專(zhuān)利名稱(chēng)：：白介素-22在制備治療肝病藥物中的應(yīng)用及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及白介素-22的醫(yī)藥用途和制備方法，具體地說(shuō)涉及白介素-22在制備治療肝病藥物上的用途，還涉及重組人白介素-22的制備方法。
背景技術(shù)：
：白介素-22(英文名稱(chēng)為Interleukin22，簡(jiǎn)寫(xiě)為IL22)是二000年發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞因子，由活化的T細(xì)胞及NK細(xì)胞分泌(WolkK等，JImmunol2002;168:5397402)，通過(guò)異源受體復(fù)合物(IL22R1，IL10R2)而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)(XieMH等JBiolChem2000;275:313359)，IL10R2分布較為廣泛，IL22R1表達(dá)高度受限，主要表達(dá)于胰腺、皮膚、肝臟、肺以及腎臟。靜息或活化的免疫細(xì)胞均無(wú)IL-22Rl的表達(dá)(WolkK等，Immunity2004;21:241-54)。白介素_22的醫(yī)藥用途主要有(1)在治療高脂血癥、高甘油三酯血癥、肥胖和/或糖尿病中的用途(專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?00510023103.0)，(2)在治療胰腺功能紊亂中的用途(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)7，226，591)目前沒(méi)有發(fā)現(xiàn)白介素一22治療肝病的文獻(xiàn)。酒精性肝病和非酒精性脂肪性肝病均屬于遺傳—環(huán)境一代謝應(yīng)激相關(guān)性疾病。酒精性肝病和非酒精性脂肪性肝病可以與病毒性肝炎合并存在，非酒精性脂肪性肝病除了與酒精性肝病一樣可以導(dǎo)致肝病相關(guān)殘疾和死亡外，還與2型糖尿病、代謝綜合癥及其相關(guān)心腦血管事件密切相關(guān)(BruntE:Nonalcoholicsteatohepatitis.SeminLiverDis2004，24:3-20)。酒精性肝病(alcoholicliverdiseases簡(jiǎn)稱(chēng)ALD)是指由于長(zhǎng)期過(guò)量飲酒而引起的肝臟損害等一系列病變，其病理學(xué)變化包括酒精性脂肪肝，酒精性肝炎，酒精性肝纖維化，酒精性肝硬化，幾種病理變化可以單獨(dú)發(fā)生又可同時(shí)存在。隨著人們生活水平的不斷上升，酒精性肝病的發(fā)病率呈現(xiàn)出明顯上升的趨勢(shì)，在我國(guó)已經(jīng)成為僅次于病毒性肝病的第二大肝臟疾病。目前還沒(méi)有對(duì)ALD有效的治療藥物，當(dāng)前在臨床上應(yīng)用的藥物有糖皮質(zhì)激素，PTX(己酮可可堿)以及抗TNF-a治療，糖皮質(zhì)激素被認(rèn)為可以改善酒精性肝炎急性期的癥狀，提高短期生存率，但并不能對(duì)預(yù)后，肝臟并發(fā)癥以及肝臟組織學(xué)形態(tài)的改善產(chǎn)生有利的影響(BergheimI等，DigDis.2005:23(3-4):275-84)。PTX因其抗炎作用，能夠有效預(yù)防肝腎綜合癥的發(fā)生以及較好的安全性而被應(yīng)用于酒精性肝炎肝硬化的治療。非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一種肝組織病理學(xué)改變與酒精性肝病相類(lèi)似但無(wú)過(guò)量飲酒史的臨床綜合癥。西歐、美國(guó)、日本普通人群NAFLD患病率為1024%，NASH(非酒精性脂肪性肝炎)患病率為2%5%，肥胖患者中NAFLD患病率高達(dá)57.5%74%。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，NAFLD患病率迅速增高，現(xiàn)己成為危害人類(lèi)健康的三大肝病之一。NAFLD是遺傳一環(huán)境一代謝應(yīng)激相關(guān)性疾病，與胰島素抵抗及其相關(guān)的代謝綜合癥和遺傳易感性密切相關(guān)。NAFLD不僅可以導(dǎo)致肝病相關(guān)殘疾和死亡，而且與動(dòng)脈粥樣硬化性心腦血管事件的高發(fā)密切相關(guān)。對(duì)于NAFLD還沒(méi)有有效的藥物進(jìn)行治療。