專利名稱：一種通用的抗體靶向非病毒型基因?qū)胂到y(tǒng)的制作方法
專利說(shuō)明一種通用的抗體靶向非病毒型基因?qū)胂到y(tǒng) 本發(fā)明涉及一種通用的抗體靶向非病毒型基因?qū)胂到y(tǒng)?；?qū)胂到y(tǒng)或方法可分成兩類病毒型基因?qū)胂到y(tǒng)，以逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒，腺相關(guān)病毒為載體；非病毒型基因?qū)耄鏒NA直接注射，基因槍，磷酸鈣共沉淀法，脂質(zhì)體介導(dǎo)法。由于病毒型基因?qū)胂到y(tǒng)存在許多嚴(yán)重不足，如病毒轉(zhuǎn)染有可能激活癌基因等，故非病毒型基因?qū)胂到y(tǒng)是目前研究的一個(gè)熱點(diǎn)，然而所有這些方法均存在一個(gè)重大缺陷，這也是目前基因?qū)牒突蛑委熦酱鉀Q的重大問(wèn)題，即基因?qū)氲募?xì)胞靶向性或特異性。以抗體為配體的受體介導(dǎo)的基因?qū)敕椒芸朔@些方法不足，其原理將能識(shí)別細(xì)胞膜受體的抗體(也可認(rèn)為是一種配體)先與帶強(qiáng)大正電荷的多聚陽(yáng)離子多肽(常用為多聚賴氨酸，PLL)共價(jià)交聯(lián)，形成抗體-多聚陽(yáng)離子多肽交聯(lián)物，再與帶負(fù)電荷的核酸片段非共價(jià)結(jié)合形成抗體靶向的非病毒型基因?qū)胂到y(tǒng)，然后通過(guò)抗體(配體)與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，借助受體內(nèi)化機(jī)制從而將目的基因片段靶向?qū)爰?xì)胞中。以抗體為配體的靶向非病毒基因?qū)胂到y(tǒng)較其它配體有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)可以針對(duì)任何受體制備其相應(yīng)抗體；抗體易純化；靶向性較好。目前已有多種以抗體為配體通過(guò)受體介導(dǎo)的基因?qū)胙芯康膱?bào)道，且獲得了較好結(jié)果，如抗CD3抗體，抗EGF抗體靶向基因的轉(zhuǎn)染，然而這些抗體靶向的非病毒型基因?qū)胂到y(tǒng)的構(gòu)建需要抗體與多聚陽(yáng)離子多肽的共價(jià)交聯(lián)，這對(duì)于抗體的活性有很大影響，因抗體較其它蛋白易變性失活，另外共價(jià)交聯(lián)過(guò)程需用較多的抗體，而抗體的成本較高，故有必要尋找避免抗體化學(xué)交聯(lián)的方法。本發(fā)明為一種抗體和核酸片段的連接物，能將IgG抗體與核酸片段(包括質(zhì)?；蚬押塑账?非共價(jià)鍵結(jié)合，組裝成抗體靶向非病毒型基因?qū)胂到y(tǒng)用于核酸片段的靶向?qū)耄景l(fā)明由金黃色葡萄球菌A蛋白(葡萄球菌A蛋白，SPA或A蛋白)與多聚賴氨酸(Poly-L-Lysin，PLL)共價(jià)結(jié)合形成A蛋白-多聚賴氨酸交聯(lián)物(SPA-PLL)，將該SPA-PLL交聯(lián)物與IgG抗體和質(zhì)粒或寡核苷酸經(jīng)混合組裝成細(xì)胞靶向結(jié)合的基因?qū)胂到y(tǒng)用于基因轉(zhuǎn)染，該基因?qū)胂到y(tǒng)為非病毒導(dǎo)入系統(tǒng)。
由于IgG抗體能與一種小分子蛋白SPA以高親和力，非共價(jià)迅速結(jié)合，我們可以先將PLL與SPA共價(jià)連接形成SPA-PLL交聯(lián)物，再將IgG抗體通過(guò)SPA的非共價(jià)結(jié)合從而與PLL連結(jié)起來(lái)，最后與目的基因片段結(jié)合組裝抗體靶向的非病毒型基因?qū)胂到y(tǒng)(見(jiàn)下圖解)，這樣可避免抗體的化學(xué)交聯(lián)。換句話說(shuō)，該SPA-PLL交聯(lián)物有兩個(gè)“臂”，一只與預(yù)導(dǎo)入的基因片段非共價(jià)連接，另一只與IgG抗體非共價(jià)連接，也即通過(guò)SPA-PLL交聯(lián)物將IgG抗體和基因片段非共價(jià)結(jié)合在一起，進(jìn)行基因片段的細(xì)胞靶向性導(dǎo)入。這種靶向基因?qū)胂到y(tǒng)有多種特性及優(yōu)越性1、抗體以非共價(jià)方式與預(yù)導(dǎo)入的基因片段結(jié)合，故對(duì)抗體的靶向活性無(wú)損傷2、因SPA可與多種IgG抗體以高親和力，非共價(jià)迅速結(jié)合，故只要制備出SPA-PLL，就可以將任何IgG抗體與任何預(yù)導(dǎo)入的基因片段結(jié)合構(gòu)建抗體靶向的非病毒基因?qū)胂到y(tǒng)進(jìn)行基因?qū)?，故該?dǎo)入系統(tǒng)具有通用性。
3、相對(duì)于抗體，SPA的成本很低，且SPA-PLL穩(wěn)定性很好，易保存，易標(biāo)準(zhǔn)化。

圖1為SPA-PLL交聯(lián)物的洗脫曲線圖。
圖2為SPA-PLL交聯(lián)物在200～400nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)吸收光度圖。
圖3為非還原型及還原型SPA-PLL交聯(lián)物的SDS-PAGE電泳圖譜。
圖4為酶聯(lián)法檢測(cè)包被的SPA-PLL交聯(lián)物(10μg/ml)與多種IgG的結(jié)合二抗為HRP標(biāo)記的山羊抗兔、山羊抗人、山羊抗小鼠或山羊抗牛IgG圖。
圖5為SPA-PLL交聯(lián)物結(jié)合pEGFP-C1質(zhì)粒的凝膠移動(dòng)阻滯實(shí)驗(yàn)圖。
圖6為SPA-PLL交聯(lián)物結(jié)合骨調(diào)素反義寡核苷酸的凝膠移動(dòng)阻滯實(shí)驗(yàn)圖。
圖7為CD44抗體/SPA-PLL/pEGFP-C1復(fù)合物處理NRK52E細(xì)胞40h后，pEGFP-C1質(zhì)粒表達(dá)綠色熒光蛋白從而在紫外線激發(fā)下發(fā)出熒光圖。
圖8為CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復(fù)合物與NRK52E細(xì)胞結(jié)合的熒光顯微鏡圖(×200)。
圖9為CD44抗體靶向的反義、順義或錯(cuò)義寡核苷酸復(fù)合物影響NRK52E細(xì)胞骨調(diào)素mRNA表達(dá)的斑點(diǎn)雜交圖。
ADot blot圖。B相對(duì)積分密度值分析。
圖10為不同形式的骨調(diào)素AS-ODN影響NRK52E細(xì)胞OPNmRNA表達(dá)的斑點(diǎn)雜交(CD44/SPA-PLL/AS-ODN#表示細(xì)胞經(jīng)CD44抗體預(yù)先處理60 min后再經(jīng)CD44/SPA-PLL/AS-ODN處理)圖。ADot blot圖。B相對(duì)積分密度值分析。
圖11為AS-ODN濃度為30μmol/L的CD44/SPA-PLL/AS-ODN復(fù)合物對(duì)NRK52E細(xì)胞在膠原凝膠表面粘附能力的抑制作用(CD44/SPA-PLL/AS-ODN#表示細(xì)胞經(jīng)CD44抗體預(yù)先處理60min后再經(jīng)CD44/SPA-PLL/AS-ODN處理)圖。
圖12為不同濃度CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復(fù)合物和SPA-PLL交聯(lián)物等對(duì)NRK52E細(xì)胞存活率的影響圖。
圖13為CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復(fù)合物和SPA-PLL交聯(lián)物作用不同時(shí)間對(duì)NRK52E細(xì)胞存活率的影響圖。
圖14為不同濃度CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復(fù)合物和SPA-PLL交聯(lián)物等對(duì)SMMC-7721細(xì)胞存活率的影響圖。
