專利名稱：促進(jìn)血管健康的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有多酚例如可可多酚(如矢車菊苷配質(zhì))和至少一種膽固醇降低劑的組合物，以及包括治療和預(yù)防動脈粥樣硬化和心血管疾病的促進(jìn)血管健康的方法。
背景技術(shù)：
冠狀動脈疾病是心血管疾病(CVD)的主要形式，在美國它是目前人死亡的主要原因。冠狀血管疾病名列第三位。冠狀動脈疾病和腦血管疾病兩者的病因都?xì)w因于動脈粥樣硬化癥。通過其臨床表現(xiàn)可知，動脈粥樣硬化是超過一百萬的心臟病發(fā)作的主要原因，每年大約有400,000發(fā)作以及大量的血管循環(huán)問題。許多患者患有高血壓病。
大量事實(shí)確證在高膽固醇血癥和早期動脈粥樣硬化癥之間存在著因果關(guān)系。血漿膽固醇水平越高，其后心臟病發(fā)作的風(fēng)險(xiǎn)越大(見Steinberg，D.，JAMA 2643047(1990))。在導(dǎo)致動脈粥樣硬化的系列過程中，人們相信最初的過程是在頸動脈、冠狀動脈和腦動脈以及在主動脈中形成“脂肪條斑”。這些病變包括主要發(fā)現(xiàn)于內(nèi)膜層平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞內(nèi)的膽固醇和膽固醇酯的脂肪性沉淀。血管平滑肌細(xì)胞的遷移和增殖在脂質(zhì)最初沉淀之后的動脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)理中起著關(guān)鍵作用。
另外，動脈粥樣硬化和心血管疾病的發(fā)展受LDL氧化作用、環(huán)加氧酶(COX)活性、脂氧合酶(LOX)活性、氧化氮(NO)生成和氧化氮合酶(NOS)活性調(diào)節(jié)和/或與之有關(guān)。

圖1中給出由此相關(guān)的各種途徑和過程中的關(guān)系，詳細(xì)內(nèi)容可見國際申請PCT/US97/05693，公開為WO97/36497中的說明，其相關(guān)部分結(jié)合到本發(fā)明中作為參考。簡言之，LDL的氧化作用是當(dāng)巨噬細(xì)胞吸收氧化性改變的LDL并轉(zhuǎn)化成所謂的“泡沫細(xì)胞”時(shí)出現(xiàn)的引發(fā)病變(動脈粥樣化)的關(guān)鍵步驟。酶COX和LOX與花生四烯酸途徑有關(guān)，該途徑引發(fā)前列腺素和血栓烷A2的產(chǎn)生，已知后者能引起血管收縮和血小板聚集，由此引起動脈粥樣硬化的進(jìn)行。已知氧化氮能抑制血小板聚集、單核細(xì)胞的粘附/趨化以及血管平滑肌的增殖，認(rèn)為所有這些都與動脈粥樣硬化的進(jìn)行有關(guān)。已表明可可多酚可通過抑制LDL氧化作用、增強(qiáng)NO/NOS活性和抑制COX/LOX活性，對上述過程具有有益的作用。這些作用可見如公開為WO97/36497的國際專利申請PCT/US97/05693以及該申請中的實(shí)例?？蓪⒖煽啥喾佑糜谥委熁蝾A(yù)防已知通過給予非甾體抗炎藥(如阿司匹林)進(jìn)行治療的疾病。
盡管可可多酚有益于與動脈粥樣硬化和CHD的誘發(fā)和發(fā)展有關(guān)的途徑和癥狀的數(shù)目，但已發(fā)現(xiàn)這些化合物不具有明顯的膽固醇降低作用。因此，本發(fā)明制備一種含有多酚并結(jié)合至少一種膽固醇降低劑的改良組合物。與以前所知的含有多酚或膽固醇降低劑的組合物相比，該組合物對哺乳動物(尤其是人)的血管健康具有改進(jìn)的作用。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及促進(jìn)哺乳動物，尤其是人或動物血管健康的組合物和方法。
一方面，本發(fā)明涉及一種包含可可多酚和膽固醇降低劑的組合物，如食品、食品添加劑、飲食補(bǔ)充劑或藥物。該組合物可任選包含L-精氨酸。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及降低膽固醇的糖果，最優(yōu)選降低膽固醇的巧克力(如黑巧克力)和含有降低膽固醇巧克力的糖果。
