專利名稱：：七葉樹總皂苷制備方法及其抗肥胖作用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明公開一種七葉樹總皂苷的制備方法及在預(yù)防和治療肥胖的醫(yī)藥品和保健食品中的應(yīng)用，屬于中藥有效成分提取
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：《本草綱目拾遺》記載；"娑羅樹出西番海中...秋后結(jié)實如栗可食，正所謂七葉樹也"。本發(fā)明所述的七葉樹種子為七葉樹科植物日本七葉樹"escw/"s7^W"a/aBlume.)的干燥成熟種子。本發(fā)明所涉及的七葉樹種子總皂苷藥效，目前臨床上主要用于腦水腫、創(chuàng)傷性肢體腫脹、靜脈炎等疾病的輔助治療。七葉皂苷藥理作用可靠，臨床用途廣泛，不良反應(yīng)少，尤其在抗?jié)B出、消腫脹、對機體保護作用等方面發(fā)揮著重要作用。此外，該藥在治療腰椎間盤突出癥、流行性乙型腦炎、視網(wǎng)膜炎、腎病綜合征、腹瀉、周圍神經(jīng)性疾病等方面也有研究報道。但是經(jīng)檢索未見有七葉皂苷抗肥胖作用的報道。目前，世界肥胖人口日益增加，肥胖對人們的健康影響十分嚴(yán)重，容易引發(fā)高脂血癥、動脈粥樣硬化、冠心病、高血壓、糖尿病等一系列疾病。本發(fā)明所述七葉皂苷的抗肥胖作用對開發(fā)抗肥胖藥物及保健食品具有十分現(xiàn)實的意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了日本七葉樹種子總皂苷提取物的制備方法，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明公開了日本七葉樹總皂苷提取物預(yù)防及治療肥胖的用途。本發(fā)明中日本七葉樹種子提取物的提取方法包括以下步驟干燥的日本七葉樹種子粗粉5kg用80%乙醇20L浸泡過夜，超聲波室溫條件下提取30min,過濾，重復(fù)三次，合并濾液，減壓濃縮，得到80%乙醇提取物，水溶，過大孔樹脂D101柱，依次用水、80%乙醇洗脫。乙醇溶液減壓濃縮，真空干燥，得七葉總皂苷400g。七葉總皂苷用ZorbaxColumnsCis高效液相色譜儀半制備柱經(jīng)制備、分離、純化得化合物1和2，經(jīng)鑒定分別為化合物七葉皂苷Ib、七葉皂苷IIa。實驗例l胰脂肪酶活性的測定I實驗材料與方法U材料[3H]三油酸甘油酯購于日本東京Amersham公司；胰脂肪酶購自Sigma公司。七葉樹總皂苷由本室提供。1.2實驗方法從三油酸甘油酯釋放油酸的量來判定酶的活性。90nmol/L三油酸甘油酯，12.6umol/L卵磷脂，9.45umol/L牛磺膽酸置于9mL的0.1mol/LN-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙磺酸(TES)，pH7.0,含有0.1mol/LNaCl,超聲波處理5min。測定溶液總體積200uL含有下列物質(zhì)50liL七葉總皂苷，50uL胰脂肪酶，0.5umol/L三油酸甘油酯，0.053umol/L牛磺酸，0.07nmol/L卵磷脂,20umol/LTES，20umol/LNaCl，于37°C,pH7.0的條件孵化30min。釋放油酸的測定按BelfmgeW的方法進行測定。2數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)處理所有數(shù)據(jù)以X士S^來表示。用t檢驗進行顯著性檢驗。