專利名稱：：沒食子?；咸烟穷惢衔锏闹苽浞椒ㄅc用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及藥用植物南酸棗提取物中所含沒食子?；咸烟穷惢衔锏闹苽浞椒?，以及這些化合物用于制備抗腫瘤或抗缺氧藥物、抗缺氧保健品等功能性食品的用途。
背景技術(shù)：
：氧在人的生命活動中是不可或缺的，在體內(nèi)組織和細胞的能量代謝中氧分子發(fā)揮著重要作用。多種因素可導(dǎo)致人體組織和細胞的供氧不足，如某些疾病或身處特殊低氧環(huán)境(如高原)等，而缺氧又反過來可造成細胞、組織損傷乃至各種嚴重疾病，如嚴重的呼吸系統(tǒng)疾病以及并發(fā)的心腦血管疾病、免疫機能低下等。嚴重缺氧往往還成為許多相關(guān)危重病人死亡的直接原因。因此，抗缺氧劑的研究與開發(fā)受到關(guān)注。癌癥嚴重威脅人類的生命，全世界每年死于癌癥的病人約500萬；最近的統(tǒng)計資料表明，我國每年有160萬腫瘤患者，近130萬人死于胂瘤，且腫瘤的發(fā)病率呈逐年上升和年輕化的趨勢，其死亡率占總死亡人口的1/5，成為人類健康的主要殺手之一。癌癥的研究已有上百年的歷史，但至今癌癥仍然在猖獗肆虐，因此如何預(yù)防和治療癌癥在二十一世紀仍然是人類面臨的一大難題。南酸棗C/roems/顯力Vw紅/〃鎖V5"(Roxb.)Burtt.etHill.為漆樹科南酸棗屬植物，其樹皮和果實入藥(江蘇新醫(yī)學(xué)院編，中藥大辭典，上冊，上海，上海人民出版社，1977年，第397-398頁和第1564頁)，干燥果實已作為中藥"廣棗"收入我國2005年版藥典(國家藥典委員會，中華人民共和國藥典，一部，北京，化學(xué)工業(yè)出版社，2005年，第29-30頁)。南酸棗的化學(xué)成分有些已有報道，其粗提物、總黃酮或某些單體化合物的抗菌、抑制血小板聚集、抗腫瘤等活性也有報道(李長偉等；南酸棗的研究進展解放軍藥學(xué)學(xué)報，2008年第24巻第3期，第231-234頁)。此外，南酸棗果實總黃酮的缺氧保護作用也曾有文獻記載(李增晞等；廣棗總黃酮對動物耐缺氧和急性心肌缺血的保護作用中草藥，1984年第15巻第6期，第25-27頁)，但其中抗缺氧活性成分尚未闡明。本發(fā)明涉及的從南酸棗提取物中分離制備的沒食子酰基葡萄糖類化合物的抗缺氧、抗腫瘤活性及其用途至今未見報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)藥用植物南酸棗的含水醇浸骨、其乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、柱層析組分等多種提取物具有很好的抗缺氧活性及抗腫瘤活性，并從這些提取物中首次發(fā)現(xiàn)并分離制備了具有抗缺氧及抗腫瘤活性的l-O-沒食子?；?Z-D-葡萄吡喃糖(化合物I)、1，6-二-0-沒食子?；?Z-D-葡萄吡喃糖(化合物II),1，4-二-0-沒食子?；?Z-D-葡萄吡喃糖(化合物IH)，1，4，6-三-0-沒食子?；?P-D-葡萄吡喃糖(化合物IV)、1，3，4，6-四-0-沒食子?；?Z-D-葡萄吡喃糖(化合物V)等五個沒食子酰基葡萄糖類化合物。因此，本發(fā)明的第一個方面涉化合物1V及其藥學(xué)上可接受的鹽，以及這些化合物的抗缺氧、抗腫瘤相關(guān)生物活性。本發(fā)明的第二個方面涉及制備化合物iv及其鹽類的方法，所述方法包括用醇或含水醇對植物原料如南酸棗進行提取，再經(jīng)過分離純化得到目的化合物。