專利名稱：誘導型位點特異性重組系統(tǒng)定時刪除特定外源基因的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種利用誘導型位點特異性重組技術在特定時間內刪除基因的技術，屬于生物技術領域。
背景技術：
轉基因植物的實驗中主要使用的是兩種遺傳成分，目的基因和標記基因。其中，標記基因大致可以分為選擇標記基因和報告基因，它們起著篩選和鑒定轉化細胞的作用。也就是說，在轉化過程中，需要合適的選擇標記基因，用來篩選那些導入外源基因的細胞。選擇標記基因主要有抗生素抗性、抗除草劑抗性和植物代謝三大類。前兩類使用最為普遍，現(xiàn)在常用的標記基因有hpt(潮霉素磷酸轉移酶)、ntpII(氯霉素乙酰轉移酶)、bar(草丁膦-N-一線轉移酶)基因等。
目前，越來越多的人認識到標記基因的存在所帶來的負面影響。第一，由于轉化體細胞進行再次轉化時不能采用相同的選擇標記基因，只能使用其它的選擇標記基因。從而導致轉化體中選擇標記基因的累加。刪除掉轉化體中的選擇標記基因將利于轉化體細胞的再次轉化。第二，一旦確定目的基因已存在于轉化體中，標記基因就完成了它的使命，在轉化體中是無用的部分。第三，標記基因的數(shù)量是有限的，這一事實就造成了多個目的基因都與某一個標記基因相關，形成多重轉化中存在同源序列的現(xiàn)象。多重同源序列有利于基因沉默的發(fā)生，繼而破壞了遺傳轉化體內的穩(wěn)定遺傳和表達。Goldbrough認為第二次轉化會導致首次轉化基因表達的改變或丟失的現(xiàn)象，但對這種不穩(wěn)定的遺傳機制還不完全清楚。第四，通過種或品種間的花粉雜交，可能導致雜草就有抗性，長期種植轉基因植物將會導致一系列的生態(tài)問題。第五，在健康和安全領域，人們對于轉基因食品最主要的擔心在于選擇標記基因及其產物是否有毒。第六，當一些臨床或獸用抗生素基因作為選擇標記基因被利用時，人們關心這些標記基因是否會轉到微生物中，從而使人或牲畜中的病原微生物增加。雖有大量研究表明一些標記基因對人畜是安全的，但人們在心理上并不能完全接受轉基因食品。如果徹底刪除掉轉基因食品中的標記基因，轉基因食品可能就不存在安全性問題。
利用位點特異性重組系統(tǒng)刪除外源基因的方法是隨著對轉基因作物安全性問題的日益重視而逐步發(fā)展起來的。位點特異性重組系統(tǒng)可以對DNA進行非常精確的體內或體外重組，從而在基因或染色體水平上對生物進行改造。位點特異性重組是發(fā)生在兩條DNA鏈的特異位點上的重組，重組的發(fā)生需要一段同源序列即特異性位點(又稱附著點)以及位點特異性的蛋白因子即重組酶參與催化。重組酶僅能催化特異性位點間的重組，不能催化其它任何兩條同源或非同源序列之間的重組，而重組具有特異性和高度保守性。據(jù)此，位點特異性重組又稱保守重組。目前應用較多的位點特異性重組系統(tǒng)主要有噬菌體P1的Cre/lox系統(tǒng)(SternbergN.，Sauer B.，et al，1986，J.Mol.Biol.，187197-212)、酵母的FLP/FRT系統(tǒng)(L.Alexander lyznik，K V.Rao，Thomas K.Hodges，1996，Nucleic AcidResearch，24(19)3784-378)、噬菌體Mu的Gin/gix系統(tǒng)(Deufel，A.；Hermann，T.；Kahmann，R.，1997 Nucleic acids research.25(19)3832)、Zygosaccharomyces rouxii的R/RS系統(tǒng)(K.Sugita，E.Mastsunaga，H.Ebinuma，1999，Plant Cell Reports，18941-947)。