專利名稱：一種具有抗血管新生協同作用的中藥有效成分組合配方的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于藥物配方技術領域，特別涉及一種具有抗血管新生協同作用的中藥有效成分組合配方。
背景技術：
“血管新生”(新生血管形成)是類風濕性關節(jié)炎(RA)、腫瘤等危害人民生命健康的重大疾病的共性病理環(huán)節(jié)?？寡苄律幬锸亲钄囝愶L濕性關節(jié)炎病變進程，“餓死腫瘤”(治療實體腫瘤)等疾病發(fā)生發(fā)展的重要途徑。以類風濕性關節(jié)炎為例，目前，在中國類風濕藥物市場上主要為非甾體類抗炎藥物、慢作用藥物和中成藥。目前專用于治療類風濕性關節(jié)炎中藥以中成藥為主，包括以下12種風濕寒痛片，痹苦乃停片，麝香丸，血痹大易方，防風丸，痹隆清安片，正清風痛寧，石楠散，燥濕化痰丸，虎骨丸，益腎蠲痹丸，活血丹。以上中成藥處方較大，特色不突出，同時作用機理不夠明確。成份較為明確的中藥提取物主要為昆明山海棠片，雷公藤總苷片，該二藥具有免疫抑制作用，但其嚴重的胃腸道、腎臟和生殖毒性卻限制了它們的應用，同時也面臨自然資源枯竭的問題。
“清絡飲”是一種用于治療類風濕性關節(jié)炎中藥復方。其主要藥物組成為苦參，青風藤，黃柏，粉萆。該方由李濟仁教授、張舜華主任醫(yī)師長期臨床實踐經驗所得。經現代藥理學實驗表明，“清絡飲”方劑具有抗炎、減少滑膜毛細血管新生、防止血管翳的形成，改善軟骨破壞、減輕滑膜細胞亢進的分泌功能及代謝活性，并在分子、組織、病理等多層次上表現出抑制“血管新生”的顯著效果，被國際上認為是目前進行中醫(yī)方劑與血管新生的代表性研究之一。因此，“清絡飲”作為標本兼治、特點突出、安全的抗血管新生相關病種如類風濕性關節(jié)炎等疾病的中藥，具有充足的成長動力和充分的成長空間。
然而，“清絡飲”復方的藥物成份復雜，同時方劑之間不是藥物成份的單純迭加，各成份間還存在著復雜的相互作用。因此采用中藥飲片形式進行配伍的原有“清絡飲”復方存在成分繁雜，質量難以控制，藥效物質基礎不明確，藥物作用機理不清晰等現有中藥方劑所普遍存在的諸多不足與局限。
總的看來，目前抗血管新生相關疾病(類風濕性關節(jié)炎)的治療現狀是(1)尚缺乏治療類風濕性關節(jié)炎的有效中藥。(2)沒有以抗血管新生為特點的治療類風濕性關節(jié)炎的中成藥及中藥制劑。(3)沒有以中藥有效組合形式申報專利的抗血管新生相關疾病的中藥組合。(4)面對患者人群龐大且不斷增長的類風濕性關節(jié)炎等血管新生相關疾病的市場，治療需求遠未得到滿足。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是為克服已有技術的不足之處，提出一種具有抗血管新生協同作用的中藥有效成分組合配方，該配方是中藥“清絡飲”復方飲片配伍中提取的，具有“增效減毒”的效果，對類風濕性關節(jié)炎、實體腫瘤等血管新生相關疾病具有明顯的治療作用，且藥效物質基礎明確，同時又保存了傳統中藥方劑配伍的特性。
本發(fā)明提出的具有抗血管新生協同作用的中藥有效成分組合配方，其特征在于由苦參堿與青藤堿混合而成，該兩種成分的用量比例為苦參堿∶青藤堿＝1∶0.05～1。
上述配方的臨床一次用量為苦參堿總量44.69mg～191.48mg，青藤堿對應的范圍為2.23mg～191.48mg。
本配方還可作用于其它對象(動物、細胞等)的用量，可按照藥理實驗公式推廣使用。
上述也可由苦參堿與青藤堿中的衍生物或鹽類混合而成，其用量按衍生物或鹽類的分子量推算。
本發(fā)明的組合配方可采用常規(guī)的制備方法制成中、西藥的各種劑型。