本發(fā)明的第三個方面涉及上述化合物i~v及其鹽類作為活性成分的抗缺氧及抗肺瘤藥物組合物、抗缺氧保健品等功能性食品。上述化合物I~V的制備方法是，用含水醇浸泡提取南酸棗植物材料，獲得含有上述化合物的粗浸骨，再用分離手段，純化制備粗浸骨中的上述化合物。所述含水醇是60%95%(v/v)的含水乙醇，所述分離手段包括天然產(chǎn)物化學(xué)領(lǐng)域的專業(yè)人士所熟知的液-液萃取、柱層析、薄層層析、高效液相層析及重結(jié)晶等。本發(fā)明采用大鼠嗜鉻細胞瘤抹PC12和人白血病細胞K562，用MTT法測試評價了化合物I~V的抗缺氧及抗腫瘤活性，并經(jīng)實驗證實，上述化合物對K562細胞有明顯抗腫瘤活性，同時對PC12細胞的缺氧損傷均具有很好保護作用。本發(fā)明的化合物I~V可作為抗缺氧劑用于防治各種缺氧性疾病、或改善和減輕低氧環(huán)境下的缺氧相關(guān)各種不適癥狀。化合物IV還可用作抗腫瘤藥物用于治療各種腫瘤。本發(fā)明化合物可以單獨或兩個以上組合，或再組合藥學(xué)上可接受的各種載體、賦形劑或輔料配伍，制成抗缺氧藥物及抗腫瘤藥物，用于防治缺氧引起的各種疾病及腫瘤，也可以制成具有抗缺氧功能的保健品或食品添加劑，用于預(yù)防、改善或減輕缺氧條件下的各種癥狀。本發(fā)明中的術(shù)語"藥學(xué)上可接受的鹽"是指藥用無機或有機鹽?；衔颕~V中所含酚羥基等酸性基團可以使化合物與堿金屬或堿土金屬形成藥用鹽，也可以形成藥用銨鹽，優(yōu)選但不限于銨(或胺)鹽、鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽或釣鹽。本發(fā)明的化合物可以單獨或以藥物組合物的形式給藥。給藥途徑可以是口服、非腸道或局部給藥。藥物組合物可根椐給藥途徑配成各種適宜的劑型。本發(fā)明化合物的藥物組合物可以以下面的任意方式施用口服，噴霧吸入，直腸用藥，鼻腔用藥，頰部用藥，局部用藥，非腸道用藥，如皮下，靜脈，肌內(nèi)，腹膜內(nèi)，鞘內(nèi)，心室內(nèi)，胸骨內(nèi)和顱內(nèi)注射或輸入，或借助一種外植儲器用藥。其中優(yōu)選口服、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)給藥方式。當口服用藥時，本發(fā)明化合物可制成任意口服可接受的制劑形式，包括但不限于片劑、膠嚢、水溶液或水懸浮液。其中，片劑使用的載體一般包括乳糖和玉米淀粉，另外也可加入潤滑劑如硬脂酸鎂。膠嚢制劑使用的稀釋劑一般包括乳糖和干燥玉米淀粉。水懸浮液制劑則通常是將活性成分與適宜的乳化劑和懸浮劑混合使用。任選地，以上口服制劑形式中還可加入一些甜味劑、芳香劑或著色劑。當皮膚局部施用時，本發(fā)明提取物和化合物可制成適當?shù)能涁?、洗劑或霜劑制劑形式，其中將活性成分懸浮或溶解于一種或多種栽體中。軟膏制劑可使用的載體包括但不限于礦物油、液體凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧化乙烯、聚氧化丙烯、乳化蠟和水；洗劑或霜劑可使用的載體包括但不限于礦物油、脫水山梨糖醇單硬脂酸酯、吐溫60、十六烷酯蠟、十六碳烯芳醇、2-辛基十二烷醇、芐醇和水。本發(fā)明化合物還可以無菌注射制劑形式用藥，包括無菌注射水或油懸浮液或無菌注射溶液。其中，可使用的載體和溶劑包括水、林格氏溶液和等滲氯化鈉溶液。另外，滅菌的非揮發(fā)油也可用作溶劑或懸浮介質(zhì)，如單甘油酯或二甘油酯。