目前制備IL22的方法主要有兩種(l)原核表達(dá)體系(RonaldoAlvesPintoNagem等，CrystalStructureofRecombinantHumanInterleukin-22Structure,Vol.10，1051-1062，August,2002)，原核表達(dá)體系是利用pET系列載體，其誘導(dǎo)方式為化學(xué)誘導(dǎo)(IPTG誘導(dǎo)表達(dá))，其缺點(diǎn)是成本高；(2)真核表達(dá)體系(JingLi等，InternationalImmunopharmacology4(2004)693-708)，采用真核表達(dá)體系表達(dá)hlL22為可溶性，其缺點(diǎn)是表達(dá)量小，無(wú)法滿(mǎn)足動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的需求；因此需要尋找表達(dá)量高、成本低的制備方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的之一是提供一種白介素一22的用途。本發(fā)明另一目的是提供重組人白介素一22的制備方法。本發(fā)明提供了白介素_22在制備治療肝病藥物中的應(yīng)用。所述的白介素一22是指人白介素—22、重組人白介素一22、鼠白介素一22或重組鼠白介素一22等。所述肝病是指酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、病毒性肝炎、急性肝衰竭、肝纖維化、肝臟缺血再灌注損傷、肝臟移植后衰竭等肝病之一種。上述肝病是指酒精性肝病或非酒精性脂肪性肝病。本發(fā)明重組人白介素一22的制備方法，包括如下步驟(1)利用人新鮮外周血液，培養(yǎng)人外周血淋巴細(xì)胞，提取總RNA;(2)以總RNA為模板，以fl和rl為引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，得hlL22的CDNA序列;所述的引物fl和rl的序列如下fl:5'GAGAATTCATATGGCACCCATCAGCTCCCA3';rl:5'ACGGATCCTCAAATGCAGGCATTTCT3'然后再以所得的cDNA為模板，以fl和rl為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得hlL22的DNA序列；(3)用fcoR工和分別將步驟(2)所得hlL22的DNA序列和質(zhì)粒pBV220酶切；然后將兩者混合，用T4連接酶將兩者連接，然后將連接產(chǎn)物用電轉(zhuǎn)化或CaCl,轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，篩選鑒定，得重組質(zhì)粒pBV220/hlL22;(4)用電轉(zhuǎn)化或CaCl2法將重組質(zhì)粒pBV220/hlL22轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；再接種于LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)，然后離心、重懸沉淀物，利用超聲波破碎菌體，接著將所得包涵體變性、溶解、純化、復(fù)性、濃縮，即得本發(fā)明重組人白介素22蛋白。上述重組人白介素一22的制備方法，其詳細(xì)的操作步驟為(1)將人新鮮外周血液用含2mmol/LEDTA的PBS溶液稀釋2倍，然后鋪于等體積淋巴細(xì)胞分離液上，再在7001000rpm下離心，然后用毛細(xì)玻璃管吸出灰白層細(xì)胞，用Hanks液洗滌灰白層細(xì)胞23次，再將灰白層細(xì)胞懸浮在1640培育基中，并在37。C、59C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,而后加入ConA(2mg/ml)和anti-CD:,(4mg/ml)共刺激細(xì)胞，再在37。C，5%0^培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h，用總RNA提取試劑盒提取總RNA;(2)以總RNA為模板，以fl和rl為引物fl:5'GAGAATTCATATGGCACCCATCAGCTCCCA3'rl:5'ACGGATCCTCAAATGCAGGCATTTCT3'進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增得到人白介素一22的cDNA序列；所述RT-PCR反應(yīng)體系的各部分比例為總RNA，5ul;RNase抑制劑；0.5ul;Oligo(dT)，0.5ul;DEPC處理水，6.5ul;總計(jì)12ul;70°C5min至4。C;RT:在上述體系加入5Xbuffer4ul，2.5mMdNTP2ul，AMVlul，RNase抑制劑lul，42°Clh，85°C5min至4。