圖15為CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復(fù)合物和SPA-PLL交聯(lián)物作用不同時(shí)間對(duì)SMMC-7721細(xì)胞存活率的影響圖。下面對(duì)本發(fā)明作較詳盡的描述。內(nèi)容包括SPA-PLL交聯(lián)物的構(gòu)建；SPA-PLL交聯(lián)物的一些理化特性及其與多種IgG抗體，基因片段的結(jié)合特性(體現(xiàn)SPA-PLL交聯(lián)物的核心作用和通用性)；抗體靶向非病毒型基因?qū)胂到y(tǒng)的組裝及其用于細(xì)胞靶向轉(zhuǎn)染的舉例說(shuō)明；SPA-PLL交聯(lián)物及其基因?qū)胂到y(tǒng)的毒性作用。
一、PA-PLL交聯(lián)物的制備及純化。
1、主要材料(1)蛋白A(SPA，MW20000 D)，Sigma公司產(chǎn)品；(2)多聚賴氨酸(PLL，MW25700D)，Sigma公司產(chǎn)品；(3)異型雙功能交聯(lián)劑SPDP(3-[2-吡啶乙基]丙酸-N-琥珀酰亞胺酯，N-succinimidy[3-(2-pyridyldithio)proponate])，Sigma公司產(chǎn)品；(4)二硫蘇糖醇(DTT)，Roche公司產(chǎn)品；(5)SephadexG50分子篩(fine)，Pharmacia公司產(chǎn)品；(6)透析袋，Serva公司產(chǎn)品。
2、主要方法(1)SPA與PLL的化學(xué)交聯(lián)1)PLL-PDP，SPA-PDP的制備取10mg PLL或SPA用1ml 0.1M的PBS(pH7.5)溶解，置于透析袋中于4℃對(duì)0.1M的PBS(pH7.5)透析過(guò)夜，取出PLL或SPA按PLL或SPA與SPDP的1∶2摩爾比加入SPDP溶液(無(wú)水乙醇溶解，濃度20mM)50ul，緩慢攪拌加入，于室溫下作用60min，再次置于透析袋中于4℃對(duì)0.1M的PBS(pH7.5)透析過(guò)夜，其間換透析液使其充分透析去除未反應(yīng)的SPDP等小分子物質(zhì)，獲得純化PLL-PDP或SPA-PDP，于4℃保存。(2)PLL-PDP還原生成PLL-SH將10mg PLL-PDP置于透析袋中于4℃對(duì)0.1M醋酸緩沖液(pH4.5)透析過(guò)夜，使PLL-PDP的pH值為4.5，取出PLL-PDP加入1M DTT，使DTT終濃度為50mM，于室溫下作用30min后轉(zhuǎn)入透析袋中于4℃對(duì)0.1M的PBS(pH7.5)透析過(guò)夜，獲得純化的PLL-SH。透析期間充入氮?dú)庖员苊釶LL-SH氧化！(3)PLL-SH與SPA-PDP反應(yīng)生成SPA-PLL交聯(lián)物將等量PLL-SH與SPA-PDP混合于室溫下攪拌22h(期間充入氮?dú)庖员苊釶LL-SH氧化)，獲得含有SPA-PLL交聯(lián)物的混合物。
(2)SPA-PLL交聯(lián)物的純化常規(guī)方法處理SephadexG50，裝層析柱，按下列條件進(jìn)行層析，收集合并第一峰液體即為純化SPA-PLL交聯(lián)物，將合并的液體置于透析袋中用聚乙二醇濃縮至適當(dāng)體積，過(guò)濾除菌，于4℃保存。層析條件檢測(cè)波長(zhǎng)226nm；洗脫液0.1M的PBS(pH7.5)；柱長(zhǎng)62cm；柱直徑10mm；柱體積50ml；進(jìn)樣量0.9ml(＜2％)；流速≤0.5ml/min；1.5ml/管。
3結(jié)果SPA-PDP與PLL-SH反應(yīng)后的混合物中除SPA-PLL交聯(lián)物外，還有未反應(yīng)的SPA-PDP與PLL-SH及其它反應(yīng)產(chǎn)物，故需將SPA-PLL交聯(lián)物分離純化出來(lái)。我們采用SephadexG50分子篩分離洗脫，獲得3個(gè)蛋白峰(參閱圖1所示)，首峰應(yīng)是SPA-PLL交聯(lián)物。
二，SPA-PLL交聯(lián)物主要的理化性質(zhì)1、主要材料(1)30％丙烯酰胺/0.8％亞甲雙丙烯酰胺，4×Tris·Cl/SDS(pH8.8)，4×Tris·Cl/SDS(pH6.8)，自配；(2)過(guò)硫酸銨(AP)，TEMED(四甲基乙烯基二胺)，Sigma公司產(chǎn)品；(3)3×SDS蛋白加樣緩沖液，1×SDS電泳緩沖液，自配；(4)考馬斯亮藍(lán)R-250(Coomssia BrilliantR-250)，Sigma公司產(chǎn)品；(5)DTT，同前；(6)BCA-100 proteinQuantitation Kit，上海博彩生物科技有限公司產(chǎn)品。
2、主要方法(1)SPA-PLL交聯(lián)物的波長(zhǎng)掃描將SPA-PLL交聯(lián)物的PBS(0.1M，pH7.5)溶液于200～400nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定吸收光度(A值)，觀察其最大吸收光度。
(2)PA-PLL交聯(lián)物的濃度測(cè)定采用BCA法測(cè)定。按BCA-100protein Quantitation Kit說(shuō)明書進(jìn)行。大致過(guò)程將SolutinA和SolutionB按比例混合成Mix(A+B)液；將標(biāo)準(zhǔn)的牛血清白蛋白(BSA)用0.1M的PBS(pH7.5)稀釋成以下不同濃度(μg/ml)50，100，200，400，500；在BSA溶液或SPA-PLL樣品中加入Mix(A+B)液，混勻后于37℃保溫30min，待液體冷至室溫后于波長(zhǎng)562nm處測(cè)吸收光度(A值)(以0.1M的PBS pH7.5調(diào)零)，繪制BSA的標(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出SPA-PLL交聯(lián)物的濃度。
(3)SDS-PAGE電泳按照精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南方法進(jìn)行。大致過(guò)程組裝凝膠模具，先配制10％的分離膠加入模具中，待膠凝固后在其表面加入5％的層析膠同時(shí)放入樣品梳以形成樣品槽，待膠凝固后上樣，于1×SDS電泳緩沖液中電泳(100V，恒壓)，待溴酚藍(lán)指示劑接近分離膠底部停止電泳；將凝膠置于考馬斯亮藍(lán)R-250染色液中室溫振蕩3～4h后，在脫色液中脫色，觀察結(jié)果。樣品的處理采用非還原型和還原型方法非還原型法即樣品與非還原型的3×SDS蛋白加樣緩沖液混合即可；還原型法即樣品先經(jīng)過(guò)量的DTT作用10min，再與非還原型的3×SDS蛋白加樣緩沖液混合。
3、結(jié)果(1)SPA-PLL交聯(lián)物的最大吸收波長(zhǎng)將SPA-PLL交聯(lián)物在200～400nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定吸收光度(A)，在210nm處有最大光吸收值，這是因?yàn)楹写罅侩逆I所致(圖2)，并且在280nm處有一小吸收峰，可能是SPA所致。
