專利名稱：互補(bǔ)型高容量腺病毒載體系統(tǒng)及其構(gòu)建的疫苗和基因治療產(chǎn)品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種互補(bǔ)型高容量腺病毒載體系統(tǒng)及其衍生物，該系統(tǒng)包括一對 互補(bǔ)的腺病毒載體。本發(fā)明還涉及基于互補(bǔ)原理的其他病毒載體系統(tǒng)。該系統(tǒng)可 以作為哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體、重組疫苗和基因治療載體，適用于攜帶多種外源 基因的多價疫苗以預(yù)防傳染性疾病，也適用于攜帶多個治療基因的基因治療產(chǎn)
背景技術(shù)：
腺病毒(Adenoviruses, Ad)是一種特征性的二十面體病毒殼體，它的基因 組是線性的雙鏈DNA，約34kb到43kb。 Ad的宿主范圍很廣。人源Ad可分為6 個亞群，約51種血清型。Ad可將外源基因高效的遞送到細(xì)胞核中進(jìn)行表達(dá)，因 而Ad載體系統(tǒng)作為哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體、重組疫苗和基因治療載體備受胄睞。
目前開發(fā)的腺病毒載體主要以5型腺病毒(Ad5)為主，Ad5載體系統(tǒng)作為 基因轉(zhuǎn)移載體有諸多優(yōu)點。
1. 安全性
1) 腺病毒基因組的遺傳背景比較清楚；
2) 5型腺病毒比較溫和，正常人感染后可以自愈；
3) 通過刪除、置換E1區(qū)，可造成腺病毒的復(fù)制缺陷，并且避免了E1基因 對細(xì)胞的轉(zhuǎn)化作用，因此更加安全。
2. 有效性
1) 腺病毒可以高效的感染處于分裂期與靜息期的細(xì)胞，而且攜帶的外源基
因可以長時間高水平地表達(dá)；
2) 重組腺病毒載體可以經(jīng)口服以及鼻吸用藥，這種用藥途徑不僅方便，而 且還大大減少了注射用藥造成的交叉感染。
3. 生產(chǎn)易得性
1) 腺病毒可以在宿主細(xì)胞中復(fù)制增長到很高的滴度(達(dá)到1X10"pi'u/ral)， 適于重組疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)；
2) 腺病毒的物理化學(xué)性狀比較穩(wěn)定，可以冷凍保存數(shù)月不失去感染能力， 所以可以方便地運輸、儲存重組腺病毒疫苗成品。
腺病毒載體經(jīng)歷了三個發(fā)展階段。
1、 第一代腺病毒載體去除了腺病毒基因組的El和(或)E3區(qū)，其增殖必須 在能夠反式提供E1區(qū)表達(dá)蛋白的互補(bǔ)細(xì)胞株中完成。目前可以提供E1區(qū)表達(dá)產(chǎn) 物的細(xì)胞株有293， 911， N52. E6和PER. C6。喪失了在非El互補(bǔ)細(xì)胞中復(fù)制能 力的第一代腺病毒載體不能在活體內(nèi)復(fù)制，安全性大為提高。其攜帶外源基因的 最大能力僅為7-8Kb。
2、 第二代腺病毒載體是在第一代腺病毒載體的基礎(chǔ)上去除了更多的早期基 因，如E2區(qū)、E4區(qū)等，載體可容納14kb的外源基因序列。然而，去除了相關(guān) 基因的第二代腺病毒載體的生產(chǎn)必須在提供相應(yīng)功能的互補(bǔ)細(xì)胞株中完成。腺病 毒基因的表達(dá)對細(xì)胞本身是一種毒性，使得這種細(xì)胞中病毒產(chǎn)量較低，不利于大 規(guī)模生產(chǎn)。
