毒蛋白質、乙型肝炎病毒蛋 白質和天花病毒蛋白質。
132.權利要求114的方法，其中所述一種或多種白介素選自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、 IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18 和 IL-23。
133.制備配體靶向的陽離子免疫脂質體復合物的方法，其包括(a)制備配體；(b)使所述配體與陽離子脂質體混合，以形成配體靶向的陽離子脂質體，其中所述配體 與所述陽離子免疫脂質體直接復合，但不化學綴合；和(c)使所述配體靶向的陽離子脂質體與下述混合編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分子；和編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子，以形成所述配體靶向的陽離子脂質體復合物。
134.權利要求133的方法，其中所述配體選自轉鐵蛋白、半乳糖、L-37pA、抗體和抗體 片段。
135.權利要求134的方法，其中所述配體是單鏈Fv片段。
136.權利要求135的方法，其中所述單鏈Fv片段是抗轉鐵蛋白受體單鏈 Fv(TfRscFv)。
137.權利要求134的方法，其中所述抗體片段在羧基末端處包括半胱氨酸部分。
138.權利要求133的方法，其進一步包括混合這樣的肽，所述肽包括與所述陽離子脂 質體結合的 K[K(H)KKK]5-K(H)KKC(HoKC) (SEQID NO 1)肽。
139.權利要求133的方法，其中所述陽離子脂質體包括一種或多種陽離子脂質和一種 或多種中性或輔助脂質的混合物。
140.權利要求133的方法，其中所述配體和所述陽離子脂質體以約1 1至約 1 100 (w w)范圍中的比存在。
141.權利要求140的方法，其中所述配體和所述陽離子脂質體以約1 10至約 1 50(w w)范圍中的比存在。
142.權利要求141的方法，其中所述配體和所述陽離子脂質體以約1 20至約 1 40(w w)范圍中的比存在。
143.權利要求133的方法，其中所述陽離子脂質體包括二油?；谆姿徜@與二油 ?；字Ｒ掖及泛?或膽固醇的混合物；或雙十八烷基二甲基溴化銨與二油?；字?乙醇胺和/或膽固醇的混合物。
144.權利要求133的方法，其中所述核酸分子以約0.1摩爾編碼一種或多種病毒蛋白 質的一種或多種核酸分子比約10摩爾編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子；至 10摩爾編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分子比約0. 1摩爾編碼一種或多種 白介素的一種或多種核酸分子的摩爾比存在。
145.權利要求144的方法，其中所述核酸以約1摩爾編碼一種或多種病毒蛋白質的一 種或多種核酸分子比約1摩爾編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子的摩爾比存 在。
146.權利要求133的方法，其中所述編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分 子、所述編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子、和所述配體靶向的陽離子脂質體 以約0.5 1至約1 40(iig總核酸Pg脂質體)的重量比存在。
147.權利要求146的方法，其中所述編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分 子、所述編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子、和所配體靶向的述陽離子脂質體 以約1 5至約1 20(iig總核酸Pg脂質體)的重量比存在。
148.權利要求147的方法，其中所述編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分 子、所述編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子、和所述配體靶向的陽離子脂質體 以約1 10(iig總核酸Pg脂質體)的重量比存在。
149.權利要求133的方法，其中所述一種或多種病毒蛋白質選自HIV病毒蛋白質、埃博 拉病毒蛋白質、流感病毒蛋白質、SARS病毒蛋白質、禽流感病毒蛋白質、乙型肝炎病毒蛋白 質和天花病毒蛋白質。
150.權利要求133的方法，其中所述一種或多種白介素選自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、 IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18 和 IL-23。
