專(zhuān)利名稱(chēng)：用于藥物誘導(dǎo)型腎病和肝病的預(yù)防或治療組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于緩解藥物誘導(dǎo)型腎病和肝病的藥物。
背景技術(shù)：
治療和/或診斷性藥物的應(yīng)用逐年增大，所用藥物多種多樣。這些藥物可為我們帶來(lái)顯著的好處，但也可實(shí)質(zhì)性導(dǎo)致?lián)p害效應(yīng)，尤其是對(duì)腎臟，這是因?yàn)樗鼈兊娜缦滤龅木唧w作用。
腎臟在總體重中占不到1％。從生理學(xué)的角度看，心臟輸出血流總量的25％進(jìn)入腎臟，每天有150升原尿(為總血漿量的50倍之多)經(jīng)腎小球過(guò)濾；再經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能多相性不相同的腎細(xì)管再吸收，分泌和代謝便產(chǎn)生最終的尿。這樣一來(lái)，血中藥物及其代謝物不斷地循環(huán)，而這些物質(zhì)在腎臟濃縮和代謝。因此，各種高度濃縮的代謝物包括未代謝的藥物分散在腎臟中。腎臟可能經(jīng)常性地高強(qiáng)度地接觸藥物。四類(lèi)藥物可能誘導(dǎo)腎病抗微生物試劑，非類(lèi)固醇劑，造影劑，和抗腫瘤制劑。
肝臟也易受藥物損傷。藥物誘導(dǎo)型肝病根據(jù)其發(fā)病機(jī)制分為由藥物或其中間代謝產(chǎn)物直接攻擊肝臟引起的中毒性肝病，以及由變態(tài)反應(yīng)，涉及T細(xì)胞的IV型遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)引起的變態(tài)反應(yīng)性肝病。藥物誘導(dǎo)型肝炎最常見(jiàn)的致病因素有抗生素，其次有用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥物，用于循環(huán)器官的藥物，抗腫瘤制劑、激素、診斷試劑，等等。
已嘗試用γ-球蛋白，細(xì)胞色素C，腺嘌呤，SH化合物，B族維生素等緩解藥物誘導(dǎo)型疾病，但它們均非足夠有效。很重要的是臨床治愈藥物誘導(dǎo)型疾病(副作用)，因?yàn)橹委煹闹袛嗪筒∪说纳钯|(zhì)量(Q.O.L)的重要性。
發(fā)明詳述本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是能有效緩解或抑制由各種藥物，尤其是抗腫瘤制劑誘導(dǎo)的疾病的藥物。
發(fā)明人將注意力集中于以下事實(shí)midkine(MK)家族的蛋白質(zhì)如midkine(MK)和pleiotrophin(PTN)是一類(lèi)具有多種功能的生長(zhǎng)和分化因子。其功能有1)延伸軸突，2)活化纖溶系統(tǒng)，3)強(qiáng)烈表達(dá)于人體癌癥區(qū)，及4)創(chuàng)傷的冶愈。關(guān)于這類(lèi)蛋白質(zhì)進(jìn)行了很多研究，目的是尋找新的藥效。
Midkine是作為一種基因產(chǎn)物被發(fā)現(xiàn)的，該基因在小鼠胚胎腫瘤細(xì)胞的分化早期受視黃酸誘導(dǎo)而表達(dá)(Kadomatsu，K.等，生物化學(xué)與生物物理學(xué)研究通訊，1511312-1318，1988)。Pleiotrophin發(fā)現(xiàn)于一只新生大鼠的腦內(nèi)，是有軸突延伸能力的肝素結(jié)合蛋白(Rauvala，H.，EMBO J.，82933-2941，1989)。Midkine和Pleiotrophin構(gòu)成了一類(lèi)新的肝素結(jié)合蛋白類(lèi)的生長(zhǎng)分化因子。它們之間有45％同源性并總稱(chēng)MK家族(Muramatsu，T.，國(guó)際發(fā)育生物學(xué)雜志，37183-188，1993；Muramatsu，T.，生長(zhǎng)與分化進(jìn)展，36(1)1-8，1994)。Midkine和Pleiotrophin分別在發(fā)育進(jìn)程中有其特殊的表達(dá)模式，并且預(yù)計(jì)涉及分化過(guò)程中重要的生理性活化作用。