(2)SPA-PLL交聯(lián)物的濃度測(cè)定采用BCA法建立起蛋白的濃度測(cè)定的直線回歸方程Y＝0.009783+0.000615x(r＝0.9995)，于562nm波長(zhǎng)處比色可知SPA-PLL交聯(lián)物的平均A562為0.182，經(jīng)計(jì)算可得SPA-PLL交聯(lián)物的濃度為280μg/ml(3)SPA-PLL交聯(lián)物的純度未經(jīng)還原劑DTT處理的SPA-PLL交聯(lián)物，SDS PAGE電泳后染色無(wú)條帶出現(xiàn)(圖3)，說(shuō)明SPA-PLL交聯(lián)物純度較高，無(wú)游離的SPA等其它組份存在；SPA-PLL交聯(lián)物經(jīng)DTT處理后電泳染色，可見(jiàn)在分子量約20000處出現(xiàn)一蛋白條帶(欄4)，該蛋白應(yīng)是SPA，說(shuō)明SPA是以-S-S-鍵結(jié)合在SPA-PLL交聯(lián)物中，DTT的處理能使SPA被還原出來(lái)。游離SPA是否經(jīng)DTT還原處理，電泳后染色均在分子量約20000處出現(xiàn)條帶，而游離PLL是否經(jīng)DTT還原處理則電泳染色后均無(wú)條帶出現(xiàn)(參閱圖3所示1、單抗Hab18+DTT2、蛋白分子量marker.3、SPA-PLL交聯(lián)物.4、SPA-PLL交聯(lián)物+DTT.5、游離PLL+DTT.6，游離SPA+DTT)。游離PLL及未經(jīng)DTT處理的SPA-PLL交聯(lián)物經(jīng)電泳后染色無(wú)條帶出現(xiàn)，這可能由于PLL及SPA-PLL交聯(lián)物帶強(qiáng)大正電荷，在從負(fù)極向正極的電泳過(guò)程中未能泳動(dòng)而仍停留在加樣孔中所致。
結(jié)論所制備的SPA-PLL交聯(lián)物純度較高，確實(shí)由SPA和PLL構(gòu)成。
三、PA-PLL交聯(lián)物的結(jié)合性質(zhì)所制備的SPA-PLL交聯(lián)物應(yīng)是一種抗體和核酸片段的連接物，也即既能良好結(jié)合多種IgG抗體，又能良好結(jié)合多種核酸片段或基因片斷，從而組裝成抗體靶向非病毒型基因?qū)胂到y(tǒng)用于細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)染。
(一)SPA-PLL交聯(lián)物結(jié)合IgG能力(SPA活性)
1、主要材料(1)SPA，PLL同前；(2)酶標(biāo)條板NUNC公司產(chǎn)品；(3)包被緩沖液(0.05M碳酸鹽緩沖液，pH9.6)，酶聯(lián)洗滌液(PBST即PBS-Tween20)，自配；(4)正常山羊血清，武漢博士德公司產(chǎn)品；(5)多種IgG兔抗大鼠CD44抗體(IgG)，武漢博士德公司產(chǎn)品；正常兔血清IgG，正常山羊血清IgG，正常人血清IgG，正常小牛血清IgG，均為華美生物工程公司產(chǎn)品；(6)小鼠抗人肝癌單抗HAb18，第四軍醫(yī)大學(xué)病理教研室產(chǎn)品；(7)HRP(辣根過(guò)氧化物酶)標(biāo)記的兔抗山羊IgG，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG，HRP標(biāo)記的山羊抗人IgG，HRP標(biāo)記的山羊抗牛IgG，HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，均為華美生物工程公司產(chǎn)品；(8)酶聯(lián)底物(鄰苯二胺，OPD)，Sigma公司產(chǎn)品。(9)Dynex-24100，酶標(biāo)儀，美國(guó)生產(chǎn)。
2、主要方法(1)樣品的包被按常規(guī)酶聯(lián)包被方法進(jìn)行。大致過(guò)程用包被緩沖液將SPA-PLL交聯(lián)物或PLL，SPA稀釋成終濃度10μg/ml，將稀釋的樣品加入酶聯(lián)板中(100μl/孔)于4℃過(guò)夜即可。
(2)酶聯(lián)法檢測(cè)包被的SPA-PLL交聯(lián)物與多種IgG的結(jié)合按常規(guī)酶聯(lián)方法進(jìn)行。大致過(guò)程取已包被的酶聯(lián)板去上清，加入酶聯(lián)洗滌液洗1次；用正常山羊血清(200μl/孔)于37℃封閉60min；同上洗滌3次，加入各自的IgG(100μl/孔)，于37℃孵育45min；同上洗滌3次，加入各自對(duì)應(yīng)的HRP標(biāo)記的山羊抗IgG二抗(100μl/孔)，同上孵育30min；洗滌液洗滌4次后盡量摔盡孔中余液，加入酶聯(lián)底物液(100μl/孔)，避光顯色10～30min，加入終止液(2N硫酸)終止顯色反應(yīng)，于490nm波長(zhǎng)處測(cè)吸收光度(A值)，以比值(樣品孔A490/空白對(duì)照孔A490)大于或等于2.0為陽(yáng)性。
(3)中和抑制實(shí)驗(yàn)按常規(guī)中和抑制酶聯(lián)方法進(jìn)行。大致過(guò)程先將1∶1000稀釋的HRP標(biāo)記的兔抗小鼠IgG與不同濃度的SPA-PLL交聯(lián)物混合于4℃過(guò)夜；取SPA包被的酶聯(lián)板去上清，同上封閉，洗滌，加入以上混合物，同上孵育，洗滌，加入酶聯(lián)底物液顯色，測(cè)定A490，觀察結(jié)果。
3、結(jié)果用SPA-PLL交聯(lián)物或SPA或PLL包被酶聯(lián)板，兔抗大鼠CD44抗體(IgG)，正常兔血清IgG，正常人血清IgG及小鼠單抗(HAb18)均能與包被的SPA-PLL交聯(lián)物或SPA結(jié)合，且具有IgG濃度依賴性，不與包被的PLL結(jié)合；而正常山羊IgG，牛IgG與包被的SPA-PLL結(jié)合陰性(參閱圖4所示，表1)，表現(xiàn)為其A490僅為0.3左右，與培養(yǎng)基對(duì)照孔(均值0.28)接近，提示SPA-PLL交聯(lián)物可與多種IgG抗體良好結(jié)合，但與山羊，牛等一些動(dòng)物來(lái)源的IgG抗體不結(jié)合；用SPA包被酶聯(lián)板，SPA-PLL交聯(lián)物預(yù)先處理能抑制HRP標(biāo)記的兔抗小鼠IgG與包被的SPA的結(jié)合，且具有SPA-PLL濃度依賴性(表2)，提示SPA-PLL交聯(lián)物與IgG結(jié)合具有SPA特異性。這些結(jié)果表明，SPA-PLL交聯(lián)物能良好地結(jié)合多種IgG抗體，保持較好的SPA活性，交聯(lián)過(guò)程對(duì)SPA的結(jié)合特性無(wú)明顯影響。
表1酶聯(lián)法檢測(cè)HRP標(biāo)記的兔IgG與包被的SPA-PLL交聯(lián)物等結(jié)合包被物 A492(X±SD)SPA-PLL交聯(lián)物1.022±0.15游離PLL 0.117±0.01游離SPA 1.607±0.22表2酶聯(lián)法檢測(cè)SPA-PLL交聯(lián)物抑制HRP標(biāo)記的兔IgG與包被SPA的結(jié)合
SPA-PLL交聯(lián)物(μg/m1) A492(X±SD)0 3.287±0.223501.274±0.156100 0.579±0.122200 0.224±0.116結(jié)論SPA-PLL交聯(lián)物具有結(jié)合多種IgG抗體的活性(二)SPA-PLL交聯(lián)物結(jié)合核酸片斷的能力(PLL活性)質(zhì)粒和寡核苷酸是常用于基因轉(zhuǎn)染的核酸片斷，SPA-PLL交聯(lián)物均能良好地結(jié)合質(zhì)?；蚬押塑账酳PA-PLL交聯(lián)物與質(zhì)粒結(jié)合1、主要材料(1)綠色熒光蛋白質(zhì)粒(pEGFP-C1)，按常規(guī)細(xì)菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)將pEGFP-C1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)TG1細(xì)菌，篩選，擴(kuò)增質(zhì)粒，采用Qiagenplasmid mega kit質(zhì)粒提取純化試劑盒提取pEGFP-C1質(zhì)粒，紫外分光光度法測(cè)定質(zhì)粒DNA含量；(2)HEPES平衡鹽溶液(HEPES BanlancedSolution，HBS)，自配；(3)電泳緩沖液(0.5×TBE)，自配；(4)DNA上樣緩沖液(6×)，華美生物工程公司產(chǎn)品；(5)DNA分子量Marker(221～4058bp)，上海博彩生物科技有限公司產(chǎn)品。