另外需要指出，本發(fā)明提取物和化合物的使用劑量和使用方法取決于諸多因素，包括患者的年齡、體重、性別、自然健康狀況、營養(yǎng)狀況、各種提取物或各種化合物的活性強度、服用時間、代謝速率、病癥的嚴重程度以及診治醫(yī)師的主觀判斷。優(yōu)選的4吏用劑量介于0.01-500mg/kg體重/天。具體實施例方式下列實施例將進一步說明本發(fā)明，但并不對本發(fā)明構(gòu)成限制。在以下實施例中，以下稱為化合物I的是"l-O-沒食子酰基-Z-D-葡萄吡喃糖"；稱為化合物II的是"l，6-二-0-沒食子?；?p-D-葡萄吡喃糖"；稱為化合物III的是"l，4-二-0-沒食子酰基-Z-D-葡萄吡喃糖"；稱為化合物IV的是l，4，6-三-0-沒食子?；?;-D-葡萄吡喃糖"；稱為化合物V的是"l，3，4,6-四-0-沒食子?；?;-D-葡萄吡喃糖"。實施例1.化合物IV的分離制備原材料藥用植物南酸棗的提取和萃取分離南酸奉C7f0m>s/^wd/"s紅/〃"〃'es(Roxb.)Burtt.etHill.的干燥樹皮3.2kg(1999年8月采自云南勐臘地區(qū))粉碎后用市售醫(yī)用95%(v/v)乙醇室溫浸提，每次用乙醇25升浸泡7天，共提4次，合并提取液，減壓濃縮干燥，得乙醇提取物750g。該乙醇提取物750g懸浮于3升水中，依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，各種溶劑每次用3升，分別各萃取4次，合并相同萃取液，減壓濃縮干燥，得到氟仿萃取物60g、6乙酸乙酯萃取物310g、正丁醇萃取物300g和水層殘留物80g。從正丁醇萃取物中化合物iin的分離制備將上述南酸棗的正丁醇萃取物300g用適量甲醇溶解，加適量大孔樹脂AB-8吸附、干燥，上大孔樹脂AB-8柱(水中柱床8.5cmx48cm)，用不同體積比的水-乙醇梯度洗脫，根據(jù)薄層檢測結(jié)果收集合并洗脫液，減壓濃縮干燥，依洗脫流出順序得兩個水洗組分B-1(20g)、B-2(38g)和若千后續(xù)流出含水乙醇洗脫組分(共計230g)。組分B-1(20g)用適量水溶解，直接上S印hadexLH-20凝膠柱(水中柱床3.6cmx50cm)，用不同體積比的水-乙醇梯度洗脫，根據(jù)薄層檢測結(jié)果收集合并洗脫液，減壓濃縮干燥，得五個組分B-l-l(13g，水洗脫部分)、B-l-2(l,lg，水洗脫部分)、B-l-3(1.4g，水-乙醇80:20洗脫部分)、B-l-4(0.25g，水-乙醇60:40洗脫部分)、B-l-5(0.8g，水-乙醇30:70洗脫部分)、B-l-6(3.2g，乙醇洗脫部分)。B-l-5(0.8g)用適量體積百分數(shù)70%的曱醇水溶解，添加到用相同體積百分數(shù)70%甲醇水裝填的SephadexLH-20柱上，并用體積百分數(shù)70%的甲醇水洗脫精制，得到化合物I(35mg)。組分B-2(38g)用適量曱醇溶解，加適量聚酰胺吸附、干燥，上聚酰胺柱(水中柱床7.5cmxl8.5cm),用不同體積比的水-丙酮梯度洗脫，根據(jù)薄層檢測結(jié)果合并所收集的洗脫液，減壓濃縮，得八個組分B-2-l(10g，水洗脫部分)、B-2-2(2g,水洗脫部分)、B-2-3(1.5g，水-丙酮9:1洗脫部分)、B-2-4(1.7g，水-丙酮9:1洗脫部分)、B-2-5(2g，水-丙酮9:1洗脫部分)、B-2-6(5g，水-丙酮7:3洗脫部分)、B-2-7(5g，水畫丙酮5:5洗脫部分)和B-2畫8(5g，丙酮洗脫部分)。