專利名稱：：具有酶許可量顯像劑的試劑盒、制劑和溶液及其用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及與纖維蛋白原反應時能形成纖維蛋白的蛋白水解酶組合物、纖維蛋白膠試劑盒和纖維蛋白膠制劑，其包含酶許可濃度的顯像劑。
背景技術：
：纖維蛋白膠通常是來自商業(yè)來源或某些地區(qū)輸血中心的血液制品。制備纖維蛋白膠中通常使用的成分有纖維蛋白原、凝血酶、因子VIII、因子XIII、纖連蛋白、玻連蛋白和血管假性血友病因子(VWF)。纖維蛋白膠通過酶反應形成，所述酶反應尤其涉及纖維蛋白原、凝血酶和因子XIII。凝血酶通過酶促作用將纖維蛋白原轉化成纖維蛋白，其速率由凝血酶的濃度決定。因子XIII是通常存在于膠的纖維蛋白原成分，是交聯(lián)和穩(wěn)定纖維蛋白塊的血液凝固系統(tǒng)的酶。該過程繞過了大部分常規(guī)凝固步驟，僅模擬了其最后時期。某些廠商在纖維蛋白膠制劑中添加了抗蛋白水解劑(如W0-A-93/05822中所述)或特別除去纖溶酶原以阻止或延遲纖維蛋白溶解(如US-B-5,792，835和US-B-7，125，569中所述)。已報道了纖維蛋白膠在各種醫(yī)學領域的眾多應用，包括用作封閉劑、止血劑、抗粘連劑以及用于多種腹腔鏡手術中。然而，纖維蛋白膠產生透明膜，其在照明較佳的開放性手術中較為明顯，但在某些腹腔鏡手術中則可能不被注意。因此，使用染色的纖維蛋白膠，使用戶在手術期間能夠評價所用材料的厚度并改善其可見度是有利的。US-B-7,009，034公開了適于包被患者組織的組合物，包括聚合物、保留在交聯(lián)的聚合物中的小分子“交聯(lián)劑”和顯像劑。公開的聚合物可以是合成或天然的。US-B-7，009，034中提到的天然聚合物有膠原、纖維蛋白原、白蛋白，以及纖維蛋白、多糖或葡萄糖胺聚糖。US-B-7，009，034的說明書未涉及因子XIII和/或凝血酶。實施例顯示，向US-B-7，009,034的組合物中添加1.25%高濃度的顯像劑未引起膠凝時間任何不可接受的變化。根據(jù)說明書，可使用比1.25%更高的濃度，直至顯像劑在最終混合物中溶解度的極限。以下專利申請并未公開或提示染料的添加對凝血酶活性的任何不希望的效應。US-A-2003/0077272公開了具有顯像劑的蛋白膠。所公開的是包含纖維蛋白原、凝血酶和保留在交聯(lián)聚合物中的小分子“交聯(lián)劑”的凝膠。幾乎沒有實施例提到使用水凝膠和通過凝血酶形成纖維蛋白粘連的纖維蛋白原和因子XIII組合物的可能制劑。這些實施例公開了向纖維蛋白原溶液中加入的熒光染料濃度為0.0002-0.02%，未說明纖維蛋白原與凝血酶溶液混合后的纖維蛋白膠中的最終濃度。US-A-2005/0049178公開了用于血管阻塞的試劑，其包含生理學安全的染料。該染料使得栓塞的血管染色。優(yōu)選的試劑是液態(tài)纖維蛋白原溶液，其可與液態(tài)凝血酶制劑和因子XIII聯(lián)用。該專利申請沒有公開染料的任何特定濃度。JP-A-2002104996公開了止血組合物，其包含活性成分(如凝血酶)和可避免內科治療中誤用(即局部施用和注射之間的混淆)的著色劑。該染料在組合物中的范圍很寬，為0.0001至1%。W0-A-91/04073公開了光動力學療法，其利用諸如染料的能量吸收材料和諸如纖維蛋白原或纖維蛋白膠的接合劑以完成組織的接合。根據(jù)該發(fā)明，染料是化學活性成分，僅當使用能源諸如激光將足夠的能量傳遞至所述能量吸收材料上時發(fā)生接合。US-A-5,292，362涉及包括至少一種天然或合成肽和至少一種支持物的組合物，所述支持物可被能量激活形成鍵或涂層。在可用作該組合物第一成分的許多肽中提到纖維蛋白原和凝血酶。第二成分通過對第一成分分子間相互關系的改良有助于第一成分。根據(jù)說明書，所述組合物還可包括內源或外源性發(fā)色團。染料在該組合物中的范圍較寬，為基于所述組合物總重量的約0.01%至50%重量。發(fā)明概述纖維蛋白膠日漸用于手術中以減少出血和粘連，封閉或填充表面和/或改善傷口愈合。目前的纖維蛋白膠制劑是無色的，因此將所述制劑應用至滲出(oozing)位置是難以控制的。加入顯像劑改善了纖維蛋白膠的應用靶向質量，例如簡化了應用區(qū)域的定位，使用戶能評價所用材料的厚度并改善其可見度。然而，根據(jù)本發(fā)明已發(fā)現(xiàn)向纖維蛋白膠制劑中加入提高濃度的顯像劑會影響凝血酶的活性。根據(jù)本發(fā)明，發(fā)現(xiàn)不同的顯像劑不同程度地影響凝血酶凝固活性或凝塊形成。本發(fā)明解決了這一問題，因為所述顯像劑以凝血酶或任何其他與纖維蛋白原反應時能形成纖維蛋白的酶活性允許的濃度添加。有利地，根據(jù)本發(fā)明，所述顯像劑以酶許可的足夠低的濃度添加至纖維蛋白膠或其成分中，但其足以清楚地以某種方式染色應用部位，使得可定位該區(qū)域，可評價應用材料的厚度，和/或可區(qū)分應用材料。一方面，本發(fā)明提供了用于施用至患者身體部分的表面的纖維蛋白膠試劑盒，其包括(i)形成纖維蛋白膠需要的至少兩種單獨的成分，所述至少一種單獨的成分包括纖維蛋白原，所述至少第二種單獨的成分包括蛋白水解酶，當其與纖維蛋白原反應時能形成纖維蛋白，以及(ii)酶許可濃度的顯像劑。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述顯像劑在產生的膠中的濃度范圍為約0.0025至約0.1%，或約0.0025至約0.01%。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述蛋白水解酶是凝血酶。該試劑盒還可包括能誘導纖維蛋白交聯(lián)的催化劑。在本發(fā)明的又一個實施方案中，所述纖維蛋白原、能誘導纖維蛋白交聯(lián)的催化劑、顯像劑和/或能形成纖維蛋白的蛋白水解酶均在溶液中。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述催化劑是諸如因子XIII的轉谷氨酰胺酶。在本發(fā)明的又一個實施方案中，將因子XIII并入包含纖維蛋白原的成分中。在本發(fā)明的一個實施方案中，將顯像劑并入包含蛋白水解酶的成分中。在本發(fā)明的又一個實施方案中，所述包含顯像劑的成分被避光保護。本發(fā)明的另一方面涉及用于施用至患者身體部分的表面的纖維蛋白膠制劑，其包含纖維蛋白原、與纖維蛋白原反應時能形成纖維蛋白的蛋白水解酶，以及酶許可濃度的顯像劑。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述蛋白水解酶、纖維蛋白原和/或顯像劑是粉末的形式。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所生成膠中顯像劑的濃度在約0.0025至約0.1%,或約0.0025至約0.01%的范圍內。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述制劑還包括能誘導纖維蛋白交聯(lián)的催化劑。在本發(fā)明的又一個實施方案中，所述蛋白水解酶是凝血酶。本發(fā)明的又一方面提供了用于施用至患者身體部分的表面的溶液，其包括與纖維蛋白原反應時能形成纖維蛋白的蛋白水解酶，以及酶許可濃度的顯像劑。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述顯像劑的濃度在約0.005至約0.2%，或約0.005至約0.02%的范圍內。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述蛋白水解酶是凝血酶。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述溶液被避光保護。該包含蛋白水解酶和顯像劑的溶液可用于用于治療止血、封閉或填充表面和/或治療或預防粘連的纖維蛋白膠試劑盒或制劑中。本發(fā)明的另一方目的提供一種在表面制備纖維蛋白膠的方法，包括提供包含纖維蛋白原的溶液A；提供包含與纖維蛋白原反應時能形成纖維蛋白的蛋白水解酶以及酶許可濃度顯像劑的溶液B；將規(guī)定體積的該溶液施用至所述表面，以引起纖維蛋白凝固。在本發(fā)明的一個實施方案中，所生成膠中顯像劑的濃度在約0.0025至約0.1%，或0.0025至約0.01%的范圍內。溶液A和B可以任何順序施用，例如，A和B可同時或依次施用。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述蛋白水解酶是凝血酶。溶液A還可包含能誘導纖維蛋白交聯(lián)的催化劑。在本發(fā)明的又一個實施方案中，該催化劑是諸如因子XIII的轉谷氨酰胺酶。在本發(fā)明的又一個實施方案中，溶液B被避光保護。所述纖維蛋白膠可在患者的身體部分的表面上制備。另一方面本發(fā)明涉及纖維蛋白膠試劑盒，其包括(i)形成纖維蛋白膠需要的至少兩種單獨的成分，所述至少一種單獨的成分包括纖維蛋白原，所述至少第二種單獨的成分包括蛋白水解酶，當其與纖維蛋白原反應時能形成纖維蛋白，以及(ii)酶許可濃度的顯像劑，其中當所述試劑被避光保護時該濃度最高為約0.1%，或未被避光保護時該濃度最高為約0.01%。該試劑盒還可包括能誘導纖維蛋白交聯(lián)的催化劑。