專(zhuān)利名稱(chēng)：：改良的痘病毒快速誘導(dǎo)抗痘病毒或其它傳染物的免疫力的用途的制作方法改良的痘病毒快速誘導(dǎo)抗痘病毒或其它傳染物的免疫力的用途發(fā)明領(lǐng)域_免疫力的快速誘導(dǎo)本發(fā)明涉及通過(guò)給動(dòng)物包括人接種在所述動(dòng)物(包括人)中不能復(fù)制的痘病毒來(lái)快速誘導(dǎo)抗痘病毒和痘病毒感染諸如天花的保護(hù)性免疫應(yīng)答。此類(lèi)痘病毒的例子有改良的安卡拉痘苗病毒(MVA)。本發(fā)明還涉及重組痘病毒(如重組MVA)快速誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答的用途,所述病毒在接種該病毒的動(dòng)物(包括人)中不能復(fù)制、但表達(dá)異源抗原和/或抗原性表位，所述免疫應(yīng)答是抗所述異源抗原和/或抗原性表位(例如作為傳染物一部分的抗原和/或抗原性表位)的保護(hù)性免疫應(yīng)答。發(fā)明背景對(duì)于許多疾病，諸如傳染病，疫苗已經(jīng)開(kāi)發(fā)得到或者正在開(kāi)發(fā)中。這些疫苗在某個(gè)時(shí)限內(nèi)誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答。由于大多數(shù)疫苗用于接種以抵抗在人群中相當(dāng)罕見(jiàn)的疾病，免疫應(yīng)答的產(chǎn)生通常不需要特別快速。然而，有應(yīng)當(dāng)盡可能快的產(chǎn)生免疫應(yīng)答諸如保護(hù)性免疫應(yīng)答的情況。這可以是天花或任何其它人類(lèi)痘病毒疾病爆發(fā)的情況。天花的I丈病因子(causativeagent)是天花(variola)病毒，它是正痘病毒(Orthopoxvirus)屬的一個(gè)成員。痘苗病毒也是痘病毒科正痘病毒屬的一個(gè)成員，曾經(jīng)作為活疫苗用于抗天花的免疫。在世界范圍內(nèi)，用痘苗病毒進(jìn)行的成功接種以天花病毒的根除而告終(Theglobaleradicationofsmallpox.Finalreportoftheglobalcommissionforthecertificationofsmallpoxeradication;HistoryofPublicHealth,No.4,Geneva:WorldHealthOrganization,1980)。當(dāng)時(shí)，銷(xiāo)毀了傳染性天花病毒的大多數(shù)原種。然而，不能排除包括天花或天花樣疾病在內(nèi)的痘病毒疾病可能再次成為重大健康問(wèn)題。另外，存在動(dòng)物的痘病毒疾病傳播給人的風(fēng)險(xiǎn)。此外，可能還有希望誘導(dǎo)快速免疫應(yīng)答的其它情況，例如有些疾病是世界上部分地區(qū)流行的地方病，當(dāng)接到通知必須在短期內(nèi)到此類(lèi)國(guó)家旅行時(shí)，可能希望誘導(dǎo)抵抗這些疾病的快速免疫應(yīng)答。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及用于在動(dòng)物(包括人)中快速誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法，包括給動(dòng)物(包括人)施用在所述動(dòng)物(包括人)中不能復(fù)制的痘病毒的步驟。本發(fā)明還涉及所述不能復(fù)制的痘病毒用于制備在動(dòng)物(包括人)中快速誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答的疫苗的用途，及作為疫苗用于快速誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答的痘病毒，其中所述痘病毒在所述動(dòng)物(包括人)中不能復(fù)制。術(shù)語(yǔ)"不能復(fù)制的痘病毒"及同義術(shù)語(yǔ)"不能復(fù)制成感染性后代病毒"的病毒指，在接種了疫苗的動(dòng)物的細(xì)胞中根本不復(fù)制的痘病毒，及在施用了該痘病毒的動(dòng)物(包括人)中顯示出受到免疫系統(tǒng)控制的微小殘余復(fù)制活性的病毒。依照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，不能復(fù)制的痘病毒是能夠感染動(dòng)物(包括人)的細(xì)胞的病毒，該病毒在其中用作疫苗。"能夠感染細(xì)胞"的病毒是能夠與宿主細(xì)胞相互作用，使該病毒或至少病毒基因組摻入宿主細(xì)胞的病毒。盡管依照本發(fā)明使用的病毒能夠感染接種了疫苗的動(dòng)物(包括人)的細(xì)胞，它們或是不能在接種了疫苗的動(dòng)物的細(xì)胞中復(fù)制成感染性后代病毒，或是在施用了該痘病毒的動(dòng)物(包括人)中只顯示出受到免疫系統(tǒng)控制的微小殘余復(fù)制活性。應(yīng)當(dāng)理解，能夠感染第一種動(dòng)物物種的細(xì)胞但不能在所述細(xì)胞中復(fù)制成感染性后代病毒的病毒在第二種動(dòng)物物種中可能有不同表現(xiàn)。例如，對(duì)于人，MVA-BN及其衍生物(見(jiàn)下文)是能夠感染人的細(xì)胞但不能在人細(xì)胞中復(fù)制成感染性后代病毒的病毒。同樣的病毒在雞(chicken)中非常高效的復(fù)制；即，在雞中，MVA-BN是能夠感染細(xì)胞且能夠復(fù)制成感染性后代病毒的病毒。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道對(duì)具體動(dòng)物物種該選擇哪種病毒。WO02/42480中公開(kāi)了能夠確定病毒是能夠還是不能在小鼠中復(fù)制的測(cè)試法，它使用AGR129小鼠品系(見(jiàn)下文)不能生成成熟B和T細(xì)胞并因而嚴(yán)重免疫受損且對(duì)有復(fù)制能力的病毒高度易感的任何其它小鼠品系。在此動(dòng)物模型中得到的結(jié)果對(duì)人有預(yù)示作用。依照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，依照本發(fā)明的病毒能夠在至少一種動(dòng)物物種的至少一種細(xì)胞類(lèi)型中復(fù)制。如此，可以在對(duì)需要接種和/或治療的動(dòng)物施用前擴(kuò)增病毒。舉例而言，要提到能在CEF(雞胚成纖維細(xì)胞)細(xì)胞中擴(kuò)增但不能在人中復(fù)制成感染性后代病毒的MVA-BN。依照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，將改良的安卡拉痘苗病毒(MVA)用于人和數(shù)種動(dòng)物物種，諸如小鼠和非人靈長(zhǎng)類(lèi)。已知MVA異常安全。MVA通過(guò)痘見(jiàn)Mayr，A.,Hochstein-Mintzd,V.andStickl，H.[1975]Infection3,6-14;瑞士專(zhuān)利第568,392號(hào))。遵從布達(dá)佩斯條約的要求已經(jīng)保藏且可用于實(shí)施本發(fā)明的MVA病毒抹的例子有毒抹MVA572，保藏于歐洲動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(EuropeanCollectionofAnimalCellCultures(ECACC),Salisbury,UK),保藏號(hào)ECACC94012707,保藏日1994年1月27日；MVA575，保藏號(hào)ECACC00120707，保藏日2000年12月7日；和MVA-BN,保藏號(hào)ECACC00083008,保藏日2000年8月30日。