3、 第三代腺病毒載體去除了所有病毒編碼基因，僅保留了5'和3'末端反 向重復(fù)序列(ITR)與腺病毒的包裝信號(v)。其可以容納36kb的外源基因，故也 稱其為輔助病毒依賴(helper dependent)高容量腺病毒。該系統(tǒng)的弊端是， 高容量載體的生長完全依賴于輔助病毒，缺乏選擇生長優(yōu)勢，故產(chǎn)量很低。第三 代腺病毒載體需要在輔助病毒的幫助下才能夠在細(xì)胞株中生產(chǎn)，在大規(guī)模生產(chǎn)和 純化中輔助病毒的去除工作使得生產(chǎn)和純化成本大大提高。
此外，在第三代腺病毒載體中，大量的異源填充物片段的選擇也是一個難題。 眾所周知，腺病毒外殼的包裝范圍為整個腺病毒基因組的75-105%，通常情況下 構(gòu)建的第三代輔助病毒依賴高容量腺病毒載體骨架區(qū)長度較短，即使加上作為抗 原或者治療性的外源基因片段，其長度也達(dá)不到腺病毒的包裝范圍。因此需要借 助填充物來實現(xiàn)高容量腺病毒載體的正常包裝。目前，報道的填充物主要有X-噬菌體、酵母、細(xì)菌和非編碼的高等動物來源(包括人來源)的DNA片段。然而， 研究表明1 )攜帶X-噬菌體DNA填充片段的高容量腺病毒載體應(yīng)用于動物試驗時， 機(jī)體產(chǎn)生了針對這些填充物編碼的l噬菌體蛋白的CTL反應(yīng)，使得這些載體被體
內(nèi)的免疫系統(tǒng)迅速清除，同時X-噬菌體DNA在病毒生產(chǎn)過程中不穩(wěn)定，易于導(dǎo)致 自動的缺失與重組。2)選用人的基因組非編碼區(qū)(例如，包含基質(zhì)附著區(qū)元件 的次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因內(nèi)含子序列)作為填充物可以提高DNA的穩(wěn)定 性，且不會引起免疫反應(yīng)，但是這些方法存在著填充片段介導(dǎo)的外源基因重組到 人類基因組中的潛在危險。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種基于互補(bǔ)原理的腺病毒載體系統(tǒng)，該系統(tǒng)將人類5型腺病毒 的基因組按不同的方式分布在兩個載體中(參見附圖2)，由于分別提供了病毒復(fù) 制和/或包裝所必需的基因，兩個載體在生長過程中互相依存。這兩個載體在本發(fā) 明中分別被命名為互補(bǔ)型高容量腺病毒載體I (以下在本發(fā)明中簡稱為CHCAdI ) 和互補(bǔ)型高容量腺病毒載體II (以下在本發(fā)明中簡稱為CHCAdII )。整個系統(tǒng)中. 在缺少其中任意一個載體的情況下，另一個載體不能自己單獨生長擴(kuò)增。其特征 在于兩個載體可以單獨或者共同攜帶外源基因，使得攜帶外源基因的能力可以達(dá) 到整個基因組的長度。
本發(fā)明術(shù)語"腺病毒"指本領(lǐng)域技術(shù)人員己知的任何腺病毒亞型，分離株或 其他動物來源的腺病毒。具體地，可以是人類2型或者5型腺病毒。本發(fā)明優(yōu)選地， 但不限于此優(yōu)選方案，使用5型腺病毒來構(gòu)建新型載體系統(tǒng)。
將5型腺病毒的基因組中的復(fù)制包裝必需元件合理地分配在兩個載體中，依 照彼此制約、共同生長的原理，將對腺病毒復(fù)制包裝必需的基因平均或不平均地 分開，使得任何單獨一個病毒載體都不能獨自復(fù)制包裝。只有兩種互補(bǔ)的病毒載 體共同存在時，才能互相利用對方攜帶的另外一部分必需基因產(chǎn)物進(jìn)行復(fù)制包 裝。在本發(fā)明中通過實施例，最優(yōu)選地將這些必需元件以附圖2中所示的組合分 配在兩個載體中。然而，本發(fā)明不限于這些最優(yōu)選的分配方案。
腺病毒基因組中的各區(qū)域的主要功能是本領(lǐng)域熟悉技術(shù)人員所已知的(參見
附圖l)。具體地，如下所述