本發(fā)明所述苦參堿(別名母菊堿，英文名matrine)與青藤堿(或稱鹽酸青藤堿能夠對類風濕性關節(jié)炎、實體腫瘤等血管新生相關疾病發(fā)揮治療作用，同時在苦參堿與青藤堿的作用上存在“增效減毒”的交互作用。
苦參堿(別名母菊堿、a-苦參堿；英文名matrine、(+)-Matrine、α-Matrine)，分子式為C15H24N2O；分子量為248.36；結構式為 苦參堿(Matrine)結構式青藤堿(或稱鹽酸青藤堿Sinomenine hydrochloride；別名青風堿、防己堿、毛防己堿；英文名sinomenine，Cucoline)，分子式為C19H23N04；分子量為329.39；結構式為 青藤堿(Sinomenine)結構式本發(fā)明的技術特點及效果(1)采用液相色譜-質譜連用分析技術，通過對實驗動物口服“清絡飲”水煎液后，不同時間點血漿中的藥物成分分析，發(fā)現“清絡飲”經代謝吸收入血的成分主要為苦參堿和青藤堿。同時，細胞實驗顯示苦參堿和青藤堿具有較強的抗血管增生藥理活性，二者的適當組合具有“增效減毒”的協同作用效果。因此，苦參堿和青藤堿應為“清絡飲”的主要藥效物質。
(2)在配方比例上，通過“清絡飲”單味藥及全方水煎液中，對苦參堿和青藤堿等生物堿含量進行高效液相(HPLC)分析測定，同時考慮到氧化苦參堿在體內轉化為苦參堿，按轉化率為50％～100％，得到苦參堿與青藤堿組合的比例為(53.04∶28.81)～(92.83∶28.29)，即1.84∶1至3.28∶1之間。考慮到苦參為君藥，在臨床使用時的劑量范圍為10克至25克，因此苦參堿與青藤堿的配比為1∶(0.05～1)，臨床一次口服量為苦參堿44.69mg～191.48mg，青藤堿對應的范圍為2.23mg～～191.48mg。
(3)對于代表血管新生的內皮細胞實驗研究發(fā)現，苦參堿、青藤堿二者均有明顯的抑制內皮細胞增殖作用。通過苦參堿和青藤堿組合的細胞實驗，采用國際公認的等效線方法評價二者抑制作用的交互效應，結果發(fā)現苦參堿和青藤堿上述的比例范疇內，例如1∶0.05、1∶0.22、1∶0.44、1∶1時，均具有抑制內皮細胞增殖的明顯交互作用(詳見實驗三)。以上結果表明苦參堿和青藤堿的組合具有“增效減毒”的交互作用，即與青藤堿的適當地配伍組合，既可使抗血管新生的功效加強，同時又可有效地避免苦參堿用量過大所可能帶來的毒性。動物實驗研究發(fā)現，苦參堿和青藤堿的有效組合對于實驗動物的抗血管新生治療效果與原方“清絡飲”相當，部分方面優(yōu)于原方以及雷公藤總苷片對照組。
具體實施例方式
實施例1其一次用量的配方為苦參堿的劑量為2000μg/ml，青藤堿劑量為100μg/ml，苦參堿和青藤堿的比例為1∶0.05。本實施例抑制內皮細胞增殖的交互作用最強，抑制率達80.16％；實施例2其一次用量的配方為苦參堿的劑量為1350μg/ml，青藤堿劑量為300μg/ml，苦參堿和青藤堿的比例為1∶0.22。本實施例具有抑制內皮細胞增殖的交互作用，抑制率達72.02％；實施例3其一次用量的配方為苦參堿的劑量為888μg/ml，青藤堿劑量為394μg/ml，苦參堿和青藤堿的比例為1∶0.44。本實施例具有抑制內皮細胞增殖的交互作用，抑制率達70.91％；實施例4其一次用量的配方為苦參堿的劑量為445μg/ml，青藤堿劑量為445μg/ml，苦參堿和青藤堿的比例為1∶1。本實施例具有抑制內皮細胞增殖的交互作用，抑制率達54.12％。