依照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，MVA毒抹是MVA-BN及其衍生物。PCT/EP01/13628中給出了MVA-BN及其衍生物的定義。簡(jiǎn)而言之，PCT/EP01/13628中所公開(kāi)的MVA-BN及其衍生物特征在于具有至少一項(xiàng)、至少兩項(xiàng)、至少三項(xiàng)或所有如下特性(i)能夠在雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)和細(xì)胞系BHK中繁殖性復(fù)制(reproductivereplication),但不能在人細(xì)胞系中繁殖性復(fù)制。依照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，人細(xì)胞系是人骨骨肉瘤細(xì)胞系143B、人角質(zhì)細(xì)胞(keratinocyte)細(xì)胞系HaCat和人子宮頸腺癌細(xì)胞系HeLa;(ii)不能在免疫嚴(yán)重受損的小鼠體內(nèi)復(fù)制；(iii)在致死攻擊模型中誘導(dǎo)與已知毒抹MVA575(ECACCV00120707)相比更高的免疫原性；和/或(iv)在痘苗病毒引發(fā)(prime)/痘苗病毒強(qiáng)化方案中誘導(dǎo)與DNA引發(fā)/痘苗病毒強(qiáng)化方案相比至少基本上相同水平的免疫力。關(guān)于確定MVA毒抹是否具有一項(xiàng)或多項(xiàng)上述特征(i)-(iv)的測(cè)定法的詳細(xì)信息參見(jiàn)WO02/42480(PCT/EP01/13628)。此出版物還公開(kāi)了如何能夠獲取具有所需特性的病毒。下文筒略概述了本領(lǐng)域技術(shù)人員如何能夠測(cè)試MVA毒抹是否具有一項(xiàng)或多項(xiàng)所述特征且因而是依照本發(fā)明所述實(shí)施方案的病毒。下面的概述不應(yīng)理解為將WO02/42480關(guān)于本申請(qǐng)的實(shí)用性限于下列信息。相反，在此完整收入WO02/42480作為參考。在人細(xì)胞系諸如細(xì)胞系HaCat(Boukampetal.1988，JCellBiol106(3):761-71)或HeLa中"不能繁殖性復(fù)制"，其在本發(fā)明中的含義如WO02/42480中所定義的。如此，在一細(xì)胞系中"不能繁殖性復(fù)制，，的病毒是在所述細(xì)胞系中顯示出小于1的擴(kuò)增比率的病毒。病毒的"擴(kuò)增比率，，指由受感染細(xì)胞產(chǎn)生的病毒(輸出)與最初用于感染這些細(xì)胞的量(輸入)的比率。輸出和輸入之間的比率為"1"表示，由受感染細(xì)胞產(chǎn)生的病毒的量與最初用于感染這些細(xì)胞的量相同的擴(kuò)增狀態(tài)。依照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，在人細(xì)胞系中"不能繁殖性復(fù)制，，的病毒在任何上述人細(xì)胞系HeLa、HaCat和143B中可具有1.0(平均值)或更低或者甚至0.8(平均值)或更低的擴(kuò)增比率。術(shù)語(yǔ)"平均"在用于本申請(qǐng)時(shí)指由至少2，3,4，5，6，7,8,9，10或更多次實(shí)驗(yàn)得到的平均值。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，單次實(shí)驗(yàn)可由于生物學(xué)系統(tǒng)的內(nèi)在變異性而偏離平均值。術(shù)語(yǔ)"不能在體內(nèi)復(fù)制"在本申請(qǐng)中使用WO02/42480中的定義。如此，所述術(shù)語(yǔ)指在小鼠模型中不復(fù)制的病毒，正如WO02/42480中所解釋的。WO02/42480中所使用的小鼠不能生成成熟B和T細(xì)胞(AGR129小鼠)。MVA-BN及其衍生物在腹膜內(nèi)施用107pfli病毒量感染AGR129小鼠后，至少45天(平均值)的平均時(shí)段內(nèi)，諸如在至少60天(平均值)內(nèi)，或者在90天(平均值)內(nèi)不殺死所述小鼠。依照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，"不能在體內(nèi)復(fù)制"的病毒的進(jìn)一步特征在于腹膜內(nèi)施用10pfti病毒感染AGR129小鼠后45天(平均值)，或者60天(平均值)，或者90天(平均值)內(nèi)不能從所述小鼠的器官或組織回收到病毒。除了AGR129小鼠，可使用不能生成B和T細(xì)胞及因而免疫嚴(yán)重受損且對(duì)有復(fù)制能力的病毒高度易感的任何其它小鼠品系。在所述小鼠模型中得到的數(shù)據(jù)對(duì)人有預(yù)示作用。如此，依照一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā),明的病毒，諸如MVA-BN及其衍生物在人中根本不復(fù)制。在將涉及術(shù)語(yǔ)"不能復(fù)制的痘病毒"和"不能復(fù)制成感染性后代病毒的病毒"的部分中的定義應(yīng)用于MVA-BN及其衍生物在人中的復(fù)制行為時(shí)，那些在施用了痘病毒的人中顯示出受到免疫系統(tǒng)控制的微小殘余復(fù)制活性的病毒也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。WO02/42480中解釋了用于確定MVA毒抹是否具有"與已知毒抹MVA575相比更高的免疫原性"的致死攻擊實(shí)驗(yàn)的細(xì)節(jié)。在這樣一種致死攻擊模型中，未接種疫苗的小鼠在感染有復(fù)制能力的痘苗病毒抹諸如WesternReserve毒抹L929TK+或IHD-J后死亡。有復(fù)制能力的痘苗病毒的感染在描述致死攻擊模型的語(yǔ)境中稱(chēng)為"攻擊"。通常在攻擊后4天殺死小鼠，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)噬斑測(cè)定法使用VERO細(xì)胞測(cè)定卵巢中病毒滴度。對(duì)未接種疫苗的小鼠和接種了MVA-BN及其衍生物的小鼠測(cè)定病毒滴度。更具體的說(shuō)，MVA-BN及其衍生物特征在于，在此測(cè)試中，在接種102TCID5o/ml病毒后，與未接種疫苗的小鼠相比，卵巢病毒滴度降低至少70%(平均值)，或者至少80%(平均值)，或者至少90%(平均值)。如果以WO02/42480中公開(kāi)的"測(cè)定法1"和"測(cè)定法2"之一測(cè)得的CTL應(yīng)答在痘苗病毒引發(fā)/痘苗病毒強(qiáng)化方案中與DNA引發(fā)/痘苗病毒強(qiáng)化方案相比至少基本上相同，那么認(rèn)為痘苗病毒諸如MVA毒抹在痘苗病毒引發(fā)/痘苗病毒強(qiáng)化方案中誘導(dǎo)與DNA引發(fā)/痘苗病毒強(qiáng)化方案相比至少基本上相同水平的免疫力。依照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，以WO02/42480中公開(kāi)的"測(cè)定法1"和"測(cè)定法2"二者測(cè)得的CTL應(yīng)答在痘苗病毒引發(fā)/痘苗病毒強(qiáng)化方案中與DNA引發(fā)/痘苗病毒強(qiáng)化方案相比至少基本上相同。依照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，至少在一種測(cè)定法中，實(shí)施痘苗病毒引發(fā)/痘苗病毒強(qiáng)化方案后的CTL應(yīng)答與DNA引發(fā)/痘苗病毒強(qiáng)化方案相比更高。依照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，在兩種測(cè)定法中，CTL應(yīng)答都更高。