從二十世紀80年代末至今，以Dale EC為代表的科學工作者將位點特異性重組系統(tǒng)引入到煙草、擬南芥等植物中刪除特定基因，應用Cre/lox系統(tǒng)能有效刪除轉基因植物中的標記基因。其具體操作過程為，將目的基因與選擇標記基因構建在同一轉化載體上，同時在選擇標記基因的兩側分別連上同方向的lox位點。進行第一次轉化得到含有目的基因和選擇標記基因的轉基因植株。然后向轉基因植株細胞中引入Cre基因并使Cre基因表達重組酶。Cre重組酶催化了lox位點的特異性同源重組，刪除掉標記基因。向植物細胞中引入Cre基因主要有兩種方法，一種方法是用含有Cre基因的轉化載體對轉基因植株細胞進行第二次轉化，另一種方法是用含有Cre基因的轉化載體單獨轉化植物細胞，獲得含有Cre基因的轉基因植株，并與含有標記基因的轉基因植株進行有雜交，從而將Cre基因引入含有標記基因的轉基因植株細胞中。研究結果表明，通過轉化引入Cre基因，95％的轉化體中的標記基因被刪除。通過有性雜交方法引入Cre基因，也能有效刪除標記基因，但F1代個體大多數(shù)是嵌合體，而且不同F(xiàn)1個體的F2后代中，刪除掉標記基因的個體數(shù)不同。這種方法的特點是采用二次轉化法或雜交法引入位點特異性重組系統(tǒng)；同時重組酶基因被整合到植物基因組中。但操作復雜、周期長，且引入的重組酶基因在植物體內也是無用的基因，形成了新的安全隱患。
為了克服現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明提供了一種新的方法，該方法采用一次轉化法，操作簡單、周期短，且可在需要時同時刪除特定基因和重組酶基因。

發(fā)明內容
本發(fā)明涉及一種利用誘導型位點特異性重組技術在特定時間內刪除基因的方法。此方法用于在轉基因植物轉化過程中或田間生產過程中根據(jù)需要定時刪除無用或有害的基因，且不會引入其他基因。由化學誘導啟動子控制重組酶基因的表達，特定的無用或有害的基因和重組酶基因同時位于特定重組識別位點的中間。通過轉化程序，將特定的無用或有害的基因和重組酶基因整合到植物基因組中，在特定的任意時間，通過施入誘導物使重組酶基因激活，將特定基因和重組酶基因刪除。
該方法所采用的技術方案是將化學誘導啟動子控制下的重組酶基因的和特定的無用或有害的基因同時插入特定重組識別位點的中間。轉化植物后，在需要的時間里施入誘導劑，使化學誘導啟動子轉錄，激活重組酶基因，使兩個同方向的特定重組識別位點間發(fā)生刪除反應，從而刪除重組酶基因的和特定的無用或有害的基因。如圖1所示。本發(fā)明優(yōu)選用到的位點特異性重組系統(tǒng)是Cre/lox系統(tǒng)，但并不意味著本發(fā)明僅局限于此，其它位點特異性重組系統(tǒng)也在本發(fā)明保護的范圍之內。


圖1誘導型基因刪除策略。
圖2植物表達載體pNC5的物理圖譜。
圖3植物表達載體p1301的物理圖譜。
圖4無標記基因轉基因煙草轉化過程。
圖5轉基因煙草后代的PCR檢測，(A)GUS(β-葡萄糖苷酸酶基因)，(B)hpt，(C)CIP(乙酰苯胺類除草劑誘導啟動子)，(D)Excision(刪除反應)，其中M1kb DNA Ladder；1負對照；2正對照；3-6化學誘導的轉基因煙草；7-10未誘導的轉基因煙草。
圖6轉基因煙草后代的Southern檢測，(A)GUS，(B)hpt，(C)CIP，(D)Excision，其中1正對照；2負對照；3-9未誘導的轉基因煙草；10-16化學誘導的轉基因煙草。
具體實施例方式
下述實施例是為了更詳細地解釋本發(fā)明，但不應理解為本發(fā)明局限于此。
實驗中所用到的限制性內切酶購自寶生物公司，Taq、dNTPs購自博大公司，所用煙草品種為山西煙，購自中國農業(yè)科學院。