C;然后以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的第一鏈cDNA為模板，以fl，rl為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，所述的PCR反應(yīng)體系的各部分比例為IOPCR反應(yīng)Xbuffer2.0ul，2.Ommol/LdNTP2.0ul，5pmol/ulfl2.0ul，5pmol/ulrl2.0ul，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物4.Oul，TaqDNA聚合酶0.5ul，ddH207.5ul，共20ul;所述的PCR反應(yīng)條件為94。C預(yù)變性3min，94°C30S，50°C30S，72°C30S，30個(gè)循環(huán)；72°C延伸7min;用1.2%的瓊脂糖凝膠分離PCR產(chǎn)物；(3)分別向RT-PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒pBV220加入限制性?xún)?nèi)切酶fcoRI和勘/zffl，在37"C水浴中酶切3.5h，然后將兩者按104:1比例混合，加入T4連接酶，于16"C進(jìn)行連接反應(yīng)12h，利用電轉(zhuǎn)化或CaCL法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，利用氨芐青霉素抗性篩選重組克隆，提取相應(yīng)質(zhì)粒、酶切鑒定、測(cè)序，可得重組質(zhì)粒pBV220/hlL22;(4)用電轉(zhuǎn)化或CaCl2法將重組質(zhì)粒pBV220/hlL22轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中；轉(zhuǎn)化菌落3(TC過(guò)夜活化，次日按照12%體積百分比的比例接種于LB培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)23hr，然后置于42。C水浴搖床上、180220rpm條件下培養(yǎng)48hr;再在4。C、10，00012，000rpm條件下離心1015min，去上清，按照質(zhì)量體積比l:810的比例將沉淀重懸于PB溶液中，再以超聲波破碎菌體，用2mol/L尿素將超聲波處理后得到的包涵體洗滌24次，然后將包涵體加入到8mol/L尿素中，得溶解的包涵體溶液，以S印hacry卜200(S-200)為柱填料，對(duì)溶解上清進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析，再將所得純化樣品置于復(fù)性緩沖液中4'C進(jìn)行復(fù)性反應(yīng)72hr，最后用PEG6000緩慢濃縮得到人白介素一22蛋白。上述方法中所述的宿主細(xì)胞可以是Eco7iDH5a、HB101或JM109等。上述方法中所述的Hanks液可從巿場(chǎng)上直接購(gòu)買(mǎi)，如可從天潤(rùn)善達(dá)公司購(gòu)買(mǎi)。上述方法中所述的淋巴細(xì)胞分離液可從市場(chǎng)上直接購(gòu)買(mǎi)，如可從上海華精生物公司購(gòu)買(mǎi)。上述方法中所述的ConA可于市場(chǎng)上直接購(gòu)買(mǎi)，如可從夏斯生物公司購(gòu)買(mǎi)。上述方法中所述的anti-CD,可于市場(chǎng)上直接購(gòu)買(mǎi)，如可從上海我武生物科技有限公司購(gòu)買(mǎi)。上述1640培育基為常用的培養(yǎng)基，可從市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)，如可購(gòu)從天潤(rùn)善達(dá)試劑公司購(gòu)買(mǎi)。上述總RNA提取試劑盒可從市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)，如可從Promega公司購(gòu)買(mǎi)。上述方法中所述的PB溶液為終濃度為100mmol/LNa2HP0d，100mmol/LNaH2P04的混合液。見(jiàn)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版1568頁(yè)。上述LB培養(yǎng)基指通常所用的LB培養(yǎng)基。上述方法步驟(3)和步驟(4)中利用電轉(zhuǎn)化或CaCl2法轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的方法見(jiàn)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版9699。所述的凝膠過(guò)濾層析是以S印hacry1-200(S-200)為柱填料。所述的復(fù)性緩沖液的組成成分及其比例為100ol/LNa2HP0"100腿ol/L線(xiàn)P。4，0.1腸1/LGSSG，1國(guó)1/LGSH，0.1%PEG。