本發(fā)明的實驗及效果實驗一 實驗動物口服清絡飲水煎液的入血成分分析實驗方案采用液相色譜-紫外-質聯用儀、高效液相色譜儀等儀器分析方法，對實驗大鼠口服“清絡飲”水煎液后，不同時間點血漿中的藥物成分分析，測試“清絡飲”代謝吸收入血的成分。本實驗分別進行清絡飲水煎液和各單味藥的分析測試、清絡飲樣品與清絡飲加空白血漿樣品分析、空白及含藥(給藥清絡飲濃縮液20min，1h，2h取血)血漿樣品的質譜分析與比較。
實驗結果發(fā)現大鼠灌胃給藥清絡飲后，清絡飲中迅速進入到血漿中的成分主要包括330(青藤堿)和249(苦參堿)，此外尚有少量的205(N-甲基金雀花堿)和247(槐果堿)，可以認為清絡飲最主要的入血成分為青藤堿和苦參堿。因此，我們通過對實驗動物口服“清絡飲”水煎液后，不同時間點血漿中的藥物成分分析，發(fā)現“清絡飲”的經代謝吸收入血的成分主要為苦參堿和青藤堿，故可以推斷清絡飲抗血管新生的主要藥效物質至少包括了苦參堿和青藤堿，為對這兩個成分進行組合研究提供了堅實的科學依據。
實驗二 清絡飲水煎液中苦參堿與青藤堿等生物堿的含量測定實驗方案采用高效液相色譜儀等儀器分析方法，對于清絡飲水煎液及單味藥水煎液中苦參堿(以及在體內可轉化為苦參堿的氧化苦參堿)與青藤堿的含量進行測定。供含量測定對照所用的苦參堿、氧化苦參堿、青藤堿標準品購自中國藥品生物制品檢定所。本實驗所建立的生物堿測試方法在工作曲線濃度范圍內線性關系良好，相關系數(R2)達0.999以上，精密度、穩(wěn)定性、重復性試驗相對標準偏差(RSD)都在3％以內，低中高濃度回收率亦都在94％以上。
實驗結果清絡飲水煎液及單味藥水煎液中苦參堿、氧化苦參堿與青藤堿的含量測試結果見表1。可見合煎后氧化苦參堿的含量下降，而苦參堿的濃度則比單煎時幾乎增加了一倍，青藤堿濃度增加了8.28％。通過應用該法對清絡飲水煎液中相應生物堿含量進行分析測定，同時考慮到氧化苦參堿在體內轉化為苦參堿，按轉化率為50％～100％，可得苦參堿與青藤堿組合的比例為(53.04∶28.81)～(92.83∶28.29)，即1.84∶1～3.28∶1之間。
表1 三個生物堿在清絡飲及其單味藥水煎液中的濃度

變化率，指的是用復方中的濃度與單味藥濃度之差再比上單味藥濃度所得的百分比。
實驗三 苦參堿和青藤堿分子組合交互作用的細胞試驗實驗方案在苦參堿和青藤堿獨立實驗的基礎上，采用實驗設計的方法設計苦參堿和青藤堿不同的劑量與配比組合，運用評價交互作用的經典理論與方法(等效曲線法，反應曲面法)，對苦參堿和青藤堿組合進行抑制人臍靜脈內皮細胞增殖的實驗觀察并繪出量效曲線，以對內皮細胞增殖的半數抑制濃度(IC50)為指標進行交互效應評價。
實驗結果發(fā)現苦參堿、青風藤堿在抗血管新生的作用上，具有明顯的“減毒增效”的協同作用?？鄥A和青藤堿的比例為1∶0.05(苦參堿的劑量為2000μg/ml，青藤堿劑量為100μg/ml)時，抑制內皮細胞增殖的交互作用最強，抑制率達80.16％，相當于單獨使用苦參堿5097.7μg/ml的效果；苦參堿和青藤堿的比例為1∶0.22(苦參堿的劑量為1350μg/ml，青藤堿劑量為300μg/ml)時，具有抑制內皮細胞增殖的交互作用，抑制率達72.02％，相當于單獨使用苦參堿4441.4μg/ml的效果；苦參堿和青藤堿的比例為1∶0.44(苦參堿的劑量為888μg/ml，青藤堿劑量為394μg/ml)時，具有抑制內皮細胞增殖的交互作用，抑制率達70.91％，相當于單獨使用苦參堿4351.9μg/ml的效果；苦參堿和青藤堿的比例為1∶1(苦參堿的劑量為445μg/ml，青藤堿劑量為445μg/ml)時，具有抑制內皮細胞增殖的交互作用，抑制率達54.12％，相當于單獨使用苦參堿2998.2μg/ml的效果。