組分B-2-5(2g)用適量曱醇溶解，加適量聚酰胺吸附、干燥，上聚酰胺柱(乙酸乙酯中柱床2,8cmx30cm)，用不同體積比的乙酸乙酯-甲醇梯度洗脫，收集洗脫液并根據(jù)薄層檢測結(jié)果合并，減壓濃縮干燥，得B-2-5-l(lg，乙酸乙酯-甲醇6:1洗脫部分)、B-2-5-2(0.6g，乙酸乙酯-甲醇4:1洗脫部分)和B-2-5-3(0.4g，乙酸乙酯-甲醇2:1洗脫部分)。B-2-5-l(1g)用適量體積比70:30的曱醇-水溶解，直接上SephadexLH-20柱(甲醇-水70:30中柱7床2.8cmx45cm)，用相同體積比70:30的曱醇-水溶劑洗脫，收集洗脫液并根據(jù)薄層檢測結(jié)果合并含化合物V的洗脫組分，減壓濃縮并經(jīng)曱醇中重結(jié)晶精制，得化合物II(白色針晶，270mg)。B-2-5-2(0.6g)用適量甲醇溶解，加適量聚酰胺吸附、干燥，上聚酰胺柱(乙酸乙酯中柱床1.8cmx33cm)，用體積比20:10的乙酸乙酉旨-甲醇洗脫，根據(jù)薄層檢測結(jié)果收集洗脫液，減壓濃縮干燥，依洗脫流出先后順序分為B-2-5-2-l(350mg)和B-2-5-2-2(200mg)兩個組分。B-2-5-2-2(200mg)用適量甲醇溶解，加適量聚酰胺吸附、干燥，上聚酰胺柱(乙酸乙酯中柱床1.8cmx33cm)，用乙酸乙酯-曱醇(體積比4:1)洗脫，根據(jù)薄層檢測結(jié)果收集含化合物III的洗脫液，減壓濃縮干燥，再次同法用相同聚酰胺柱層析分離，收集含化合物III的洗脫組分，減壓濃縮干燥，并經(jīng)甲醇中重結(jié)晶精制，得化合物III(結(jié)晶型粉末，27mg)。從乙酸乙酯萃取物中化合物IV和V的分離制備將南酸棗的乙酸乙酯萃取物100g用適量甲醇溶解，加適量聚酰胺吸附、干燥，上聚酰胺柱(乙酸乙酯中柱床7.0cmx50cm)，用不同體積比的乙酸乙酯-甲醇梯度洗脫，收集洗脫液并根據(jù)薄層檢測結(jié)果合并，減壓濃縮干燥，得到四個層析粗組分E-l(4g，乙酸乙酯洗脫部分)、E-2(35g，乙酸乙酯-甲醇9:1洗脫部分)、E-3(25g，乙酸乙酯-甲醇1:1洗脫部分)和E-4(15g，甲醇洗脫部分)。E-4(15g)用適量曱醇溶解，加入約2倍量聚酰胺吸附、干燥，進行聚酰胺柱層析(柱床3.8cmxSOcm)用氯仿(C)-甲醇(M)溶劑系統(tǒng)梯度洗脫，收集洗脫液并根據(jù)薄層檢測結(jié)果合并，減壓濃縮干燥，得到2個組分E-4畫l(2.0g，VC:VM=1:1洗脫部分)和E畫4國2(12.0g，曱醇洗脫部分)。E-4-2(12.0g)用適量體積百分數(shù)90%的甲醇水溶解進行SephadexLH-20凝膠柱層析，用相同體積百分數(shù)90%的甲醇水洗脫，收集洗脫液并根據(jù)薄層檢測結(jié)果合并，減壓濃縮干燥，得到3個組分E-4-2-l(7.2g)、E-4-2-2(2.3g)和E-4-2-3(2.5g)。其中，E-4-2-l用適量曱醇溶解后放置易析出結(jié)晶，經(jīng)預(yù)實驗選擇體積比30%的甲醇水溶液進行重結(jié)晶精制，得化合物IV(4g);E-4-2-2經(jīng)反復(fù)S印hadexLH-20柱層析，用體積百分數(shù)60%的曱醇水洗脫，收集含目的化合物的洗脫組分，并在甲醇中反復(fù)重結(jié)晶精制，得化合物V(152mg);化合物IV的光譜數(shù)據(jù)化合物I為白色結(jié)晶型粉末(曱醇)，熔點為203-205。C。正離子ESI-MSzw々355[M+Na+,與其分子組成d3H^OK)相應(yīng)分子量332—致。