1、腺病毒基因組的兩端各有一段103bp的反向末端重復(fù)序列UTR)，是復(fù)制 的起始位點。在左端lTR的3'側(cè)有一段長約300bp的包裝信號(v)，介導(dǎo)腺病毒基 因組包裝入病毒衣殼。2、 El區(qū)基因表達(dá)產(chǎn)物
可以進(jìn)一步分為E1A和E1B。 E1A編碼蛋白的主要功能是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，使細(xì) 胞對病毒復(fù)制更易感。ElB19K與細(xì)胞Bc1--2基因的表達(dá)產(chǎn)物同源，可以通過滅活 和清除Bax家族成員來防止細(xì)胞發(fā)生凋亡或壞死。ElB55K基因產(chǎn)物可以下調(diào)p53 基因的轉(zhuǎn)錄水平，并與病毒復(fù)制、病毒晚期mRNA的轉(zhuǎn)錄以及病毒RNA的轉(zhuǎn)運有關(guān)。
3、 E2區(qū)基因表達(dá)產(chǎn)物
可分為E2A和E2B。其中，E2A即DNA結(jié)合蛋白(DBP， DNA Binding Protein): E2B主要產(chǎn)物有兩種，分別是末端蛋白前體(pTP)和病毒DNA聚合酶(poi)。三 種蛋白與細(xì)胞內(nèi)復(fù)制因子相互作用，啟動腺病毒DNA復(fù)制以及病毒晚期基因的轉(zhuǎn) 錄和翻譯過程。
4、 E3區(qū)基因表達(dá)產(chǎn)物 主要功能是破壞宿主的免疫防御機(jī)制。
5、 E4區(qū)基因表達(dá)產(chǎn)物
E4區(qū)的基因產(chǎn)物通常被稱為orf l—orf6/7，主要與病毒信使RNA的代謝有關(guān)， 還有促進(jìn)病毒DNA復(fù)制以及關(guān)閉宿主蛋白合成與抑制調(diào)亡的功能。
6、 晚期轉(zhuǎn)錄單位(L1一L5)
大部分晚期基因的轉(zhuǎn)錄是以一個共同的主要晚期啟動子(MLP， Major Late Promoter)調(diào)控的。晚期基因主要編碼腺病毒的結(jié)構(gòu)蛋白。病毒結(jié)構(gòu)蛋白在細(xì)胞 核內(nèi)聚集形成病毒衣殼，病毒的基因組被包裝進(jìn)去，形成有感染能力的病毒顆粒， 并最終裂解宿主細(xì)胞被釋放出去，完成腺病毒的生活周期。
由上述資料可以看出對腺病毒復(fù)制包裝的順式元件包括反向末端重復(fù)序列 (1TR)和包裝信號(i|/);反式作用因子包括El基因、E2基因與E4基因表達(dá)產(chǎn) 物以及晚期基因的表達(dá)產(chǎn)物。因此在本發(fā)明中通過實施例，且不限于所述的試驗 方案，將這些必需元件以不同的組合分配在兩個載體中。
在可選的實施方案之一是CHCAd I攜帶的必需元件包括ITR、包裝信號、E2 基因、E4基因及晚期轉(zhuǎn)錄基因L4和L5。 CHCAdll攜帶的必需元件包括ITR、包裝信 號及晚期轉(zhuǎn)錄基因L1—L3。
在更優(yōu)選的實施方案是CHCAd 1攜帶的必需元件包括ITR、包裝信號、E2基
因及晚期轉(zhuǎn)錄單位。CHCAdII攜帶的必需元件包括ITR、包裝信號及E4基因。
在這些實施例中CHCAd I和CHCAdll所必需的El基因產(chǎn)物由互補(bǔ)細(xì)胞系293細(xì) 胞提供。
本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知構(gòu)建攜帶外源基因的基于本發(fā)明的重組腺病毒的 方法。為驗證本發(fā)明的載體系統(tǒng)中兩種互補(bǔ)載體的比例以及穩(wěn)定性，在實施例中 CHCAd I攜帶了紅色熒光蛋白報告基因，CHCAdII攜帶了綠色熒光蛋白報告基因。