151.制備配體靶向的陽離子免疫脂質體復合物的方法，其包括(a)制備配體；(b)使所述配體與陽離子脂質體化學綴合，以形成配體靶向的陽離子脂質體；和(c)使所述配體靶向的陽離子脂質體與下述混合編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分子；和編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子，以形成所述配體靶向的陽離子脂質體復合物。
152.權利要求151的方法，其中所述配體選自轉鐵蛋白、半乳糖、L-37pA、抗體和抗體 片段。
153.權利要求151的方法，其中所述配體是單鏈Fv片段。
154.權利要求153的方法，其中所述單鏈Fv片段是抗轉鐵蛋白受體單鏈 Fv(TfRscFv)。
155.權利要求152的方法，其中所述抗體片段在羧基末端處包括半胱氨酸部分。
156.權利要求151的方法，其進一步包括混合這樣的肽，所述肽包括與所述陽離子脂 質體結合的 K[K(H)KKK]5-K(H)KKC(HoKC) (SEQID NO 1)肽。
157.權利要求151的方法，其中所述配體經由硫原子與所述陽離子脂質體化學綴合， 所述硫原子是在所述直接綴合前在所述配體上的羧基末端處的巰基的部分。
158.權利要求151的方法，其中所述陽離子脂質體包括一種或多種陽離子脂質和一種 或多種中性或輔助脂質的混合物。
159.權利要求151的方法，其中所述配體和所述陽離子脂質體以約1 1至約 1 100 (w w)范圍中的比存在。
160.權利要求159的方法，其中所述配體和所述陽離子脂質體以約1 10至約 1 50(w w)范圍中的比存在。
161.權利要求160的方法，其中所述配體和所述陽離子脂質體以約1 20至約 1 40(w w)范圍中的比存在。
162.權利要求151的方法，其中所述陽離子脂質體包括二油?；谆姿徜@與二油 ?；字Ｒ掖及泛?或膽固醇的混合物；或雙十八烷基二甲基溴化銨與二油酰基磷脂酰 乙醇胺和/或膽固醇的混合物。
163.權利要求151的方法，其中所述核酸分子以約0.1摩爾編碼一種或多種病毒蛋白 質的一種或多種核酸分子比約10摩爾編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子；至 10摩爾編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分子比約0. 1摩爾編碼一種或多種 白介素的一種或多種核酸分子的摩爾比存在。
164.權利要求163的方法，其中所述核酸以約1摩爾編碼一種或多種病毒蛋白質的一 種或多種核酸分子比約1摩爾編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子的摩爾比存 在。
165.權利要求151的方法，其中所述編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分 子、所述編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子、和所述陽離子脂質體以約0.5 1 至約1 40(iig總核酸Pg脂質體)的重量比存在。
166.權利要求165的方法，其中所述編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分 子、所述編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子、和所述陽離子脂質體以約1 5至 約1 20(iig總核酸Pg脂質體)的重量比存在。
167.權利要求166的方法，其中所述編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核 酸分子、所述編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子、和所述陽離子脂質體以約 1 10(yg總核酸Pg脂質體)的重量比存在。
168.權利要求151的方法，其中所述一種或多種病毒蛋白質選自HIV病毒蛋白質、埃博 拉病毒蛋白質、流感病毒蛋白質、SARS病毒蛋白質、禽流感病毒蛋白質、乙型肝炎病毒蛋白 質和天花病毒蛋白質。
169.權利要求151的方法，其中所述一種或多種白介素選自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、 IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18 和 IL-23。
170.配體靶向的陽離子脂質體復合物，其通過權利要求129或權利要求151的方法制備。
171.配體靶向的陽離子脂質體復合物，其包括陽離子脂質體、配體、編碼一種或多種病 毒蛋白質的一種或多種核酸分子、和編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子，其中 所述配體與所述陽離子脂質體直接復合，但不化學綴合。
172.配體靶向的陽離子脂質體復合物，其包括陽離子脂質體、配體、編碼一種或多種病 毒蛋白質的一種或多種核酸分子、和編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子，其中 所述配體與所述陽離子脂質體化學綴合。