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，MK體外抑制抗腫瘤制劑所致細(xì)胞死亡，而MK基因緩解抗腫瘤制劑誘導(dǎo)的疾病，而這些發(fā)現(xiàn)均源于一個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)中對(duì)MK基因功能受破壞的基因敲除小鼠施用抗腫瘤制劑。發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)對(duì)野生型小鼠施用MK或PTN可緩解抗腫瘤制劑所致疾病，從而完成本發(fā)明。本發(fā)明包括權(quán)利要求書(shū)中所述的每項(xiàng)發(fā)明。
在本發(fā)明中，基因敲除小鼠提供機(jī)會(huì)便于調(diào)查MK基因在活體內(nèi)如何對(duì)抗藥物所致疾病，還便于分析每只基因敲除小鼠如何對(duì)被迫接受不同水平的MK給藥進(jìn)行應(yīng)答。MK的詳細(xì)功能和機(jī)制目前尚不清楚。如果MK的功能是細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子功能級(jí)聯(lián)啟動(dòng)蛋白，則大概只需極少量的MK，而且基因敲除小鼠的應(yīng)用將變得更為重要。最近發(fā)現(xiàn)一種以高親和力特異性結(jié)合MK的細(xì)胞表面受體(分子量250+kDa)。其特點(diǎn)暗示腫瘤細(xì)胞增殖中由MK所刺激的自分泌可由該受體介導(dǎo)，并可活化JAK/STAT途徑(Edward，A.R.等，生物化學(xué)雜志，2733654-3660，1998)。
為弄清MK與個(gè)體發(fā)育的關(guān)系，制備了純合型MK基因敲除小鼠，其中外顯子2和外顯子3部分被破壞，如

圖1所示(生物化學(xué)7，Heisei 8卷68，1239頁(yè)，4-p-1244)。這些基因敲除小鼠在胚胎期并未死亡，體重明顯低于雜合型或野生型(生物化學(xué)7，卷68，1239頁(yè)，4-p-1244，1996)。
抗腫瘤試劑被施予這些基因敲除小鼠(簡(jiǎn)稱(chēng)基因敲除小鼠)和野生型小鼠。給藥后比較每只小鼠的存活率，血尿素氮(BUN)水平，肌酸酐水平作為這些疾病指標(biāo)，以便監(jiān)控MK基因活體內(nèi)緩解抗腫瘤制劑所致疾病的能力。BUN和肌酸酐水平可應(yīng)用作為腎功能障礙的指標(biāo)，因?yàn)橛捎谀I排泄能力降低將使尿素積累于血液。
在本發(fā)明中，對(duì)基因敲除小鼠和野生型小鼠施用順鉑，再比較BUN水平和存活率。基因敲除小鼠的BUN水平顯著高于野生型小鼠的?；蚯贸∈蟮拇婊盥室裁黠@區(qū)別于野生型小鼠的?；蚯贸∈蟮乃劳雎式刂沟浇o藥后第7天上升。被迫接受MK的基因敲除小鼠中異常BUN水平的發(fā)生率截止到給藥后第3天明顯低于給予生理鹽水的小鼠組。用人嬰兒腎癌細(xì)胞系進(jìn)行一項(xiàng)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)MK抑制由順鉑引起的腎細(xì)胞障礙的效應(yīng)。應(yīng)用野生型小鼠的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)揭示MK緩解了由四氯化碳引起的急性肝病，而PTN和MK均能有效抑制順鉑引起的腎病。
這些結(jié)果說(shuō)明本發(fā)明的MK家族的蛋白質(zhì)可有效緩解或抑制藥物誘導(dǎo)型腎病和肝病。
用作本發(fā)明之藥物組合物的有效成分的MK蛋白(簡(jiǎn)稱(chēng)MK)述于以下參考文獻(xiàn)(人MK基因，未審查已公布的日本專(zhuān)利申請(qǐng)(JP-A)號(hào)Hei 5-91880；人MK基因和蛋白的序列，JP-A號(hào)Hei 6-217778；MK蛋白，JP-A號(hào)Hei5-229957；Muramatsu，T.，生長(zhǎng)與分化進(jìn)展，36(1)，1-8，1994)。用作本發(fā)明之藥物組合物的有效成分的PTN蛋白述于以下文獻(xiàn)(Muramatsu，T.