本發(fā)明的另一方面是提供纖維蛋白膠制劑，其包含纖維蛋白原、與纖維蛋白原反應時能形成纖維蛋白的蛋白水解酶，以及酶許可濃度的顯像劑，其中當所述試劑被避光保護時，所生成膠中的該濃度最高為約0.1%，或未被避光保護時該濃度最高為約0.01%。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述蛋白水解酶、纖維蛋白原和顯像劑是粉末的形式。該制劑還可包括能誘導纖維蛋白交聯(lián)的催化劑。在另一方面本發(fā)明涉及溶液，其包含與纖維蛋白原反應時能生成纖維蛋白的蛋白水解酶以及酶許可濃度的顯像劑，其中被避光保護時所述濃度為約0.005至約0.2%，或未被避光保護時為約0.005至約0.02%。本發(fā)明的一個目的是提供一種在所需位置制備纖維蛋白膠的方法，包括提供包含纖維蛋白原的溶液A；提供包含與纖維蛋白原反應時能形成纖維蛋白的蛋白水解酶以及酶許可濃度顯像劑的溶液B，其中當所述試劑被避光保護時，所生成膠中的該濃度最高為約0.1%，或未被避光保護時該濃度最高為約0.01%；以及將規(guī)定體積的該溶液添加至所需位置，以引起纖維蛋白凝固。溶液A還可包含能誘導纖維蛋白交聯(lián)的催化劑。根據(jù)本發(fā)明的纖維蛋白膠試劑盒、制劑或溶液可用于促進血液凝固、預防和/或減少粘連、用于腹腔鏡手術和/或封閉或填充表面。根據(jù)本發(fā)明可獲得的纖維蛋白膠制劑可用于制備預防或治療出血、封閉或填充表面和/或預防或治療粘連的藥物。附圖簡述根據(jù)下列說明、實施例、權利要求和下述附圖可更好地理解本發(fā)明的特征、方面和優(yōu)點。圖.1A-1B顯示了兩個不同批次(A和B)經染色和非染色的凝血酶溶液暴露或未暴露于日光下延長孵育之后的凝血酶活性。所得結果表示為與TO時樣品的活性(100%)相比的凝血酶凝固活性的倍數(shù)下降。IC-靛卡紅。圖.2A-2B顯示了不同時間點染色和未染色纖維蛋白膠的凝塊重量(A)和可凝結的蛋白量(B)。該實驗在體內環(huán)境進行，在從大鼠腹部提取凝塊后第1、3、5、7和12天進行測定。每個點表示三次重復測定的平均值。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及與纖維蛋白原反應時能形成纖維蛋白的蛋白水解酶溶液、纖維蛋白膠試劑盒和纖維蛋白膠制劑，其包含酶許可濃度的顯像劑。本發(fā)明還提供了制備含所述顯像劑的纖維蛋白膠的方法，以及該染色纖維蛋白膠的用途。如用于本文中，術語“纖維蛋白膠”包括纖維蛋白封閉劑、纖維蛋白膜、纖維蛋白網(wǎng)絡、纖維蛋白格子、纖維蛋白網(wǎng)孔、纖維蛋白greed和纖維蛋白凝膠。本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)本發(fā)明證實了染料添加對于凝血酶活性具有不期望的效果。例如，根據(jù)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)向凝血酶溶液中加入提高濃度的顯像劑可影響凝血酶凝固活性，或當將所述溶液施用至纖維蛋白原溶液時影響凝塊形成。還發(fā)現(xiàn)不同的顯像劑對凝血酶凝固活性或凝塊形成的影響不同。此外，發(fā)現(xiàn)將顯像劑暴露于光照下可增加該試劑對凝血酶活性的不期望的效果。因此，本發(fā)明提供了有色的纖維蛋白膠或與纖維蛋白原反應時能形成纖維蛋白的蛋白水解酶溶液，以及在基本不改變凝固活性和/或所形成膠的機械學性質情況下改善所述膠的施用靶向質量的方法。有利地，根據(jù)本發(fā)明，所述顯像劑可以足夠低的被酶許可的濃度加入到纖維蛋白膠或其成分中，該濃度足以通過可定位區(qū)域的方式清楚地染色該施用位置，并且可評估施用材料的厚度和/或區(qū)分所施用的材料。一方面，本發(fā)明涉及纖維蛋白膠試劑盒，其包括形成纖維蛋白膠需要的至少兩種單獨的成分，所述至少一種單獨的成分包括纖維蛋白原，所述至少第二種單獨的成分包括諸如凝血酶的蛋白水解酶，當其與纖維蛋白原反應時能形成纖維蛋白，以及酶許可濃度的顯像劑。在該試劑盒中，所述顯像劑可與包含蛋白水解酶的成分并入一容器中，與包含纖維蛋白原的成分并入另一容器中，或可作為單獨的成分放入第三容器，例如將其溶于適于施用至人或動物軀體的可接受載體。在本發(fā)明的一個實施方案中，將所述顯像劑并入包含蛋白水解酶的成分中。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述膠的每種成分位于單獨的容器例如注射器中，其同時排空，當所述成分混合時，形成纖維蛋白凝塊。本發(fā)明制劑、試劑盒和方法中的纖維蛋白原濃度范圍為約15至約150mg/ml，40至約100mg/ml，或約40至約60mg/ml。顯像劑的非限制性實例有無毒有機染料和/或食品染料。所述顯像劑可以是血液可相容的，即，當應用于出血表面時提供反差的顏色，例如藍色和綠色。優(yōu)選的顯像劑光譜是人眼可見染料相應的廣譜。顯像劑的實例包括但不限于亞甲基藍、結晶紫、核黃素、靛卡紅、專利藍V及其組合。顯像劑可提供黃色、藍色、紫色或橙色。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述顯像劑是亞甲基藍。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述顯像劑是靛卡紅。術語“酶許可”中的詞“酶”是指與纖維蛋白原反應時能形成纖維蛋白的蛋白水解酶。“酶許可濃度的顯像劑”是指所述顯像劑在蛋白水解溶液或纖維蛋白膠中可溶解的濃度，其允許保留了約50至約100%的不存在顯像劑時蛋白水解酶的凝固活性，S卩加入所述顯像劑后剩余的蛋白水解酶凝固活性范圍為最初活性的約50至約100%。在本發(fā)明的一個實施方案中，加入顯像劑后剩余的凝固活性范圍為約90至約100%。凝血酶凝固活性可直接測量，例如，通過改良的歐洲藥典測定(0903/1997)方法測定，和/或間接測定，例如測定斜面上的遷移長度(或滴凝試驗(droptest)模型)，如下文實施例所述，或通過本領域已知的任何其他方法。在本發(fā)明的一個實施方案中，與形成纖維蛋白膠需要的試劑盒或制劑成分混合后，所述顯像劑的酶許可濃度范圍為約0.0005至約0.1%，約0.0005至約0.01%，約0.001至約0.1%，約0.002至約0.1%，約0.0025至約0.1%，約0.0025至約0.01%，約0.005至約0.025%，約0.005至約0.01%，約0.0025至約0.025%，約0.01至約0.025%，或為約0.01至約0.02%的范圍。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述蛋白水解酶是可從蛇毒中獲得的物質。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述蛋白水解酶是凝血酶。凝血酶溶液通常包括凝血酶和氯化鈣。加入顯像劑前的凝血酶起始濃度范圍為約2至約4000IU/ml，或為約800至約1200IU/ml。溶液中氯化鈣的濃度范圍為約2至約6.2mg/ml，或為約5.6至約6.2mg/ml，例如5.88mg/ml的濃度。凝血酶溶液還可包含賦形劑。如用于本文中，術語“賦形劑”是指加入到藥物組合物中的惰性物質，賦形劑的實例包括但不限于人白蛋白、甘露醇、乙酸鈉和注射用水。溶液中人白蛋白的范圍為約2至約8mg/ml，甘露醇的濃度范圍可以是約15至約25mg/ml。乙酸鈉也可以約2至約3mg/ml的濃度范圍添加至溶液中。在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的試劑盒和制劑還包含能誘導纖維蛋白交聯(lián)的催化劑。術語“催化劑”通常是指其存在能增加化學反應速率的物質，其在所涉及的各個化學反應完成后基本不變。催化劑可以是酶，例如轉谷氨酰胺酶。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述催化劑是因子XIII。能誘導纖維蛋白交聯(lián)的催化劑可包括在包含纖維蛋白原的成分、凝血酶成分中和/或可以為單獨的成分。在本發(fā)明的一個實施方案中，因子XIII位于包含纖維蛋白原的成分中。纖維蛋白原、催化劑、蛋白水解酶和/或顯像劑可以溶液或固體的形式(例如凍干粉)提供在本發(fā)明的試劑盒和/或制劑中。所述溶液可以是冷凍狀態(tài)的。試劑盒可包括使用說明。所述溶液可與可藥用的載體一起制備。術語“可藥用的載體”是指適于施用至人或其他動物的載體。術語“載體”指與成分結合以利于所述組合物以基本保留了所需的功效的方式應用的原料。在本發(fā)明的一個實施方案中，一種成分由纖維蛋白原以及諸如精氨酸、賴氨酸或4_(氨基甲基)_環(huán)己酸(氨甲環(huán)酸)及其組合的共穩(wěn)定劑組成。根據(jù)本發(fā)明，所述纖維蛋白膠成分可從原始血液成分制備。所述血液成分可以是全血或血液部分，即全血的產品例如血漿。纖維蛋白原成分、蛋白水解酶和催化劑可以是自體的，包括混合血漿的人的或非人來源。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述纖維蛋白原成分從生物活性成分(BAC)被包含(becomprisedfrom)，所述生物活性成分是來源自血漿的蛋白溶液，可進一步包含氨甲環(huán)酸和精氨酸或賴氨酸或精氨酸和賴氨酸的混合物，或其可藥用鹽。BAC可來源自冷沉淀物，尤其是濃縮的冷沉淀物。術語“冷沉淀物”是指從全血中制備的冷凍血漿中獲得的血液成分。