3結(jié)果七葉皂苷對胰脂肪酶的作用顯著，隨著劑量的增加對胰脂肪酶的抑制作用越顯著，在2.0g丄—'其活性只有2.3%(見表1-1、附圖1、附圖3)表1-1七葉皂苷對胰脂肪酶的作用<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>七葉皂苷在體外對胰脂肪酶活性有非常顯著的抑制作用，在2.0g丄—'時胰脂肪酶活性只有2.3%。實驗例2小鼠排泄物中三酰甘油含量的測定1實驗材料與方法1.1材料實驗動物，3周齡的ICR系雌性小鼠購自于大販CLEA公司，購買后置于室溫25土rC，相對濕度60%的室內(nèi)并且明暗12h循環(huán)適應(yīng)1周，供試驗。預(yù)備飼養(yǎng)期間，自由采食和飲水。七葉樹總皂苷由本室提供。1.2實驗方法將ICR系雌性小鼠分成5組，每組12只，分別食普通飼料、高脂肪詞料、高脂肪飼料+0.35%七葉總皂苷、高脂肪飼料+1%七葉總皂苷、高脂肪飼料+2%七葉總皂苷。3天后測定小鼠排泄物中三酰甘油含量，用和光三酰甘油酯E-試劑盒方法測定。2數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)處理所有數(shù)據(jù)以X士Sf來表示。用t檢驗進行顯著性檢驗。3結(jié)果3天后與對照組相比，食用高脂肪組的小鼠其糞重降到0.14士0.035g，食用高脂肪食物+0.35%、1%、2%七葉皂苷，其糞重和糞中三酰甘油含量都比高脂肪組小鼠有所增加,2%七葉皂苷組作用顯著(見表2-1)。表2-1七葉總皂苷對小鼠排泄物中脂肪排出的作用組別動物數(shù)(只)糞重(g)糞中三酰甘油含量(mg/g)對照121.04±0.017*11.96±0.70高脂肪食物20.14±0.03518.84±1.03高脂肪食物+0.35%皂苷120.22±0.04916.31±3.48高脂肪食物+1%皂苷120.26±0.01224.35±0.80高脂肪食物+2%皂苷120.31±0.04928.27±1,47*N=I2,*P<0.05vs高脂肪食物組4結(jié)論七葉總皂苷能增加高脂飼料小鼠排泄物重量及糞便中的三酰甘油的含量。實驗例3七葉樹總皂苷對高脂肪食小鼠體重、子宮周圍脂肪及肝臟中三酰甘油和總膽固醇含量的作用1實驗材料與方法U材料實驗動物，3周齡的ICR系雌性小鼠購自于大販CLEA公司，購買后置于室溫25士rC,相對濕度60%的室內(nèi)并且明暗12h循環(huán)適應(yīng)l周，供試驗。預(yù)備飼養(yǎng)期間，自由采食和飲水。七葉樹總皂苷由本室提供。1.2實驗方法將1CR系雌性小鼠分成5組，每組12只，自由進食l周后，分別食普通飼料、高脂肪飼料、高脂肪飼料+0.35%七葉總皂苷、高脂肪飼料+1%七葉總皂苷、高脂肪飼料+2%七葉總皂苷，試驗U周后，乙醚麻醉處死動物，迅速摘除子宮周圍脂肪、肝臟于-80'C儲存，供分析用。各鼠的體重每周測定1次，每只鼠的進食量每周記錄3次。取0.5g肝臟，置于KrebsRinger磷緩沖液(PH7.4，4.5ml)中，勻漿。勻漿液0.2ml，用混合液(V氯仿V甲醇:2:1)4ml萃取。萃取液在氮氣流下濃縮，殘渣用和光三酰甘油E-試劑盒及和光膽固醇E-試劑盒方法測定三酰甘油和總膽固醇含量。2數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)處理所有數(shù)據(jù)以X土Sf來表示。用t檢驗進行顯著性檢驗。3結(jié)果高脂組小鼠體重比正常飼料對照組明顯增加(見表3-l、附圖2)。飼喂體重?zé)o太大差別，在第3周與高脂肪組對比，小鼠體重有所下降。七葉皂苷能使子宮周圍脂肪組織質(zhì)量下降(見表3-2)。食用高脂食物的小鼠肝臟經(jīng)過11周后，其肝重、肝三酰甘油含量和總膽固醇含量都比對照組增加了很多，分別達到2.07±0.73,150.1±21.8，8.5±1.48,而對照組分別為1.5±0.36，34.0±2.3,4.5±0.37。