此外該系統(tǒng)還可以作為重組疫苗載體、基因治療載體以及哺乳動物細(xì)胞表達(dá) 載體。在可選的實施例中，且不限于這些實施例，該系統(tǒng)可適用于構(gòu)建攜帶多種 HIV抗原基因的多價疫苗。詳細(xì)資料參見專利"攜帶HIV基因的腺病毒載體疫苗"。
該系統(tǒng)也適用于攜帶多個治療基因的基因治療產(chǎn)品，亦適用于攜帶大片段外 源基因的哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體。
本發(fā)明還涉及高容量腺病毒載體中填充物的優(yōu)化選擇。本發(fā)明中對填充物進(jìn) 行了優(yōu)化選擇?？蛇x方案之一是用X-噬菌體基因組片段作為填充物。但同先前研 究相比，本發(fā)明中所采用的l噬菌體基因組片段是經(jīng)過優(yōu)化選擇的。這包括盡量 避開或打亂基因閱讀編碼框，以及通過對X-噬菌體整個基因組掃描找出GC含量與 腺病毒基因組相近的區(qū)域。
在更優(yōu)選的方案中，采用了來自腺病毒的基因組片段。用來自腺病毒的基因 組片段作為填充物可以最大程度模擬腺病毒基因組序列的天然性。具體地，填充 物可以是人類2型、5型或者其他血清型腺病毒基因組的片段。本發(fā)明最優(yōu)選的方 案(但不限于此優(yōu)選方案)是人類2型腺病毒基因組片段作為填充物。
本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知得到本發(fā)明的人類2型腺病毒的基因組片段的方 法。不必拘泥于本發(fā)明實施例的方法，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可以從包含人類2型 腺病毒基因組的病毒、質(zhì)?；蚱沃械玫竭@些片段。本發(fā)明實施方案中那些來自 人類2型腺病毒的基因組片段被分成若千小片段區(qū)域，具體地，最優(yōu)選的方案中 分成了8個片段，然而本發(fā)明不限于這些最優(yōu)選的方案。這些小片段中缺失了2 型腺病毒相應(yīng)基因的起始密碼子，這些獲得的經(jīng)過改造的小片段再以不同于原來 順序的排列串連起來作為填充物。其目的在于通過合理的排列組合避免互補(bǔ)病毒 間的重組，即使互補(bǔ)載體之間發(fā)生重組，得到的重組產(chǎn)物也由于長度小于包裝范 圍或大于包裝范圍而不能被成功包裝，子代重組病毒沒有生長優(yōu)勢。
四

圖1是人類5型腺病毒整個基因組的組成。
圖2是互補(bǔ)型高容量腺病毒載體的示意圖。 圖3是互補(bǔ)型高容量腺病毒載體I的構(gòu)建流程圖。 圖4是成功構(gòu)建的互補(bǔ)型高容量腺病毒載體I的酶切鑒定圖譜。 圖5是互補(bǔ)型高容量腺病毒載體II的構(gòu)建流程圖，其中以l噬菌體基因組片 段作為填充物。
圖6是互補(bǔ)型高容量腺病毒載體II骨架的酶切鑒定圖譜。 圖7是入-噬菌體基因組片段的獲得示意圖。
圖8是互補(bǔ)型高容量腺病毒載體II的構(gòu)建流程圖，其中以人類2型腺病毒基因 組片段作為填充物。
圖9是人類2型腺病毒基因組片段填充物的來源示意圖。
圖10是人類2型腺病毒基因組8個片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果。
圖11是人類2型腺病毒基因組片段的連接示意圖。
五具體實施例方式
下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
實施例l
互補(bǔ)型高容量腺病毒載體I (CHCAd I )構(gòu)建