，生長(zhǎng)與分化進(jìn)展，36(1)，1-8，1994；Andreas，K等，腫瘤發(fā)生的主要綜述，6(2)151-177，1995)。屬于MK家族并用作本發(fā)明之藥物組合物的有效成分的蛋白質(zhì)包括來(lái)自人，小鼠或其它動(dòng)物的天然蛋白，或經(jīng)化學(xué)合成或遺傳工程制成的人工蛋白。本發(fā)明的MK家族蛋白質(zhì)還包括不引起任何上述生物學(xué)活性改變并與天然蛋白有氨基酸的數(shù)量或序列差異的蛋白，本發(fā)明具體包括這樣的蛋白，它對(duì)應(yīng)于天然蛋白，但其中天然蛋白的氨基酸序列部分缺失或被其它氨基酸取代，或插入或增加了不同長(zhǎng)度的其它氨基酸或多肽。被取代或插入的氨基酸不限于天然型的。
可用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)(Studier，F(xiàn).W&Moffatt，B.A.，分子生物學(xué)雜志189113-130，1989；Studier，F(xiàn).W.等，酶學(xué)方法18560-89，1990)或桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(O′Reilly，D.R.等，桿狀病毒表達(dá)載體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，牛津大學(xué)出版社，1992，Ausubel，F(xiàn).M.等編輯，分子生物學(xué)最新實(shí)驗(yàn)程序，16.11單元，WileyIntescience，1994)經(jīng)遺傳工程技術(shù)獲得作為本發(fā)明有效成分的MK家族蛋白。發(fā)明人用甲醇依賴(lài)型巴斯德畢赤氏酵母(Pichia Pastons)的表達(dá)系統(tǒng)獲得MK蛋白(參見(jiàn)JP-A號(hào)Hei 7-255354)。
本發(fā)明的藥物組合物包含有效量的MK家族的蛋白，以防或治藥物引起的腎病或肝病。本發(fā)明的有效成分可制成所需劑型，只需將之混合于常用的可藥用載體，賦形劑，稀釋劑，防腐劑，穩(wěn)定劑，緩沖液等等。
本發(fā)明的藥學(xué)組合物可口服或非經(jīng)腸給藥?？诜膭┬桶ㄆ瑒?，粒劑和膠囊。非經(jīng)腸給藥的劑型包括注射液，栓劑或透皮劑，給藥途徑有靜脈內(nèi)，皮下，肌肉內(nèi)或腹膜內(nèi)。
生理活性肽如MK或PTN若口服一般在消化道內(nèi)被蛋白酶迅速降解。為在體內(nèi)穩(wěn)定MK或PTN，可結(jié)合水溶性大分子(如聚乙二醇(PEG)或聚乙烯吡咯烷酮(PVP))而制成雜交MK或雜交PTN。IL-6，TNF-α等的雜交構(gòu)建已有人嘗試，經(jīng)選擇最適雜交條件可增強(qiáng)功能(Tsutsumi，Y.等，英國(guó)癌癥雜志741090-1095；Tsutsumi，Y.等，Thoromb Haemostasis，77168-173，1997；Tsutsumi，Y.等，J Control Release，33447-451，1995)。
作為本發(fā)明之藥物組合物有效成分的MK家族的蛋白質(zhì)根據(jù)用于防或治藥物所致腎病或肝病時(shí)致病藥物的劑量，腎病或肝病的嚴(yán)重程度，病人的年齡、性別和體重而有變化。本發(fā)明的蛋白每天可給予一次或多次，劑量為每kg體重1μg-100mg。
圖的簡(jiǎn)述圖1顯示基因敲除小鼠的突變?nèi)旧w，其中129/sv小鼠的MK基因的外顯子2和3的部分被破壞。
圖2顯示129/Sv MK基因敲除小鼠及野生鼠在給予順鉑之后的存活率。
圖3顯示129/Sv MK基因敲除小鼠及野生鼠在給藥順鉑的當(dāng)天，第3天和第5天的血尿素氮水平。
圖4顯示129/Sv MK基因敲除小鼠在給予了14mg/kg順鉑并腹膜內(nèi)埋植了已吸收有MK或生理鹽水的緩釋膠囊后，在給藥的當(dāng)天，第3和第5天異常血尿素氮的發(fā)生率。
圖5顯示有四氯化碳所致急性肝病的小鼠在施用了不同濃度的MK或生理鹽水后的血清GOT(谷草轉(zhuǎn)氨酶)。
圖6顯示相同于圖5的小鼠的血清GTP(谷丙轉(zhuǎn)氨酶)。