本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)(1)本發(fā)明提供了白介素一22的一種新用途，擴(kuò)大了白介素一22的應(yīng)用范圍；(2)本發(fā)明表達(dá)量高，并且目的蛋白可以占到菌體蛋白的40%;(3)本發(fā)明方法以pBV220為載體，采用溫度誘導(dǎo)的誘導(dǎo)方式，生產(chǎn)成本低。圖1為人外周血總RNA電泳圖圖2為RT-PCR產(chǎn)物電泳圖1.DL20002.hlL22c薩圖3為pBV220—IL22酶切產(chǎn)物電泳圖1.DL20002.用Acoy/和^g/^/酶切pBV220產(chǎn)物的電泳圖3.用^co7/和及/7^/酶切pBV220-hIL-22產(chǎn)物的電泳圖圖4為hlL22在各種大腸桿菌中的表達(dá)產(chǎn)物電泳圖1.Marker2.pBV220/JM1093.pBV220-IL22/JM109圖5為hlL22的純化的電泳圖圖6為hlL22的洗脫曲線(xiàn)圖圖7為hlL22對(duì)L02細(xì)胞的促增殖作用曲線(xiàn)圖圖8為L(zhǎng)02細(xì)胞c-myc表達(dá)水平電泳圖1.DL20002.L02細(xì)胞提取的總RNA產(chǎn)物3.不同濃度(20、200、400、800ng/mL)的hlL22對(duì)c-myc表達(dá)水平的影響圖9L02細(xì)胞bcl-2表達(dá)水平電泳圖1.DL2000DNAmarker;2.L02細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物36.不同白介素一22濃度(20、200、400、800ng/mL)的L02細(xì)胞中bcl-2表達(dá)水平圖10hlL22治療非酒精性脂肪性肝病的病理切片圖A:正常組；B:模型組；C:IL22治療組具體實(shí)施例方式實(shí)施例1hlL22的制備(1)hlL-22基因的釣取和重組表達(dá)載體的構(gòu)建a.總RNA的提取用含2mmol/LEDTA的PBS將lml人新鮮外周血稀釋2倍，然后鋪于等體積淋巴細(xì)胞分離液(購(gòu)于上海華精生物公司)上，再在800r/min下離心使之分層，然后用毛細(xì)血管吸出灰白層細(xì)胞；用Hanks液(購(gòu)于天潤(rùn)善達(dá)公司)洗滌灰白層細(xì)胞3次，然后用1640培育基(購(gòu)于天潤(rùn)善達(dá)試劑公司)懸浮細(xì)胞，并在37。C，59C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，再分別加入ConA(2mg/ml，購(gòu)于夏斯生物公司)和anti-CD:i(4mg/ml購(gòu)于上海我武生物科技有限公司)共刺激細(xì)胞，然后在37°C，5%0)2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h，再用總RNA提取試劑盒(Promega公司)提取總RNA(操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行)，得總RNA(見(jiàn)圖l);b.目的基因的分離和pBV-IL22質(zhì)粒的構(gòu)建取5uL總RNA，以f1和rl為引物，利用Oligo(dT)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成第一鏈cDNA;所用的引物為EcoRIfl:5'GAGAATTCATATGGCACCCATCAGCTCCCA3'BaraHIrl:5'ACGGATCCTCAAATGCAGGCATTTCT3'反轉(zhuǎn)錄體系如下總瞧5uL，RNase抑制劑0.5uL，Oligo(dT)O.5uL，DEPC處理水6.5uL，共12uL，70°C5min至4。C;RT:在上述體系加入5Xbuffer4uL，2.5mMdNTP2uL，AMVluL，RNase抑制劑luL，42°Clh，85°C5min至4。C;以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的第一鏈cDNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系10PC反應(yīng)Xbuffer2.OuL，2.O腿ol/LdNTP2.OuL，5pmol/uLfl2.OuL，5pmol/uLrl2.OuL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物4.OuL，TaqDNA聚合酶0.5uL，d孤07.5uL，共20uL;PCR反應(yīng)條件為94。C預(yù)變性3min;94°C30S，50°C30S，72°C30S，30個(gè)循環(huán)；72°C延伸7min;用1.2%的瓊脂糖凝膠分離PCR產(chǎn)物，回收PCR產(chǎn)物，然后用EcoRI和BamHI雙酶切，再用連接酶與經(jīng)相同酶雙切的pBV220進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Eco7iDH5a感受態(tài)細(xì)胞，將經(jīng)過(guò)雙酶切鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒送Bioasia公司測(cè)序，結(jié)果(見(jiàn)圖2和圖3)得帶有目的基因hlL22的重組質(zhì)粒，將該質(zhì)粒標(biāo)記為pBV-IL22。