H-NMR(400MHz，piridine-^)3:7.58(2H，s，沒食子?；?"，6"-H)，6.67(1H，d，/=7.6Hz,葡萄糖的1國H)，4.12-4.80(6H，m,葡萄糖的26畫H);13C-NMR(100MHz，piridine誦&)3:166.2(沒食子?；腃-l')，147.5(沒食子?；腃-3"，5")，141.4(沒食子酰基的C-4"),120.4(沒食子?；腃-l")，110.5(沒食子?；腃-2"，6")，96.1(葡萄糖的C-l)，79.4(葡萄糖的C-3),78.5(葡萄糖的C-5)，74.2(葡萄糖的C-2)，70.7(葡萄糖的C-4)，61.8(葡萄糖的C-6).化合物II為白色針晶，(甲醇)，熔點為175-177。C。正離子TOF-MS附々:507[M+H]+，52M+Kj+;負離子TOF-MS附々:483[M-H];與其分子組成(:2。112。014相應(yīng)分子量484吻合。'H-NMR(400MHz，MeOH-^)<5:7.12，7.06(2Hx2，s，沒食子?；?"，6"-H)，5.68(1H，d，/=7.6Hz，葡萄糖的l-H)，4.54(1H，dd，/=12.2，2.0Hz，葡萄糖的6畫Ha)，4.39(1H，dd，/=12.2，4.8Hz，葡萄糖的6-Hb)，3.70(1H，m，葡萄糖的5-H)，3.48-3.54(3H，m，葡萄糖的24-H);"C畫匪R(100MHz，MeOH-^)<5:168.0，166.6(沒食子?；腃-l'x2)，146.1(沒食子?；腃-3",5"x2),140.1，139.5(沒食子?；腃-4"x2)，120.9，120.2(沒食子?；腃-l"x2)，110.2，109.8(沒食子酰基的C-2"，6"x2)，95.6(葡萄糖的C-l),77.6(葡萄糖的C-3)，76.1(葡萄糖的C-5)，73.7(葡萄糖的C-2)，70.8(葡萄糖的C-4)，64.1(葡萄糖的C-6)。化合物III為結(jié)晶性粉末(曱醇)，熔點為162-164。C。正離子TOF-MS附々507[M+Na廣；負離子TOF-MS附々483[M-H-;與其分子組成C2oH2。0"相應(yīng)分子量484—致。力-NMR(400MHz，MeOH-比)<5:7.14，7.10(2Hx2，s，沒食子?；?"，6"-H)，5.75(lH，d，/=8.4Hz，葡萄糖的l-H)，5.04(1H，t,/=9.6Hz，葡萄糖的4-H)，3.79(1H，t，/=9.6Hz，葡萄糖的3-H)，3.73(1H，m，葡萄糖的5-H)，3.65(1H，dd，/=3.6，12.4Hz，葡萄糖的6-Ha)，3.61(1H，dd，/=8.4，9.2Hz，葡萄糖的2畫H)，3.54(1H，dd，/=5.6，12.4Hz，葡萄糖的6-Hb);"C-NMR(100MHz，MeOH畫^)3:167.6，166.9(沒食子?；腃-l'x2)，146.5(沒食子?；腃-3"，5"x2)，140.4，14(U(沒食子?；腃-4"x2)，121.0，120.5(沒食子酰基的C-l"x2)，110.5，110.3(沒食子酰基的C-2"，6"x2)，95.8(葡萄糖的C畫1)，77.0(葡萄糖的C-3)，76.0(葡萄糖的C-5),74.3(葡萄糖的C-2)，72.0(葡萄糖的C畫4)，62.0(葡萄糖的C-6)。化合物IV為白色結(jié)晶型粉末(體積比30%的甲醇水)，熔點為174-176。C。ESI畫MS附々659[M+Na+，675[M+K]+,與其分子組成(:271124018相應(yīng)分子量636吻合。