冷沉淀物可在冷凍血漿于低溫下(通常為0-4°C的溫度)融化時獲得，形成經沉淀的上清，其含有纖維蛋白原和因子XIII。沉淀可通過例如離心收集。BAC溶液還包含因子VIII、纖連蛋白、血管假性血友病因子(vWF)、玻連蛋白等，例如如US-B-6，121，232和W0-A-9833533中所述。優(yōu)選的，所述BAC組合物可包含諸如氨甲環(huán)酸和鹽酸精氨酸的穩(wěn)定齊U。通常，BAC中纖維蛋白原的量為約40至約60mg/ml。BAC溶液中氨甲環(huán)酸的量可以是約80至約110mg/ml。鹽酸精氨酸的量可以是約15至約25mg/ml。任選地，將所述溶液緩沖至生理上相容的pH值。緩沖液可由甘氨酸、檸檬酸鈉、氯化鈉、氯化鈣，作為載體的注射用水組成。甘氨酸在組合物中的量為約6至約10mg/ml，檸檬酸鈉的范圍為約1至約5mg/ml，氯化鈉的范圍為約5至約9mg/ml，氯化鈣濃度為約0.1-0.2mg/ml。在另一個實施方案中，使用US-B-7，125，569和W0-A-02095019中所述方法將BAC組合物中的纖溶酶原和纖溶酶濃度降至等于或小于15μg/ml，例如5μg/ml或更低的纖溶酶原。纖維蛋白膠制劑或試劑盒還可包含促進凝塊形成的成分，例如Ca2+、因子VIII、纖連蛋白、玻連蛋白、血管假性血友病因子(vWF)，其可作為單獨的成分提供或與纖維蛋白膠成分一起配制。纖維蛋白膠的蛋白成分可通過重組方法制備。也可以是部分或全部的纖維蛋白膠蛋白成分通過重組方法制備。來源自血液成分的纖維蛋白膠成分通常從感染性顆粒純化。純化過程可通過納米過濾、溶劑/洗滌劑處理、熱處理，例如但不限于巴斯德滅菌法、Y或UVC(<280nm)輻射、或任何其他本領域已知的方法進行。術語“感染性顆?！笔侵钢T如微生物或朊蛋白的顯微顆粒，其可在生物有機體的細胞中感染或繁殖。感染性顆粒可以是病毒顆粒。在純化過程之前或期間可向所述組合物或血液部分中加入分子進行病毒滅活過程。加入的分子及其產物可通過重力、柱層析或本領域已知的任何其他方法除去。感染性顆?？赏ㄟ^納米過濾或選擇性吸附的方法除去，例如親和層析、離子交換或疏水層析?？刹捎枚嗖讲《緶缁钸^程。例如，可用溶劑/洗滌劑處理、熱處理、選擇性層析和納米過濾處理所述組合物。另一方面，本發(fā)明涉及用于施用至表面例如患者身體部分的表面的纖維蛋白膠制齊U，其包括纖維蛋白原、與纖維蛋白原反應時能形成纖維蛋白的蛋白水解酶例如凝血酶，以及酶許可濃度的顯像劑。因此，以在不存在顯像劑時保留了約50至約100%的蛋白水解酶的凝固活性的濃度加入顯像劑。在本發(fā)明的一個實施方案中，保留了約90%至約100%的蛋白水解酶凝固活性。術語“患者身體部分的表面”是指肉眼可見的皮膚外表面和作為機體內部解剖學一部分的內體部分(internalbodypart)的表面。外表面包括但不限于面、喉、頭皮、胸、背、耳、頸、手、肘、臀、膝部皮膚和其他皮膚位置。內體部分的實例包括但不限于體腔或暴露于外部環(huán)境的解剖學開口和內臟器官，例如鼻孔、唇、耳、性區(qū)(包括子宮、陰道和卵巢)、肺、肛門、脾臟、肝以及心肌。所述表面可以是出血或非出血位置。所述纖維蛋白膠制劑還可包含能誘導纖維蛋白交聯(lián)的催化劑。所述催化劑可以是酶，例如轉谷氨酰胺酶。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述催化劑是因子XIII。纖維蛋白原、顯像劑和/或蛋白水解酶可以用可藥用載體制備的單獨溶液或固體的形式(例如凍干粉)提供在制劑中。固體成分不需位于單獨的容器中。溶液可以是冷凍狀態(tài)的。在本發(fā)明的一個實施方案中，纖維蛋白原和蛋白水解酶在溶液中，因此需要為單獨的成分。本發(fā)明制劑和試劑盒中的顯像劑可與纖維蛋白凝塊形成前的成分之一配制和/或為單獨的成分(例如溶解于適于應用至人或動物體的可接受載體中)。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述顯像劑與纖維蛋白原成分一起存在，在另一個實施方案中，所述顯像劑與蛋白水解酶一起存在。例如，所述顯像劑可與蛋白水解酶一起配制，使?jié)舛确秶鸀榧s至少0.001至約0.2%、約0.001至約0.02%、約0.002至約0.2%、約0.004至約0.2%、約0.005至約0.2%、約0.005至約0.02%、約0.005至約0.05%、約0.02至約0.05%、約0.01至約0.05%、約0.01至約0.02%、約0.02至約0.04%。隨后，染色的蛋白水解酶溶液可與等體積的纖維蛋白原成分混合，得到包含50%起始顯像劑濃度的交聯(lián)纖維蛋白膠。在本發(fā)明的一個實施方案中，亞甲基藍染色的蛋白水解酶溶液濃度范圍為約0.01至約0.05%，交聯(lián)纖維蛋白膠中的最終濃度范圍為約0.005至約0.025%。在本發(fā)明的另一個實施方案中，靛卡紅染色的蛋白水解酶溶液濃度范圍為約0.01至約0.02%，例如約0.015%的濃度，交聯(lián)纖維蛋白膠中的最終濃度范圍為約0.005至約0.01%,例如約0.0075%的濃度。在本發(fā)明的另一個實施方案中，靛卡紅染色的蛋白水解酶溶液濃度為0.016%，交聯(lián)纖維蛋白膠中的最終濃度為0.008%。根據(jù)本發(fā)明顯示，使用凝血酶溶液中0.02%濃度的亞甲基藍導致暴露于日光下6小時后凝血酶的凝固活性下降了約50%。然而，當亞甲基藍染色的溶液被避光保護時，未發(fā)現(xiàn)凝血酶活性的任何下降。相反，暴露于日光下6小時后，0.02%靛卡紅染色的凝血酶溶液的凝血酶活性沒有任何影響。而且，靛卡紅染色的凝血酶溶液更長時間的曝光(16小時)未干擾凝血酶的凝固活性。因此，當使用亞甲基藍作為染料時，避光保護是重要的。因此，在本發(fā)明的某些實施方案中，含有顯像劑的成分被避光保護。保護可以通過用鋁箔包裝容器、將包含顯像劑的成分儲存于黑暗容器(recipient)(container)中或通過本領域已知的任何其他方法完成。包含顯像劑的成分還可包含用于避光保護的試劑，例如天然或合成的自由基清除劑，其可在不影響酶反應的情況下基本上防止或減少自由基的形成率。根據(jù)本發(fā)明，顯像劑可以按照將蛋白水解酶的凝固活性保留約50至約100%的濃度有利地添加，當被避光保護時，該濃度最高為約0.1%，或未被避光保護時該濃度最高為約0.01%。根據(jù)本發(fā)明，當Ca2+濃度為40mM時，向凝血酶溶液中以高于0.02%的濃度加入靛卡紅時會形成聚集物。高于0.02%的靛卡紅濃度會引起靛卡紅的聚集，導致與所有IC均溶解的理論值相比顯色下降。不受限于機理，該聚集物的形成似乎與凝血酶活性必需并在凝血酶成分中存在的Ca2+的參與有關。因此，向纖維蛋白膠制劑或試劑盒成分中以允許顯像劑溶解而不形成聚集物的濃度加入顯像劑是有利的。鈣濃度40mM時，凝血酶溶液中的靛卡紅濃度等于或低于0.02%，在纖維蛋白膠中則等于或低于0.01%。更低的鈣濃度可使用更高濃度的靛卡紅。術語“聚集物”是指含有若干種固體的物質塊。在本發(fā)明的一個實施方案中，蛋白水解酶溶液中的顯像劑是靛卡紅，纖維蛋白膠和/或試劑盒或制劑成分混合后的最終濃度范圍是約0.0005至約0.01%，約0.0025至約0.01%，或約0.005至約0.01%，例如0.0075%O本發(fā)明的主題包括用于施用至患者身體部分的表面的溶液，其包含與纖維蛋白原反應時能形成纖維蛋白的蛋白水解酶例如凝血酶，以及酶許可濃度的顯像劑。如上文所述，該顯像劑可以是亞甲基藍、結晶紫、核黃素、靛卡紅、專利藍V及其組I=IO有色的凝血酶溶液可用作纖維蛋白膠的成分，與包含纖維蛋白原的成分同時或依次施用，形成纖維蛋白膠。在外科手術中使用染色的纖維蛋白膠是有利的，例如，當將其用于粘連預防適應癥時，可使得外科醫(yī)生能在施用時、尤其是當進行腹腔鏡檢查時看見FS。染色的纖維蛋白封閉劑可以諸如噴霧或滴注的方式施用，如Wiseman等人所述(“纖維蛋白封閉劑中氨甲環(huán)酸對大鼠粘連形成的效果”JBiomedMaterResBApplBiomater.2004；68:222_230)。本發(fā)明的纖維蛋白膠試劑盒、制劑、溶液或方法可用于微創(chuàng)外科(minimalinvasiveprocedure)(MIS)中?；颊呖山邮芫植柯樽砘蛉砺樽怼＿@些操作可通過小切口或體腔或解剖開口進行?？刹捎脤I(yè)的技術觀察操作區(qū)域，例如帶顯微鏡的袖珍照相機、小光纖手電筒和高分辨監(jiān)視器。與常規(guī)開放型外科手術相比，微創(chuàng)手術住院期較短，可以門診治療，能減少身體創(chuàng)傷、失血、疼痛藥物治療需求和發(fā)病率。微創(chuàng)手術操作包括但不限于，腹腔鏡檢查、血管內檢查、腹腔鏡脾切除術、腹腔鏡檢查的臍疝修復、腹腔鏡檢查的良性卵巢囊腫切除、腰椎和頸椎間盤突出的治療等等。纖維蛋白封閉劑的噴霧腹腔鏡檢查施用包括靶向噴霧施用的最壞情況，一個要克服的障礙是腹腔鏡檢查纖維蛋白封閉劑噴霧施用對腹內壓(IAP)和血流動力學的影口向。在最近的出片反物中，Druckrey-Fiskaaen等人(“Laparoscopicsprayapplicationoffibrinsealanteffectsonhemodynamicsandsprayefficiencyatvariousapplicationpressuresanddistances，，，SurgEndosc.2007；21:1750_1759)報道了若滿足以下條件，纖維蛋白封閉劑(Quixil)可安全地用于腹腔鏡操作中保持較短的噴霧期，允許空氣從腹部逃離。