依照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，MVA-BN的衍生物特征在于(i)能夠在雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)和幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞系BHK中繁殖性復(fù)制，但不能在人細(xì)胞系中繁殖性復(fù)制，其中依照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，人細(xì)胞系是人骨骨肉瘤細(xì)胞系143B、人角質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞系HaCat和人子宮頸腺癌細(xì)胞系HeLa，及(ii)不能在免疫嚴(yán)重受損的小鼠體內(nèi)復(fù)制。依照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，病毒是克隆純化的病毒，諸如單克隆病毒。依照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，病毒是在無(wú)血清條件下生成/傳代的病毒，采用無(wú)血清條件是為了降低感染血清中所含傳染物的風(fēng)險(xiǎn)。依照本發(fā)明的MVA以104陽(yáng)109TCID50/ml，例如105一5xl08TCID50/ml，或例如106-108TCID5Q/ml的濃度范圍施用。實(shí)際濃度取決于病毒的類(lèi)型和待接種的動(dòng)物物種。對(duì)于MVA-BN,用于人的典型接種劑量包括皮下施用5xl07TCID5。-5xl08TCID5o,例如約lxl08TCID50。依照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，上文定義的痘病毒，例如MVA毒抹，諸如MVA-BN及其衍生物通過(guò)單次施用來(lái)誘導(dǎo)快速保護(hù)性免疫應(yīng)答。臨床數(shù)據(jù)證明，單次接種MVA-BN在幾乎100%的接種個(gè)體中導(dǎo)致可檢測(cè)的免疫應(yīng)答。依照本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，上文定義的痘病毒，例如MVA毒抹，諸如MVA-BN及其衍生物還可用于同源引發(fā)-強(qiáng)化方案，即可將痘病毒諸如MVA用于首次接種，及通過(guò)施用與首次接種中所用相同或相關(guān)的痘病毒毒抹，強(qiáng)化在首次接種中產(chǎn)生的免疫應(yīng)答。上文定義的痘病毒，例如MVA毒抹，諸如MVA-BN及其衍生物還可用于異源引發(fā)-強(qiáng)化方案，其中用上文定義的痘病毒進(jìn)行一次或多次接種并用另一類(lèi)型的疫苗，例如另一種病毒疫苗、蛋白質(zhì)或核酸疫苗進(jìn)行一次或多次接種。施用模式可以是靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、鼻內(nèi)或皮下?？墒褂萌魏纹渌┯媚Ｊ?，i者^(guò)口戈'J痕〉去(scarification)。依照本發(fā)明的痘病毒可以是非重組痘病毒，諸如MVA毒抹，例如MVA-BN及其衍生物。在這種情況中，可進(jìn)行疫苗接種以快速誘導(dǎo)抗痘病毒感染諸如天花的保護(hù)性免疫應(yīng)答。如此，依照本發(fā)明，上文定義的痘病毒，諸如MVA毒林，例如MVA-BN及其衍生物適于快速誘導(dǎo)抗天花的保護(hù)性免疫應(yīng)答。這例示于實(shí)施例1，其中比較了在接種MVA-BN(依照本發(fā)明的一種毒抹)和非MVA毒林諸如Dryvax和Elstree后，在小鼠中產(chǎn)生抗致病性痘苗病毒毒抹的保護(hù)性免疫應(yīng)答需要多長(zhǎng)時(shí)間。與MVA-BN相反，這些毒抹有完全的復(fù)制能力。證明了MVA-BN顯然具有與Elstee和Dyvax相比改良的特性，即給小鼠單次接種MVA-BN在4，3和甚至2天內(nèi)導(dǎo)致顯著的保護(hù)性免疫應(yīng)答。這是通過(guò)例如評(píng)估接種MVA-BN后2、3或4天后，肺中致病性痘苗病毒毒抹西里瑟夫(WesternReserve)(VV-WR)的滴度證實(shí)的。在接種的3天后用12.5xMLD5。VV-WR攻擊小鼠時(shí)，在接種標(biāo)準(zhǔn)劑量MVA-BN的小鼠中檢測(cè)不到VV-WR病毒滴度，而接種Dryvax或Elstree的小鼠不受保護(hù)且具有與未接種疫苗的對(duì)照小鼠非常相似的肺滴度。在接種的4天后用50xMLD5Q攻擊小鼠時(shí)，在接種標(biāo)準(zhǔn)劑量MVA-BN的小鼠中檢測(cè)不到VV-WR病毒滴度，而接種Dryvax或Elstree的小鼠不受保護(hù)且具有與未接種疫苗的對(duì)照小鼠非常相似的肺滴度。術(shù)語(yǔ)"MLD5o"指50%的接種小鼠死亡時(shí)致病性痘苗病毒毒抹的濃度。應(yīng)當(dāng)注意，小鼠數(shù)據(jù)對(duì)人有預(yù)示作用。此外，應(yīng)當(dāng)考慮到自然界中通常不會(huì)存在50倍致死劑量的致病性病毒濃度，特別是對(duì)于誘發(fā)天花的人痘病毒。依照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，術(shù)語(yǔ)"在動(dòng)物(包括人)中快速誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答"優(yōu)選指，在接種本發(fā)明病毒的7天或更短、6天或更短、5天或更短、4天或更短、3天或更短、或甚至2天或更短時(shí)間內(nèi)，產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答。這是出乎意料的，因?yàn)楸绢I(lǐng)域所知的是，產(chǎn)生抗傳統(tǒng)天花疫苗的保護(hù)性免疫應(yīng)答需要至少10-14天，取決于復(fù)制型痘苗病毒毒林。保護(hù)性免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)的快速性可在實(shí)施例部分中所描述的動(dòng)物模型中評(píng)估。所述模型對(duì)人也有預(yù)示作用。如此，依照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，當(dāng)根據(jù)實(shí)施例部分中所描述的測(cè)試系統(tǒng)的測(cè)定，在給小鼠接種有效量的痘病毒疫苗諸如MVA,例如MVA-BN及其衍生物，并在接種的4天后分別用lx、12.5x和50xMLD50VV-WR攻擊后，肺中的病毒滴度平均低于5xl(^pfU(對(duì)應(yīng)于log3.69),那么痘病毒疫苗在小鼠中有效誘導(dǎo)快速免疫應(yīng)答?；蛘撸诮臃N有效量的痘病毒疫苗的3天后，分別用lx和12.5xMLD5qVV-WR攻擊后，數(shù)值平均低于5xl03pfu(對(duì)應(yīng)于log3.69)。廣義上，當(dāng)病毒在實(shí)施例中所描述的肺滴度測(cè)定法和體重測(cè)定法中的表現(xiàn)與MVA-BN相似，那么所述病毒在小鼠中快速誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答。如此，實(shí)施例部分中所描述的限制、閾值、條件和參數(shù)一般施例部分中所給出的數(shù)據(jù)和信息顯然一般可用于補(bǔ)充此段中缺失的任何數(shù)據(jù)和信息，例如關(guān)于測(cè)試系統(tǒng)的描述的信息。