食用高脂肪食物+0.35%皂苷、高脂肪食物+1%皂苷、高脂肪食物+2%皂苷能明顯的降低因攝入高脂肪而引起的肝重、肝中三酰甘油及總膽固醇含量的增加(見表3-3)。表3-l七葉總皂苷對高脂肪小鼠體重的影響(g)周對照高脂肪食物高脂肪食物+0.35。/。皂苷高脂肪食物+1%卓苷高脂肪食物+2%皂苷021.6±1.8521.6±1.7621.6±1.6121.6±1.6321.6±1,61129.0±1.9129.1±1.6628.8±1.7728.8±2.0329.5±1.81231.8±2.2633.7±2.3731.9±2.3932.8±3.2532.9±1,87333.6±2.8037.3±3.0435.0±2.8135.7土4.0535.9±2.01435.6±2.7840.2±4.2637.4±3.8937.0±3.9838.4±2.4536.1±3.3441.1±4.9438,1±4.4937.9±4.9338.7±3.05639.1±4.4344.0±5.9740.9±5.4940.3±5.1340.5±2.93739.7±3.8146.9±6.0643.1±5.9542.9±6.1143,7±3.66841.5±5.0748.6±7.0545.1±6.3943.7±5.1745.2±4.06943.2±6.0551,5±8.8847.7±6.0846.5±6.8647.0±4.621042.0±5.0450.5±7.5847.4±6.2845.4±5.6745.4±3.661143.4±5.0449.4±6.7145.1±3.6245.5±5.4247.6±6.55N=12表3-2七葉總皂苷對高脂肪食小鼠子宮周圍脂肪質(zhì)量的影響組別動物數(shù)(只)子宮周圍組織的脂肪質(zhì)量(g)對照121.5±0.12高脂肪食物122.8±1.03高脂肪食物+0.35%皂苷122.67±0.57高脂肪食物+1%皂苷122.44±1.21高脂肪食物+2%皂苷122.29±1.46N=12表3-3七葉總皂苷對高脂肪食小鼠肝臟中三酰甘油和總膽固醇的影響組別動物數(shù)(只)肝重(g)三酰甘油(％)總膽固醇(。/。)對照21.5±0.3634.0±2.34.5±0.37高脂肪食物122.07±0.73150.1±21,88.5±1.48高脂肪食物+0.35%皂苷121.84±0.4977.2±6.8*9.1±2.13高脂肪食物+1%皂苷121.82±0.1188.0±6.7*6.0±1.07*高脂肪食物+2%皂苷121.67±0.6275.6±4,8*6.4±1.26*N=12,*P<0.05vs高脂肪食物組4結(jié)論七葉總皂苷對小鼠體重、子宮周圍脂肪及肝臟中三酰甘油和總膽固醇含量均有明顯的抑制作用。小鼠肝臟中三酰甘油和總膽固醇在食用高脂肪酸食物+2%七葉皂苷11周后與高脂組(150.1±21.8,8.5±1.48)相比，含量分別降至75.6士4.8、6.4±1.26。實驗例4大鼠血漿中三酰甘油酯的測定1實驗材料與方法U材料實驗動物，6周齡的Wistarking系大鼠購自日本CharlesRiver,購買后置于室溫25±rC，相對濕度60。/。的室內(nèi)并且明暗12h循環(huán)適應(yīng)l周，供試驗。預(yù)備飼養(yǎng)期間，自由采食和飲水。七葉樹總皂苷由本室提供。1.2實驗方法雄性Wistar系大鼠在上述條件下空腹1夜，取3ml脂質(zhì)乳膠液(由6ml玉米油、800mg膽酸、6ml生理鹽水)，或3ml脂質(zhì)乳膠液加七葉總皂苷(最終劑量(體重250mg/kg和1gAcg)),口服含有七葉總皂苷的脂質(zhì)乳膠液或沒有七葉總皂苷脂質(zhì)乳膠液O,1，2，3，4，5h后，從大鼠尾靜脈采血，離心(5500Xg，5min)得血漿。