這些條件可最小化IAP的增加。根據(jù)他們的結果，纖維蛋白封閉劑的腹腔鏡檢查噴霧施用開始的吹入壓為IOmmHg,施用壓為2.5bar，施用距離為5cm，套針的閥門開放。該噴霧條件的優(yōu)化開啟了纖維蛋白封閉劑薄層在所有類別腹腔鏡檢查應用中的有效施用之門。然而，其尚未解決將透明凝膠的相對薄層靶向至深色內出血器官的問題。攝像機具有累積的濕度時、照明不足情況下的纖維蛋白封閉劑施用甚為頻繁。這些嚴格的條件要求噴霧能輕易從外圍組織區(qū)分的染色凝膠。根據(jù)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，在腹腔鏡檢查應用中，補充0.005-0.05%(50-500ppm)亞甲基藍的凝血酶具有改善的可見度。當噴霧至深色出血器官例如脾或肝時，包含終濃度0.025%亞甲基藍的纖維蛋白封閉劑在提供清晰靶向的其他因素中是尤其有效的。此外，當產生薄纖維蛋白膠層的短期噴霧時，0.025%的亞甲基藍可完成有把握的靶向作用。在腹腔鏡檢查中，已發(fā)現(xiàn)補充0.01和0.02%靛卡紅溶液的凝血酶可導致比未染色封閉劑更好的可見度。因此，在深色出血或非出血器官諸如脾、肝和子宮中噴霧纖維蛋白膠成分時，含有終濃度0.005和0.01%靛卡紅的纖維蛋白膠可使噴霧化物質顯影。根據(jù)本發(fā)明已發(fā)現(xiàn)，增加顯像劑的濃度可妨礙纖維蛋白膠的凝固(治愈)，因此上述給出的濃度具有在不影響凝膠層穩(wěn)定性的情況下使所噴霧的凝膠可視化的優(yōu)點。保持凝血酶成分中亞甲基藍的濃度在約0.01%至約0.05%、靛卡紅的濃度在約0.01至約0.02%已進行優(yōu)化以達到雙重效果。因此，一方面本發(fā)明提供了纖維蛋白膠的腹腔鏡檢查應用，所述纖維蛋白膠包含一定濃度的染料以供可視化，其是酶許可量的。在本發(fā)明的一個實施方案中，溶液中的亞甲基藍濃度是約50-500ppm或約0.005-0.05%。在本發(fā)明的另一個實施方案中，凝血酶溶液中靛卡紅的濃度范圍是約0.01至約0.02%，例如凝血酶溶液中的靛卡紅濃度是約0.015%或0.016%。本發(fā)明的另一目的是通過提供纖維蛋白封閉劑試劑盒來完成，其包含根據(jù)本發(fā)明形成纖維蛋白膠需要的至少兩種單獨的成分，以及酶許可濃度的顯像劑和施用裝置。具有該施用裝置的纖維蛋白封閉劑試劑盒可用于預防和/或減少粘連和/或促進血液凝固或止血，和/或封閉或填充表面。本發(fā)明的主題還包括在表面制備纖維蛋白膠的方法，其包括制備包含纖維蛋白原的溶液A；制備包含與纖維蛋白原反應時能形成纖維蛋白的蛋白水解酶以及酶許可濃度顯像劑的溶液B;將規(guī)定體積的該溶液添加至所述表面，以引起纖維蛋白凝固。溶液A和B可以任何順序施用，例如，A和B可同時或依次施用。根據(jù)本發(fā)明的方法，纖維蛋白膠可在需要治療受試者的任何表面上制備，或可以在體外制備，并引入所需位置，例如以聚合物(polymerizedcast)的形式。溶液A還可包括能誘導纖維蛋白交聯(lián)的催化劑。在本發(fā)明的一個實施方案中，該催化劑是轉谷氨酰胺酶例如因子XIII。在本發(fā)明的一個實施方案中，混合溶液A和B后顯像劑的濃度范圍為約0.0005至約0.1%、約0.0005至約0.01%、約0.001至約0.1%、約0.002至約0.1%、約0.0025至約0.1%、約0.0025至約0.01%、約0.0025至約0.025%、約0.005至約0.025%、約0.005至約0.01%、約0.01至約0.025%或約0.01至約0.02%。后一種方法可用于預防或治療出血、封閉或填充表面和/或預防或治療粘連，如上文所述。另一方面，根據(jù)本發(fā)明，含有顯像劑的纖維蛋白膠試劑盒、制劑或蛋白水解酶溶液可用作止血劑。術語止血劑是指該試劑能阻止受傷血管的出血和/或有助于將血液保留在血管中。在另一方面，根據(jù)本發(fā)明的含顯像劑的纖維蛋白膠試劑盒、制劑或蛋白水解酶溶液可用作抗粘連劑。粘連形成是不期望的副作用，其中正常分離的身體組織長在一起。該不期望的副作用可在外科手術、感染、創(chuàng)傷或放射后發(fā)生。通常，抗粘連劑是指能在外科手術位置的相鄰組織間形成物理屏障(包被)的試劑，由此預防和/或減少手術后粘連的形成。本發(fā)明的纖維蛋白膠制劑、試劑盒或蛋白水解酶溶液還可包括生物活性分子諸如抗生素、抗炎劑、化學治療劑、生長因子、抗癌藥、鎮(zhèn)痛藥、蛋白、激素、抗氧化劑等。本發(fā)明的纖維蛋白膠試劑盒、制劑或蛋白水解酶溶液有利地用作藥物遞送系統(tǒng)，因為所述顯像劑改善了針對施用位置的靶向性，例如，改善靶向區(qū)域的定位，允許在延長的時期內控制釋放以及遞送在口服遞送時無法完成的需要濃度。術語藥物遞送系統(tǒng)是指并入纖維蛋白膠制劑、試劑盒或蛋白水解酶溶液中的生物活性分子的遞送，其允許在體內特定組織中控制遞送所述分子。本發(fā)明的一個目的通過提供一種預防和/或減少粘連的方法得以完成，其采用包含上述提到的顯像劑的纖維蛋白膠或封閉劑。該顯像劑是必須的以在外科手術過程中、尤其是在潮濕、濕潤和黑暗區(qū)域中改善纖維蛋白膠的可見度。該特征使用戶能評價所應用材料的厚度。根據(jù)本發(fā)明，已發(fā)現(xiàn)在上述濃度范圍內加入染料對凝塊形成的動力學和凝塊的彈性和強度沒有決定性的影響。因此發(fā)現(xiàn)保持這些濃度范圍能夠獲得期望的色度，同時基本上保留凝血酶凝固活性和膠的物理和機械特征。在一個實施方案中，該方法用于在出血或不出血情況下治療或預防外科手術導致的粘連。在另一個實施方案中，該方法用于治療或預防非外科創(chuàng)傷粘連，例如子宮內膜異位、感染、化療、放射和癌癥。本發(fā)明的另一目的通過提供促進血液凝固的方法得以完成，其使用根據(jù)本發(fā)明含顯像劑的纖維蛋白膠。本發(fā)明的方法可促進由外科手術、止血障礙或其他必須止血情況導致的出血凝血，例如在凝血紊亂患者或正接受肝素或抗凝血劑的患者中。技術人員容易理解本發(fā)明說明書中公開的范圍。其表示在范圍界限之間的連續(xù)數(shù)值和數(shù)字的公開，包括界限數(shù)字和數(shù)值。例如，如果某一范圍為0.0025至0.1，其表示至少0.0025,0.003,0.004,0.005,0.006,0.007,0.008,0.009,0.01,0.02,0.03,0.04,0.05，0.06，0.07，0.0075,0.08，0.09，和/或0.1以及所有中間的亞范圍的組合，例如0.0025和0.01，0.0025-0.02,0.0025-0.03,0.0025-0.04，0.0025-0.05，0.0025-0.06，0.0025-0.07，0.0025-0.08，0·0025-0.09，0·0025-0.1或0.01-0.02，0·01-0.03，0·01-0.04，0.01-0.05，0.01-0.06,0.01-0.07,0.01-0.08,0.01-0.09,0.01-0.1等。上文和下文引用的申請，專利和公開文獻的公開內容通過引用并入本文。以下實施例是說明性而非限制性的。實施例實施例1不同染料對凝血酶凝固活性的影響。本研究目的是確定添加至纖維蛋白膠制劑中染料對凝血酶活性的影響。為此目的，使用不同的染料配制類似于US-B-6，121，232和W09833533中描述的雙成分纖維蛋白封閉劑的凝血酶，終濃度為0.01-0.2%。根據(jù)下述改良的歐洲藥典測定方法(0903/1997)通過在不同制劑中測定凝血酶的凝固活性確定染料與凝血酶的相容性。簡而言之，將凝血酶的標準溶液(4、6、8和10IU/ml)或供試樣品在30°C下溫育2分鐘。隨后將每種溶液的40μ1凝血酶溶液與160μ1纖維蛋白原溶液(0.1%；Enzymeresearch；catNoFIBl2800L)混合，測定凝固時間。使用標準物用Log凝固時間對log凝血酶濃度作校準曲線，通過所得的凝固時間確定不同制劑中的凝血酶活性(通過凝固機自動計算，從校準曲線中內插(interpolate)，乘以稀釋倍數(shù))。下表總結了不同制劑中的凝血酶活性(表1)表1不同制劑中的凝血酶活性<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>*結晶紫購自Sigma(catNo229288)。亞甲基藍和結晶紫在濃度0.01-0.2%下測試了其對于凝血酶凝固活性的影響。結果表明亞甲基藍與凝血酶之間比結晶紫更為相容，例如含0.亞甲基藍的凝血酶回收的活性為90%，而含0.結晶紫的制劑為49%。此外，與同樣濃度的結晶紫相比，含0.2%亞甲基藍的制劑同樣顯示高回收活性(分別為89%和22%的回收活性)。實施例2不同染料對凝固動力學的影響。將人凝血酶與不同的染料混合至染料終濃度為0.005-0.2%。使用滴凝試驗模型測定染料對凝固動力學的影響。簡而言之，纖維蛋白凝固動力學測量在用7X105Pa氮壓驅動的裝置的斜面上進行。每次實驗中將5ml生物活性成分(BAC)和5ml凝血酶溶液5倍稀釋液(最終200IU/ml)(在40mMCaCl2中)泵入單獨的注射器中。根據(jù)EP-A-534178中所公開(其中如US-B-6，121，232和W0-A-9833533中所述加入精氨酸和氨甲環(huán)酸)建立后，BAC從濃縮的冷沉淀物中制備。