2、主要方法(1)SPA-PLL/pEGFP-C1質(zhì)粒復(fù)合物制備將pEGFP-C1質(zhì)粒用HEPES平衡鹽溶液稀釋成濃度0.125μg/μl，取5μl與不同濃度等體積SPA-PLL交聯(lián)物混合，于室溫下作用60min即制備成SPA-PLL/pEGFP-C1質(zhì)粒復(fù)合物；(2)質(zhì)粒DNA凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)方法進(jìn)行。具體步驟制備1％的瓊脂糖凝膠，將凝膠置于電泳緩沖液中，在樣品孔中加入SPA-PLL/pEGFP-C1質(zhì)粒復(fù)合物，DNA分子量Marker等，于70V恒壓下電泳，待溴酚藍(lán)指示劑遷移至離加樣孔4cm左右時(shí)停止電泳，于320nm紫外線處觀察，凝膠成像系統(tǒng)中成像。
3、結(jié)果pEGFP-C1質(zhì)粒分子量約4.7kb左右，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳時(shí)有多種條帶出現(xiàn)，這是由于pEGFP-C1質(zhì)粒存在多種構(gòu)型所致；當(dāng)280μg/ml，140μg/ml的SPA-PLL交聯(lián)物與等體積pEGFP-C1質(zhì)?；旌虾箅娪荆瑹o(wú)pEGFP-C1質(zhì)粒條帶出現(xiàn)；當(dāng)70μg/ml的SPA-PLL交聯(lián)物與等體積pEGFP-C1質(zhì)?；旌虾箅娪?，有部分質(zhì)粒條帶出現(xiàn)；200μg/ml的游離PLL與等體積pEGFP-C1質(zhì)?；旌虾箅娪?，無(wú)pEGFP-C1質(zhì)粒條帶出現(xiàn)；1000μg/ml游離SPA與等體積pEGFP-C1質(zhì)?；旌虾箅娪?，有pEGFP-C1質(zhì)粒條帶出現(xiàn)[參閱圖5所示1DNAmarker；2游離pEGFP質(zhì)粒；3pEGFP質(zhì)粒+SPA-PLL交聯(lián)物(280μg/ml)；4pEGFP質(zhì)粒+SPA-PLL交聯(lián)物(140μg/ml)；5pEGFP質(zhì)粒+SPA-PLL交聯(lián)物(70μg/ml)；6pEGFP質(zhì)粒+游離PLL(200μg/ml)；7pEGFP質(zhì)粒+游離SPA(1000μg/ml)]。
這些結(jié)果表明，帶正電荷的SPA-PLL交聯(lián)物及游離PLL均能很好地中和帶負(fù)電荷的質(zhì)粒的負(fù)電荷，形成電中性或帶正電荷的SPA-PLL/pEGFP-C1質(zhì)粒復(fù)合物，從而仍存在于加樣孔中不能在電場(chǎng)中的移動(dòng)，且這種電荷中和作用具有SPA-PLL交聯(lián)物濃度依賴性，顯示SPA-PLL交聯(lián)物具有良好地結(jié)合質(zhì)粒的能力，保持較好的PLL活性，交聯(lián)過(guò)程對(duì)PLL的結(jié)合特性無(wú)明顯影響。
結(jié)論SPA-PLL交聯(lián)物具有良好地結(jié)合質(zhì)粒的能力SPA-PLL交聯(lián)物與寡核苷酸片段的結(jié)合1、主要材料(1)大鼠骨調(diào)素(osteopontin，OPN)反義寡核苷酸(AS-ODN)，其堿基序列與OPN mRNA上游部分(含起始密碼)堿基互補(bǔ)，序列為5‘AAC CAC TGC CAG TCT CAT 3‘，所有堿基均經(jīng)硫代修飾，由上海Sangon公司經(jīng)亞磷酰胺法合成，PAGE純化，紫外分光光度法定量。(2)HEPES平衡鹽溶液，自配；(3)電泳緩沖液(1×TBE)，自配；(4)DNA上樣緩沖液(6×)，華美生物工程公司產(chǎn)品；(5)DNA分子量Marker(100～1500bp)，上海博彩生物科技有限公司產(chǎn)品。
2、主要方法(1)SPA-PLL/AS-ODN復(fù)合物制備將AS-ODN用HEPES平衡鹽溶液稀釋成濃度0.58μg/μl，取5μl與不同濃度等體積SPA-PLL交聯(lián)物混合，于室溫下作用60min即制備成SPA-PLL/AS-ODN復(fù)合物；(2)制備2％的瓊脂糖凝膠，在樣品孔中加入SPA-PLL/AS-ODN復(fù)合物，DNA分子量Marker等，用1×TBE為電泳緩沖液，于70V恒壓下電泳15min，立即于320nm紫外線處觀察，凝膠成像系統(tǒng)中成像。
3、結(jié)果AS-ODN含18個(gè)核苷酸，分子量很小，在2％瓊脂糖凝膠電泳中泳動(dòng)速度較快，且易擴(kuò)散，故電泳時(shí)間應(yīng)很短；SPA-PLL交聯(lián)物能抑制AS-ODN的泳動(dòng)，且具有濃度依賴性，游離PLL(200μg/ml)及較高濃度(280μg/ml，140μg/ml)SPA-PLL交聯(lián)物能完全抑制AS-ODN的泳動(dòng)[參閱圖6所示1DNA marker；2游離AS-ODN；3AS-ODN+PLL(200μg/ml)；4AS-ODN+SPA-PLL交聯(lián)物(280μg/ml)；5AS-ODN+SPA-PL交聯(lián)物L(fēng)(140μg/ml)；6AS-ODN+SPA-PLL交聯(lián)物(70μg/ml)；7AS-ODN+SPA-PLL交聯(lián)物(35μg/ml)；8AS-ODN+SPA-PLL交聯(lián)物(17.5μg/ml)；7AS-ODN+SPA(1000μg/ml))]，而游離SPA無(wú)抑制作用，提示SPA-PLL交聯(lián)物具有良好地結(jié)合寡核苷酸片斷能力，該能力由PLL而非SPA賦予。
結(jié)論SPA-PLL交聯(lián)物具有良好地結(jié)合寡核苷酸片斷的能力四、抗體靶向非病毒型基因?qū)胂到y(tǒng)的組裝及應(yīng)用舉例SPA-PLL交聯(lián)物顯示出既可良好地結(jié)合多種IgG又可良好結(jié)合質(zhì)粒和寡核苷酸片段的特性即該復(fù)合物與IgG抗體和核酸片斷結(jié)合即可組裝成抗體靶向非病毒型基因?qū)胂到y(tǒng)，該組裝也即SPA-PLL交聯(lián)物與IgG抗體和預(yù)導(dǎo)入的基因的結(jié)合過(guò)程極其簡(jiǎn)便，且為非共價(jià)結(jié)合，即將SPA-PLL交聯(lián)物與IgG抗體和預(yù)導(dǎo)入的基因混合，在室溫下靜置30～60分鐘即可。下面列舉實(shí)例說(shuō)明幾種抗體靶向非病毒型基因?qū)胂到y(tǒng)的組裝及靶向轉(zhuǎn)染細(xì)胞情況。
大鼠腎小管上皮細(xì)胞株(NRK52E)細(xì)胞在細(xì)胞因子EGF作用下能表達(dá)CD44分子及骨調(diào)素(osteopontin，OPN)，將能識(shí)別NRK52E細(xì)胞表面受體CD44的抗體為配體，通過(guò)SPA-PLL交聯(lián)物的非共價(jià)結(jié)合，與綠色熒光蛋白質(zhì)?；蚬钦{(diào)素反義寡核苷酸組裝抗體靶向非病毒型基因?qū)胂到y(tǒng)(CD44抗體/SPA-PLL/pEGFP-C1或CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN)，期望該導(dǎo)入系統(tǒng)能特異性或靶向性將綠色熒光蛋白質(zhì)?；蚬钦{(diào)素反義寡核苷酸導(dǎo)入大鼠腎小管上皮細(xì)胞中并使核酸片斷發(fā)揮作用。
(一)將綠色熒光蛋白質(zhì)粒(pEGFP-C1)靶向?qū)氡磉_(dá)CD44分子的大鼠腎小管上皮細(xì)胞株(NRK52E)細(xì)胞中CD44抗體靶向的綠色熒光蛋白質(zhì)粒導(dǎo)入系統(tǒng)的組裝1、主要材料(1)HEPES平衡鹽溶液，自配；(2)綠色熒光蛋白質(zhì)粒(pEGFP-C1)，本室純化；(3)兔抗大鼠CD44抗體(IgG)，武漢博士德公司產(chǎn)品；(4)SPA-PLL交聯(lián)物，同前制備。
2、主要方法(1)SPA-PLL交聯(lián)物與pEGFP-C1質(zhì)粒結(jié)合的適宜質(zhì)量比的確定同上采用質(zhì)粒DNA凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)，可得SPA-PLL交聯(lián)物與pEGFP-C1質(zhì)粒適宜質(zhì)量比1∶0.89。