173.權利要求171或權利要求172的配體靶向的配體靶向的陽離子脂質體復合物，其 中所述配體選自轉鐵蛋白、半乳糖、L-37pA、抗體和抗體片段。
174.權利要求171或權利要求172的配體靶向的陽離子脂質體復合物，其中所述核酸 分子封裝在所述陽離子脂質體內。
175.權利要求171或權利要求172的配體靶向的陽離子脂質體復合物，其中所述核酸 分子與所述陽離子脂質體的內部或外部單層結合。
176.權利要求171或權利要求172的配體靶向的陽離子脂質體復合物，其中所述配體 是單鏈Fv片段。
177.權利要求176的配體靶向的陽離子脂質體復合物，其中所述抗體片段是抗轉鐵蛋 白受體單鏈Fv (TfRscFv)。
178.權利要求171或權利要求172的配體靶向的陽離子脂質體復合物，其中所述陽離 子脂質體包括一種或多種陽離子脂質和一種或多種中性或輔助脂質的混合物。
179.權利要求171或權利要求172的配體靶向的陽離子脂質體復合物，其中所述抗體 或抗體片段和所述陽離子脂質體以約1 1至約1 100(w w)范圍中的比存在。
180.權利要求179的配體靶向的陽離子脂質體復合物，其中所述抗體或抗體片段和所 述陽離子脂質體以約1 10至約1 50(w w)范圍中的比存在。
181.權利要求180的配體靶向的陽離子脂質體復合物，其中所述抗體或抗體片段和所 述陽離子脂質體以約1 20至約1 40(w w)范圍中的比存在。
182.權利要求171或權利要求172的配體靶向的陽離子脂質體復合物，其中所述陽離 子脂質體包括二油?；谆姿徜@與二油酰基磷脂酰乙醇胺和/或膽固醇的混合物；或 雙十八烷基二甲基溴化銨與二油酰基磷脂酰乙醇胺和/或膽固醇的混合物。
183.權利要求171或權利要求172的配體靶向的陽離子脂質體復合物，其中所述核酸 分子以約0. 1摩爾編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分子比約10摩爾編碼一 種或多種白介素的一種或多種核酸分子；至10摩爾編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或 多種核酸分子比約0. 1摩爾編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子的摩爾比存在。
184.權利要求183的配體靶向的陽離子脂質體復合物，其中所述核酸以約1摩爾編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分子比約1摩爾編碼一種或多種白介素的一種 或多種核酸分子的摩爾比存在。
185.權利要求171或權利要求172的配體靶向的陽離子脂質體復合物，其中所述編碼 一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分子、所述編碼一種或多種白介素的一種或多種 核酸分子、和所述陽離子脂質體以約0.5 1至約1 40(iig總核酸Pg脂質體)的重 量比存在。
186.權利要求185的配體靶向的陽離子脂質體復合物，其中所述編碼一種或多種病毒 蛋白質的一種或多種核酸分子、所述編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子、和所 述陽離子脂質體以約1 5至約1 20(iig總核酸Pg脂質體)的重量比存在。
187.權利要求186的配體靶向的陽離子脂質體復合物，其中所述編碼一種或多種病毒 蛋白質的一種或多種核酸分子、所述編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子、和所 述陽離子脂質體以約1 10(yg總核酸Pg脂質體)的重量比存在。
188.權利要求171或權利要求172的配體靶向的陽離子脂質體復合物，其中所述一種 或多種病毒蛋白質選自HIV病毒蛋白質、流感病毒蛋白質、SARS病毒蛋白質、禽流感病毒蛋 白質、埃博拉病毒蛋白質、乙型肝炎病毒蛋白質和天花病毒蛋白質。
189.權利要求171或權利要求172的配體靶向的陽離子脂質體復合物，其中所述一種 或多種白介素選自 IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、 IL-13、IL-15、IL-17、IL-18 和 IL-23。
190.權利要求171或權利要求172的配體靶向的陽離子脂質體復合物，其進一步包 括這樣的肽，所述肽包括與所述復合物結合的K[K(H)KKK]5-K(H)KKC(HoKC) (SEQ ID NO 1) 肽。
191.藥物組合物，其包括權利要求171或權利要求172的配體靶向的陽離子脂質體復 合物。
192.權利要求191的藥物組合物，其進一步包括選自一種或多種抗菌劑、一種或多種 防腐劑、一種或多種緩沖劑和一種或多種表面活性劑的一種或多種賦形劑。
193.藥物組合物，其包括第一配體靶向的陽離子脂質體復合物，其包括陽離子脂質體、配體和編碼一種或多種 病毒蛋白質的一種或多種核酸分子，其中所述配體與所述陽離子脂質體直接復合但不化學 綴合；和第二配體靶向的陽離子脂質體復合物，其包括陽離子脂質體、配體和編碼一種或多種 白介素的一種或多種核酸分子，其中所述配體與所述陽離子脂質體直接復合但不化學綴1=1 o