這兩種溶液同時釋放(各自約1/8)，混合滴滴在斜面上，液滴沿斜面下滲，直到形成凝塊。液滴移動距離被記錄在斜面上的毫米紙上。液滴移動距離顯示與凝血酶的濃度成反比。下表2列出了不同制劑纖維蛋白封閉劑的遷移長度。表2不同制劑中纖維蛋白封閉劑的遷移長度<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>*核黃素購自MerckKGaA(catNo500257)。*甲基橙鈉鹽購自J.T.Baker(catNo1145)。*溴百里藍購自BAKERANALYZED。*ND_未測定。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>*甲基紅購自J.Τ.Baker(catNo5926-04)，根據(jù)上述說明稀釋。這些結果證實了上述顯示濃度范圍為0.1-0.2%的亞甲基藍與未染色的制劑相比最大程度地保留了凝血酶的凝固活性的結果。另一方面，在滴凝試驗模型中，濃度范圍為0.01-0.05%的結晶紫強烈干擾凝固活性，但在上述示例的凝血酶凝固活性測定(實施例1)中同樣濃度范圍的結晶紫未引起凝血酶活性的干擾(滴凝試驗模型中2倍的移動距離vs.直接凝血酶活性測定中106和94%的凝血酶活性回收)。在該測試中顯示，0.005-0.01%核黃素、0.005-0.01%甲基橙、151-126稀釋的甲基紅和0.01-0.02%的溴百里藍未顯著干擾凝固動力學。實施例3凍融(F&T)后含顯像劑(染料)的纖維蛋白膠的凝固活性穩(wěn)定性。將人凝血酶與終濃度0.005-0.的亞甲基藍、結晶紫、溴百里藍或核黃素配制。將不同的制劑迅速冷凍至_35°C，隨后融化。使用滴凝試驗模型評價凍融操作對凝血酶凝固活性的影響(遷移時間測試如實施例2所述)。結果總結于表3。表3凍融操作對膠穩(wěn)定性的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>*NA-不可獲得凍融操作后，用亞甲基藍配制的纖維蛋白膠的凝固活性沒有顯著變化。因此，該實驗顯示含亞甲基藍的纖維蛋白膠制劑的凝固活性即使經過凍融也是穩(wěn)定的。實施例4靛卡紅在凝血酶溶液中的穩(wěn)定性。該實施例用于確定靛卡紅在纖維蛋白封閉劑凝血酶組分中的最大溶解度。將凝血酶終容器(Omrix，1，000IU/ml,5ml)與的靛卡紅(溶于純水)混合至最終濃度為0.2、0.21,0.22,0.25或0.3mg/mL·將制備的溶液于室溫下在滾筒上混合30分鐘，目檢確定該染料的溶解度極限。經顯示僅在濃度為0.2mg/ml時獲得完全溶解的樣品。更高濃度的靛卡紅染色的凝血酶溶液(即0.21、0.22、0.25*0.3mg/ml)超過了溶解度極限，導致聚集物形成。似乎該聚集物的形成與凝血酶組分中的Ca2+參與有關。這些數(shù)據(jù)表明靛卡紅在所測試凝血酶溶液(40mMCa2+)中的極限溶解度為約0.02%。同樣發(fā)現(xiàn)，將0.02%靛卡紅染色的凝血酶溶液在2_8°C儲存約30分鐘后出現(xiàn)沉降作用。目檢觀察發(fā)現(xiàn)，室溫下溫育所述冷卻的0.02%靛卡紅染色的凝血酶溶液(2-8°C孵育過夜后)可使微粒樣品再溶解。實施例5:靛卡紅和亞甲基藍對凝血酶活性的影響。在粘連預防適應癥中，可在與BAC混合前向凝血酶組分中加入染料。本試驗用于評價添加至凝血酶溶液中的顯像劑對凝血酶凝固活性的影響。共評價了兩種染料靛卡紅(IC)和亞甲基藍(MB)。為此目的，將凝血酶終容器(Omrix，1，000IU/ml)與MB或IC混合至最終濃度為0.02%。評價了暴露或未暴露于日光下的染料對凝血酶活性的影響。凝血酶凝固活性按照實施例1中測定。通過混合凝血酶標準品與0.的纖維蛋白原溶液制備校準曲線(log凝固時間VS.log凝血酶濃度)。樣品與同種纖維蛋白原溶液混合，根據(jù)校準曲線計算凝血酶活性。使用凝血酶終容器(Omrix)、靛卡紅(AmrescocodecatNo9827_25g)、亞甲基藍(SpectrumcatNoME141_25g_USP)、分光光度計和凝固機器。為制備IC和1%MB溶液，向4ml純水中加入0.04gIC或MB。該實驗中使用3個5ml的凝血酶終容器小瓶1.第一個凝血酶小瓶通過向4.9ml凝血酶中加入0.Iml的IC溶液獲得0.2mg/ml的IC終濃度用IC染色。2.第二個凝血酶小瓶通過向4.9ml凝血酶中加入0.Iml的MB溶液獲得0.2mg/ml的MB終濃度用MB染色。3.第三個凝血酶小瓶未處理。三個5ml小瓶在透明小瓶中分成2.5ml的2個等分試樣；隨后每組一份等分試樣用鋁箔覆蓋。所有樣品在室溫下暴露于日光中孵育。在TO時測量凝血酶活性和色度(610nm處的ICOD值和663nm處的MBOD值)。隨后暴露于日光下6小時。重復實驗2次以產生雙份結果。獲得的結果顯示，在覆蓋的樣品中，無論存在IC或MB凝血酶活性和OD值不受暴露在日光下的影響(表4或5)。孵育期間，IC染色的凝血酶溶液與未染色的凝血酶溶液一樣對日光的暴露對凝血酶活性沒有影響。然而，當凝血酶溶液用MB染色，并且未遮擋暴露于日光孵育時，在孵育6小時后凝血酶活性顯著下降約50%。孵育期間MB和IC的OD值不變，表明在日光暴露期間色度保持不變。表4靛卡紅和亞甲基藍對凝血酶活性的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>L51T60+MB+鋁蕩1091±301070±81*結果為兩次獨立重復的平均值。**由于在測定校準曲線之外，該結果為估算值。最終結果精確地定義為<564IU/ml。表5光暴露對染色凝血酶溶液OD值的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>*結果為兩次獨立重復的平均值。結果清楚地表明，不論暴露于日光中長達6小時，在凝血酶溶液中使用最終濃度0.02%的靛卡紅不影響凝血酶的活性。反之，當使用同樣濃度的亞甲基藍作為染料時，等量的日光暴露后觀察到凝血酶活性的顯著下降。然而，當亞甲基藍染色的溶液被光保護時(用鋁箔覆蓋)，在整個研究過程中未發(fā)現(xiàn)凝血酶活性的下降。因此，結果表明當使用靛卡紅作為凝血酶的染料時不需要避光保護凝血酶，而在使用亞甲基藍時避光保護是重要的。實施例6延長的孵育期后靛卡紅對凝血酶活性的影響。上述實施例顯示，即使暴露在日光下6小時，向凝血酶成分中加入終濃度0.02%的靛卡紅對凝血酶的凝固活性沒有影響。本實施例目的是確定靛卡紅染色的凝血酶溶液延長孵育期對凝血酶凝固活性的影響。日光暴露和未暴露樣品均進行了檢測。為此目的，將0.4%靛卡紅溶液(溶于純水中)與5ml凝血酶溶液混合(126)，最終濃度為0.15mg/ml。將混合溶液在透明或琥珀色小瓶中于室溫下孵育27小時(16小時日光)。在以下時間點從小瓶中取樣(40μ1)試驗開始后0、4、22和27小時，根據(jù)前面描述的方法測定凝血酶活性(實施例1)。測量重復進行兩次。表6總結了暴露或未暴露于日光下時靛卡紅染色的凝血酶溶液延長孵育期對凝血酶活性的影響。得到的結果同樣表示為與TO時樣品活性相比(100%；圖.IA和B為兩個不同批次的凝血酶)凝血酶凝固活性的倍數(shù)下降。。IC-靛卡紅。表6日光暴露和未暴露樣品經延長的孵育期后靛卡紅對凝血酶活性的影響。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>結果顯示，即使暴露在日光下16小時，向凝血酶溶液中加入終濃度0.015%的靛卡紅不干擾凝血酶的凝固活性(透明小瓶中靛卡紅染色的凝血酶溶液和未染色的凝血酶溶液相對于81和78%的回收活性分別為85和84%)。這些結果驗證了當使用靛卡紅作為凝血酶溶液染料時不需要光保護。實施例7靛卡紅溶液的凍融對凝血酶活性的影響。評價了添加經1或5個循環(huán)的凍融的靛卡紅溶液后的凝血酶溶液的凝固活性穩(wěn)定性。將融化的靛卡紅溶液(0.4%溶于純水中)在5ml凝血酶成分(Omrix)中126稀釋，得到終濃度為0.15mg/ml的靛卡紅染色的凝血酶溶液。使用未染色的凝血酶溶液作為對照。如上文所述測定凝血酶凝固活性(實施例1)。每次測量重復進行兩次。表7靛卡紅溶液的凍融對凝血酶凝固活性的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>經1(*)或5個循環(huán)(**)凍融的靛卡紅溶液。結果顯示，無論在向凝血酶成分中加入之前進行靛卡紅溶液的多次凍融循環(huán)，所有的試驗組中基本保留了凝血酶活性。實施例8加入到BAC成分中時靛卡紅對凝固時間的影響。顯像劑可在與凝血酶成分混合前加入BAC中。因此該實施例說明了靛卡紅當加入BAC時對凝固時間的影響。將0.4%靛卡紅溶液(溶于純水中)126稀釋至5mlBAC成分中，終濃度為0.15mg/ml。使用未染色BAC作為對照。按照改良的歐洲藥典測定(0903/1997)(其基于Clauss方法)評定凝固時間。簡而言之，通過將纖維蛋白原溶液[EnzymeResearch；catNoFIB12800L溶于Owren-Koller緩沖液(DiagnosticaStago；catNo00360)]稀釋至終濃度38.46、25、12.5和8.3mg/100ml制備校準曲線。稀釋在含牛血清白蛋白的Owren-Koller緩沖液的稀釋緩沖液中進行。隨后，將約0.03g染色或未染色的BAC樣品在稀釋緩沖液中1300稀釋，獲得最終纖維蛋白原濃度為約0.2mg/ml?