(2)SPA-PLL交聯(lián)物與CD44抗體結(jié)合的適宜質(zhì)量比的確定按常規(guī)中和抑制酶聯(lián)方法進(jìn)行。大致過(guò)程一定濃度的兔抗大鼠CD44抗體(20μg/ml)與不同濃度的SPA-PLL交聯(lián)物混合于4℃過(guò)夜；取SPA包被的酶聯(lián)板去上清，同上節(jié)法封閉，洗滌，加入SPA-PLL/CD44抗體混合物，同上節(jié)孵育，洗滌，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(100μl/孔)，同上孵育30min；洗滌液洗滌4次后盡量摔盡孔中余液，加入酶聯(lián)底物液顯色，測(cè)定A490，按下式計(jì)算SPA-PLL交聯(lián)物抑制CD44抗體與包被SPA結(jié)合的抑制率。以達(dá)到最大抑制率時(shí)所需最小的SPA-PLL交聯(lián)物的量與CD44抗體的質(zhì)量比即為SPA-PLL交聯(lián)物與抗體適宜質(zhì)量比。
抑制率＝(1-實(shí)驗(yàn)孔A490/對(duì)照孔A490)×100％(實(shí)驗(yàn)孔指在固定濃度CD44抗體中混合0～200μg/ml濃度的SPA-PLL交聯(lián)物；對(duì)照孔指在固定濃度CD44抗體中混合PBS)。經(jīng)計(jì)算可得SPA-PLL交聯(lián)物與CD44抗體結(jié)合的合適質(zhì)量比1∶0.5。
(3)CD44/SPA-PLL/pEGFP-C1質(zhì)粒復(fù)合物即CD44抗體靶向的綠色熒光蛋白質(zhì)粒導(dǎo)入系統(tǒng)的組裝將SPA-PLL交聯(lián)物，質(zhì)粒pEGFP-C1分別用HEPES平衡鹽溶液溶解，按SPA-PLL交聯(lián)物與pEGFP-C1質(zhì)粒適宜質(zhì)量比1∶0.89混合，室溫靜置60min；按SPA-PLL交聯(lián)物與抗體適宜質(zhì)量比1∶0.5再將該混合物與抗體混合，室溫靜置60min即獲得CD44抗體/SPA-PLL/pEGFP-C1復(fù)合物，過(guò)濾。
結(jié)論將SPA-PLL交聯(lián)物與CD44抗體和pEGFP-C1質(zhì)?；旌?，于室溫下分別靜置60min即組裝成CD44抗體靶向的綠色熒光蛋白質(zhì)粒導(dǎo)入系統(tǒng)，組裝過(guò)程簡(jiǎn)單方便，為非共價(jià)結(jié)合。
CD44抗體靶向的綠色熒光蛋白質(zhì)粒導(dǎo)入系統(tǒng)靶向轉(zhuǎn)染表達(dá)CD44分子的大鼠腎小管上皮細(xì)胞株(NRK52E)細(xì)胞1、主要材料(1)CD44/SPA-PLL/PEGFP-C1質(zhì)粒復(fù)合物，同上制備；(2)綠色熒光蛋白質(zhì)粒(pEGFP-C1)，本室純化；(3)兔抗大鼠CD44抗體(IgG)，同上；(4)RPMI1640培養(yǎng)基，Gibco公司產(chǎn)品；(5)小牛血清，杭州四季青公司產(chǎn)品；(6)小鼠表皮生長(zhǎng)因子(EGF)，Gibco公司產(chǎn)品；(7)6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，Corning Costar公司產(chǎn)品；(8)大鼠腎小管上皮細(xì)胞株(NRK52E)，本室提供。
2、主要方法(1)細(xì)胞的培養(yǎng)將NRK52E細(xì)胞用胰蛋白酶-EDTA消化下來(lái)，計(jì)數(shù)后加入直徑35cm的6孔板中(5×105/孔)，用含EGF(0.5μg/ml)的10％小牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞密度為60～70％的融合度。
(2)細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞去上清分別加入下列復(fù)合物CD44/SPA-PLL/pEGFP-C1質(zhì)粒復(fù)合物，SPA-PLL/pEGFP-C1質(zhì)粒復(fù)合物，游離pEGFP-C1質(zhì)粒，CD44抗體+pEGFP-C1質(zhì)粒混合物，同時(shí)設(shè)置含EGF(0.5μg/ml)的10％小牛血清的1640培養(yǎng)基對(duì)照。這些復(fù)合物或混合物均用含EGF(0.5μg/ml)的10％小牛血清的1640培養(yǎng)基稀釋，其中pEGFP-C1質(zhì)粒量均為2.5μg/ml，于37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)16h，用無(wú)血清1640培養(yǎng)基洗滌2次后換含10％小牛血清的1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h，用PBS洗滌后于熒光顯微鏡下觀察GFP蛋白的表達(dá)和在細(xì)胞中的定位。同時(shí)先將細(xì)胞預(yù)先經(jīng)CD44抗體(50μg/ml)于4℃孵育60min，再加入CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復(fù)合物，再按上述方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以觀察該復(fù)合物轉(zhuǎn)染的特異性。
3、結(jié)果CD44抗體/SPA-PLL/pEGFP-C1復(fù)合物處理細(xì)胞40h后，熒光顯微鏡下觀察可見(jiàn)部分細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，且熒光主要分布于細(xì)胞核中(參閱圖7所示)，表明pEGFP-C1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，并進(jìn)行了有效的轉(zhuǎn)錄，翻譯生成了綠色熒光蛋白從而在紫外線激發(fā)下發(fā)出熒光；然而游離pEGFP-C1質(zhì)粒，SPA-PLL/pEGFP-C1復(fù)合物或CD44抗體+pEGFP-C1質(zhì)粒的混合物處理細(xì)胞40h，未觀察到細(xì)胞綠色熒光陽(yáng)性(表3)，提示CD44抗體/SPA-PLL/pEGFP-C1復(fù)合物轉(zhuǎn)染細(xì)胞的有效性。將NRK52E細(xì)胞預(yù)先經(jīng)CD44抗體(50ug/ml)于4℃孵育60min，再加入CD44抗體/SPA-PLL/pEGFP-C1復(fù)合物處理細(xì)胞40h觀察，則未觀察到細(xì)胞綠色熒光陽(yáng)性，表明CD44抗體能阻斷該復(fù)合物與細(xì)胞的結(jié)合，提示CD44抗體/SPA-PLL/pEGFP-C1復(fù)合物轉(zhuǎn)染細(xì)胞具特異性或靶向性。
表3pEGFP-C1質(zhì)粒的不同形式轉(zhuǎn)染NRK52E細(xì)胞40h后表達(dá)綠色熒光蛋白的情況pEGFP-C1形式 熒光CD44抗體/SPA-PLL/pEGFP-C1 +SPA-PLL/pEGFP-C1 -游離pEGFP-C1 -CD44抗體+pEGFP-C1 -完全1640培養(yǎng)基 -結(jié)論CD44抗體靶向的綠色熒光蛋白質(zhì)粒導(dǎo)入系統(tǒng)能將綠色熒光蛋白質(zhì)粒靶向?qū)氪笫竽I小管上皮細(xì)胞中，并使該質(zhì)粒在細(xì)胞獲得有效表達(dá)。
(二)將骨調(diào)素反義寡核苷酸靶向?qū)氡磉_(dá)CD44分子的大鼠腎小管上皮細(xì)胞株(NRK52E)細(xì)胞中CD44抗體靶向的反義寡核苷酸導(dǎo)入系統(tǒng)的組裝1，主要材料(1)HEPES平衡鹽溶液，自配；(2)大鼠骨調(diào)素(osteopontin，OPN)反義寡核苷酸(AS-ODN)，同前；(3)兔抗大鼠CD44抗體(IgG)，同前；(4)SPA-PLL復(fù)合物，同前制備。