(2)pBV-IL22在大腸桿菌中的表達(dá)將所構(gòu)建的質(zhì)粒pBV-IL22轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞JM109，從轉(zhuǎn)化平板上挑取單克隆菌落接種于3mlamplB培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基稱(chēng)取胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，用蒸餾水定容至1L)中，3(TC過(guò)夜活化。次日以3。/。比例將活化菌接種于3ml新鮮的amp「LB培養(yǎng)基中，在3(TC搖至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期至0D,m達(dá)0.5時(shí)，將菌直接轉(zhuǎn)入水浴搖床在42°C、200rpm條件下4h，再在4°C、12，000rpm條件下離心10min，收菌，將沉淀以質(zhì)量體積比1:10重懸于PB(100mmol/LNa2HP0,,100畫(huà)1/L脇P0.J中，以超聲波破碎菌體(6次，每次30s;+200W),分別收取上清及沉淀，進(jìn)行15%SDS-PAGE，結(jié)果(見(jiàn)圖4)表明hlL22在￡JM109中的表達(dá)。(3)rhIL-22的純化菌體破碎后的沉淀用10倍體積的2mol/L尿素洗滌，將洗滌好的包涵體溶于8mol/L尿素中，室溫放置8h，不斷攪拌，等包涵體充分溶解，然后在4。C、12000rpm條件下離心30min，分別收取上清和沉淀，選用S印hacryl-300(S-300)為填料，柱體積為3.6X100cm，對(duì)目的蛋白進(jìn)行分離純化。上樣前柱子用2倍體積的平衡液(8mol/L尿素、100mmol/LNa2HP(\100腿ol/LNaH2P04，50腿ol/LNaClPH7.4，10國(guó)/LDTT)平衡，上樣體積約為柱體積的2%，用洗脫液(50mmol/LNa2HP(\50醒ol/LNaH氛50國(guó)l/LNaCl)以0.5mL/min的流速洗脫樣品；采用15%SDS-PAGE分析各洗脫峰對(duì)應(yīng)的樣品純度，結(jié)果(見(jiàn)圖5)得到了純化的rhlL-22蛋白；(4)rhIL-22的復(fù)性向(3)中所得純化的rhIL-22蛋白加入復(fù)性緩沖液(50咖ol/LNa2HPC^,50mmol/LNaH2P04.0.l,ol/LGSSG，l腿ol/LGSH，0.1%PEG),控制蛋白濃度在0.15mg/ml，4'C下放置50小時(shí)并結(jié)合透析法逐步降低尿素濃度，最后以PEG6000緩慢濃縮得到rhIL-22蛋白質(zhì)。實(shí)施例2hlL22對(duì)L02細(xì)胞的促增殖活性試驗(yàn)用含10。/。胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液(購(gòu)于GibcoBRL公司)培養(yǎng)L02細(xì)胞至細(xì)胞至生長(zhǎng)狀態(tài)良好，收集細(xì)胞，以lXl(f個(gè)細(xì)胞/mL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，50ix1/孔；然后分別在每孔加入50ti1按倍比稀釋實(shí)施例1所得的hIL-22蛋白，終濃度分別為0.1、1、2.5、10、50、100、1000、2000、4000和8000ng/ml，同時(shí)設(shè)無(wú)細(xì)胞的空白對(duì)照和有細(xì)胞但不加因子的陰性對(duì)照，每個(gè)濃度做三個(gè)重復(fù)；在37。C，5。/。C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h后，每孔加入5mg/ml的MTT20^1;繼續(xù)培養(yǎng)5h，然后每孔加100ul10%SDS(溶于0.01NHC1中)，待紫色甲肷結(jié)晶溶解后，測(cè)定570咖的吸光值。采用Bradford法測(cè)得復(fù)性并濃縮后的hIL-22濃度為lmg/mL，應(yīng)用MTT法檢測(cè)重組蛋白質(zhì)對(duì)L02細(xì)胞的增殖活性的促進(jìn)。