1H-NMR(400MHz,MeOH國^)<5:7.15，7.10，7.07(2Hx3，s，沒食子?；?"，6"-H),5.79(lH，d，/=8.4Hz，葡萄糖的1-H)，5.23(1H，t，/=9.6Hz，葡萄糖的4-H)，4.44(1H，dd，/=12.6，2.0Hz，葡萄糖的6-Ha),4.22(lH，dd，/=12.6,4.8Hz，葡萄糖的6-Hb)，4.07(1H，m，葡萄糖的5-H)，3.84(1H，t,/=9.2Hz，葡萄糖的3-H)，3.65(1H，dd，/=8.4,9.6Hz，葡萄糖的2畫H);13C-NMR(100MHz，MeOH國^)&166.7，166.1，165.6(沒食子酰基的C-l，x3)，145.2，145.2，145.1(沒食子?；腃-3"，5"x3),139.2，138.8，138.6(沒食子?；腃-4"x3)，119.8，119.6，119.1(沒食子?；腃-l"x3)，109.2，109.0，108.9(沒食子?；腃畫2"，6"x3)，94.5(葡萄糖的C-1)，74.7(葡萄糖的C-3)，73.1(葡萄糖的C-5)，72.9(葡萄糖的C-2)，70.5(葡萄糖的C-4)，62.3(葡萄糖的C-6).化合物V為棕色結(jié)晶型粉末(甲醇)，熔點為166-168°C。正離子ESI-MS附々80M+NH4I+，82M+K廣與其分子組成<:341128022相應(yīng)分子量788吻合。'H國醒R(400MHz，MeOH畫^)3:7.15，7.07，7.01，6.95(2Hx4，s，沒食子?；?"，6"-H)，5.93(1H，d，/=8.1Hz，葡萄糖的1-H)，5.58(1H，t，/=9.4Hz，葡萄糖的3畫H)，5.45(1H，t，/=10.0Hz，葡萄糖的4-H)，4.47(1H，dd，/=12.4，1.6Hz，葡萄糖的6-Ha)，4.31(1H，dd，/=12.4，4.4Hz，葡萄糖的6-Hb)，4.30(lH，m，葡萄糖的5-H)，3.93(1H,dd，/=8.1，9.4Hz，葡萄糖的2-H);13C-NMR(100MHz，MeOH畫^)J:167.4，167.2，166.6，166.2(沒食子?；腃-l，x4)，146.1，145.9，145.9，145.8(沒食子?；腃-3"，5"x4)，140.1，139.7，139.4，139.4(沒食子酰基的C-4"x4)，120.5，120.4，119.8，119.8(沒食子酰基的C-l"x4)，110.1，109.8，109.7，109.7(沒食子?；腃-2"，6"x4)，95.2(葡萄糖的C-1)，75.9(葡萄糖的C-3)，73.7(葡萄糖的C-5)，72.0(葡萄糖的C-2),69.4(葡萄糖的C-4)，62.8(葡萄糖的C-6).實施例2.抗缺氧活性測試細胞系與細胞培養(yǎng)活性測試采用大鼠嗜鉻細胞瘤PC12細胞林，細胞用含10。/。新生小牛血清和青霉素、鏈霉素各100〃g/mL的DMEM培養(yǎng)基，于37°C通入5。/。C02和95。/。空氣的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)和繼代維護。被測樣品與樣品溶液配制實施例1中化合物I、IV和V。精密稱量被測樣品適量，用含10。/。新生小牛血清和青霉素與鏈霉素各100^g/mL的DMEM培養(yǎng)基溶解，配制成50〃g/mL、100〃g/mL和200;/g/mL的樣品溶液，供活性測試用?