圖7顯示2×104細(xì)胞/孔的G401細(xì)胞在單獨(dú)的培養(yǎng)基，加有2μg/ml MK的培養(yǎng)基，或加有10μg/ml MK的培養(yǎng)基，及培養(yǎng)過(guò)程中用briplatin(順鉑)處理的細(xì)胞存活率。
圖8顯示G401細(xì)胞(6×104細(xì)胞/孔)經(jīng)圖7中同樣的處理后的細(xì)胞存活率。
圖9顯示小鼠在施用PTN或生理鹽水期間，給藥briplatin(順鉑)之前和之后的BUN水平。
圖10顯示圖9小鼠的血清肌酸酐水平。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的最佳方式本發(fā)明參照以下實(shí)施例詳細(xì)舉例說(shuō)明，但不限于此。實(shí)施例1MK體內(nèi)緩解腎病的效應(yīng)使用129/Sv基因敲除小鼠，其MK基因的外顯子2和3的部分被破壞，如圖1所示(生物化學(xué)7，卷68，1239頁(yè)，4-p-1244，1996，Nakamura，E.等，Genes to Cells 3，811-822，1998)。圖2顯示了129/Sv MK基因敲除小鼠及野生型小鼠腹膜內(nèi)接受14mg/kg順鉑(產(chǎn)品名，briplatin，BristolMyers Squibb公司)后的存活率。圖3顯示給予順鉑后當(dāng)天，第3天和第5天的BUN水平。選擇順鉑是因?yàn)樗亲羁?，最有效，且最常?jiàn)的抗實(shí)體瘤抗腫瘤制劑。而且，順鉑的副作用是腎病如急性腎衰而MK只表達(dá)于成年小鼠的腎臟中。
Student t檢驗(yàn)揭示基因敲除小鼠的BUN水平顯著高于野生型小鼠，如圖3所示。
圖4顯示給予14mg/kg順鉑的當(dāng)天，第3天和第5天小鼠的異常血尿素氮發(fā)生率；207mg含MK的緩釋膠囊被腹膜內(nèi)植入MK給藥組的七只小鼠，207mg含生理鹽水的緩釋膠囊被腹膜內(nèi)植入生理鹽水給藥組的七只小鼠。異常率說(shuō)明當(dāng)50 BUN或更多作為異常水平時(shí)的BUN異常發(fā)生率。實(shí)施例2MK緩解肝病的效應(yīng)制備由四氯化碳引起急性肝病的野生型鼠。然后監(jiān)測(cè)施用MK對(duì)緩解急性肝病的效應(yīng)。每個(gè)處理用5只小鼠。一旦用食物油“中等鏈長(zhǎng)的甘油三酯Panasate 800”(NOF公司)稀釋至10％的四氯化碳對(duì)小鼠施用，小鼠被禁食。生埋鹽水，0.017mg MK或1.7mg MK(JP-A號(hào)Hei 9-95454)分別在第一次給藥的24小時(shí)后和32小時(shí)后腹膜內(nèi)施用。16小時(shí)后收集血液，測(cè)量血清GOT(谷草轉(zhuǎn)氨酶)和GPT(谷丙轉(zhuǎn)氨酶)(圖5和6)。
Student t檢驗(yàn)揭示生理鹽水組的GOT與MK(1.7mg)給藥組的GOT并無(wú)顯著性差異，如圖5和6所示。相比之下，組間GPT有5％風(fēng)險(xiǎn)水平的顯著性差異。因此可確定MK顯著緩解了四氯化碳所引發(fā)的急性肝病。實(shí)施例3MK緩解腎病的效應(yīng)人嬰兒腎癌(Wilms腫瘤)源的G401細(xì)胞被用于檢驗(yàn)抗腫瘤制劑順鉑對(duì)腎臟的副作用。
人嬰兒腎癌(Wilms腫瘤)源的G401細(xì)胞用10％FBS/DME培養(yǎng)基調(diào)成1×105細(xì)胞/ml或3×105細(xì)胞/ml。在96孔板(COSTAR3596)上每孔接種2×104細(xì)胞或6×104細(xì)胞，37℃5％CO2氣氛中溫育過(guò)夜。
然后，將細(xì)胞溫育在含或不含(對(duì)照)2μg/ml或10μg/ml MK的0.1％FBS/DME培養(yǎng)基中6小時(shí)。第二次接種后，將細(xì)胞于含10μM順鉑(商品名，briplatin，Bristol Myers Squibb公司)的培養(yǎng)基中溫育2小時(shí)。
溫育后將培養(yǎng)基洗四次，再繼續(xù)將細(xì)胞溫育于含2μg/ml或10μg/ml MK的培養(yǎng)基(同上)中。