結(jié)果(見(jiàn)圖7)與陰性對(duì)照相比，加入重組蛋白質(zhì)h工L-22后，L02細(xì)胞的增殖有明顯變化；隨著重組蛋白質(zhì)濃度的增加，hIL-22促L02細(xì)胞的增殖活性明顯加強(qiáng)，在lyg/mL時(shí)，重組蛋白質(zhì)hIL-22促L02細(xì)胞的增殖活性最高，之后活性開(kāi)始下降，至4ug/mL后，L02細(xì)胞的增殖出現(xiàn)平臺(tái)效應(yīng)。將所測(cè)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組不同濃度的重組蛋白質(zhì)刺激L02細(xì)胞后570nm的吸光值與陰性對(duì)照有顯著性差異(P〈0.01)，說(shuō)明hIL-22促進(jìn)了L02細(xì)胞的增殖活性。實(shí)施例3hlL22對(duì)L02細(xì)胞c-myc表達(dá)水平的影響試驗(yàn)L02細(xì)胞在60mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)2h，然后分組依次加入不同濃度的實(shí)施例1所制備的重組IL-22蛋白質(zhì)溶液，使各種蛋白的終濃度分別為20、200、400、800ng/mL，在37。C、5%(:02培養(yǎng)2h，提取RNA后并定量進(jìn)行RT-PCR。結(jié)果(見(jiàn)圖8)顯示經(jīng)外源hIL-22刺激后，c-myc基因的表達(dá)水平從20800ng/mL逐漸升高，與hIL-22的濃度呈依賴(lài)關(guān)系，說(shuō)明hlL22可以提高L02細(xì)胞c-myc的表達(dá)水平。實(shí)施例4hlL-22對(duì)L02細(xì)胞bcl-2表達(dá)水平的影響試驗(yàn)以不同濃度的實(shí)施例1所得的hIL-22重組蛋白質(zhì)溶液作用L02細(xì)胞后，使各種蛋白的終濃度分別為20、200、400、800ng/mL，提取RNA后并定量進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以特異的bcl-2引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，可見(jiàn)bcl-2和hGAPDH特異的目的帶大小分別與預(yù)期的435bp和445bp基本相符，經(jīng)外源hIL-22刺激后，結(jié)果顯示(見(jiàn)圖9)bcl-2基因的表達(dá)水平從20800ng/mL逐漸升高，與hIL-22的濃度呈依賴(lài)關(guān)系，說(shuō)明hIL-22促進(jìn)了L02細(xì)胞bcl_2表達(dá)。實(shí)施例5hIL22對(duì)酒精性肝病的作用效果試驗(yàn)(1)建立酒精性肝病模型選取200250g的雄性Wistar大鼠60只(購(gòu)于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，正常組10只，模型組50只，模型組喂以高脂飼料，同時(shí)灌以56°紅星二鍋頭(購(gòu)于北京紅星股份有限公司)，劑量為14周16ml/kg.d，每天兩次灌予58周24ml/kg.d，每天兩次灌予912周32ml/kg.d，每天兩次灌予高脂飼料組成為基礎(chǔ)詞料+10%豬大油+5。％玉米油+1%膽固醇；正常組喂以全價(jià)營(yíng)養(yǎng)顆粒飼料，同時(shí)灌以與模型組等劑量的生理鹽水；(2)12周末時(shí)將模型組分為實(shí)驗(yàn)組、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，繼續(xù)喂以高脂飲食，實(shí)驗(yàn)組通過(guò)尾靜脈注射hIL22重組蛋白，劑量為0.25ug/g.d，持續(xù)注射14天，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組通過(guò)尾靜脈注射相同劑量的生理鹽水，14天后5%的戊巴比妥鈉溶液麻醉，下腔靜脈取血化驗(yàn)相關(guān)指標(biāo)，分離肝臟，稱(chēng)重，計(jì)算肝指數(shù)(肝臟質(zhì)量/體重)的變化，取肝組織，10%甲醛固定，石蠟切片，HE染色，對(duì)其病理積分進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果(見(jiàn)表l)顯示IL22可以明顯降低血清轉(zhuǎn)氨酶的升高，有效緩解酒精性肝病的病理變化。