；旌?00μ1上述稀釋的BAC樣品與100μ1Fibri-PrestAutomate2(DiagnosticaStago；catNo00316)以凝固。在室溫下使用凝固機(ST2或ST4DiagnosticaStago)孵育1和3小時后測量凝固時間?；讷@得的凝固時間，從校準曲線中內插樣品的纖維蛋白原濃度，結果含有凝固時間和計算的纖維蛋白原濃度。下表8列出了不同樣品的凝固時間。表8加入到BAC成分中時靛卡紅溶液對凝固時間的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>*每個樣品分兩份重復測試，每份測試2次。給出的數(shù)據(jù)是每個樣品在每個時間點所有4次測量結果的平均值。根據(jù)獲得的結果，很明顯靛卡紅在所有的時間點(即0、1和3小時)均不改變凝固時間。這些結果顯示靛卡紅可加入到BAC成分中，而不改變凝固活性和產生凝塊需要的時間。實施例9加入靛卡紅對所形成凝塊機械學性質的影響。下述實施例的目的是確定向纖維蛋白膠制劑中加入靛卡紅是否影響所產生凝塊的彈性模量。纖維蛋白凝塊的機械學性質通過使用LFPlus模型(Lloydinstrument)儀器的伸長試驗測試。該儀器是用于測試各種產品和材料回彈、屈服點和斷裂強度的電機驅動的張力和壓縮測試儀。兩個圓錐型的模具疊放在一起，預涂有凡士林溶液(己烷中的10%溶液)以防止與模具粘連。所述模具按如下填充纖維蛋白膠將染色的(終濃度為0.15mg/ml靛卡紅，按上文獲得)或未染色的凝血酶標準溶液(0mrix，lnhouseSTD139IU/ml)在40mMCaCl2中稀釋獲得8IU/ml的凝血酶活性。使用雙注射器組件向模具中加入BAC(Omrix)和等體積的稀釋的凝血酶樣品，總體積為0.7ml。制備的凝塊在37°C溫育30分鐘，使膠完全聚合。隨后將模具安裝在LFPlus儀上，機械分罔。將使用的力(y)對上模具在凝塊斷裂點前移動的距離(X)作圖，測定凝塊的強度。收集數(shù)據(jù)，用支持LFPlus儀的NexyGenPlus軟件(AmetekCompany)處理，使用經處理的數(shù)據(jù)產生應力_應變曲線，計算楊氏模量(亦稱彈性模量)，其以應力_應變曲線的斜率表示。結果用kPa表示。表9總結了這些研究的結果表9靛卡紅溶液對凝塊彈性的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>凝塊的彈性測定顯示，在產生的凝塊中添加終濃度為0.0075%的靛卡紅對凝塊的剛性沒有任何影響。這些結果顯示向纖維蛋白膠制劑中加入靛卡紅不改變凝塊的彈性模量，因此可產生具有優(yōu)良機械學性質的纖維蛋白膠。實施例10加入靛卡紅對所形成凝塊凝固動力學和剛性的影響下述實施例用于評價靛卡紅對凝塊形成和剛性的影響。其使用凝血彈性描記器(TEG)進行，該儀器用于評價血液和血液制品的凝固參數(shù)。以下參數(shù)使用止血分析儀(TEG-5000，Haemoscope公司)評價R_時間、K-時間、角度(α)、最大振幅(MA)、G和Ε。反應時間(R)-從將樣品安置在分析儀中至初期纖維蛋白凝塊形成所需要的時間。時間(K)-獲得某種水平的凝塊強度所測量的時間。該時間從R測量至發(fā)展出固定水平的凝塊硬度。K代表凝塊形成的動力學。角度(α，等級)_測量纖維蛋白建立和交聯(lián)的速度。該測定值反應了凝固動力學。最大振幅(MA)-代表所形成纖維蛋白凝塊的最大強度或剛性。G(剪切彈性模量強度)是凝塊強度的測量值。E是標準化的G參數(shù)，指彈性常數(shù)。測定方法如下將BAC(Omrix)19稀釋在Owren-Koller緩沖液中(DiagnosticaStagocatNo00360)，凝血酶(OmrixIn-House標準，139IU/ml)稀釋在40mMCaCl2溶液中獲得10IU/ml的凝血酶活性。向每一稀釋的纖維蛋白膠成分中加入0.4%的靛卡紅溶液(用純水制備)使終濃度為0.075mg/ml。將稀釋的BAC溶液(340μ1)與稀釋的凝血酶溶液(20μ1)在一個指定的測試杯中混合。隨后將該杯置于TEG分析儀中，收集產生的凝塊參數(shù)。獲得的凝塊參數(shù)如下(表10)。每一測試均重復進行兩次。表10使用凝血彈性描記法評價IC對凝固動力學和凝塊剛性的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>向纖維蛋白膠制劑中加入所產生凝塊中最終濃度為0.0075%的靛卡紅時，所測量的血栓彈性描記參數(shù)未顯著改變。這些結果提供了證據(jù)表明向纖維蛋白膠組合物中加入顯像劑時，所產生凝塊的凝固動力學、凝塊剛性和最大強度未損害。實施例11靛卡紅對凝塊壽命的影響。下述實施例的目的是測試向纖維蛋白膠中加入顯像劑對凝塊體內壽命的影響。選擇作為染色物質的染料是靛卡紅。未染色的纖維蛋白凝塊作為參照。凝塊壽命在300_400g的超過9月齡斯普拉-道來氏(Sprague-Dawley)大鼠中測定。每個實驗組包括15只動物。使用隨機分層方法在馴化期進行治療組分配。手術前后將動物飼養(yǎng)在空調房的動物房中，溫度范圍為22士4°C，相對濕度為30-70%，進行人工照明循環(huán)(12小時人工照明12小時黑暗)。動物置于籠中(每個聚碳酸酯籠1或2只動物，42X26X18cm)，自由攝取食物和無菌自來水。每天檢查動物，在研究開始和結束時稱重。手術前通過40-80mg/kgIM注射85/15氯胺酮HCl100mg/ml和甲苯噻嗪HCl20mg/ml的混合物麻醉動物。使用腹壁缺損模型，如Wiseman等人所述(“纖維蛋白封閉劑中氨甲環(huán)酸對大鼠粘連形成的影響”，JBiomedMaterResBApplBiomater.2004；68222~230)簡而言之，將大鼠剃毛，在腹部中線皮膚上標記6cm的切口。在肌壁暴露情況下，沿直線制造穿過腹膜腔的5cm肌肉中的切口。右側腹壁進行對稱操作(reflected)，除去2cmXIcm的腹膜，該缺損的中間邊緣位于中線切口側面1cm，與之平行。腹壁缺損暴露于空氣中10分鐘，監(jiān)測任何出血。傷口用包括BAC(0.5ml，如實施例2中)和凝血酶(0.5ml，如實施例4中)的纖維蛋白膠制劑噴霧(總共Iml膠)。測試樣品組的凝血酶成分補充有濃度為0.16mg/ml(0.016%)的靛卡紅。所得的纖維蛋白凝塊含有的靛卡紅濃度為0.08mg/ml(0.008%)0中線切口和皮膚用運轉的2-ODexon雙色縫線縫合。在試驗開始后1、3、5、7和12天后處死兩組動物，每個時間點每組處死3只。在每個預定的時間間隔末期，每只大鼠以200mg/ml腹膜內注射0.7mlPental進行安樂死。制造V形切口暴露腹壁。從大鼠腹部取出剩余的凝塊，萃取，稱重，溶于凝塊溶解液，如下所述測定蛋白。每一凝塊用鹽水洗滌，置于含凝塊溶解液的試管中(0.5_5ml，依賴于凝塊的大小；含7M尿素和0.2MNaOH的以12混合的PBS-氯化鈉0.9%緩沖液)。將試管于室溫下站立，直到目檢凝塊完全溶解。根據(jù)下列方法定量測定每一樣品經凝塊溶解后剩余凝塊的蛋白濃度。將0.Iml溶解的凝塊溶液用PuW稀釋(110)，280nm讀數(shù)。測量在Iml透明容器中進行。降低320nm處的光散射并從已知的內標內插后測定凝塊蛋白。用于溶解剩余凝塊的凝塊溶解液的實際體積也用于蛋白量的計算。表11和表12分別列出了染色和未染色的纖維蛋白膠制劑的凝塊重量和可凝結蛋白的量。各時間點的平均凝塊重量和平均可凝結蛋白量分別在圖2A和B中給出。表11不同時間點的靛卡紅染色的纖維蛋白膠凝塊重量和可凝結蛋白量<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>表12不同時間點的未染色的纖維蛋白膠凝塊重量和可凝結蛋白量<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>結果表明從第3天開始兩個試驗組中(即染色和未染色的纖維蛋白膠)凝塊重量隨時間而下降(圖2Α)。兩組中從第5天開始可凝結蛋白量下降明顯(圖2Β)。關于凝塊重量和可凝結蛋白量組間無明顯差異。這些結果說明在產生的膠中添加終濃度為0.008%的靛卡紅未改變體內環(huán)境的凝塊的壽命以及纖維蛋白溶解速率。此外應當注意的是，第一天后分光光度計或目檢均未發(fā)現(xiàn)凝塊內有明顯染料。實施例12腹膜內腔中含有不同濃度亞甲基藍和靛卡紅的纖維蛋白膠的腹腔鏡檢查可見度。這些試驗的目的是研究不同濃度的試驗顯像劑對腹腔鏡檢查中非出血或出血器官噴霧時纖維蛋白膠(如US-B-6，121，232和恥4-9833533中所述)可見度的影響。試驗產品的可見度使用誘導或不誘導器官表面滲出的豬腹膜間腹腔鏡檢查模型測定，測試了兩種著色物質的可見度亞甲基藍和靛卡紅。根據(jù)當前的倫理要求，體重約50kg，年齡2歲的成年雌性馴養(yǎng)雜種豬(η=1)飼養(yǎng)于授權的實驗室中。將三個腹腔鏡檢查口置入豬的腹部，纖維蛋白膠制劑通過噴霧施用于靶位置。對于每個試驗材料濃度和對照(未染色)試驗，重復試驗操作方法。纖維蛋白膠小瓶在使用前不久融化，將染料加入到凝血酶小瓶中。每個濃度使用新應用的裝置。器官上每個所選施用位置與之前的應用位置距離足夠遠以區(qū)分不同的施用。在施用纖維蛋白膠前后記錄操作和施用位置。根據(jù)不同的角度和<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>不同的放大設定記錄纖維蛋白膠的施用。