；钚詼y試方法取對數(shù)生長期的PC12細胞，用含10%新生小牛血清和青霉素、鏈霉素各100〃g/mL的新鮮DMEM培養(yǎng)基配成細胞密度為每毫升"105個的細胞懸液，接種于96孔板中，每孔150^L，于37°C通入5%C02和95%空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1824h,吸引棄去培養(yǎng)液，分成正常對照組、缺氧對照組和缺氧給藥組，各組每個樣品均設(shè)三孔。正常對照組和缺氧對照組每孔加含10%新生小牛血清、青霉素和鏈霉素各100〃g/mL的新鮮DMEM培養(yǎng)基各150〃L，缺氧給藥組每孔加樣品溶液各150;/L。對照組和給藥組于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)lh，缺氧對照組和缺氧給藥組以31.25//MCoCl2處理2h造成對細胞的缺氧損傷，然后于培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入5mg/mL的MTT溶液(用0.01M的PBS液配制)各15〃L,混勻，37。C孵育4h，翻板法棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加DMSO各150;/L,振蕩10min使MTT紫色產(chǎn)物充分溶解，用酶標儀測量每孔于490nm處的OD值。數(shù)據(jù)以正常對照組為ii100%,取各組OD平均值按下式計算缺氧對照組和缺氧給藥組的細胞存活率細胞存活率(％)=缺氧對照組或缺氧給藥組OD平均值/正常對照組OD平均值xl00。/。。取8次獨立實驗數(shù)據(jù)，計算相應(yīng)細胞存活率(％)，并用Students檢驗法，統(tǒng)計檢驗缺氧對照組和缺氧給藥組兩組間細胞存活率的顯著性差異。實驗結(jié)果見表l。表l化合物I、IV和V對PC12細胞缺氧損傷的保護作用<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>*星號表明與相應(yīng)缺氧對照組相比有顯著性差異，P<0.01表1中所示測試結(jié)果表明，本發(fā)明化合物I、IV和v在所試濃度范圍內(nèi)對PC12細胞的缺氧損傷具有顯著保護作用。實施例3.抗腫瘤活性測試細胞系與細胞培養(yǎng)活性測試釆用人白血病K562細胞系，細胞用含10。/。胎牛血清和青霉素與鏈霉素各100//g/mL的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37°C通入5。/。C02和95%空氣的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)和繼代維護。被測樣品與樣品溶液配制實施例1中化合物IV。精密稱量被測樣品適量，用曱醇溶解，配制成10mg/mL的樣品溶液，供測活性?；钚詼y試方法收集對數(shù)生長期的K562細胞，用新鮮RPMI-1640培養(yǎng)基配制成細胞密度為2x105個細胞/mL的細胞懸液，接種于96孔板中，每孔200wL。將接種后的細胞于37°C、通入5%的C02和95%空氣的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h后，每孔加2〃L不同濃度的樣品溶液，每個濃度設(shè)三個平行孔，同時設(shè)三孔陰性對照。加藥后繼續(xù)培養(yǎng)24h,培養(yǎng)結(jié)束后首先在光學(xué)顯微鏡下觀察藥物處理后引起的細胞形態(tài)變化，判斷有無細胞凋亡或細胞壞死的形態(tài)學(xué)特征，必要時拍照，繼而每孔加入20MTT溶液(用0.01M的PBS液配制的5mg/mL的MTT溶液)，繼續(xù)置于37。