實(shí)施例6hlL22對(duì)非酒精性脂肪性肝病的作用效果試驗(yàn)(1)非酒精性脂肪性肝病模型的建立將剛斷乳的SD大鼠30只(購(gòu)于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)分為空白組，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組，空白組喂以全價(jià)營(yíng)養(yǎng)顆粒詞料，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組喂以高脂飼料，高脂詞料的組成成分為70%基礎(chǔ)詞料+20%豬大油+2%膽固醇+1%膽汁鹽+7%蛋黃粉，建模周期為12周；(2)12周末時(shí)，對(duì)實(shí)驗(yàn)組及其空白組喂以高脂詞料，同時(shí)實(shí)驗(yàn)組注射重組hlL22蛋白(0.25ug/g.d)，對(duì)照組注以相同劑量的生理鹽水；治療周期為14天，4天后用5%的戊巴比妥鈉溶液麻醉，下腔靜脈取血化驗(yàn)相關(guān)指標(biāo)，分離肝臟，稱(chēng)重，計(jì)算肝指數(shù)(肝臟質(zhì)量/體重)的變化，取肝組織，10%甲醛固定，石蠟切片，HE染色，對(duì)其病理積分進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果(見(jiàn)表2，圖IO)顯示hlL22可以明顯降低血清酶學(xué)及血脂的升高，改善肝功，減輕非酒精性脂肪性肝病的病理積分。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>權(quán)利要求1、白介素-22在制備治療肝病藥物中的應(yīng)用；2、按照權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的白介素一22是指人白介素一22、重組人白介素一22、鼠白介素一22或重組鼠白介素一22等之一種。3、按照權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的肝病是指酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、病毒性肝炎、急性肝衰竭、肝纖維化、肝臟缺血再灌注損傷、肝臟移植后衰竭等肝病之一種。4、按照權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的肝病是指酒精性肝病或非酒精性脂肪性肝病。5、按照權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述的肝病是指酒精性肝病。6、按照權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述的肝病是指非酒精性脂肪性肝病。7、權(quán)利要求2所述的重組人白介素一22蛋白的制備方法，包括如下步驟(1)利用人新鮮外周血液，培養(yǎng)人外周血淋巴細(xì)胞，提取總RNA;(2)以總RNA為模板，以fl和rl為引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，得hlL22的cDNA序列;所述的引物fl和rl的序列如下fl:5'GAGAATTCATATGGCACCCATCAGCTCCCA3';rl:5'ACGGATCCTCAAATGCAGGCATTTCT3'然后再以所得的cDNA為模板，以fl和rl為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得hlL22的DNA序列；(3)用fcoRI和分別將步驟(2)所得hlL22的DNA序列和質(zhì)粒pBV220酶切；然后將兩者混合，用T4連接酶將兩者連接，然后將連接產(chǎn)物用電轉(zhuǎn)化或CaCL轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，篩選鑒定，得重組質(zhì)粒pBV220/hlL22;(4)用電轉(zhuǎn)化或CaCL法將重組質(zhì)粒pBV220/hlL22轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；再接種于LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)，然后離心、重懸沉淀物，利用超聲波破碎菌體，接著將所得包涵體變性、溶解、純化、復(fù)性、濃縮，即得本發(fā)明重組人白介素22蛋白。8、按照權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于其詳細(xì)的操作步驟為(1)將人新鮮外周血液用含2mmol/LEDTA的PBS溶液稀釋2倍，然后鋪于等體積淋巴細(xì)胞分離液上；再在7001000rpm下離心，然后用毛細(xì)玻璃管吸出灰白層細(xì)胞，用Hanks液洗滌灰白層細(xì)胞23次，再將灰白層細(xì)胞懸浮在1640培育基中，并在37。C、5。/。C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24hr，而后加入ConA和anti-CD:,共剌激細(xì)胞，再在37。C，5。/。