2、主要方法(1)SPA-PLL交聯(lián)物與AS-ODN結(jié)合的適宜質(zhì)量比的確定同前采用寡核苷酸凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)，可得SPA-PLL交聯(lián)物與AS-ODN適宜質(zhì)量比1∶4.1；(2)SPA-PLL交聯(lián)物與CD44抗體結(jié)合的適宜質(zhì)量比的測(cè)定同前方法測(cè)定，SPA-PLL交聯(lián)物與CD44抗體結(jié)合的適宜質(zhì)量比為1∶0.5；(3)CD44/SPA-PLL/AS-ODN復(fù)合物即CD44抗體靶向反義寡核苷酸的導(dǎo)入系統(tǒng)的組裝將SPA-PLL交聯(lián)物，AS-ODN分別用HEPES平衡鹽溶液溶解，按SPA-PLL交聯(lián)物與AS-ODN適宜質(zhì)量比1∶4.1混合，室溫靜置60min；按SPA-PLL交聯(lián)物與抗體適宜質(zhì)量比1∶0.5再將該混合物與抗體混合，室溫靜置60min即獲得CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復(fù)合物，過(guò)濾。
結(jié)論將SPA-PLL交聯(lián)物與CD44抗體和OPN反義寡核苷酸混合，于室溫下分別靜置60min即組裝成CD44抗體靶向的OPN反義寡核苷酸導(dǎo)入系統(tǒng)，組裝過(guò)程簡(jiǎn)單方便，為非共價(jià)結(jié)合。
CD44抗體靶向的反義寡核苷酸導(dǎo)入系統(tǒng)靶向轉(zhuǎn)染表達(dá)CD44分子的大鼠腎小管上皮細(xì)胞株(NRK52E)細(xì)胞的觀察1、主要材料(1)FAM標(biāo)記的AS-ODN，5’端經(jīng)熒光素(FAM)標(biāo)記，由上海Sangon公司經(jīng)亞磷酰胺法合成，PAGE純化，紫外分光光度法定量；(2)CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復(fù)合物，同上制備；(3)SPA-PLL/AS-ODN復(fù)合物，自制；(4)兔抗大鼠CD44抗體(IgG)，同上；(5)CD44抗體+AS-ODN混合物；(6)RPMI1640培養(yǎng)基，Gibco公司產(chǎn)品；(7)小牛血清，杭州四季青公司產(chǎn)品；(8)小鼠表皮生長(zhǎng)因子(EGF)，Gibco公司產(chǎn)品；(9)6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，Corning Costar公司產(chǎn)品；(10)大鼠腎小管上皮細(xì)胞株(NRK52E)，本室提供。
2、主要方法(1)細(xì)胞的培養(yǎng)同前；(2)細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞去上清分別加入下列復(fù)合物CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復(fù)合物，SPA-PLL/AS-ODN復(fù)合物，游離AS-ODN，CD44抗體+AS-ODN混合物。同時(shí)設(shè)置含EGF(0.5ug/ml)的10％小牛血清的1640培養(yǎng)基對(duì)照。這些復(fù)合物或混合物均用含EGF(0.5ug/ml)的10％小牛血清的1640培養(yǎng)基稀釋，其中AS-ODN量均為52μg/ml，于37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)2h，用冷PBS洗滌細(xì)胞2次后于熒光顯微鏡下觀察。同時(shí)先將細(xì)胞預(yù)先經(jīng)CD44抗體(50ug/ml)于4℃孵育60min，再加入CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復(fù)合物，再按上述方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以觀察該復(fù)合物轉(zhuǎn)染的特異性。
3、結(jié)果CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復(fù)合物與NRK52E細(xì)胞孵育后能較好地與細(xì)胞結(jié)合，表現(xiàn)為復(fù)合物結(jié)合在細(xì)胞周圍發(fā)出黃綠色熒光(參閱圖8所示)，而SPA-PLL/AS-ODN復(fù)合物，游離AS-ODN，CD44抗體+AS-ODN混合物與細(xì)胞孵育2h后經(jīng)洗滌則未見(jiàn)細(xì)胞發(fā)出熒光，提示CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復(fù)合物能特異性結(jié)合在靶細(xì)胞表面；當(dāng)細(xì)胞預(yù)先用CD44抗體處理再與CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復(fù)合物孵育則未見(jiàn)該復(fù)合物結(jié)合在細(xì)胞周圍，進(jìn)一步提示CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復(fù)合物能特異性或靶向性結(jié)合NRK52E細(xì)胞。
結(jié)論CD44抗體靶向的OPN反義寡核苷酸導(dǎo)入系統(tǒng)能將OPN反義寡核苷酸靶向?qū)氪笫竽I小管上皮細(xì)胞中。CD44抗體靶向的反義寡核苷酸導(dǎo)入系統(tǒng)靶向轉(zhuǎn)染表達(dá)大鼠腎小管上皮細(xì)胞株(NRK52E)細(xì)胞對(duì)OPN mRNA表達(dá)及粘附活性的影響1、主要材料(1)大鼠骨調(diào)素(osteopontin，OPN)反義寡核苷酸(AS-ODN)，同前；順義寡核苷酸(S-ODN)堿基序列5’ATG AGA CTG GCA GTG GTT3’；錯(cuò)義寡核苷酸(MS-ODN)堿基序列5’CTC TCA CAC TAA AGC GTC3’；以上片斷所有堿基均經(jīng)硫代修飾，由上海Sangon公司經(jīng)亞磷酰胺法合成，PAGE純化，紫外分光光度法定量；(2)兔抗大鼠CD44抗體(IgG)，同上；(3)CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復(fù)合物，CD44抗體/SPA-PLL/S-ODN復(fù)合物，CD44抗體/SPA-PLL/MS-ODN復(fù)合物，SPA-PLL/AS-ODN復(fù)合物，CD44抗體+AS-ODN混合物均按上述CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復(fù)合物制備方法制備；(4)RPMI1640培養(yǎng)基，Gibco公司產(chǎn)品；(5)小牛血清，杭州四季青公司產(chǎn)品；(6)小鼠表皮生長(zhǎng)因子(EGF)，Gibco公司產(chǎn)品；(7)Vitrogen100，Celtrix公司產(chǎn)品(8)6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，Corning Costar公司產(chǎn)品；(9)大鼠腎小管上皮細(xì)胞株(NRK52E)，本室提供。