出血位置的外科施用選擇的器官表面滲出通過用隨腹腔鏡夾插入腹部的沙紙摩擦器官表面進行誘導。補充亞甲基藍的纖維蛋白膠的施用將未染色或補充三種不同的亞甲基藍濃度的纖維蛋白膠施用至出血的脾表面。該纖維蛋白膠包括1)實施例2中的BAC(5ml)。2)凝血酶(1000IU/ml；5ml)。凝血酶補充有下列濃度的亞甲基藍:50、100或500ppm(濃度分別為0.005,0.01和0.05%)。實驗室主任指定了三名評價人員進行關于含不同濃度的亞甲基藍纖維蛋白膠的可見度的獨立評價。評價人員考慮下列參數(shù)1)脾表面和所施用材料間的色對比。2)血液和所施用材料之間的色對比。評價人員獨立地認為膠的凝血酶小瓶中500ppm濃度的亞甲基藍是能提供纖維蛋白膠最高可見度的濃度。所有測試的MB濃度與未染色的纖維蛋白膠相比顯示更高的可見度。補充靛卡紅的纖維蛋白膠的施用應用兩種靛卡紅濃度，與未染色產品進行比較。在兩個深色器官(脾和肝)出血和非出血位置上進行可見度測試。此外，僅在淺色器官(子宮)上的一個出血位置進行了僅使用染料的染色纖維蛋白膠的測試(由于器官大小的限制)。該纖維蛋白膠包括BAC和凝血酶，如前所述。凝血酶成分補充有下列濃度的靛卡紅0.2mg/ml和0.lmg/ml(分別為0.02%和0.01%)。每次施用噴霧每種成分各1ml。7名評價人員對不同的施用進行了評價，在每種情況下對噴霧產品的可見度進行評分?？梢姸然谒┯梦镔|和器官表面或血池間的對比進行分級(可見度分為1至10級，1代表低可見度，10代表高可見度)。所有評價人員同意含靛卡紅的纖維蛋白膠要優(yōu)于未染色的纖維蛋白膠。結果表明即使在輕度出血的深色器官上噴霧時，0.01和0.02%靛卡紅染色的凝血酶溶液均使噴霧材料清晰地顯像。當?shù)蹇t施用至出血脾表面時，相對大量的血液稀釋了產品，為獲得清晰的靶向，含有0.02%靛卡紅的纖維蛋白膠要更好。應當注意的是，附加的結果顯示增加顯像劑(例如亞甲基藍和靛卡紅)的濃度會妨礙纖維蛋白膠的凝固過程。因此，上述給出的濃度是噴霧凝膠可見度和凝膠層穩(wěn)定性之間的折衷。保持這些濃度已優(yōu)化以達到雙重效果。實施例13染色纖維蛋白膠制劑vs.未染色制劑在減少手術后粘連中的效率。本發(fā)明的纖維蛋白膠制劑可用作抗粘連劑。以下實施例說明了染色的纖維蛋白膠制劑在減少手術后粘連中的效率。(Indigotindisulfonatesodium,Amresco,Solon,Ohio)i^^j^iM溶液提供在琥珀色小瓶中。在就要使用前從小瓶中抽取0.1ml，與凝血酶溶液(5ml)混合5分鐘獲得終濃度為0.02%的染料(染料在纖維蛋白膠中最終濃度為0.01%)。使用未染色的纖維蛋白膠制劑作為參照物。在出血的情況下，用兔子宮角磨損模型(rabbituterinehornabrasionmodel)進行評價。使用雌性新西蘭白兔(Oryctolaguscuniculus)，重量在2.7-3.3kg之間。研究開始前使動物最低適應5天，每天由有經驗的動物馴養(yǎng)人員監(jiān)控。動物單獨地飼養(yǎng)于不銹鋼籠中，室內環(huán)境維持在約20°C，相對濕度30-70%，12小時/12小時的光照/黑暗循環(huán)。研究期間，兔進食HarlanTeklad15%RabbitDiet#8630(HarlanTeklad,Indianapolis,IN)#<:。白勺自HfflilEdstromAutomaticWateringf/NO該研究根據(jù)實驗室動物的看護與使用指南(NationalAcademyPress,1996)中描述的NIH指導原則進行。準備和恢復外科手術當天稱重動物。吸入異氟烷誘導麻醉并維持(分別為5%和3.5%濃度)。用電動動物剪刀對手術位置脫毛，對該區(qū)域抽真空以除去毛發(fā)剪取物和碎屑，隨后用乙醇沖洗。整個區(qū)域用3%的對氯間二甲酚擦洗，保留5分鐘，用70%的異丙醇除去，重復。再次用70%的異丙醇清洗手術位置，在該準備區(qū)域應用無菌切割布。靜脈注射3劑丁丙諾啡叔丁啡(Buprenex)(0.03mg/kg,0.3mg/mlx0.3ml)，一次在手術上午，一次在6-8小時后，一次在第二天上午。動物可在保溫箱中完全復原后返回其籠子。此后，隨意進食和飲水，每天觀察。每天檢查切割線的開裂和出血征兆。兔子宮角磨損模型兔子宮角模型基本按Wiseman等人所述建立(“凝血酶誘導的止血對可吸收粘連屏障效率的效果”.JReprodMed.1992;37:766-770)。簡而言之，在麻醉和為無菌手術準備后，制備通過皮膚和腹壁的中線切口。定位并外置兩個子宮角，使用法國導管刻度，測量并記錄每個子宮角的直徑。僅那些子宮角測量尺寸為10-16法國刻度以內的兔子進入該方案。使用10號手術刀片，從離子宮分叉約Icm處沿整個角長刮擦5cm長度的子宮角。每側40次，直到點狀出血。從子宮切取約5mm子宮中部連拱內的4根小血管產生出血以評價“出血”差異。磨損操作完成后，組分配透露給外科醫(yī)生。13只動物接受不含染料的纖維蛋白膠，11只接受補充靛卡紅的纖維蛋白膠，5只動物作為對照(進行外科手術，但不施用試驗材料)。通過抽簽(lottery)隨機分配實驗組。將試驗材料應用至子宮角。試驗材料的應用將4.5ml至IOml總體積染色的(0.02%染料在凝血酶溶液中，如前所述)或未染色的纖維蛋白膠應用至隨機接受治療的每只動物。治愈后(約120秒)翻轉角以應用至另一側。隨后解剖學地放回器官，縫合切口。使用連續(xù)的Vicryl4-0縫線縫合腹部切口。筋膜用4-0Vicryl寬松地縫合，皮膚用未染色的4-0Vicryl(快口縫合針)采用表皮下縫合法縫合。評價手術后13或14天，動物通過靜脈注射戊巴比妥鈉(120mg/ml；lml/kg)安樂死。記錄動物的體重，打開腹部，由盲觀察者檢查手術位置。評價了以下參數(shù)粘連程度_總的粘連角長度％，以子宮長度的％表示。粘連的粘性(嚴重性)-粘連分成0級(無)、1.0級(薄粘連)和2.0級(粘的，需要銳器切開)。子宮卷旋程度_測量由于粘連造成的解剖學扭曲。子宮卷旋程度記錄為無卷旋-粘附或非粘附的角直線長度，其可清楚地辨別。部分卷旋的_角帶有粘連，50-75%的角長度是纏亂的，不能辨別直線部分。完全卷旋的_由于角完全纏亂，不能辨別子宮解剖學。組織學和照相操作手術操作和解剖大部分動物時拍照。子宮和卵巢保留在10%的中性緩沖的福爾馬林中。如果有可能影響結果的非正常事件體征，則將動物排除在主要分析以外。這樣的體征通常包括腹腔內感染。在不知道分組或粘連存在或程度情況下，任何排除動物的決定在檢查手術位置和評價粘連之前作出。統(tǒng)計分析計算兩個角的平均％粘連程度。該平均值被用于計算該組粘連的平均程度(+SEM)，以一位小數(shù)表示。通過設置95%單向置信上限確定差值(染色的減去未染色的)，假定正態(tài)性(即基于student'st檢驗)比較染色和非染色纖維蛋白膠組粘連程度。根據(jù)該方案，若該置信限低于20%，宣布纖維蛋白膠加靛卡紅非劣于未染色的纖維蛋白膠。采用student’st檢驗與對照組比較以證明測試的靈敏度。粘連的發(fā)生率采用Fisher’s確切檢驗比較，使用x2檢驗比較粘性和子宮卷旋程度。對于所有的檢驗，統(tǒng)計學顯著的水平設定為P<0.05。結果兩種制劑均易于操作和應用。任一制劑在治療腹壁切口方面均無明顯效果。所有動物均從外科手術中平靜地恢復，在研究期間體重增加。下表13給出了體重的變化情況。表13體重變化<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>很明顯，研究組間的體重變化無差異。染色和未染色的纖維蛋白膠制劑對粘連形成的影響結果總結于下表14表14染色和未染色的纖維蛋白膠制劑對粘連形成的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>1.有粘連的子宮角長度％，為左側和右側角的平均值(SEM)2.針對對照的student，st檢驗ρ值3.無粘連的子宮角％(無粘連的子宮角數(shù)目/總數(shù))4.無粘連的角數(shù)目/1級粘連/2級粘連5.無卷旋的角數(shù)目/部分卷旋/完全卷旋6.殘余物小/中/大7.動物數(shù)目#p^0.01,χ2檢驗，vs對照；##ρ<0.05，X2檢驗，vs對照；§p<0.088,Fisher's確切檢驗VS對照；§§p<0.114，F(xiàn)isher’s確切檢驗，vs對照對照動物中形成了廣泛的粘連(42.5士10%)。與對照組相比，未染色和染色的纖維蛋白膠制劑組均觀察到粘連形成程度％的統(tǒng)計學顯著下降(9.3士3.1%，ρ=0.027和8.4士1.4%,ρ=0.027)。與對照相比，未染色和染色的纖維蛋白膠制劑均統(tǒng)計學顯著地降低了粘連的粘性和子宮卷旋程度。兩種制劑使粘連自由度從對照的10%增加到38%(未染色)和36%(染色)，但這些差異是非統(tǒng)計學顯著性的。兩種纖維蛋白膠組(染色和未染色的)粘連程度的比較顯示置信上限是5.44，表明兩個實驗組在減少手術后粘連方面同樣有效。這些結果顯示兩種纖維蛋白膠制劑(染色和未染色的)在減少手術后粘連方面同樣有效。在制劑中加入染料未導致效率、操作性、不良事件或降解性質的顯著變化。權利要求一種用于施用至患者身體部分的表面的纖維蛋白膠試劑盒，其包括(i)形成纖維蛋白膠需要的至少兩種單獨的成分，所述至少一種單獨的成分包括纖維蛋白原，所述至少第二種單獨的成分包括當與纖維蛋白原反應時能形成纖維蛋白的蛋白水解酶，以及(ii)酶許可濃度的顯像劑。