在另一方面，本發(fā)明涉及一種促進(jìn)哺乳動物(如人或動物)血管健康的方法，包括預(yù)防或治療動脈粥樣硬化和心血管疾病，該方法包括給予一種包含可可多酚和膽固醇降低化合物以及任選L-精氨酸的組合物。在本發(fā)明的組合物和方法中，還可以與膽固醇降低劑(如基于甾醇和/或甾烷醇(stanol)的膽固醇降低劑)聯(lián)合使用具有與可可多酚類似性質(zhì)的其它來源的多酚。
在另一方面，本發(fā)明涉及一種促進(jìn)多酚(如黃烷醇或黃酮醇)吸收的方法，其通過聯(lián)合給予哺乳動物所述多酚和植物甾醇和/或植物-甾烷醇。本發(fā)明還提供所述方法中使用的組合物和產(chǎn)品的制備法。
圖示簡介圖1是表明冠心病(CHD)發(fā)展的主要影響因素以及表示可可多酚如何預(yù)防該病發(fā)展的示意圖。
圖2A-D表示植物化學(xué)物對BAECS中前列腺素類和內(nèi)皮縮血管肽的基礎(chǔ)內(nèi)皮細(xì)胞合成的影響(*＝與對照組明顯不同p＜0.05)。
圖3A-B表示細(xì)胞種類對前列腺環(huán)素和內(nèi)皮縮血管肽的EC釋放中矢車菊苷配質(zhì)誘發(fā)的變更的影響。
圖4A-C表示在有或無弱激動劑刺激下，可可飲料消耗對活化的GPIIb-IIIa的血小板表面表達(dá)的影響。
圖5A-C表示在有或無弱激動劑刺激下，可可飲料消耗對活化的P-選擇蛋白的血小板表面表達(dá)的影響。
圖6表示植物甾醇、可可矢車菊苷配質(zhì)及其結(jié)合物對表兒茶精吸收入血漿的影響。
圖7表示植物甾醇、可可矢車菊苷配質(zhì)及其結(jié)合物對氧化損害DNA的影響。
圖8表示植物甾醇、可可矢車菊苷配質(zhì)及其結(jié)合物對氧化損害脂質(zhì)的影響。
發(fā)明詳述本申請中摘錄的所有專利、專利申請以及參考文獻(xiàn)都結(jié)合到本發(fā)明中作為參考。在任何不一致的情況下，以本公開為準(zhǔn)。
本發(fā)明涉及一種含有可可多酚并結(jié)合有膽固醇降低劑(如基于甾醇和/或甾烷醇的膽固醇降低劑)的組合物，該組合物可用于改善或促進(jìn)哺乳動物的血管健康。該組合物可任選包含L-精氨酸、鈣、鉀、鎂、維生素E、維生素C、任何一種復(fù)合維生素B、類胡蘿卜素、瓜耳膠或者單或多不飽和脂肪酸(如ω-3脂肪酸)。在本發(fā)明的組合物和方法中，還可以使用包含具有與可可多酚類似性質(zhì)的其它來源的多酚的組合物，與膽固醇降低劑如基于甾醇和/或甾烷醇的膽固醇降低劑進(jìn)行聯(lián)合應(yīng)用，這也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
此處所用術(shù)語“可可多酚”(CP)指存在于可可豆中或者從可可豆或可可成分中提取出來的多酚物質(zhì)，包括原花色素，更優(yōu)選是矢車菊苷配質(zhì)。術(shù)語“矢車菊苷配質(zhì)”包括兒茶素和表兒茶精的單體和低聚物。應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明中任何涉及可可多酚之處也適用于可可矢車菊苷配質(zhì)。術(shù)語“可可成分”指含有可可固體的物質(zhì)，它們來源于無殼的可可碎粒，如巧克力液體和部分或全部脫脂的可可固體(如餅或粉末)。術(shù)語“膽固醇降低劑”指當(dāng)以有效量進(jìn)行給藥時(shí)，具有降低哺乳動物膽固醇水平的性質(zhì)的任何天然存在或加工的化合物、化合物組合物、提取物或植物成分。當(dāng)這些膽固醇降低劑是甾醇或甾烷醇類型(即包括衍生物和異構(gòu)體形式)的化合物或化合物組合物時(shí)，該“膽固醇降低劑”被稱為“基于甾醇和/或甾烷醇的膽固醇降低劑”。當(dāng)用該術(shù)語指一種組合物時(shí)，如“降低膽固醇的黑巧克力”，是指該組合物具有降低膽固醇的性質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員從本說明書中可清楚，術(shù)語“血管”指全身的血管系統(tǒng)，即它包括心臟的血管系統(tǒng)，術(shù)語“血管健康”指心血管健康和/或冠狀血管健康?！按龠M(jìn)血管健康”指達(dá)到本文說明的有益的健康效果。