2、主要方法(1)細(xì)胞的培養(yǎng)同前；(2)細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞去上清分別加入1ml不同濃度的下列復(fù)合物(1)CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復(fù)合物(2)CD44抗體/SPA-PLL/S-ODN復(fù)合物(3)CD44抗體/SPA-PLL/MS-ODN復(fù)合物(4)SPA-PLL/AS-ODN復(fù)合物(5)游離AS-ODN(6)CD44抗體+AS-ODN混合物，這些復(fù)合物或混合物均用含EGF(0.5μg/ml)的10％小牛血清的1640培養(yǎng)基稀釋，同時(shí)設(shè)置含EGF(0.5ug/ml)的10％小牛血清的1640培養(yǎng)基對(duì)照，于37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)2h，用無(wú)血清1640培養(yǎng)基洗滌3次，再繼續(xù)培養(yǎng)48h，收集細(xì)胞提取總RNA。(3)細(xì)胞總RNA的提取按Trizol試劑盒說(shuō)明書操作，同前。(4)RNA的斑點(diǎn)雜交按“The Dig System User’sGuide for Filter Hybridization”說(shuō)明書(Boehringer Mannheim公司)操作；(5)膠原凝膠的制備將Vitrogen100與此1×和10×M199培養(yǎng)基混合，使膠原的終濃度為2mg/ml，調(diào)pH值為7.4，加入到6孔板中于37℃過(guò)夜使膠凝固；(6)細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)將經(jīng)處理的細(xì)胞用胰蛋白酶-EDTA消化下來(lái)計(jì)數(shù)(細(xì)胞濃度2.5×105/ml)，取200μl加在膠原凝膠表面，于37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)，于不同時(shí)間點(diǎn)用培養(yǎng)基沖洗凝膠表面計(jì)數(shù)未貼附的細(xì)胞和已貼附的細(xì)胞，按下式計(jì)算細(xì)胞在凝膠中的貼附率(％)。貼附率(％)＝貼附細(xì)胞數(shù)/加入細(xì)胞數(shù)×100％3、結(jié)果(1)CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復(fù)合物對(duì)NRK52E細(xì)胞OPN mRNA表達(dá)的抑制作用RNA斑點(diǎn)雜交結(jié)果表明，當(dāng)同CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復(fù)合物共培養(yǎng)48h，NRK52E細(xì)胞OPN-mRNA水平較低，明顯低于未加藥物的1640培養(yǎng)基對(duì)照，且具有AS-ODN一定的濃度依賴性，其最低抑制濃度為10μmmol/L；而經(jīng)CD44抗體/SPA-PLL/S-ODN復(fù)合物或CD44抗體/SPA-PLL/MS-ODN復(fù)合物處理的細(xì)胞OPN-mRNA水平仍然較高，即使30μmmol/L濃度也未表現(xiàn)出明顯抑制作用(參閱圖9所示)，提示AS-ODN能特異性抑制大鼠小管上皮細(xì)胞OPN mRNA表達(dá)也即AS-ODN具有基因水平的特異性反義抑制作用。如將細(xì)胞預(yù)先經(jīng)CD44抗體(50ug/ml)于4℃孵育60min，加入CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復(fù)合物處理，或經(jīng)SPA-PLL/AS-ODN復(fù)合物，CD44抗體+AS-ODN混合物，游離AS-ODN處理則NRK52E細(xì)胞OPN-mRNA水平無(wú)明顯降低(參閱圖10所示)，提示CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復(fù)合物對(duì)NRK52E細(xì)胞OPN mRNA表達(dá)的抑制作用也具有細(xì)胞特異性或靶向性。CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復(fù)合物對(duì)NRK52E細(xì)胞OPN mRNA表達(dá)具有細(xì)胞和基因水平的雙重抑制作用。
(2)CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復(fù)合物對(duì)NRK52E細(xì)胞粘附能力的影響在膠原凝膠板上培養(yǎng)時(shí)，經(jīng)CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復(fù)合物處理的細(xì)胞很容易被洗滌下來(lái)，而經(jīng)CD44抗體/SPA-PLL/S-ODN復(fù)合物，CD44抗體/SPA-PLL/MS-ODN復(fù)合物，SPA-PLL/AS-ODN復(fù)合物，CD44抗體+AS-ODN混合物處理的細(xì)胞及1640培養(yǎng)基對(duì)照處理的細(xì)胞仍緊緊地貼附于板上(參閱圖11所示)，提示CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復(fù)合物可通過(guò)抑制OPN的表達(dá)從而在細(xì)胞水平，基因水平特異性地抑制NRK52E細(xì)胞的粘附功能；當(dāng)將細(xì)胞預(yù)先經(jīng)CD44抗體(50μg/ml)于4℃孵育60min，加入CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復(fù)合物處理，則該細(xì)胞不容易被洗滌下來(lái)而是較緊密貼附于板上(參閱圖11所示)，進(jìn)一步提示CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復(fù)合。
結(jié)論CD44抗體靶向的OPN反義寡核苷酸導(dǎo)入系統(tǒng)能將OPN反義寡核苷酸靶向?qū)氪笫竽I小管上皮細(xì)胞中，該反義寡核苷酸在細(xì)胞中發(fā)揮出反義抑制作用。
五、抗體靶向非病毒型基因?qū)胂到y(tǒng)的毒性作用由于抗體靶向非病毒型基因?qū)胂到y(tǒng)能選擇性或者說(shuō)特異性將目的基因?qū)氚屑?xì)胞中，讓目的基因在細(xì)胞中發(fā)揮作用，故一般希望該導(dǎo)入系統(tǒng)無(wú)或低毒性。該導(dǎo)入系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分是SPA-PLL復(fù)合物，因此SPA-PLL復(fù)合物毒性大小決定著抗體靶向非病毒型基因?qū)胂到y(tǒng)的毒性作用，下面實(shí)驗(yàn)以抗體靶向非病毒型基因?qū)胂到y(tǒng)(CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN)和SPA-PLL交聯(lián)物對(duì)培養(yǎng)的兩種細(xì)胞存活率的影響來(lái)說(shuō)明抗體靶向非病毒型基因?qū)胂到y(tǒng)對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的毒性作用。
(一)SPA-PLL交聯(lián)物和抗體靶向非病毒型基因?qū)胂到y(tǒng)(CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN)對(duì)大鼠腎小管上皮細(xì)胞(NRK52E)的毒性作用1、主要材料(1)CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復(fù)合物，SPA-PLL交聯(lián)物，SPA，PLL，同前；(2)噻唑藍(lán)(MTT)，Sigma公司產(chǎn)品；(3)二甲基亞砜(DMSO)，分析純，Sigma公司產(chǎn)品；(4)大鼠腎小管上皮細(xì)胞株(NRK52E)，同前；(5)96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，公司產(chǎn)品；(6)RPMI1640培養(yǎng)基，Gibco公司產(chǎn)品；(7)小牛血清，杭州四季青公司產(chǎn)品。