實驗四 苦參堿和青藤堿組合對膠原誘導性關節(jié)炎大鼠的治療實驗實驗方案采用國際公認的膠原誘導性的關節(jié)炎大鼠(CIA，II型膠原從大鼠軟骨肉瘤組織中獲得，純度達99.99％以上，由瑞典Lund大學提供)模型，隨機分為5組，每組8只，即正常對照組、模型組、雷公藤總苷片治療組(簡稱雷公藤組，為三九醫(yī)藥集團黃石制藥產品)，清絡飲治療組，苦參堿和青藤堿組合治療組(簡稱苦青組)，進行對照實驗。檢測指標包括關節(jié)炎指數(ArthritisIndex，AI)；大鼠踝關節(jié)切片、HE染色后在光鏡下觀察滑膜、軟骨、骨的病理改變；取大鼠血清采用ELISA法進行抗CII抗體含量測定。
實驗結果(1)苦參堿和青藤堿組合組可以顯著降低CIA大鼠在免疫第28天(P＜0.05)、35天(P＜0.01)、42天的關節(jié)炎積分(P＜0.01)，效果相對優(yōu)于清絡飲治療組，與雷公藤總苷片治療組相近。(2)病理光鏡觀察結果可見CIA組關節(jié)腔及滑囊均內可見明顯的滑膜組織增生，滑膜細胞增生呈的乳頭狀，滑膜組織內見有擴張的血管及新生毛細血管及成纖維細胞，并伴有淋巴細胞侵潤。踝關節(jié)各跗骨關節(jié)軟骨的基質及軟骨細胞出現不同程度的退行性，嚴重處軟骨壞死剝脫，變性、壞死剝脫的軟骨表面，可見由滑膜細胞和毛細血管增生所形成的血管翳；膝關節(jié)腔內可見滑膜組織增生，血管翳形成，關節(jié)軟骨見有不同程度的退行性變?？鄥A和青藤堿組合組可以明顯改善CIA的血管新生病變并改善關節(jié)炎癥，表現為增生的滑膜組織內的炎細胞、滑膜細胞及毛細血管數量減少，滑膜組織充血水腫明顯減輕，血管新生受到明顯抑制。但纖維結締組織增生，并有膠原化。仍可見有退變的軟骨組織，未見有新的軟骨壞死及剝脫的軟骨區(qū)，血管翳纖維化。清絡飲組，雷公藤組也能夠不同程度改善CIA的關節(jié)病變。(2)抗CII抗體含量測定結果表明，苦參堿和青藤堿組合可明顯降低CIA大鼠血清異常增高的抗II型膠原抗體含量(P＜0.01)，清絡飲治療組與雷公藤總苷片治療組也有一定改善(P＜0.05)。以上實驗結果綜合表明，苦參堿和青藤堿的有效組合能有效地改善膠原誘導性關節(jié)炎大鼠關節(jié)腫脹，減輕血管翳形成，降低其血清中抗II膠原抗體含量，提示對膠原誘導性關節(jié)炎癥血管新生大鼠具有明顯的治療作用。同時，苦參堿和青藤堿的有效組合對于實驗動物的抗血管新生治療效果與原方“清絡飲”相當，部分方面優(yōu)于原方“清絡飲”以及雷公藤總苷片對照組。
權利要求
1.一種具有抗血管新生協同作用的中藥有效成分組合配方，其特征在于該配方由苦參堿與青藤堿混合而成，該兩種成分的用量比例為苦參堿∶青藤堿＝1∶0.05～1。
2.如權利要求1所述的配方，其特征在于所述配方的臨床一次用量為苦參堿總量44.69mg～191.48mg，青藤堿對應的范圍為2.23mg～191.48mg。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有抗血管新生協同作用的中藥有效成分組合配方，屬于藥物配方技術領域。該配方由苦參堿與青藤堿混合而成，該兩種成分的用量比例為苦參堿∶青藤堿＝1∶0.05～1。本發(fā)明具有“增效減毒”的協同作用效果，對類風濕性關節(jié)炎、實體腫瘤等血管新生相關疾病具有明顯的治療作用，且藥效物質基礎明確，同時又保存了傳統中藥方劑配伍的特性。
文檔編號A61K31/4375GK1965830SQ20061011422
公開日2007年5月23日 申請日期2006年11月2日 優(yōu)先權日2006年11月2日
發(fā)明者李梢, 吳敏 申請人:清華大學