或者，保護(hù)性免疫應(yīng)答的快速誘導(dǎo)可用下文所解釋的血清轉(zhuǎn)化測(cè)試來(lái)評(píng)估，在此語(yǔ)境中，將觀察到血清轉(zhuǎn)化的時(shí)間點(diǎn)視作保護(hù)性免疫誘導(dǎo)誘導(dǎo)的時(shí)間點(diǎn)。依照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，動(dòng)物(包括人)指就痘病毒感染而言是首次使用的(na'ive)動(dòng)物(包括人)，即從未接觸過(guò)痘病毒且尚未接種痘病毒疫苗的動(dòng)物(包括人)。依照一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案，動(dòng)物(包括人)是接觸過(guò)痘病毒和/或接種過(guò)痘病毒疫苗的動(dòng)物(包括人)。這些動(dòng)物(包括人)已經(jīng)產(chǎn)生抗痘病毒和/或痘病毒疫苗諸如MVA的免疫應(yīng)答。術(shù)語(yǔ)"保護(hù)性免疫應(yīng)答，，意味著接種了疫苗的動(dòng)物能夠控制疫苗接種所針對(duì)的致病因子的感染。通常，形成了"保護(hù)性免疫應(yīng)答"的動(dòng)物只形成輕度至中度的臨床癥狀或者根本沒(méi)有癥狀。通常，具有抗某一因子的"保護(hù)性免疫應(yīng)答"的動(dòng)物不會(huì)由于感染所述因子而死亡。如上文所指出的，MVA-BN或其衍生物用于在人中產(chǎn)生抗天花的保護(hù)性免疫應(yīng)答的濃度為5xl07TCID50-5xl08TCID50,如lx108TCID50，其中所述病毒可皮下或肌肉內(nèi)施用。似乎接種上文定義的痘病毒，諸如MVA毒抹，例如MVA-BN及其衍生(naive)的動(dòng)物(即之前從未接觸過(guò)痘病毒)還是之前曾經(jīng)接觸過(guò)疽病毒(例如經(jīng)疫苗接種)的動(dòng)物。在首次使用(nalive)的動(dòng)物(包括人)中，施用依照本發(fā)明的痘病毒，諸如MVA-BN或其衍生物，有效引發(fā)免疫系統(tǒng)，即使在疫苗接種后的最初幾天可能檢測(cè)不到中和性抗體。致病性病毒的感染強(qiáng)化免疫系統(tǒng)，致使已被有效引發(fā)的免疫系統(tǒng)能出乎意料的有效且快速控制所述感染。如此，曽經(jīng)接種過(guò)本發(fā)明病毒的首次使用的動(dòng)物僅僅在單次接種后就很容易地受到保護(hù)，可以抵抗該接種所針對(duì)的致病性病毒。依照本發(fā)明定義的病毒，諸如MVA-BN及其衍生物及其衍生物，在之前曾經(jīng)接觸過(guò)痘病毒的動(dòng)物中，出乎意料的有效且快速?gòu)?qiáng)化早些時(shí)候的疫苗接種，使得在這種情況中也快速產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答。保護(hù)性免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)的快速性還表現(xiàn)為，給動(dòng)物(包括人)接種本發(fā)明病毒如MVA,例如MVA-BN及其衍生物后，出乎意料的快速血清轉(zhuǎn)化。在非人靈長(zhǎng)類(lèi)中證明了血清轉(zhuǎn)化在短于10天內(nèi)，例如7天內(nèi)發(fā)生，這比接種其它天花疫苗諸如Elstree后的血清轉(zhuǎn)化快了一周。下文描述了如何評(píng)估接種MVA-BN及其衍生物后的血清轉(zhuǎn)化。相同的測(cè)試原理在適當(dāng)變更后也適用于測(cè)試接種其它病毒后的血清轉(zhuǎn)化。評(píng)估由所述其它病毒誘導(dǎo)的血清轉(zhuǎn)化時(shí)，要求的唯一改動(dòng)是，定量測(cè)定對(duì)所述其它病毒特異的總IgG抗體，而非對(duì)MVA-BN特異的總IgG抗體。評(píng)估樣品是否是陽(yáng)性的截留值(cutoffvalue)和標(biāo)準(zhǔn)基本上以相同方式?jīng)Q定，可在本領(lǐng)域技術(shù)人員技術(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行任選的微小修改。為了評(píng)估接種MVA-BN(或其衍生物)后的血清轉(zhuǎn)化，使用直接ELISA定量測(cè)定測(cè)試血清中的MVA-BN⑧特異性總IgG抗體。這種ELISA是用于檢測(cè)血清中抗體的靈敏方法。MVA-BN⑧特異性ELISA是用于檢測(cè)人測(cè)試血清中的總IgG抗體的標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合ELISA。ELISA結(jié)果表述成通過(guò)直接測(cè)定對(duì)數(shù)趨勢(shì)線(logarithmictrendline)得到的終點(diǎn)抗體滴度。截留或終點(diǎn)吸光度定義為0.35。樣品的終點(diǎn)滴度通過(guò)繪制對(duì)數(shù)圖來(lái)測(cè)定，例如使用商品化計(jì)算機(jī)程序Excel(y軸為光密度(OD)，x軸為血清稀釋度的log)。同樣，非人靈長(zhǎng)類(lèi)中的數(shù)據(jù)對(duì)人有預(yù)示作用。當(dāng)測(cè)試樣品在1:50稀釋度時(shí)，其OD大于0.35認(rèn)為該測(cè)試樣品是陽(yáng)性的。幾何平均滴度(geometricmeantitre,GMT)通過(guò)loglO滴度轉(zhuǎn)化的平均值取反對(duì)數(shù)來(lái)計(jì)算。GMT通常為"R告的ELISA滴度。血清轉(zhuǎn)化率定義為，最初為血清陰性但在MVA特異性IgGELISA中表現(xiàn)出抗體滴度>1:50的受試者的百分比。如此，依照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，術(shù)語(yǔ)"在動(dòng)物(包括人)中快速誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答"指，在接種本發(fā)明病毒的10天或更短、7天或更短、6天或更短、5天或更短、4天或更短、3天或更短、或甚至2天或更短時(shí)間內(nèi)，以上文定義的測(cè)試法得出上文定義的血清轉(zhuǎn)化。上文定義的痘病毒，諸如MVA毒抹，例如MVA-BN及其衍生物還可以是重組痘病毒抹，諸如重組MVA-BN或其衍生物。依照本發(fā)明的重組病毒，諸如重組MVA-BN及其衍生物可包含至少一種異源核酸序列。術(shù)語(yǔ)"異源"在下文中用于指核酸序列的任意組合，所述核酸序列在自然界中通常未發(fā)現(xiàn)與所述病毒密切相關(guān)。異源序列可以是抗原性表位或抗原，它們選自任何非痘苗病毒來(lái)源。依照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，所述重組病毒表達(dá)一種或多種抗原性表位或抗原，它們是來(lái)自傳染物的抗原性表位或抗原。傳染物可以是任何傳染物，諸如病毒、真菌、致病性單細(xì)胞真核和/或原核生物體、或寄生生物體。傳染物的例子有瘧原蟲(chóng)(Plasmodiumfalciparum)、分枝桿菌、流感病毒、黃病毒、副粘病毒、肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、引起出血熱的病毒諸如漢坦病毒(Hantavirus)或纖絲病毒(Filovirus),即埃博拉(Ebola)病毒或馬爾堡(Marburg)病毒。依照此實(shí)施方案，上文定義的重組痘病毒不僅可用于誘導(dǎo)抗痘病毒感染的快速免疫應(yīng)答，而且還可(或者備選)用于誘導(dǎo)抗異源抗原性表位/抗原的快速免疫應(yīng)答，所述異源抗原性表位/抗原由重組病毒中所包含的異源核酸表達(dá)。