血漿中的三?；视王ビ煤凸馊８视王ピ噭┖羞M行測定。2數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)處理所有數(shù)據(jù)以X士S^來表示。用t檢驗進行顯著性檢驗。3結(jié)果攝入高脂肪組食物的大鼠，血漿中的三酰甘油含量逐淅上升，在2h后達到最高，為183.38±73.12，然后逐漸回落到正常水平。七葉皂苷在250mg/kg，lg/kg時能夠?qū)σ蚋咧臼澄镆鸬娜８视蜕仙泻芎玫囊种谱饔?。?h后抑制效果最為明顯，分別為142.12±47.72、88.54±13.37(見表4-l)。表4-1七葉總皂苷對大鼠血漿中三酰甘油含量的影響(％)_<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>N=3，*P<0.05vs高脂肪食物組4結(jié)論七葉皂苷對火鼠血漿中三酰甘油含量有明顯的抑制作用，食用高脂肪食物+2%七葉皂苷的大鼠2h后，大鼠血漿中三酰甘油含量較高脂肪組(183.38±73.12)降至88.54±13.37。圖1為七葉皂苷對胰脂肪酶活性的作用。圖2為七葉皂苷對高脂肪食小鼠體重的影響。圖3為七葉總皂苷及七葉皂苷Ib，lla對胰脂肪酶活性的作用。具體實施方式實施例1原料制備方法干燥的七葉樹種子粉末5kg用80。/。乙醇10L浸泡過夜，超聲波室溫條件下提取30min，過濾，重復(fù)三次，合并濾液，減壓濃縮，得到80%乙醇提取物0.85kg，水溶，過大扎樹脂D101柱，依次用水、80%乙醇洗脫。乙醇溶液減壓濃縮，真空干燥，得七葉總皂苷提取物400g。實施例2抗肥胖口服液制劑取實施例1中的制備物50g，加入羧甲基纖維素lg，甘草甜素適量，加純凈水至1000ml，混合均勻，滅菌，灌裝。每支50ml，含原料提取物2.5g。實施例3抗肥胖果凍制劑取實施例1的制備物50g，加入食用果膠10g，開水調(diào)勻，冷卻即得。切制成塊，使每塊含有1.5g制備物。實施例4抗肥胖泡騰片劑取實施例1的制備物50g，，制成泡騰片，每片lg。注[l]BelfrageP，VaughanM.Simpleliquid-liquidpartitionsystemforisolationoflabelledoleicacidfrommixturewithglycerides.JLipidRas，1969，10:341-34權(quán)利要求1.一種以日本七葉樹種子總皂苷提取物預(yù)防治療肥胖的醫(yī)藥品和保健食品。全文摘要本發(fā)明公開一種七葉總皂苷的制備方法以及在抗肥胖作用中的應(yīng)用。將干燥的日本七葉樹種子粗粉5kg用80％乙醇20L浸泡過夜，超聲波室溫條件下提取30min，過濾，重復(fù)三次，合并濾液，減壓濃縮，得到80％乙醇提取物，水溶，過大孔樹脂D101柱，依次用水、80％乙醇洗脫。乙醇溶液減壓濃縮，真空干燥，得七葉總皂苷。本發(fā)明動物實驗具有明顯的抗肥胖作用，可用于制備預(yù)防、治療肥胖的藥物。本發(fā)明屬于中藥有效成分提取
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。文檔編號A61K36/185GK101239082SQ200710055528公開日2008年8月13日申請日期2007年4月17日優(yōu)先權(quán)日2007年4月17日發(fā)明者王丹輝,胡蔣寧,鄭毅男,韓立坤申請人:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)