194.藥物組合物，其包括第一配體靶向的陽離子脂質體復合物，其包括陽離子脂質體、配體和編碼一種或多種 病毒蛋白質的一種或多種核酸分子，其中所述配體與所述陽離子脂質體化學綴合；和第二配體靶向的陽離子脂質體復合物，其包括陽離子脂質體、配體和編碼一種或多種 白介素的一種或多種核酸分子，其中所述配體與所述陽離子脂質體化學綴合。
195.權利要求194或權利要求195的藥物組合物，其中所述核酸分子封裝在所述陽離 子脂質體內。
196.權利要求194或權利要求195的藥物組合物，其中所述核酸分子與所述陽離子脂 質體的內部或外部單層結合。
197.權利要求194或權利要求195的藥物組合物，其中所述配體選自轉鐵蛋白、半乳 糖、L-37pA、抗體和抗體片段。
198.權利要求194或權利要求195的藥物組合物，其中所述配體是單鏈Fv片段。
199.權利要求198的藥物組合物，其中所述抗體片段是抗轉鐵蛋白受體單鏈 Fv(TfRscFv)。
200.權利要求194或權利要求195的藥物組合物，其中所述第一和第二陽離子脂質體 包括一種或多種陽離子脂質和一種或多種中性或輔助脂質的混合物。
201.權利要求194或權利要求195的藥物組合物，其中每一所述陽離子脂質體的所述 抗體或抗體片段以約1 1至約1 100(w w)范圍中的比存在。
202.權利要求201的藥物組合物，其中每一所述陽離子脂質體的所述抗體或抗體片段 以約1 10至約1 50(w w)范圍中的比存在。
203.權利要求202的藥物組合物，其中每一所述陽離子脂質體的所述抗體或抗體片段 以約1 20至約1 40(w w)范圍中的比存在。
204.權利要求194或權利要求195的藥物組合物，其中所述第一和第二陽離子脂質體 包括二油酰基三甲基磷酸銨與二油?；字Ｒ掖及泛?或膽固醇的混合物；或雙十八烷 基二甲基溴化銨與二油?；字Ｒ掖及泛?或膽固醇的混合物。
205.權利要求194或權利要求195的藥物組合物，其中所述核酸分子以約0.1摩爾編 碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分子比約10摩爾編碼一種或多種白介素的一 種或多種核酸分子；至10摩爾編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分子比約0. 1 摩爾編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子的摩爾比存在。
206.權利要求205的藥物組合物，其中所述核酸以約1摩爾編碼一種或多種病毒蛋白 質的一種或多種核酸分子比約1摩爾編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子的摩 爾比存在。
207.權利要求194或權利要求195的藥物組合物，其中，在所述第一和第二陽離子脂 質體中，所述編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分子、所述編碼一種或多種白 介素的一種或多種核酸分子、和所述陽離子脂質體分別以約0.5 1至約1 40(iig總核 酸Pg脂質體)的重量比存在。
208.權利要求207的藥物組合物，其中，在所述第一和第二陽離子脂質體中，所述編碼 一種或多種病毒蛋白質的一種或多種核酸分子、所述編碼一種或多種白介素的一種或多種 核酸分子、和所述陽離子脂質體分別以約1 5至約1 20(iig總核酸Pg脂質體)的 重量比存在。
209.權利要求208的藥物組合物，其中所述編碼一種或多種病毒蛋白質的一種或多種 核酸分子、所述編碼一種或多種白介素的一種或多種核酸分子、和所述陽離子脂質體以約 1 10(yg總核酸Pg脂質體)的重量比存在。
210.權利要求194或權利要求195的藥物組合物，其中所述一種或多種病毒蛋白質選 自HIV病毒蛋白質、流感病毒蛋白質、SARS病毒蛋白質、禽流感病毒蛋白質、乙型肝炎病毒 蛋白質和天花病毒蛋白質。
211.權利要求194或權利要求195的藥物組合物，其中所述一種或多種白介素選自 IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、 IL-18 和 IL-23。
212.權利要求194或權利要求195的藥物組合物，其進一步包括這樣的肽，所述肽包括 與每一所述復合物結合的 K[K(H)KKK]5-K(H)KKC(HOKC) (SEQ ID NO 1)肽。
213.權利要求194或權利要求195的藥物組合物，其進一步包括選自一種或多種抗菌 劑、一種或多種防腐劑、一種或多種緩沖劑和一種或多種表面活性劑的一種或多種賦形劑。
全文摘要
本發(fā)明在藥物遞送且特別地基于陽離子脂質體的疫苗領域中。在實施方案中，本發(fā)明提供了制備用于遞送分子以誘導針對病毒抗原的免疫應答或者治療或預防病毒疾病的配體靶向的(例如，抗體或抗體片段靶向的)脂質體的方法。遞送系統(tǒng)的特異性得自靶向性配體。
文檔編號A61K39/12GK101801344SQ200880105375
公開日2010年8月11日 申請日期2008年7月9日 優(yōu)先權日2007年7月9日
發(fā)明者E·H·常, K·F·皮若羅 申請人:喬治敦大學