實施例1.乙酰苯胺類除草劑誘導啟動子的克隆從玉米Z31(購自中國農業(yè)大學思農玉米中心)的葉中提取總DNA，以其作為模板進行PCR反應。依據(jù)乙酰苯胺類除草劑誘導啟動子的報道序列(U5,608,143)設計引物P15’-GGCGTTGAGCCTTTTTCTAC-3’(SEQID NO1)，P25’-AGATCTAGATC TTGTTTC CTGCTACTCGTTGG-3’(SEQ ID NO2)(由三博生物公司合成)，反應條件94℃變性1min，56℃退火1min，72℃延伸2min，40個循環(huán)后72℃保溫10min。
反應體系10×Buffer5uldNTPs 4ul引物1 2ul引物2 2ul總DNA 1-10ngTaq(5U/ul)0.5ul滅菌蒸餾水加至總體積為50ul凝膠電泳回收PCR擴增片段1.5kb，插入到克隆載體pGEM-T Easy(購自Promega公司)中，采用CaCl2法轉化E.coli DH5α，在含有X-gal和IPTG(購自上海生物工程公司)的氨芐青霉素選擇培養(yǎng)基上挑選白色菌落，搖菌，提取質粒DNA，經EcoRI酶切于37□2小時，電泳檢測，得到重組質粒，命名為CIP-T。DNA序列分析由上海聯(lián)合基因公司完成。煙草基因組DNA的提取(SDS法)(1)取5g煙草葉片，加入石英砂、液氮，充分研磨后，將粉末倒入50ml離心管中；(2)待離心管中液氮揮發(fā)完全后，加入13ml DNA提取Buffer(50mMTris·HCl(pH7.6)，100mM NaCl，50mM EDTA，0.5％SDS)，充分混勻后(可適當加熱)，室溫下充分抽提10～15min；(3)加入0.5倍體積苯酚，抽提5～10min；再加入0.5倍體積氯仿，繼續(xù)抽提10～15min；(4)3,750rpm，室溫離心20min；(5)吸取上清，加入等體積異丙醇，輕柔晃動離心管，使異丙醇與上清液充分混勻，可見白色絮狀DNA；(6)將DNA沉淀挑入一新的1.5ml離心管中，加入1ml 70％的乙醇，洗滌沉淀；(7)沉淀干燥后加入0.5ml TE(含終濃度50μg/ml的RnaseA)溶解，37℃消化RNA 0.5～1hr；(8)等體積苯酚/氯仿、氯仿各抽提一次；(9)上清加入1/10倍體積3M NaAc(pH5.2)和2～2.5倍體積預冷的無水乙醇，混勻后，于-20℃放置30min，12,500rpm，4℃離心15min，棄上清；(1)70％乙醇洗滌DNA沉淀，干燥后溶于適量TE或水中；(2)取少許DNA，瓊脂糖凝膠上檢查其質量并進行定量，其余DNA樣品保存在-20℃?zhèn)溆谩?br> 實施例2.誘導型位點特異性重組載體的構建用BglII和EcoRI消化Cre基因(GeneBankX03453)，連接到同樣酶切的CIP-T質粒(見實施例1)上，經酶切鑒定得到重組質粒pNC1。CaMV 3′UTR經SalI和EcoRI消化，被連入同樣酶切的pNC1中，經酶切鑒定得到重組質粒pNC2。
根據(jù)GENEBANK序列(GenebankAF234297)設計引物nos1(5’-TACTGAATTAACGCCGAATT-3’)(SEQ ID NO3)和nos2(5’-AGATGCCGACCGGATCTGTC-3’)(SEQ ID NO4)，以p1301載體(物理圖譜如圖3所示)為模板擴增CaMV 3′UTR。反應條件94℃變性1min，60℃退火1min，72℃延伸2min，30個循環(huán)后72℃保溫10min。