如此，舉例而言，如果重組MVA表達(dá)HIV表位或黃熱病病毒表位，那么該重組MVA可用于誘導(dǎo)分別抗HIV和黃熱病病毒的快速免疫應(yīng)答。重組病毒或可表達(dá)進(jìn)一步提高M(jìn)VA免疫原性的抗原性表位/抗原，這也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。依照本發(fā)明使用的重組病毒還可包含表達(dá)治療性化合物的異源基因/核酸。由病毒中的異源核酸編碼的"治療性化合物"可以是例如具有所需生物學(xué)活性的治療性核酸諸如反義核酸或肽或蛋白質(zhì)。依照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，異源核酸序列的表達(dá)可處于痘病毒啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下。合適的痘病毒啟動(dòng)子的例子有牛痘ATI啟動(dòng)子(見(jiàn)WO03/097844)。依照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，將異源核酸序列插入病毒基因組的非必須區(qū)。依照本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，將異源核酸序列插入MVA基因組的天然缺失位點(diǎn)(公開(kāi)于PCT/EP96/02926)。依照還有一個(gè)備選實(shí)施方案，可將異源序列插入痘病毒基因組的基因間區(qū)域(見(jiàn)WO03/097845)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何將異源序列插入痘病毒基因組的方法。上文為關(guān)于非重組病毒的實(shí)施方案給出的所有定義也適用于關(guān)于重組病毒的實(shí)施方案。發(fā)明概述痘病毒用于制備在動(dòng)物(包括人)中快速誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答的疫苗的用途，其中所述痘病毒在所述動(dòng)物(包括人)中不能復(fù)制。用于在動(dòng)物(包括人)中快速誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法，包括給動(dòng)物(包括人)施用在所述動(dòng)物(包括人)中不能復(fù)制的痘病毒的步驟。如上所述的用途或方法，其中所述保護(hù)性免疫應(yīng)答在7天內(nèi)或更短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生。如上所述的用途或方法，其中所述痘病毒是改良的安卡拉痘苗病毒(MVA)。如上所述的用途或方法，其中所述MVA選自MVA毒林MVA575、MVA572和MVA-BN。如上所述的用途或方法，其中所述病毒是克隆純化的病毒。如上所述的用途或方法，其中所述病毒在無(wú)血清培養(yǎng)過(guò)程中獲得。如上所述的用途或方法，其中所述痘病毒以105-5xl08TCIDM)/ml的劑量施用。如上所述的用途或方法，其中所述痘病毒靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或皮下施用。如上所述的用途或方法，其中所述保護(hù)性免疫應(yīng)答是抗痘病毒感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答。如上所述的用途或方法，其中所述免疫應(yīng)答抗天花感染。如上所述的用途或方法，其中所述痘病毒是重組痘病毒。如上所述的用途或方法，其中所述重組痘病毒包含至少一種異源核酸序列。如上所述的用途或方法，其中所述異源核酸序列是編碼至少一種抗原、抗原性表位、和/或治療性化合物的序列。如上所述的用途或方法，其中所述抗原性表位和/或抗原是傳染物的抗原性表位和/或抗原。如上所述的用途或方法，其中所述傳染物選自病毒、真菌、致病性單細(xì)胞真核和/或原核生物體、寄生生物體。如上所述的用途或方法，其中所述病毒選自流感病毒科、黃病毒科、副粘病毒科、肝炎病毒科、人免疫缺陷病毒科或者來(lái)自引起出血熱的病毒。如上所述的用途或方法，其中所述免疫保護(hù)抗衍生所述抗原性表位和/或抗原的傳染物。附圖簡(jiǎn)述圖1:不同疫苗接種的小鼠在lxMLDs。VV-WR鼻內(nèi)攻擊后的體重變化給BALB/c小鼠皮下接種MVA-BN、Elstree、Dryvax、或鹽水(PBS)4天，或MVA-BN3天或2天，然后每只小鼠用4xl04TCID5QVV-WR攻擊。在攻擊前(第0天)和攻擊后的每一天，在同一時(shí)刻測(cè)量體重。該圖代表每組隨時(shí)間的平均體重變化，使用經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的(第O天作為基線值)各數(shù)值。圖2:不同疫苗接種的小鼠在12.5xMLD50W-WR鼻內(nèi)攻擊后的體重變化給BALB/c小鼠皮下接種MVA-BN、Elstree、Dryvax、或鹽水(PBS)4天，或MVA-BN3天，然后每只小鼠用5xl05TCID5oVV-WR攻擊。在攻擊前(第0天)和攻擊后的每一天，在同一時(shí)刻測(cè)量體重。該圖代表每組隨時(shí)間的平均體重變化，使用經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的(第O天作為基線值)各數(shù)值。圖3:不同疫苗接種的小鼠在50xMLDsoVV-WR鼻內(nèi)攻擊后的體重變化給BALB/c小鼠皮下接種MVA-BN、Elstree、Dryvax、或鹽水(PBS)4天，或MVA-BN3天，然后每只小鼠用2xl06TCID5qVV-WR攻擊。在攻擊前(第0天)和攻擊后的每一天，在同一時(shí)刻測(cè)量體重。該圖代表每組隨時(shí)間的平均體重變化，使用經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的(第o天作為基線值)各數(shù)值。圖4、5和6:lxMLD50VV-WR(圖4)、12.5xMLDS0VV-WR(圖5)或50xMLDsoVV-WR(圖6)鼻內(nèi)攻擊后死亡或處死時(shí)肺的病毒載量自每只動(dòng)物收集肺，并使用標(biāo)準(zhǔn)噬斑測(cè)定法在Vero細(xì)胞上測(cè)定病毒載量。條代表每組平均肺滴度士標(biāo)準(zhǔn)誤差。實(shí)施例下面的實(shí)施例將進(jìn)一步例證本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員將完全理解，所提供的實(shí)施例絕非解釋為將本發(fā)明所提供的技術(shù)的適用性限于此實(shí)施例。實(shí)施例1:接種了MVA-BN、Elstrce或DryVax的小鼠中用lx、12.5x或50xMLDso痘苗病毒西里瑟夫(VV-WR)攻擊后保護(hù)作用的發(fā)起1.引言開(kāi)發(fā)了鼠鼻內(nèi)牛痘攻擊模型來(lái)測(cè)試天花疫苗候選物的功效。在此模型中，給小鼠接種要測(cè)定功效的疫苗。對(duì)照小鼠接受鹽水對(duì)照代替疫苗。接種疫苗后幾天，用致病性痘苗病毒毒抹諸如痘苗病毒毒抹西里瑟夫(VV-WR)感染小鼠。痘苗病毒毒抹西里瑟夫(VV-WR)的鼠致死劑量50(MLDso)在未接種疫苗的小鼠中測(cè)定為3.6xl04TCID50。在一項(xiàng)初步研究中證明，接種MVA-BN的BALB/c小鼠受到25x或50xMLD5。VV-WR攻擊后，迅速?gòu)脑摬《竟糁谢謴?fù)，不顯示臨床癥狀的明顯征候，而且這些動(dòng)物的肺中不存在病理?yè)p傷。