CHCAdI中對腺病毒復(fù)制包裝所必需的元件包括ITR、包裝信號、E2基 因及晚期轉(zhuǎn)錄單位。它的獲得方案如下本實驗室已有的第一代5型腺病毒載體 中已經(jīng)去除了 El基因和E3基因，因而在此基礎(chǔ)上再去除E4基因即可獲得 CHCAdI載體。具體地講，先把所要刪除的E4基因左右兩側(cè)的序列擴(kuò)增出來， 得到E4-L和E4-R片段。這兩個片段按照附圖3中的方向和順序先后插入到 pVAXl中得到pVAXl —E4-L-R。 EcoRI酶切線性化的pVAXl —E4-L -R產(chǎn)物和 Sbfl部分消化的pAd5 El-E3-產(chǎn)物共同轉(zhuǎn)化BJ5183菌，重組即可得到pAd5 E1-E3-E4-(含有卡那霉素抗性基因)。如果卡那霉素抗性基因?qū)ο掠蔚脑囼炗杏?響可進(jìn)一步將其刪除，因為在設(shè)計擴(kuò)增E4-L和E4-R片段的引物時候，己經(jīng)在 其兩端引入了 Swal位點。這樣在pAd5El-E3-E4-的卡那霉素抗性基因兩端存在 了 Swal位點，該位點在pAd5 E-E3-E4-其他區(qū)域不存在。因此用Swal酶切pAd5 E1-E3-E4-(含有卡那霉素抗性基因)質(zhì)粒再向連即可得到CHCAd I載體。這種 "部分酶切，雙抗性篩選"的方法經(jīng)本實驗室證實是一種十分有效的刪除病毒、 細(xì)菌或者其他微生物中任意基因或者任意片段(這些基因或者片段中不要求必需 存在單個酶切位點)的技術(shù)。該技術(shù)的詳細(xì)介紹參見本實驗室的另外專利。 具體的實驗流程見附圖3。
實施例2
互補(bǔ)型高容量腺病毒載體II (CHCAdIl)構(gòu)建
CHCAdII中對腺病毒復(fù)制包裝所必需的元件包括ITR、包裝信號及E4基 因。它的獲得方案如下從第一代5型腺病毒載體(來自Stratagene公司的 AdEasy Adenoviral Vector System或其他)中已經(jīng)去除E2基因及晚期轉(zhuǎn)錄單位， 僅保留E4基因即可到CHCAdlI載體骨架。具體地，用BstZm和Hpal雙酶切 pAd5 El-E3-回收帶有質(zhì)粒骨架和E4基因的片段再自連即得CHCAdlI載體骨 架。
X-噬菌體基因組片段作為填充物
以入-噬菌體基因組片段作為填充物的具體試驗流程見附圖4。具體地講，先 把所選擇的X-噬菌體基因組片段左右兩側(cè)的序列擴(kuò)增出來，得到XA和XB片段。 這兩個片段按照附圖4中的方向和順序先后插入到pVAXl載體中得到pVAXl — XA B。酶切XA B片段連到CHCAdII載體骨架中得到pAdE4-XA B質(zhì)粒。Swal 線性化得pAdE4-AA B和Xbal與Xhol酶切消化的X-噬菌體基因組產(chǎn)物共同轉(zhuǎn)化 BJ5183菌，重組即可得到CHCAdIl (以X-噬菌體基因組片段作為填充物)。
Ad2基因組片段作為填充物
以Ad2基因組片段作為填充物的具體試驗流程見附圖5。具體地講，先從人 類2型腺病毒的基因組片段分別通過PC:R擴(kuò)增出8個片段。其中S5和S8先按 照附圖5中的方向和順序先后插入到pVAXl中得到pVAXl—S5S8。酶切S5S8 片段連到0^^(111載體骨架中得到？八(:舊4- S5S8質(zhì)粒。S12345片段與BstZ171 酶線性化的pA犯4-S5S8共同轉(zhuǎn)化BJ5183菌，重組即可得到pAdE4- S123458。 S5678與Swal線性化的pAdE4- S123458共同轉(zhuǎn)化BJ5183菌，同源重組得到 pAdE4-Sl2345678，即CHCAdII (Ad2基因組片段作為填充物)
其中SI2345片段的連接方案如下
1.S1 (HindlII+BamHI酶切)，S5c (XhoI + Spel酶切)，S2 (BamHI+Hpal 酶切)，S4 (Notl+Xho1酶切)和S3 (Scal+Notl酶切)片段依次連入pVAXl 中，得到pVAXl-S 12345。