2.根據(jù)權利要求1的試劑盒，其中所產生的膠中所述顯像劑的濃度范圍為約0.0025至約0.1%，或約0.0025至約0.01%o3.根據(jù)權利要求1或2的試劑盒，其中所述蛋白水解酶是凝血酶。4.根據(jù)權利要求1至3的任一項的試劑盒，其進一步包含能夠誘導纖維蛋白交聯(lián)的催化劑。5.根據(jù)權利要求4的試劑盒，其中所述纖維蛋白原，所述能夠誘導纖維蛋白交聯(lián)的催化劑，所述顯像劑和/或所述能夠形成纖維蛋白的蛋白水解酶在溶液中。6.根據(jù)權利要求4或5的試劑盒，其中所述催化劑是轉谷氨酰胺酶。7.根據(jù)權利要求6的試劑盒，其中所述轉谷氨酰胺酶是因子XIII。8.根據(jù)權利要求7的試劑盒，其中因子XIII并入包含所述纖維蛋白原的成分中。9.根據(jù)權利要求1至8的任一項的試劑盒，其中所述顯像劑選自亞甲基藍，靛卡紅及其組合。10.根據(jù)權利要求1至9的任一項的試劑盒，其中所述顯像劑并入包含所述蛋白水解酶的成分中。11.根據(jù)權利要求9或10的試劑盒，其中所述顯像劑是亞甲基藍。12.根據(jù)權利要求1至11的任一項的試劑盒，其中包含所述顯像劑的成分被避光保護。13.根據(jù)權利要求9或10的試劑盒，其中所述顯像劑是靛卡紅。14.根據(jù)權利要求1至13的任一項的試劑盒，其用于止血和/或封閉或填充表面。15.根據(jù)權利要求1至13的任一項的試劑盒，其用作抗粘連劑。16.用于施用至患者身體部分的表面的纖維蛋白膠制劑，其包含纖維蛋白原，當與纖維蛋白原反應時能夠形成纖維蛋白的蛋白水解酶，以及酶許可濃度的顯像劑。17.根據(jù)權利要求16的制劑，其中所述蛋白水解酶，所述纖維蛋白原和/或所述顯像劑是粉末形式的。18.根據(jù)權利要求16或17的制劑，其中在所產生的膠中所述顯像劑的濃度范圍為約0.0025至約0.1%,或約0.0025至約0.01%。19.根據(jù)權利要求16至18的任一項的制劑，其進一步包含能夠誘導纖維蛋白交聯(lián)的催化劑。20.根據(jù)權利要求16至19的任一項的制劑，其中所述蛋白水解酶是凝血酶。21.用于施用至患者身體部分的表面的溶液，其包含當與纖維蛋白原反應時能夠形成纖維蛋白的蛋白水解酶，和酶許可濃度的顯像劑。22.根據(jù)權利要求21的溶液，其中所述顯像劑的濃度范圍為約0.005至約0.2%，或約0.005至約0.02%。23.根據(jù)權利要求21或22的溶液，其中所述顯像劑選自亞甲基藍，靛卡紅及其組合。24.根據(jù)權利要求21至23的任一項的溶液，其中所述蛋白水解酶是凝血酶。25.根據(jù)權利要求23或24的溶液，其中所述顯像劑是亞甲基藍。26.根據(jù)權利要求21至25的任一項的溶液，其中所述溶液被避光保護。27.根據(jù)權利要求23或24的溶液，其中所述顯像劑是靛卡紅。28.在表面制備纖維蛋白膠的方法，其包含提供包含纖維蛋白原的溶液A；提供包含當與纖維蛋白原反應時能夠形成纖維蛋白的蛋白水解酶以及酶許可濃度的顯像劑的溶液B；將規(guī)定體積的所述溶液施用至所述表面以引起纖維蛋白的凝結。29.根據(jù)權利要求28的方法，其中在所產生的膠中所述顯像劑的濃度范圍為約0.0025至約0.1%，或約0.0025至約0.01%。30.根據(jù)權利要求28或29的方法，其中溶液A和B同時施用至所述表面。31.根據(jù)權利要求28至30的任一項的方法，其中所述蛋白水解酶是凝血酶。32.根據(jù)權利要求28至31的任一項的方法，其中溶液A進一步包含能夠誘導纖維蛋白交聯(lián)的催化劑。33.根據(jù)權利要求32的方法，其中所述催化劑是轉谷氨酰胺酶。34.根據(jù)權利要求33的方法，其中所述轉谷氨酰胺酶是因子XIII。35.根據(jù)權利要求28至34的任一項的方法，其中所述顯像劑選自亞甲基藍，靛卡紅及其組合。36.根據(jù)權利要求35的方法，其中所述顯像劑是亞甲基藍。37.根據(jù)權利要求28至36的任一項的方法，其中溶液B被避光保護。38.根據(jù)權利要求35的方法，其中所述顯像劑是靛卡紅。39.根據(jù)權利要求28至38的任一項的方法，其中所述表面是患者的身體部分的表面。40.根據(jù)權利要求28至39的任一項的方法，其中所述纖維蛋白膠用于封閉或填充表面和/或用于預防或治療出血。41.根據(jù)權利要求28至39的方法，其中所述纖維蛋白膠用于預防或治療粘連。42.纖維蛋白膠試劑盒，其包含(i)形成纖維蛋白膠需要的至少兩種單獨的成分，所述至少一種成分包含纖維蛋白原，并且所述至少第二種成分包含當與纖維蛋白原反應時能夠形成纖維蛋白的蛋白水解酶，和(ii)酶許可濃度的顯像劑，其中當所述試劑被避光保護時在所產生膠中所述濃度最高達約0.或沒有被避光保護時最高達約0.01%。43.根據(jù)權利要求42的試劑盒，其進一步包含能夠誘導纖維蛋白交聯(lián)的催化劑。44.根據(jù)權利要求42或43的試劑盒，其中所述顯像劑選自亞甲基藍，靛卡紅及其組合。45.根據(jù)權利要求44的試劑盒，其中所述顯像劑是亞甲基藍。46.根據(jù)權利要求44的試劑盒，其中所述顯像劑是靛卡紅。47.纖維蛋白膠制劑，其包含纖維蛋白原，當與纖維蛋白原反應時能夠形成纖維蛋白的蛋白水解酶；以及酶許可濃度的顯像劑，其中當所述試劑被避光保護時在所產生膠中所述濃度最高達約0.或沒有被避光保護時最高達約0.01%。48.根據(jù)權利要求47的制劑，其中所述蛋白水解酶，所述纖維蛋白原和所述顯像劑是粉末形式的。49.根據(jù)權利要求47或48的制劑，其進一步包含能夠誘導纖維蛋白交聯(lián)的催化劑。50.根據(jù)權利要求47到49的任一項的制劑，其中所述顯像劑選自亞甲基藍，靛卡紅及其組合。51.根據(jù)權利要求50的制劑，其中所述顯像劑是亞甲基藍。52.根據(jù)權利要求50的制劑，其中所述顯像劑是靛卡紅。53.溶液，其包含當與纖維蛋白原反應時能夠形成纖維蛋白的蛋白水解酶，以及酶許可濃度的顯像劑，其中當被避光保護時所述濃度為約0.005至約0.2%或沒有被避光保護時為約0.005至約0.02%。54.根據(jù)權利要求53的溶液，其中所述顯像劑選自亞甲基藍，靛卡紅及其組合。55.根據(jù)權利要求54的溶液，其中所述顯像劑是亞甲基藍。56.根據(jù)權利要求54的溶液，其中所述顯像劑是靛卡紅。57.在期望的位置制備纖維蛋白膠的方法，其包含提供包含纖維蛋白原的溶液A；提供包含當與纖維蛋白原反應時能夠形成纖維蛋白的蛋白水解酶以及酶許可濃度的顯像劑的溶液B，其中當所述試劑被避光保護時在所產生膠中所述濃度最高達約0.或沒有被避光保護時最高達約0.01%；以及將規(guī)定體積的所述溶液施用至所述期望的位置以引起纖維蛋白的凝結。58.根據(jù)權利要求57的方法，其中溶液A進一步包含能夠誘導纖維蛋白交聯(lián)的催化劑。59.根據(jù)權利要求57或58的方法，其中所述顯像劑選自亞甲基藍，靛卡紅及其組合。60.根據(jù)權利要求59的方法，其中所述顯像劑是亞甲基藍。61.根據(jù)權利要求59的方法，其中所述顯像劑是靛卡紅。62.用于促進血液凝固和/或用于填充或封閉表面的方法，其包含施用根據(jù)權利要求1至15或42至46的任一項的試劑盒，根據(jù)權利要求16至20或47至52的任一項的制劑，或權利要求21至27或53至56的任一項的溶液。63.用于預防和/或降低粘連的方法，其包含施用根據(jù)權利要求1至15或42至46的任一項的試劑盒，根據(jù)權利要求16至20或47至52的任一項的制劑，或權利要求21至27或53至56的任一項的溶液。64.根據(jù)權利要求1至15或42至46的任一項的試劑盒，根據(jù)權利要求16至20或47至52的任一項的制劑，或權利要求21至27或53至56的任一項的溶液，其用于腹腔鏡手術。65.纖維蛋白膠制劑在制備用于預防或治療出血和/或封閉或填充表面的藥物中的用途，所述纖維蛋白膠制劑包含纖維蛋白原，當與纖維蛋白原反應時能夠形成纖維蛋白的蛋白水解酶；以及酶許可濃度的顯像劑。66.纖維蛋白膠制劑在制備用于預防或治療粘連的藥物中的用途，所述纖維蛋白膠制劑包含纖維蛋白原，當與纖維蛋白原反應時能夠形成纖維蛋白的蛋白水解酶；以及酶許可濃度的顯像劑。67.纖維蛋白膠制劑在制備用于預防或治療出血和/或封閉或填充表面的藥物中的用途，所述纖維蛋白膠制劑包含纖維蛋白原，當與纖維蛋白原反應時能夠形成纖維蛋白的蛋白水解酶；以及酶許可濃度的顯像劑，其中當所述試劑被避光保護時在所產生膠中所述濃度最高達約0.或沒有被避光保護時最高達約0.01%。68.纖維蛋白膠制劑在制備用于預防或治療粘連的藥物中的用途，所述纖維蛋白膠制劑包含纖維蛋白原，當與纖維蛋白原反應時能夠形成纖維蛋白的蛋白水解酶；以及酶許可濃度的顯像劑，其中當所述試劑被避光保護時在所產生膠中所述濃度最高達約0.或沒有被避光保護時最高達約0.01%.全文摘要本發(fā)明涉及與纖維蛋白原反應時能形成纖維蛋白的蛋白水解酶、包含酶許可濃度的顯像劑的纖維蛋白膠試劑盒和纖維蛋白膠制劑以及它們在預防和/或減少粘連的方法和/或促進血液凝固封閉或填充身體表面方法中的用途。文檔編號A61L24/04GK101820927SQ200880105291公開日2010年9月1日申請日期2008年7月1日優(yōu)先權日2007年7月2日發(fā)明者I·努爾,L·巴,R·梅德勒申請人:奧姆里克斯生物藥品有限公司