在另一項(xiàng)初步研究中，調(diào)查了接種疫苗后從VV-WR的致死攻擊建立保護(hù)作用所需要的時(shí)間給小鼠接種MVA-BN,3天后用亞致死劑量的VV-WR(5x103TCID5q/小鼠)攻去，結(jié)果顯示出保護(hù)作用(在體重降低和病毒肺滴度方面)。此實(shí)施例的目標(biāo)是縮短MVA-BN⑧(或Elstree或Dryvax)接種后在VV-WR的致死攻擊后獲得保護(hù)所需要的時(shí)間。2.病毒和對(duì)照觀寸試疫苗1改良的安卡拉(Ankara)-BavarianNordic痘苗病毒(MVA-BN),濃度為5.0E+08TCID50/ml。配制在10mMTris140mMNaClpH7.4中。在MVA-BN接種組中，MVA-BN⑧原種(stock)不做進(jìn)一步稀釋?zhuān)は率┯?00jil，導(dǎo)致最終劑量為1.0E+08TCID50。測(cè)試疫苗2痘苗病毒毒抹Elstree，標(biāo)稱(chēng)濃度為1.0E+08TCID5()/ml;配制在10mMTris140mMNaClpH7.4中。Elstree原種不做進(jìn)一步稀釋?zhuān)恐恍∈笤谖膊客ㄟ^(guò)劃痕法施用2.5jil，導(dǎo)致最終劑量為2.5E+05TCID50。測(cè)試疫苗3DryVax,標(biāo)稱(chēng)濃度為2.9E+07TCID5Q/ml;配制在lOmMTris140mMNaClpH7.4中。DryVax原種不做進(jìn)一步稀釋?zhuān)恐恍∈笤谖膊客ㄟ^(guò)劃痕法施用8pl，導(dǎo)致最終劑量為2.5E+05TCID50。測(cè)試疫苗1-3都是以其最佳施用劑量和路徑施用的。攻擊病毒痘苗病毒西里瑟夫(VV-WR),標(biāo)稱(chēng)濃度為4.0E+08TCID5()/ml。對(duì)VV-WR(4.0E+08TCIDM)/ml)進(jìn)行如下稀釋以產(chǎn)生最終工作儲(chǔ)液(finalworkingstock),8.0E+04TCID50/ml和4.0E+07TCID50/ml:對(duì)于lxMLD50VV-WR/小鼠(8.0E+05TCID5()/ml工作儲(chǔ)液懸浮液)將100|tilVV-WR原種4.0E+08TCID5o/ml加到90(^1PBS中，通過(guò)旋渦震蕩混勻(以產(chǎn)生4.0E+07TCID5Q/ml的濃度)，將lOOpl此懸浮液轉(zhuǎn)移到900|alPBS中，再次通過(guò)旋渦震蕩混勻(以產(chǎn)生4.0E+06TCID5o/ml的濃度)，將600pl此懸浮液加到2400|ilPBS中，通過(guò)旋渦震蕩混勻以產(chǎn)生8.0E+05TCID50/ml的終濃度。對(duì)于50xMLD50VV-WR/小鼠(4.0E+07TCID50/ml工作儲(chǔ)液懸浮液)將300^1VV-WR原種4.0E+08TCID50/ml力口到2700|ilPBS中并通過(guò)旋渦震蕩混勻以產(chǎn)生4.0E+07TCID50/ml的終濃度。鹽水對(duì)照在鹽水對(duì)照組中，將200|ilPBS(由制造商供應(yīng))用于皮下注射各只小鼠。3.方法和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)測(cè)試系統(tǒng)無(wú)特定病原體(SpedficPathogenFree,SPF)的雌性Balb/c小鼠H-2d獲自TaconicM&B,P.O.Box1079,DK-8680Ry,Denmark。研究中的動(dòng)物數(shù)60。攻擊開(kāi)始時(shí)的年齡9周。攻擊開(kāi)始時(shí)的體重范圍18-23克。BALB/c小鼠品系廣泛用于測(cè)試天花疫苗的免疫原性和功效。該品系對(duì)VV-WR攻擊高度易感。實(shí)驗(yàn)^f衣照丹麥的Dyrefors0gstilsynet進(jìn)4亍。處理組的分配在到達(dá)時(shí)，將動(dòng)物隨機(jī)分配到處理組，每個(gè)測(cè)試組(和籠)由5只動(dòng)物組成。劑量水平的論證MVA-BN⑧以在先實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)證明的在小鼠中誘導(dǎo)體液和細(xì)胞介導(dǎo)的強(qiáng)免疫應(yīng)答的最佳劑量使用。Elstree和Dryvax以建議的人用劑量使用。接種和攻擊時(shí)間表此項(xiàng)研究中使用了總共80只小鼠(見(jiàn)下表)。在接種MVA-BN、或Elstree、或Dryvax的4天后，用lx、12.5x或50xMLD50VV-WR攻擊小鼠。在另外的組中，在接種MVA-BN⑧的3天后，用lx、12.5x或50xMLD50VV-WR攻擊小鼠，或者在接種MVA-BN⑧的2天后，用lxMLD5。VV-WR攻擊小鼠。在對(duì)照組中，用lx、12.5x或50xMLD5()VV-WR攻擊沒(méi)有進(jìn)行預(yù)先接種的小鼠。接受lx和12.5x或者50xMLD50VV-WR的對(duì)照動(dòng)物分別在攻擊的5天或者4天后，當(dāng)體重比最初降低20。/。以上或者動(dòng)物呼吸困難時(shí)處死。這是為了減輕痛苦。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>組大小的論證研究的主要終點(diǎn)是通過(guò)鼻內(nèi)VV-WR攻擊后第4或5天的保護(hù)水平測(cè)定的功效。根據(jù)先前的臨床前實(shí)驗(yàn)，假設(shè)在攻擊后疫苗接種組的至少95%受到保護(hù)，而安慰劑處理組的不超過(guò)5°/。受到保護(hù)。使用費(fèi)歇爾精確檢驗(yàn)(Fisher'sExacttest),5對(duì)5的組容量大小足以在雙側(cè)(two-sided)顯著性水平a=0.05時(shí)證明顯著差異，且power大于80%。施用測(cè)試物品進(jìn)行疫苗接種在微生物學(xué)安全櫥(SW100040/classII,HoltenLaminAir)中進(jìn)行接種。使用1ml29G結(jié)核菌素胰島素注射器(Temmo)在后腿的皮膚皺紋中經(jīng)皮下路徑給小鼠接種200WMVA-BN(lxlO8TCID5o/ml)或鹽水對(duì)照(200ji1PBS)。接受Elstree和DryVax的小鼠在尾部劃痕前麻醉配制含75mg氯胺酮(Ketamine)、5mg賽拉嗪(Xylazine)和水的新鮮混合液，使用lml27G胰島素注射器經(jīng)皮下路徑施用80|il麻醉劑。屬于一個(gè)籠子的所有小鼠在施用疫苗前麻醉。經(jīng)尾部劃痕施用2.5pl或8^1EIstree或Dryvax。肺攻擊模型在微生物安全櫥(SW100040/classII,HoltenLaminAir)中經(jīng)鼻內(nèi)路徑將測(cè)試物品(即VV-WR)施用于麻醉的小鼠。配制75mg氯胺酮(Ketamine)、5mg賽拉嗪(Xylazine)在水中的新鮮混合液作為麻醉劑。使用lml29G胰島素注射器經(jīng)皮下路徑施用80pl該麻醉劑。屬于一個(gè)籠子的所有小鼠在施用VV-WR測(cè)試物品前麻醉。在微生物安全櫥(SW100040/classII，HoltenLaminAir)中進(jìn)行鼻內(nèi)攻擊。從冰上取出攻擊病毒工作稀釋液(workingdilution),通過(guò)輕輕旋渦震蕩幾秒鐘來(lái)混勻。使用lOOpl移液器(pipette)量取稀釋的VV-WR測(cè)試物品。抓住麻醉小鼠頸后的皮/毛，用同一只手的手掌握住小鼠的軀體。將測(cè)試項(xiàng)目緩慢加到小鼠的單個(gè)鼻孔中。如上所述掌握小鼠直至停止喘氣。在攻擊前(第0天)和攻擊后每一天觀察動(dòng)物，以監(jiān)測(cè)健康變壞的任何征候。在攻擊前(第0天)和攻擊后每一天測(cè)量體重，直至尸^r那天，以監(jiān)測(cè)疾病的進(jìn)展。