2.用Swal酶切(在PCR擴(kuò)增Sl和S5兩個片段時，己在Sl左端和S5右端 引入了 Swal位點)卸出S12345片段，備用。
其中S5678片段的連接方案如下
1. S5 (HindlII+BamHI), S6 (BamHI+EcoRD， S7 (EcoRI+Hpal)禾[i S8 (用平端DNA聚合酶擴(kuò)增得到的S8片段與EcoRV酶切的pVAXl-S5S6S7連接)
片段依次連入pVAXl中，得到pVAX卜S5S6S7S8。
2. 用SnaBI酶切(在PCR擴(kuò)增S5和S8兩個片段時，已在S5左端和S8右 端引入了SnaBI位點)卸出片段S5678，備用。
實施例3
1-噬菌體基因組片段作為填充物的優(yōu)化選擇
在CHCAdII載體構(gòu)建過程中共刪除了 5型腺病毒基因組的23583bp的片段， 此片段的平均GC含量為58 % 。用在線軟件geneGC calculater (http:〃pl加tst.genomics.purdue.edu/plantst/cgi-bin/geneGC.cgi)通過對X-噬菌體全 基因組分析，選取了 X-噬菌體基因組得149-21749區(qū)間的片段作為填充物，該片 段長度為21601bp，平均GC含暈為56.7% 。
實施例4
Ad2基因組片段作為填充物的優(yōu)化選擇
來自人類2型腺病毒的基因組(invi加gen， Catalog Number: 15270-010)片 段被分成了 8個片段通過PCR擴(kuò)增出來見參見附圖9和附圖10。各個片段對應(yīng) 于人類2型腺病毒基因組(genebank: AC—000007)人類5型腺病毒基因組 (genebank: AC_000008)的位置分別為
SI: Ad5 genome (4435-5711 bp)
S2: Ad2 genome (31057-32716bp)
S3: Ad2 genome (18851-24072bp)
S4: Ad2 genome (24110-28165bp)
S5: Ad2 genome (28222-28616bp)
S6: Ad2 genome (11082-14019bp)
S7: Ad2 genome (14161-18618bp)
S8: Ad2 genome (28669-31016bp)
通過引物設(shè)計，這些小片段中缺失了 2型腺病毒相應(yīng)基因的起始密碼子和下 游操作過程中所用到的酶切位點，這些獲得的經(jīng)過改造的小片段再以不同于原來 順序的排列卑連起來作為填充物(參見附圖ll)。其目的在于通過合理的排列組 合使得互補(bǔ)病毒間的重組盡量被避免，即使重組發(fā)生，產(chǎn)生的重組產(chǎn)物也由于長 度太短或太長不會被包裝起來。
實施例5
攜帶報告基因的互補(bǔ)型高容量腺病毒載體構(gòu)建
CHCAd I與pGAl-RFP共同轉(zhuǎn)化BJ5183菌，重組得到CHCAd I -RFP。. CHCAd I -RFP用Pad酶切，即得到CHCAd I -RFP病毒基因組。
CHCAd II與pGAl -EGFP共同轉(zhuǎn)化BJ5183菌，重組得到CHCAd II -EGFP 。 CHCAd II-EGFP用PacI酶切，即得到CHCAd II-EGFP病毒基因組。
將CHCAd I -RFP病毒基因組和CHCAd II -EGFP病毒基因組的產(chǎn)物共轉(zhuǎn)染 Trex293細(xì)胞即可拯救得到CHCAd I -RFP和CHCAd II -EGFP病毒。
權(quán)利要求