同Premix WST-1細(xì)胞增殖試驗(yàn)系統(tǒng)(Takara)測(cè)量活細(xì)胞的增殖活性以評(píng)估MK緩解腎病的效應(yīng)。通過(guò)反映為吸收值(450nm，對(duì)照650nm)的線(xiàn)粒體胞內(nèi)分裂和增殖分析增殖活性，就象MTT試驗(yàn)的方式一樣。
具體地細(xì)胞用順鉑處理。處理后第二，三，四天每孔再加入多達(dá)培養(yǎng)液的1/10的Premix WST-1試劑，然后溫育細(xì)胞4小時(shí)。用Plate Reader(BIO-RAD；3550型)測(cè)量每孔的吸收值(圖7和8)。圖7和8說(shuō)明2-10μg/ml MK使順鉑(抗腫瘤制劑)引起的G401細(xì)胞死亡數(shù)顯著降低了近2倍。實(shí)施例4PTN緩解藥物誘導(dǎo)型腎病的效應(yīng)ICR小鼠(雄性，8-10周齡)分成兩組；一為生理鹽水給藥組，另一為PTN給藥組(每組11只小鼠)。PTN和生理鹽水的劑量為每組500μg/kg(Merenmies，J.和H.Rauvala生理化學(xué)雜志，26516721-16724，1990)。用Briplatin(BristolMyers Squibb公司)作為順鉑。
連續(xù)三天對(duì)上述兩組的每只小鼠腹膜內(nèi)施用PTN或生理鹽水。第4天，每組收集3只小鼠的全血，制備血清作為briplatin用藥前的血清樣本。
同一天(第4天)下午，對(duì)剩下的每只小鼠腹膜內(nèi)給予15mg/kg briplatin。連續(xù)每天對(duì)所剩每只小鼠給予PTN或生理鹽水直至第七天。在第六和第八天，收集小鼠全血，制成血清，作為briplatin給藥后第2和第4天的血清樣本。
血尿素氮(BUN)是腎功能的代表性標(biāo)志物。用Iatro-chrom UN(IATRONLABORATORIES，公司)和肌酸酐-檢驗(yàn)Wako(Wako Pure化學(xué)工業(yè)公司)分別測(cè)量每份樣本的BUN(圖9)和血清肌酸酐(圖10)。圖9和10顯示生理鹽水給藥組的BUN和肌酸酐傾向于高過(guò)PTN給藥組的。這些結(jié)果說(shuō)明PTN和MK均能緩解藥物誘導(dǎo)型腎病。
工業(yè)化適用性本發(fā)明證實(shí)MK家族的蛋白質(zhì)可有效緩解藥物誘導(dǎo)型腎病和肝病。因此，包含MK家族的蛋白質(zhì)作為有效成分的本發(fā)明之藥物組合物可用于緩解由藥物，尤其是抗腫瘤制劑誘導(dǎo)的腎病和肝病。
權(quán)利要求
1.一種用于治療或預(yù)防藥物誘導(dǎo)型腎病或肝病的藥物組合物，含MK家族的蛋白質(zhì)作為有效成分。
2.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中該組合物治療或預(yù)防因給藥抗腫瘤制劑而引起的藥物誘導(dǎo)型腎病。
3.權(quán)利要求2的藥物組合物，其中該抗腫瘤制劑是順鉑。
4.應(yīng)用MK家族的蛋白質(zhì)制備治療或預(yù)防藥物誘導(dǎo)型腎病或肝病的藥物組合物的用途。
5.權(quán)利要求4的MK家族的蛋白質(zhì)的用途，其中該藥物誘導(dǎo)型腎病由抗腫瘤制劑引起。
6.權(quán)利要求4的MK家族的蛋白質(zhì)的用途，其中該抗腫瘤制劑為順鉑。
7.一種緩解藥物誘導(dǎo)型腎病或肝病的方法，包括施用MK家族的蛋白質(zhì)。
8.權(quán)利要求7的緩解藥物誘導(dǎo)型腎病或肝病的方法，其中該藥物誘導(dǎo)型腎病由施用抗腫瘤制劑所致。
9.權(quán)利要求7的緩解藥物誘導(dǎo)型腎病或肝病的方法，其中該抗腫瘤制劑是順鉑。
全文摘要
本發(fā)明提供緩解藥物誘導(dǎo)型腎病和急性肝炎的一種新藥,包括midkine(MK)家族的蛋白質(zhì)如pleiotrophin(PTN)。這些MK家族的蛋白質(zhì)可抑制抗腫瘤制劑如順鉑誘導(dǎo)的腎病和四氯化碳引起的急性肝炎,從而有效緩解藥物誘導(dǎo)型腎病或肝炎。
文檔編號(hào)A61K38/18GK1255856SQ98805018
公開(kāi)日2000年6月7日 申請(qǐng)日期1998年3月12日 優(yōu)先權(quán)日1997年3月12日
發(fā)明者村松喬, 門(mén)松健治, 小田宗宏, 池松真也, 佐久間貞俊 申請(qǐng)人:明治乳業(yè)株式會(huì)社, 村松喬