反應體系10×Buffer5uldNTPs 4ul引物1 2ul引物2 2ul質粒p1301 DNA 1-10ngTaq(5U/ul)0.5ul滅菌蒸餾水加至總體積為50ul用Xho和EcoRI消化第一個lox位點(GeneBankX03453)(由上海生物工程公司合成)，并連接到同樣酶切的p1301載體上，經酶切鑒定得到重組質粒pM1。用SalI和EcoRI消化pNC2，并連接到同樣酶切的pM1上，經酶切鑒定得到重組質粒pNC3。用SalI和EcoRV消化第二個lox位點(GeneBankX03453)(由上海生物工程公司合成)，并連接到SalI和HindIII酶切的pNC3載體上，經酶切鑒定得到重組質粒pNC4。
根據(jù)GENEBANK序列(GenebankAF234297)設計引物hpt1(5’-ATTGACGCTTAGACAACTTA-3’)(SEQ ID NO5)和hpt2(5’-TATTTGAATCT TTGACTCCA-3’)(SEQ ID NO6)，以p1301載體為模板擴增hpt(潮霉素)基因，反應條件94℃變性1min，47℃退火1min，72℃延伸2min，30個循環(huán)后72℃保溫10min。反應體系如上。
用SalI消化PCR產物后連接到SalI酶切的pNC4載體上，經酶切鑒定得到重組質粒pNC5。保存菌種備用，物理圖譜如圖2所示。
實施例32-氯乙酰苯胺誘導下的潮霉素基因的定時刪除農桿菌感受態(tài)的制備及轉化農桿菌菌株LBA4404購自鼎國生物技術公司，用接種環(huán)取菌液在YEB(含鏈霉素(Sm)100ug/ml)固體培養(yǎng)基上劃線，28℃培養(yǎng)48小時。
1.挑取單菌落于3ml YEB(Sm100ug/ml)中，28℃，振蕩培養(yǎng)過夜。
2.取過夜培養(yǎng)菌液500ul，接種于50ml YEB(Sm100ug/ml)中，28℃，振蕩培養(yǎng)至OD600＝0.5，(大約4-5小時)。
3.5000rpm離心5分鐘。
4.加10ml 0.15M NaCl懸浮農桿菌細胞，5000rpm離心5分鐘。
5.1ml預冷的20mM CaCl2懸浮細胞，冰浴，24小時內使用或分裝成200ul，液氮中速凍1分鐘，-70℃保存。
6.取200ul感受態(tài)細胞，加入1ug pNC5液氮中速凍1分鐘，37℃，5分鐘。
7.加入1ml YEB，28℃慢速(15000轉左右)培養(yǎng)4小時。
8.1000rpm離心30秒，棄4上清，加入0.1ml YEB培養(yǎng)基重新懸浮細胞，涂布于含有100ug/ml卡那霉素和100ug/ml SmYEB平板上，28℃培養(yǎng)48小時。挑取單菌落于3ml YEB(Sm100ug/ml)中，28℃，振蕩培養(yǎng)過夜，菌液備用。
煙草轉化和再生及啟動子的誘導參照Horsch等人的方法(Science，1985，2271229-1231)進行煙草的葉盤法轉化，取MS培養(yǎng)基(PH7.0)稀釋上述菌液15倍。取無菌煙草葉片浸入上述農桿菌稀釋液中，10分鐘后取出并用無菌濾紙吸去多余菌液，將這些葉片放在MS固體培養(yǎng)基中28℃暗培養(yǎng)2天，轉入含200mg/L的潮霉素和500mg/L的羧芐青霉素的MS固體生芽培養(yǎng)基上進行篩選，每10天繼代一次。大約1個月后，在生芽培養(yǎng)基中加入0.2g/L誘導物2-氯乙酰苯胺(由中國農業(yè)大學應用化學學院合成)，15天后將生長至1厘米以上的小芽轉至含200mg/L的潮霉素的MS固體生根培養(yǎng)基中，生根后移栽到溫室中。煙草轉化過程如圖4所示。
再生植株的分子檢測取溫室中煙草葉片用SDS法提取總DNA，以其為模板進行PCR反應，并進行Southern雜交檢測，證實目的基因已整合到植物基因組中，而在誘導后的轉基因煙草中沒有發(fā)現(xiàn)潮霉素基因和重組酶基因。