接受50xMLD5。VV-WR的鹽水組由于在攻擊后第4天超過(guò)了Dyrefors0gstilsyn設(shè)定的體重截留值而處死。接受lx或12.5xMLD5。VV-WR的鹽水組由于在攻擊后第5天超過(guò)了Dyrefors0gstilsyn設(shè)定的體重截留值而處死。用lxMLDsoVV-WR攻擊的疫苗接種小鼠在攻擊后第5天處死，而用12.5x或50xMLD5。VV-WR攻擊的MVA-BN⑧接種小鼠最晚在攻擊后第8天處死。耳又出肺，使用標(biāo)準(zhǔn)噬斑測(cè)定法在Vera細(xì)胞上測(cè)定肺中的病毒總量。在肺滴度低于5xl03pfti時(shí)，認(rèn)為動(dòng)物受到完全保護(hù)，該滴度是在Vero細(xì)胞上使用我們的病毒滴定法能檢測(cè)到的最低滴度。4.結(jié)果和討論體重變化在此項(xiàng)研究的一些組中調(diào)查了接種不同天花疫苗對(duì)其后4天用lxMLD5。痘苗病毒毒抹西里瑟夫(VV-WR)攻擊后體重的影響。如圖1所示，用lxMLD5QVV-WR攻擊的未接種疫苗(鹽水對(duì)照)的小鼠組在攻擊后3天可首次檢測(cè)到體重降低。體重繼續(xù)降低，直至在第5天處死時(shí)比平均初始體重平均低20.9%。在用VV-WR攻擊前4天接種Elstree或Dryvax的組中檢測(cè)到類(lèi)似的體重降低這些組中處死那天的平均體重比初始平均體重分別低23.2%或21.1%。在用VV-WR攻擊前2天接種MVA-BN⑧的組中，在攻擊后2天檢測(cè)到首次體重降低(大約比平均初始體重降低4%)。在這組中平均體重繼續(xù)降低，直至攻擊后第4天的平均體重比初始平均體重4氐17.6%。攻擊后第5天，平均體重不再降低，此時(shí)比初始平均體重〗氐16.7%。在攻擊前3天接種MVA-BN⑧的組中，從攻擊后第3天開(kāi)始只檢測(cè)到體重的輕微降低，攻擊后第4天最多，為比初始體重低4.2%。在這組中，體重在第5天恢復(fù)至初始值。攻擊前4天接種MVA-BN⑧的小鼠組在用lxMLD5。VV-WR攻擊后不顯示出任何體重降低。在第二批小組中，用12.5xMLD5()VV-WR攻擊小鼠，再次監(jiān)測(cè)攻擊前和攻擊后每一天的小鼠體重。如圖2所示，未接種疫苗(鹽水對(duì)照)的小鼠組在攻擊后2天可首次檢測(cè)到體重降低。體重繼續(xù)降低，直至在第5天處死時(shí)比平均初始體重平均低23.3%。如此，比用lxMLDs。VV-WR攻擊的未接種疫苗組早1天可檢測(cè)到體重降低，而且在處死那天更加顯著(見(jiàn)圖1)。在用VV-WR攻擊前4天接種Elstree或Dryvax的組中，檢測(cè)到與未接種疫苗的小鼠類(lèi)似的體重降低。在用VV-WR攻擊前3天接種MVA-BN⑧的組中，在攻擊后2天檢測(cè)到首次輕微體重降低(大約比平均初始體重低1.7%)。在這組中平均體重繼續(xù)降低，直至攻擊后第4天的平均體重比初始平均體重低16.1%。此后，在這組中平均體重開(kāi)始恢復(fù)，在攻擊后第8天^^測(cè)到平均體重比平均初始體重低2.3%。在攻擊前4天接種MVA-BN⑧的小鼠組中，檢測(cè)到與平均初始體重相比10.8%的平均體重降低。在攻擊后第3天檢測(cè)到13.8%的平均體重降低最大值。在隨后幾天了觀察到體重的恢復(fù)，在攻擊后8天觀察到與攻擊前相似的平均體重。在第三批小組中，用50xMLD5QVV-WR攻擊小鼠，再次監(jiān)測(cè)攻擊前和攻擊后每一天的小鼠體重。如圖3所示，未接種疫苗(鹽水對(duì)照)的小鼠組早在攻擊后1天就可首次檢測(cè)到體重降低。平均體重繼續(xù)降低，直至在第4天處死時(shí)比平均初始體重平均低20.1%。如此，分別比用lx或12.5xMLD50VV-WR攻擊的未接種疫苗組早2天或1天可檢測(cè)到體重降低。接種Elstree或Dryvax的組在攻擊后2天開(kāi)始可檢測(cè)到體重降低，到攻擊后第4天時(shí)這些組中的小鼠分別揭示出相對(duì)于初始體重20.1%或19.7%的平均體重降低。在用VV-WR攻擊前3天接種MVA-BN⑧的組中，在攻擊后第1天檢測(cè)到首次體重降低(大約比平均初始體重低1.6%)。在這組中平均體重繼續(xù)降低，直至攻擊后第4天處死時(shí)平均體重比初始平均體重4氐24.0%。在攻擊前4天才妄種MVA-BN⑧的小鼠組中，在攻擊后第1天可檢測(cè)到首次體重降低，平均體重繼續(xù)降低，在攻擊后第4天比平均初始體重低22.5%。在隨后幾天了檢測(cè)到體重的恢復(fù)，在攻擊后8天檢測(cè)到比平均初始體重低5.1%的平均體重。肺滴度在小鼠死亡或處死后，取出肺，使用標(biāo)準(zhǔn)噬斑測(cè)定法在Vero細(xì)l包上測(cè)定該組織中病毒總量。在肺滴度低于1ogl03.69(5xl()Spfli)時(shí)，認(rèn)為動(dòng)物受到完全保護(hù)，該滴度是在Vero細(xì)胞上使用我們的病毒滴定法能檢測(cè)到的最低滴度。在第一批小組中，比較了用lxMLDsoVV-WR攻擊的小鼠。如圖4所示，未接種疫苗的小鼠揭示出1ogl07.81的平均病毒載量。在攻擊前4天接種Elstree或Dryvax的小鼠揭示出loglO7.75和loglO6.68的平均肺病毒載量。如此，接種Elstree的小鼠不能阻止肺部病毒感染，接種Dryvax的小鼠只能在一定程度上阻止肺部病毒感染。在攻擊前4天接種MVA-BN⑧的小鼠組中，在用lxMLDs。VV-WR鼻內(nèi)攻擊后，檢測(cè)不到肺病毒滴度，如此受到抵抗病毒感染的完全保護(hù)。將MVA-BN⑧接種和VV-WR攻擊之間的時(shí)間間隔從4天縮短至3或2天，分別將每組病毒陽(yáng)性肺數(shù)目提高至5只中l(wèi)只或5只中4只,平均肺病毒滴度分別為loglO3.77或logl04.68。在第二批小組中，比較了用12.5xMLD5()VV-WR攻擊的小鼠。如圖5所示，未接種疫苗的小鼠揭示出loglO8.38的平均病毒載量。在攻擊前4天接種Elstree或Dryvax的小鼠揭示出loglO8.17和log108.00的平均肺病毒載量。如此，接種Elstree和Dryvax的小鼠不能阻止肺部病毒感染。在攻擊前4或3天接種MVA-BN⑧的小鼠組中，在用12.5xMLD50VV-WR鼻內(nèi)攻擊后，檢測(cè)不到肺病毒滴度，如此受到抵抗病毒感染的完全保護(hù)。在第三批小組中，比較了用50xMLD5QVV-WR攻擊的小鼠。如圖6所示，未接種疫苗的小鼠揭示出loglO8.59的平均病毒載量。在攻擊前4天接種Elstree或Dryvax的小鼠揭示出loglO8.49和loglO8.25的平均肺病毒載量。如此，接種Elstree和Dryvax的小鼠不能阻止肺部病毒感染。在接種MVA-BN⑧的小鼠組中，在攻擊前4天施行接種，則檢測(cè)不到肺病毒滴度。因此，這些小鼠在用50xMLD5oVV-WR鼻內(nèi)攻擊后受到抵抗病毒感染的完全保護(hù)。在MVA-BN⑧接種和VV-WR攻擊之間的時(shí)間間隔為3天的小鼠組中，平均肺病毒載量經(jīng)測(cè)定為loglO7.63。如此，這組只在一定程度上受到抵抗病毒感染的保護(hù)。5.結(jié)論在此項(xiàng)研究中，測(cè)定了體重降低以及病毒肺滴度這兩方面的恢復(fù)情況，以指示抵抗VV-WR致死鼻內(nèi)攻擊的"保護(hù)作用"。用lx、12.5x或50xMLD5QVV-WR攻擊的對(duì)照動(dòng)物揭示出連續(xù)的體重降低，且死后尸檢(postmortem)發(fā)現(xiàn)肺中具有高病毒載量(攻擊劑量越高，肺中檢測(cè)到的病毒載量越高)。故這些小鼠不能控制感染。天花疫苗候選物IMVAMUNETM(MVA-BN⑧)能夠提供抵抗高達(dá)50xMLD5。VV-WR的鼻內(nèi)攻擊的保護(hù)作用。這種保護(hù)作用伴有初始體重降低后的體重恢復(fù)，以及肺中無(wú)病毒的狀態(tài)。