2、主要方法(1)細(xì)胞的培養(yǎng)同前；(2)，MTT比色分析將NRK52E細(xì)胞用胰蛋白酶-EDTA消化下來(lái)，計(jì)數(shù)后加入96孔板(5×104/孔)。待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復(fù)合物，SPA-PLL交聯(lián)物，SPA，PLL(每個(gè)濃度均作4復(fù)孔)，于37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)不同時(shí)間，加入MTT(5mg/ml，12μg/孔)，繼續(xù)培養(yǎng)4-8h，吸棄上清，加入DMSO(120μl/孔)，混勻后于570nm波長(zhǎng)處測(cè)吸收光度(A)，按下式計(jì)算細(xì)胞存活率存活率＝(實(shí)驗(yàn)孔A570/對(duì)照孔A570)×100％3、結(jié)果(1)不同濃度SPA-PLL交聯(lián)物及CD44/SPA-PLL/AS-ODN復(fù)合物對(duì)細(xì)胞的毒性作用當(dāng)與NRK52E細(xì)胞共同孵育72h，SPA-PLL交聯(lián)物和CD44/SPA-PLL/AS-ODN復(fù)合物在低濃度范圍內(nèi)(0～62.5μg/ml)對(duì)細(xì)胞毒性作用較小(細(xì)胞存活率＞85％)，在高濃度時(shí)(＞125μg/ml)對(duì)細(xì)胞毒性作用顯著增強(qiáng)(參閱圖12所示)；游離PLL對(duì)細(xì)胞的毒性作用明顯，且呈濃度依賴性；而游離SPA對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用，細(xì)胞存活良好(＞90％)。
(2)同一濃度SPA-PLL交聯(lián)物及CD44/SPA-PLL/AS-ODN復(fù)合物處理不同時(shí)間對(duì)細(xì)胞的毒性作用濃度為31.3μg/ml的SPA-PLL交聯(lián)物或CD44/SPA-PLL/AS-ODN復(fù)合物處理的細(xì)胞存活率較高(＞85％)，無(wú)時(shí)間依賴性，游離SPA處理對(duì)NRK52E細(xì)胞無(wú)任何毒性作用，然而PLL的處理能明顯降低細(xì)胞存活率，且具有時(shí)間依賴性(參閱圖13所示)。
結(jié)論抗體靶向非病毒型基因?qū)胂到y(tǒng)(CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN)及SPA-PLL交聯(lián)物對(duì)大鼠腎小管上皮細(xì)胞在常用濃度內(nèi)無(wú)毒性作用。
(二)SPA-PLL交聯(lián)物和抗體靶向非病毒型基因?qū)胂到y(tǒng)(CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN)對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的毒性作用1、主要材料(1)CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復(fù)合物，SPA-PLL交聯(lián)物，SPA，PLL，同前；(2)噻唑藍(lán)(MTT)，Sigma公司產(chǎn)品；(3)二甲基亞砜(DMSO)，分析純，Sigma公司產(chǎn)品；(4)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞株，四川大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室惠贈(zèng)；(5)96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，Corning Costar公司產(chǎn)品；(6)RPMI1640培養(yǎng)基，Gibco公司產(chǎn)品；(7)小牛血清，杭州四季青公司產(chǎn)品。
2、主要方法(1)細(xì)胞的培養(yǎng)同前；(2)，MTT比色分析將SMMC-7721細(xì)胞用胰蛋白酶-EDTA消化下來(lái)，計(jì)數(shù)后加入96孔板(5×104/孔)。待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復(fù)合物，SPA-PLL交聯(lián)物，SPA，PLL(每個(gè)濃度均作4復(fù)孔)，于37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)不同時(shí)間，加入MTT(5mg/ml，12μl/孔)，繼續(xù)培養(yǎng)4～8h，吸棄上清，加入DMSO(120μl/孔)，混勻后于570nm波長(zhǎng)處測(cè)吸收光度(A)，按下式計(jì)算細(xì)胞存活率存活率＝(實(shí)驗(yàn)孔A570/對(duì)照孔A570)×100％3、結(jié)果(1)不同濃度SPA-PLL交聯(lián)物及CD44/SPA-PLL/AS-ODN復(fù)合物對(duì)細(xì)胞的毒性作用當(dāng)與SMMC-7721細(xì)胞共同孵育72h，SPA-PLL交聯(lián)物和CD44/SPA-PLL/AS-ODN復(fù)合物在低濃度范圍內(nèi)(0～62.5ug/ml)對(duì)細(xì)胞毒性作用較小(細(xì)胞存活率＞85％)，在高濃度時(shí)(＞125μg/ml)對(duì)細(xì)胞毒性作用顯著增強(qiáng)(參閱圖14所示)；游離PLL對(duì)細(xì)胞的毒性作用明顯，且呈濃度依賴性；而游離SPA細(xì)胞無(wú)毒性作用，細(xì)胞存活良好。
(2)同一濃度SPA-PLL交聯(lián)物和SPA-PLLCD44/SPA-PLL/AS-ODN復(fù)合物處理不同時(shí)間對(duì)細(xì)胞的毒性作用濃度為31.3μg/ml的SPA-PLL交聯(lián)物或CD44/SPA-PLL/AS-ODN復(fù)合物處理的細(xì)胞存活率較高(85％以上)，無(wú)時(shí)間依賴性，游離SPA處理對(duì)SMMC-7721細(xì)胞無(wú)任何毒性作用；然而游離PLL的處理能明顯降低細(xì)胞存活率，且具有時(shí)間依賴性(參閱圖15所示)。
結(jié)論抗體靶向非病毒型基因?qū)胂到y(tǒng)(CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN)及SPA-PLL交聯(lián)物對(duì)人肝癌細(xì)胞在常用濃度內(nèi)無(wú)毒性作用。
權(quán)利要求
1.一種通用的抗體靶向非病毒型基因?qū)胂到y(tǒng)，其特征在于由金黃色葡萄球菌A蛋白與多聚賴氨酸共價(jià)結(jié)合形成A蛋白-多聚賴氨酸交聯(lián)物，將該A蛋白-多聚賴氨酸交聯(lián)物與IgG抗體和質(zhì)?；蚬押塑账峤?jīng)混合組裝成細(xì)胞靶向結(jié)合的基因?qū)胂到y(tǒng)用于基因轉(zhuǎn)染，該基因?qū)胂到y(tǒng)為非病毒導(dǎo)入系統(tǒng)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種通用的抗體靶向非病毒型基因?qū)胂到y(tǒng)。該基因?qū)胂到y(tǒng)由三部分構(gòu)成IgG抗體，蛋白A－多聚賴氨酸交聯(lián)物(SPA－PLL)和預(yù)導(dǎo)入的核酸片段(包括基因)，其中核心部分為SPA－PLL交聯(lián)物，SPA－PLL交聯(lián)物能與多種IgG抗體及多種預(yù)導(dǎo)入的核酸片段經(jīng)過(guò)混合即可組裝成多種不同的抗體靶向非病毒型基因?qū)胂到y(tǒng)，故該系統(tǒng)具有通用性；該基因?qū)胂到y(tǒng)具有良好的細(xì)胞靶向性或特異性。
文檔編號(hào)C12N15/87GK1478898SQ03126650
公開日2004年3月3日 申請(qǐng)日期2003年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月23日
發(fā)明者劉曉波, 余學(xué)清 申請(qǐng)人:中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院