可可多酚可以是天然產(chǎn)物，即源于可可豆，或者通過合成制備。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)可利用性或成本來選擇天然或合成的可可多酚?？煽啥喾涌砂谧鳛楹锌煽啥喾拥目煽沙煞值慕M合物中，如巧克力中的巧克力液體，或者可作為如提取物、部分提取物、蓄積的提取部分或合成制備的化合物，獨(dú)立加入可可成分中。所述可可多酚包括可可矢車菊苷配質(zhì)，它可以是表兒茶精和兒茶素的單體和/或低聚物。矢車菊苷配質(zhì)單體包括(+)-兒茶素、(-)-表兒茶精及其各自的差向異構(gòu)體(如(-)-兒茶素和(+)-表兒茶精)，其具有以下結(jié)構(gòu) 矢車菊苷配質(zhì)低聚物可含有2至約18，優(yōu)選2至約12，最優(yōu)選2至約10個(gè)單體單元。例如，低聚物可以是二聚體、三聚體、四聚體、五聚體、六聚體、七聚體、八聚體、九聚體和十聚體。在所述低聚物中，單體通過(4→6)和/或(4→8)的黃烷間鏈接進(jìn)行連接。只有(4→8)鏈接的低聚物是線性的；當(dāng)存在至少一個(gè)(4→6)鍵時(shí)，可得到支鏈的低聚物。
可通過從可可豆、可可碎粒或可可成分，如巧克力液體、部分脫脂可可固體和/或全脫脂可可固體中提取制備所述可可多酚。優(yōu)選從全脫脂或部分脫脂的可可粉中制備所述提取物?？墒褂萌魏畏N類的可可(Theobroma)、Herrania或其屬內(nèi)或?qū)匍g雜種的豆類。所述提取物可通過發(fā)酵、正在發(fā)酵或未發(fā)酵的豆類制備，發(fā)酵的可可豆具有最少量的可可多酚，未發(fā)酵的含量最高?？筛鶕?jù)該豆的發(fā)酵因子選擇可可豆，例如從具有275或275以下的發(fā)酵因子的豆中進(jìn)行提取?？砂垂_為WO98/09533的國際申請PCT/US97/15893中的說明，通過控制發(fā)酵程度來最優(yōu)化所述可可成分及其提取物中的多酚水平，該專利相關(guān)內(nèi)容結(jié)合到本發(fā)明中作為參考。
可采用傳統(tǒng)的可可加工方法(例如1997年New York，Blackie Acad.&Professional出版的，Beckett，S.T.編輯的Industrial ChocolateManufacture and Use中，如第1、5和6章中說明的方法)或者采用與傳統(tǒng)方法相反的、保護(hù)可可成分中的多酚(通過預(yù)防其分解)的Kealey等在美國專利No.6,015,913中說明的改進(jìn)方法，從已加工的可可成分中提取可可多酚。該改進(jìn)的可可加工方法省略了傳統(tǒng)的烘烤步驟。因此，可利用通過以下步驟得到的可可成分(a)在不烘烤可可粒條件下，將可可豆在能使可可殼松開的溫度下，加熱一定時(shí)間；(b)從可可殼中分離可可粒；(c)螺旋式碾壓可可粒，然后(d)回收含有防腐水平的可可多酚的可可脂和部分脫脂的可可固體。該方法比傳統(tǒng)方法保留了更高水平的高矢車菊苷配質(zhì)低聚物。該方法制備的可可固體每克脫脂固體含有總的矢車菊苷配質(zhì)超過20,000μg；優(yōu)選超過25,000μg/g，更優(yōu)選超過28,000μg/g，最優(yōu)選超過30,000μg/g。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，總的矢車菊苷配質(zhì)的量可按實(shí)施例3所述確定。
可可多酚可通過采用溶解該多酚的溶劑，從以上所述的資源中提取制備。適當(dāng)?shù)娜軇┌ㄋ蛴袡C(jī)溶劑，如甲醇、乙醇、丙酮、異丙醇和乙酸乙酯。還可以使用溶劑混合物。當(dāng)用水作為溶劑時(shí)，優(yōu)選將其用例如乙酸微酸化。優(yōu)選的溶劑為水和有機(jī)溶劑的混合物，例如甲醇、乙醇或丙酮的水溶液。含水有機(jī)溶劑可包含如約50％-約95％的有機(jī)溶劑。因此，可使用50％、60％、70％、80％和90％有機(jī)溶劑的水溶液。該溶劑還可含有少量酸，如乙酸，其量約為0.5％-約1.0％。所述提取物的組成，即表達(dá)式(即低聚物表達(dá)式)以及該矢車菊苷配質(zhì)的量根據(jù)所選擇的溶劑而定。例如，水提取物主要包含單體，乙酸乙酯提取物包含單體和低級低聚物(主要為二聚物和三聚物)，甲醇、乙醇和丙酮水溶液提取物含有單體和較高級低聚物。提取單體以及較高級矢車菊苷配質(zhì)低聚物的優(yōu)選溶劑之一為70％丙酮。但是，本發(fā)明可用含有多酚的任何提取物?？煽啥喾拥奶崛》椒ㄊ潜绢I(lǐng)域熟知的方法，可見Romanczyk等在美國專利No.5,554,645以及公開為WO97/36497的國際申請PCT/US97/05693中說明的方法。因此，在一實(shí)施方案中，可通過將可可豆壓縮成可可粉、將該粉末脫脂、提取可可多酚，然后純化提取物來制備可可提取物?？煽煞劭赏ㄟ^將將可可豆和可可豆?jié){冷凍干燥，將冷凍干燥的可可豆脫漿、去殼，然后將去殼的可可豆碾磨制備。