C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h。2000r/min離心10miii，吸棄孑L內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150pLDMSO，振蕩IO分鐘，使結(jié)晶物充分溶解，利用酶標儀在570nm處測定每孔溶液的OD值。取平均OD值，按如下公式計算不同濃度樣品對細胞增殖的抑制率抑制率％=(ODg白對照-OD樣品)/OD空白對照x100%。相同試驗分別獨立進行三次，求算不同濃度樣品對細胞增殖的平均抑制率，再利用Bliss法計算化合物的半數(shù)抑制濃度IC5()。實驗結(jié)果見表2。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表2中所示測試結(jié)果表明，本發(fā)明化合物1V在所試濃度范圍內(nèi)對K562細胞的增殖具有不同程度的抑制活性。結(jié)論本發(fā)明化合物I、IV和V對PC12細胞的缺氧損傷具有顯著的保護作用，同時本發(fā)明化合物1V對人白血病K562細胞還有明顯抗腫瘤活性。因此，本發(fā)明的上述化合物可作為抗缺氧、抗腫瘤的活性成分用于制備抗缺氧或抗肺瘤藥物以及抗缺氧保健品等功能性食品。權(quán)利要求1.沒食子?；咸烟穷惢衔?-O-沒食子?；?β-D-葡萄吡喃糖(化合物I)、1，6-二-O-沒食子?；?β-D-葡萄吡喃糖(化合物II)、1，4-二-O-沒食子?；?β-D-葡萄吡喃糖(化合物III)、1，4，6-三-O-沒食子酰基-β-D-葡萄吡喃糖(化合物IV)和1，3，4，6-四-O-沒食子?；?β-D-葡萄吡喃糖(化合物V)，或其藥學(xué)上可接受的鹽類作為活性成分用于制備抗腫瘤藥物的用途。2.沒食子?；咸烟穷惢衔飈-O-沒食子?；?--D-葡萄吡喃糖(化合物I)、1，4，6-三-0-沒食子?；?Z-D-葡萄吡喃糖(化合物IV)和1,3，4，6-四-0-沒食子?；?yff-D-葡萄吡喃糖(化合物V)，或其藥學(xué)上可接受的鹽類作為活性成分用于制備抗缺氧藥物或抗缺氧保健品等功能性食品的用途。3.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述化合物I、II、III、IV、V的制備方法，該方法包括以南酸棗為原料，經(jīng)含水醇浸泡提取，獲得含有上述化合物的粗浸骨，再用常規(guī)分離手段，分離純化得到粗浸骨中的上述化合物。4.權(quán)利要求3所述的制備方法，其中所述含水醇是60%95%(v/v)的含水乙醇。5.權(quán)利要求3所述的制備方法，所述常規(guī)分離手段包括液-液萃取、柱層析、薄層層析、高效液相層析及重結(jié)晶等。全文摘要本發(fā)明涉及藥用植物南酸棗中所含沒食子酰基葡萄糖類化合物的提取、純化方法，以及所述沒食子?；咸烟穷惢衔镒鳛榛钚猿煞钟糜谥苽淇鼓[瘤藥物，或抗缺氧藥物或保健品等功能性食品的用途。文檔編號A61P35/00GK101683350SQ20081021176公開日2010年3月31日申請日期2008年9月24日優(yōu)先權(quán)日2008年9月24日發(fā)明者崔承彬,李明明,李長偉,明范,兵蔡,冰韓申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所