1.PCR分析用SDS提取煙草葉片總DNA(具體過程如實施例1)，以它為模板，分別以如下幾對引物進行PCR反應。反應體系如實施例1。

PCR結果如圖5所示2.Southern雜交分析2.1.煙草基因組DNA的提取(SDS法)具體過程如實施例1。
2.2 煙草基因組DNA的酶切(1)少量基因組DNA酶切的預實驗基因組DNA1～2μgEcoRI酶(10U/μl) 1μ110×Buffer 3μl總體積 30μl混勻后，于37℃酶切1.5～2hr；酶切反應物在0.8％瓊脂糖上電泳分離，檢查酶切效果；(2)基因組DNA的大量酶切基因組DNA10μgEcoRI酶(10U/μl) 2μl10×Buffer 40μlTotal400μl混勻后于37℃酶切2～3hr；如酶切不完全時可補加適量的限制性內切酶，于37℃繼續(xù)酶切3-8hr；(3)取10μl酶切反應產物進行電泳分離，檢查酶切效果；(4)酶切產物用酚、酚/仿和氯仿各抽提一次；(5)上清加入0.1倍體積的3MNaAc，2倍體積無水乙醇(-20℃預冷)，混勻后，于-20℃放置0.5～1hr；(6)12,500rpm，4℃離心20min，棄上清，沉淀加入500μl 70％的乙醇，12,500rpm離心2min棄上清，抽干后沉淀溶于30μl重蒸水中；
2.3 DNA的酶切產物的電泳及轉膜(1)制備0.8％的瓊脂糖凝膠，電泳分離DNA酶切產物，開始采用低電壓(5V/cm)，待溴酚藍跑出加樣孔2～3cm后，加大電壓(8V/cm)電泳5～6小時；(2)電泳結束后，依次對凝膠進行如下處理0.25M HCl中浸泡膠15min，凝膠中溴酚藍變?yōu)辄S色；變性液中處理凝膠20min；中和液中浸泡膠30min。
(3)將一玻璃皿加滿10×SSC，加上一塊長玻璃，上放數(shù)層吸水濾紙，濾紙要寬于膠塊，兩頭浸于液體中，濾紙與玻璃間和濾紙間不能有氣泡。將凝膠點樣孔朝下置于濾紙上，排盡其間氣泡，膠塊四周加好隔水條。
(4)預先剪好長寬較膠塊大1mm的尼龍膜(購自華美生物工程公司)，在蒸餾水中浸泡透后置于10×SSC中備用。
(5)將尼龍膜鋪于膠上，趕盡其間氣泡。在尼龍膜上鋪一張與膜等大的厚濾紙，趕盡間隙的氣泡，然后疊壓緊后也有8cm高的紙巾平放于濾紙上，其上壓一塊玻璃并加500g重物。如此轉移吸印過夜，期間需更換浸濕的紙巾4-5次。
(6)去掉紙巾，將凝膠和膜一起翻過來置于一塊濾紙上，用鉛筆或圓珠筆標出加樣孔。揭去凝膠，將膜在6×SSC溶液中浸一下，以便洗去凝膠，取出后用吸水紙吸去多余的水分。然后，將膜夾在兩層吸水紙之間，用兩塊玻璃夾緊，在80℃烘1-2h。烘干的膜放于干燥處備用。
2.4 探針標記PCR產物30～50ng，用滅菌雙蒸水補至30μl。沸水中變性5min，冰浴5min。按Promega公司的Prime-a-Gene Labelling System Kit說明，依次加入
5×標記緩沖液 10μldA.T.G(0.5mM each) 2μlBSA(10mg/ml)2μlKlenow大片段(5 1μlunits/μl) 5μlα-32P-dCTP(10μCi/μl)總體積 50.0μl37℃水浴兩個小時以上，標記產物經Sephadex G-50柱層析去除游離同位素，收集含有標記探針的洗脫液，沸水中變性10min，冰浴10min，備用。
2.5 Southern預雜交和雜交(1)配Church緩沖液(含1％BSA，1mM EDTA，0.25M Na2HPO4-NaH2PO4(pH7.2)，7％SDS))，混勻后預熱至65℃；(2)用6×SSC預濕雜交膜，將膜有DNA的一面朝內，卷成筒狀放入雜交管中，加入預雜交液，于65℃預雜交不短于5hr；(3)加入經過加熱變性的探針，65℃雜交12～16hr；(4)雜交結束后，分別用2×SSC+0.5％SDS、1×SSC+0.5％SDS、0.5×SSC+0.5％SDS和0.1×SSC+0.1％SDS在65℃洗膜，每次15min。