VV-WR的攻擊劑量越高，攻擊前4天接種MVA-BN⑧的小鼠中體重恢復(fù)需要的攻擊后時(shí)期越長(zhǎng)在用12.5xMLD5QVV-WR攻擊時(shí)，在攻擊后第4天檢測(cè)到體重恢復(fù)，而在用50xMLD50VV-WR攻擊小鼠時(shí)，在攻擊后第5天檢測(cè)到體重恢復(fù)。另外，此項(xiàng)研究清楚揭示了，給小鼠接種MVA-BN⑧和用lxMLD5QVV-WR攻擊之間的時(shí)間間隔可縮短至2天，該時(shí)間間隔足以在用lxMLD5oVV-WR攻擊后能夠穩(wěn)定體重并降低肺病毒滴度。另外，提高攻擊劑量導(dǎo)致獲得抵抗致死攻擊的保護(hù)作用所需要的、MVA-BN⑧接種和攻擊之間的時(shí)間間隔延長(zhǎng)在用50xMLD50VV-WR攻擊的情況中，3天間隔不足以獲得保護(hù)作用，而在用12.5xMLD50VV-WR攻擊后，接種和攻擊之間的3天間隔足以獲得保護(hù)作用。與MVA-BN⑧相反，第一代和第二代天花疫苗，分別是Dryvax和Elstree，在攻擊前4天施用時(shí)不能提供抵抗高達(dá)50xMLD5QW-WR的鼻內(nèi)攻擊的保護(hù)作用。這種差異的原因可能是由于施用的路徑不同MVA-BN⑧是皮下施用于小鼠(及在臨床試驗(yàn)中施用于人)的，而Elstree和Dryvax是經(jīng)劃痕法施用于小鼠(及施用于人)的?？傊?，此項(xiàng)研究清楚證明了MVA-BN⑧較之Elstree和Dryvax在？1起保護(hù)作用方面的優(yōu)越性。權(quán)利要求1.痘病毒用于制備疫苗的用途，所述疫苗在動(dòng)物包括人中快速誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答，其中所述痘病毒在所述動(dòng)物包括人中不能復(fù)制。2.依照權(quán)利要求1的用途，其中所述保護(hù)性免疫應(yīng)答在7天內(nèi)或更短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生。3.依照權(quán)利要求1或2的用途，其中所述痘病毒是改良的安卡拉痘苗病毒(MVA)。4.依照權(quán)利要求3的用途，其中所述MVA選自MVA病毒抹MVA575、MVA572和MVA-BN。5.依照權(quán)利要求l-4任一項(xiàng)的用途，其中所述病毒是克隆純化的病毒。6.依照權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的用途，其中所述病毒在無(wú)血清培養(yǎng)過(guò)程中獲得。7.依照權(quán)利要求3-6任一項(xiàng)的用途，其中所述痘病毒是用量為105-5xl08TCID5。/ml的痘病毒。8.依照權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的用途，其中所述痘病毒是靜脈施用、肌肉施用或皮下施用的痘病毒。9.依照權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的用途，其中所述保護(hù)性免疫應(yīng)答是抗痘病毒感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答。10.依照權(quán)利要求9的用途，其中所述免疫應(yīng)答是抗天花感染的免疫應(yīng)答。11.依照權(quán)利要求l-10任一項(xiàng)的用途，其中所述痘病毒是重組痘病毒。12.依照權(quán)利要求11的用途，其中所述重組痘病毒包含至少一種異源核酸序列。13.依照權(quán)利要求12的用途，其中所述異源核酸序列是編碼至少一種抗原、抗原性表位、和/或治療性化合物的序列。14.依照權(quán)利要求13的用途，其中所述抗原性表位和/或抗原是傳染物的抗原性表位和/或抗原。15.依照權(quán)利要求14的用途，其中所述傳染物選自病毒、真菌、致病性單細(xì)胞真核和/或原核生物體、寄生生物體。16.依照權(quán)利要求15的用途，其中所述病毒選自流感病毒科、黃病毒科、副粘病毒科、肝炎病毒科、人免疫缺陷病毒科或者引起出血熱的病毒。17.依照權(quán)利要求14-16任一項(xiàng)的用途，其中所述免疫保護(hù)是抵抗產(chǎn)生所述抗原性表位和/或抗原的傳染物的免疫保護(hù)。18.動(dòng)物包括人施用在所述動(dòng)物包括人中不能復(fù)制的痘病毒的步驟。19.依照權(quán)利要求18的方法，其中所述保護(hù)性免疫應(yīng)答在7天內(nèi)或更短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生。20.依照權(quán)利要求18或19的方法，其中所述痘病毒是改良的安卡拉痘苗病毒(MVA)。21.依照權(quán)利要求20的方法，其中所述MVA選自MVA病毒抹MVA575、MVA572和MVA-BN。22.依照權(quán)利要求18-21任一項(xiàng)的方法，其中所述病毒是克隆純化的病毒。23.依照權(quán)利要求18-22任一項(xiàng)的方法，其中所述病毒在無(wú)血清培養(yǎng)過(guò)程中獲得。24.依照權(quán)利要求20-23任一項(xiàng)的方法，其中所述痘病毒是用量為105-5xl08TCID5。/ml的痘病毒。25.依照權(quán)利要求18-24任一項(xiàng)的方法，其中所述痘病毒是靜脈施用、肌肉施用或皮下施用的痘病毒。26.依照權(quán)利要求18-25任一項(xiàng)的方法，其中所述保護(hù)性免疫應(yīng)答是抗痘病毒感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答。27.依照權(quán)利要求26的方法，其中所述免疫應(yīng)答是抗天花感染的免疫應(yīng)答。28.依照權(quán)利要求18-27任一項(xiàng)的方法，其中所述痘病毒是重組痘病毒。29.依照權(quán)利要求28的方法，其中所述重組痘病毒包含至少一種異源核酸序列。30.依照權(quán)利要求29的方法，其中所述異源核酸序列是編碼至少一種抗原、抗原性表位、和/或治療性化合物的序列。31.依照權(quán)利要求30的方法，其中所述抗原性表位和/或抗原是傳染物的抗原性表位和/或抗原。32.依照權(quán)利要求31的方法，其中所述傳染物選自病毒、真菌、致病性單細(xì)胞真核和/或原核生物體、寄生生物體。33.依照權(quán)利要求32的方法，其中所述病毒選自流感病毒科、黃病毒科、副粘病毒科、肝炎病毒科、人免疫缺陷病毒科或者引起出血熱的病毒。34.依照權(quán)利要求31-33任一項(xiàng)的方法，其中所述免疫保護(hù)是抵抗產(chǎn)生所述抗原性表位和/或抗原的傳染物的免疫保護(hù)。全文摘要本發(fā)明涉及，通過(guò)給動(dòng)物(包括人)接種在所述動(dòng)物(包括人)中不能復(fù)制的痘病毒，來(lái)快速誘導(dǎo)抗痘病毒和痘病毒感染(如天花)的保護(hù)性免疫應(yīng)答。此類(lèi)痘病毒的例子有改良的安卡拉痘苗病毒(MVA)。本發(fā)明還涉及重組痘病毒(如重組MVA)快速誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答的用途，所述病毒在接種該病毒的動(dòng)物(包括人)中不能復(fù)制、但表達(dá)異源抗原和/或抗原性表位，所述免疫應(yīng)答是抗所述異源抗原和/或抗原性表位(例如作為傳染物一部分的抗原和/或抗原性表位)的保護(hù)性免疫應(yīng)答。文檔編號(hào)A61K39/29GK101128217SQ200680005875公開(kāi)日2008年2月20日申請(qǐng)日期2006年2月17日優(yōu)先權(quán)日2005年2月23日發(fā)明者保羅·查普林,路易斯·梅特奧申請(qǐng)人:巴法里安諾迪克有限公司