C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h，用總RNA提取試劑盒提取總RNA;(2)以總RNA為模板，以fl和rl為引物f1:5'GAGAATTCATATGGCACCCATCAGCTCCCA3'rl:5'ACGGATCCTCAAATGCAGGCATTTCT3'進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增得到人白介素一22的cDNA序列；所述RT-PCR反應(yīng)體系的各部分比例為總RNA，5ul;RNase抑制劑；0.5ul;Oligo(dT)，0.5ul;DEPC處理水，6.5ul;總計(jì)12ul;70°C5min至4。C;RT:在上述體系加入5Xbuffer4ul，2.5mMdNTP2ul,AMVlul，RNase抑制劑lul，42°Clh，85°C5min至4。C;然后以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的第一鏈cDNA為模板，以fl，rl為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，所述的PCR反應(yīng)體系的各部分比例為IOPCR反應(yīng)Xbuffer2.0ul，2.Ommol/LdNTP2.0ul，5pmol/ulfl2.Oul，5pmol/ulrl2.0ul，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物4.Oul，TaqDNA聚合酶0.5ul，ddH207.5ul，共20ul;所述的PCR反應(yīng)條件為94。C預(yù)變性3min，94°C30S，50°C30S，72°C30S，30個(gè)循環(huán)；72°C延伸7min;用1.2%的瓊脂糖凝膠分離PCR產(chǎn)物；(3)分別向RT-PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒pBV220加入限制性?xún)?nèi)切酶fcoRI和勘MH，在37"水浴中酶切3.5h，然后將兩者按104:1比例混合，加入T4連接酶，于16'C進(jìn)行連接反應(yīng)12h，利用電轉(zhuǎn)化或CaCl2法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，利用氨芐青霉素抗性篩選重組克隆，提取相應(yīng)質(zhì)粒、酶切鑒定、測(cè)序，得重組質(zhì)粒pBV220/hlL22;(4)用電轉(zhuǎn)化或CaCl2法將重組質(zhì)粒pBV220/hlL22轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中；轉(zhuǎn)化菌落3(TC過(guò)夜，次日按照12。/。體積百分比接種于LB培養(yǎng)基，在3(TC培養(yǎng)23hr，然后置于42。C水浴搖床、180220rpm條件下培養(yǎng)48hr;再在4°C、10，00012，000rpm條件下離心1015min，去上清，按照質(zhì)量體積比1:810的比例將沉淀重懸于PB溶液中，再以超聲波破碎菌體，用2mol/L尿素將超聲波處理后得到的包涵體洗滌24次，然后將包涵體加入到8inol/L尿素中，得溶解的包涵體溶液，以S印hacryl-200(S-200)為柱填料，對(duì)溶解上清進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析，再將所得純化樣品置于復(fù)性緩沖液中4t:進(jìn)行復(fù)性反應(yīng)72hr，最后用PEG6000緩慢濃縮得到人白介素一22蛋白。9、按照權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于所述的宿主細(xì)胞為￡DH5a、HB101或JM109。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了白介素-22在制備治療肝病藥物中的用途，尤其是在制備治療酒精性肝病和非酒精性脂肪性肝病藥物上的應(yīng)用，擴(kuò)大了白介素-22的應(yīng)用范圍，為肝病患者帶來(lái)福音；本發(fā)明還公開(kāi)了人重組白介素-22的制備方法，用該方法生產(chǎn)人重組白介素-22，表達(dá)量高、生產(chǎn)成本低，為大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用白介素-22提供了基礎(chǔ)。文檔編號(hào)A61K38/20GK101168049SQ200710176219公開(kāi)日2008年4月30日申請(qǐng)日期2007年10月23日優(yōu)先權(quán)日2007年10月23日發(fā)明者深劉,吳伯靈,濤徐,徐東剛,旗楊,王園園,欣蔡,邢微微,鄒民吉申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所;北京益芝堂現(xiàn)代制藥有限公司