(5)洗完后，濾紙吸掉膜表面的水分，保鮮膜包好，放入暗盒，-70℃放射自顯影，自顯影的時間根據(jù)信號強弱而定。
(6)在暗室中取出X光片，顯影液中顯影5～10min，清水中漂洗一下除去顯影液，置于定影液中定影5～10min，取出X光片沖洗干凈，晾干。Southern雜交結果如圖6所示。
SEQUENCE LISTING<110>中國農業(yè)大學<120>誘導型位點特異性重組系統(tǒng)定時刪除特定外源基因的方法<130>I030595<160>14<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>1ggcgttgagc ctttttctac 20<210>2<211>32<212>DNA<213>人工合成<400>2agatctagat cttgtttcct gctactcgtt gg 32<210>3<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>3tactgaatta acgccgaatt 20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>4agatgccgac cggatctgtc 20<210>5
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權利要求
1.一種刪除轉基因植物特定外源基因的方法，其包括(1)將化學誘導啟動子控制下的位點特異性重組系統(tǒng)和待刪除的外源基因引入一種植物表達載體以構建一種重組載體，使得所述化學誘導啟動子控制下的位點特異性重組系統(tǒng)中的重組酶基因和待刪除的外源基因同時位于所述位點特異性重組系統(tǒng)中的重組識別位點之間；(2)將所述重組載體轉化植物；(3)使外源基因表達；(4)在需要刪除外源基因時施入化學誘導啟動子相應的誘導劑，刪除外源基因。
2.權利要求1的方法，其中所述重組載體是pNC5。
3.權利要求1的方法，其中所述化學誘導啟動子是乙酰苯胺類除草劑安全劑誘導啟動子。
4.權利要求1的方法，其中所述重組酶基因是Cre基因，所述重組識別位點是lox位點。
5.權利要求1的方法，其中所述外源基因是潮霉素基因。
6.權利要求1的方法，其中所述植物是煙草。
7.權利要求1的方法，其中所述誘導劑是2-氯乙酰苯胺。
8.一種用于刪除轉基因植物特定外源基因的植物表達載體，其特征在于，其所包含的化學誘導啟動子控制下的位點特異性重組系統(tǒng)中的重組酶基因和待刪除的外源基因同時位于所述位點特異性重組系統(tǒng)中的重組識別位點之間。
9.權利要求8的植物表達載體，其是pNC5。
10.權利要求8的植物表達載體，其中所述化學誘導啟動子是乙酰苯胺類除草劑誘導啟動子。
11.權利要求8的植物表達載體，其中所述重組酶基因是Cre基因，所述特定重組識別位點是lox位點。
12.權利要求8的植物表達載體，其中所述外源基因是潮霉素基因。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用誘導型位點特異性重組技術，在特定時間內通過施入誘導劑，激活重組酶基因轉錄，從而刪除特定外源基因的方法。用該方法獲得了無標記基因的轉基因煙草，對轉基因植株的PCR和Southern分析表明，特定外源基因在施入化學試劑后被有效地刪除了。
文檔編號C12N15/09GK1603408SQ03126400
公開日2005年4月6日 申請日期2003年9月30日 優(yōu)先權日2003年9月30日
發(fā)明者王濤, 袁媛 申請人:中國農業(yè)大學