1、一種互補(bǔ)型高容量腺病毒載體系統(tǒng)，包括一對互補(bǔ)的人類5型腺病毒載體， 其特征在于將人類5型腺病毒的基因組以不同的組合分配方式分布在兩個載 體中。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的腺病毒載體系統(tǒng)，其特征在于分配方式為兩端的ITR、 包裝信號、早期E2基因及晚期轉(zhuǎn)錄基因L4和L5在一個載體上;兩端的ITR、 包裝信號及晚期轉(zhuǎn)錄基因L1， L2， L3，在另一個載體上。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的腺病毒載體系統(tǒng)，其特征在于分配方式為兩端的ITR、 包裝信號、E2基因及晚期轉(zhuǎn)錄單位在一個載體上；兩端的ITR、包裝信號及 E4基因在另一個載體上。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的腺病毒載體系統(tǒng)，其特征在于它們可以單獨或者共同 攜帶外源基因，兩個載體的容量之和最大可以達(dá)到40kb。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的腺病毒載體系統(tǒng)，其特征在于高容量腺病毒載體 中用優(yōu)化的X-噬菌體基因組片段以及已有的非編碼基因序列與非功能性序列 作為填充物。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的腺病毒載體系統(tǒng)，其特征在于高容量腺病毒載體 中用優(yōu)化的X-噬菌體基因組片段以及人類基因組中非編碼的基因序列與非功 能性序列作為填充物。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1或4所述腺的病毒載體系統(tǒng)，其特征在于高容量腺病毒載體 中用合理排列組合的且優(yōu)化過的人類2型腺病毒基因組DNA以及其它種屬其 它血清型腺病毒基因組片段作為填充物。
8、 權(quán)利要求1所述載體系統(tǒng)構(gòu)建的攜帶多種抗原基因的多價疫苗。
9、 權(quán)利要求1所述載體系統(tǒng)構(gòu)建的攜帶治療性基因的基因治療產(chǎn)品。
10、 權(quán)利要求1所述載體系統(tǒng)構(gòu)建的哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種互補(bǔ)型高容量腺病毒載體系統(tǒng)及其構(gòu)建的疫苗和基因治療產(chǎn)品。系統(tǒng)包括一對互補(bǔ)的腺病毒載體。該系統(tǒng)將人類5型腺病毒復(fù)制包裝所必需的基因分布在兩個載體中，它們相輔相成，協(xié)同彼此的復(fù)制與包裝。它們可以分別或共同攜帶外源基因，兩個載體外源基因容量之和最大可以達(dá)到40kb。該系統(tǒng)可以作為哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體、重組疫苗載體以及基因治療載體，適用于攜帶多種外源基因的多價疫苗以預(yù)防傳染性疾病，也適用于攜帶多個治療基因的基因治療產(chǎn)品。本發(fā)明還優(yōu)選了互補(bǔ)病毒中的填充序列，提高了腺病毒的包裝效率和穩(wěn)定性。
文檔編號A61K47/46GK101363028SQ20071002657
公開日2009年2月11日 申請日期2007年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月26日
發(fā)明者鋒 李, 凌 陳 申請人:中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院