可可多酚提取物可通過例如除去咖啡因和/或可可堿進(jìn)行純化，還可通過凝膠滲透色譜和/或高效液相色譜(HPLC)進(jìn)一步純化。可使用凝膠滲透色譜(如在Sephadex LH-20柱上)濃縮提取物以得到高級矢車菊苷配質(zhì)低聚物。例如，直至開始從柱中洗脫所選擇的低聚物時(shí)，才開始收集含有單體和低級低聚物的洗脫液。這種提取的實(shí)施例在本領(lǐng)域是熟知的，可見公開為WO97/36497的國際申請PCT/US97/05693的實(shí)施例5中說明的方法，該專利相關(guān)內(nèi)容結(jié)合到本發(fā)明中作為參考。通過采用制備HPLC，例如，正相HPLC，將所述提取物分成含有至少50％重量的單體或特定低聚物的單體或低聚物部分。當(dāng)所述部分包含該單體或低級多聚物(最多至包括四聚體)時(shí)，該部分含有約90％-95％重量的特定低聚物部分。分離后，將所需的部分蓄集，得到例如含有低聚物3-10或5-10的所選低聚物的混合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過本說明書的指導(dǎo)、本領(lǐng)域中的一般知識以及例如通過Romanczyk等在美國專利No.5,554,645以及公開為WO97/36497的國際申請PCT/US97/05693中的方法，調(diào)節(jié)色譜條件獲得所需的矢車菊苷配質(zhì)分布圖。
可通過含有多酚的可可成分或者通過包含巧克力，它可以是牛奶、甜味和中等甜度巧克力，優(yōu)選黑巧克力以及低脂肪巧克力，在本發(fā)明組合物中提供可可多酚?？捎脗鹘y(tǒng)的可可加工方法制備所述可可成分，但優(yōu)選采用Kealer等在美國專利6,015,913中說明的方法制備?；蛘?，為提高可可多酚的水平，可使用巧克力液體或用具有275或275以下發(fā)酵因子可可豆制備的可可固體。這些成分含有的可可多酚含量比采用傳統(tǒng)可可加工法(如烘烤法)和全發(fā)酵豆獲得的高?？刹捎贸Ｓ玫姆椒?，從以上說明的成分中制備所述巧克力或者按公開為WO99/45788的國際申請PCT/US99/05414中說明的在制備巧克力期間保護(hù)可可多酚的改進(jìn)方法制備，該專利的相關(guān)內(nèi)容結(jié)合到本發(fā)明中作為參考。根據(jù)以下非傳統(tǒng)方法中的至少一個(gè)方法制備的巧克力此處稱為“具有儲備量可可多酚的巧克力”(i)從正在發(fā)酵或未發(fā)酵可可豆中制備的可可組分；(ii)在可可組分生產(chǎn)過程中保護(hù)可可多酚；和(iii)在巧克力生產(chǎn)過程中保護(hù)可可多酚。
還可使用合成的矢車菊苷配質(zhì)，其可通過本領(lǐng)域常用的方法以及例如公開為WO99/19319的國際申請PCT/US98/21392中說明方法制備，該專利的相關(guān)內(nèi)容結(jié)合到本發(fā)明中作為參考。還可使用可可多酚衍生物。它們包括沒食子酸鹽化的單體和低聚物、糖基化的單體和低聚物及其混合物；矢車菊苷配質(zhì)單體和低聚物的代謝物，如硫酸酯化、葡糖醛酸酯化(glucoronidated)和甲基化形式；以及通過克隆微生物系統(tǒng)代謝或哺乳動物內(nèi)代謝產(chǎn)生的矢車菊苷配質(zhì)的酶裂解產(chǎn)物。這些衍生物可以是天然產(chǎn)物或者合成制備。
所述組合物還包含膽固醇降低劑?？墒褂萌魏巫饔梅绞降哪懝檀冀档蛣?。適當(dāng)?shù)慕档蛣┛赏ㄟ^降低在哺乳動物膽汁中的膽固醇吸收或降低膽固醇的合成而發(fā)揮作用。適當(dāng)?shù)哪懝檀冀档蛣┑膶?shí)例為植物甾醇、植物甾烷醇及其衍生物和異構(gòu)體；大豆蛋白；可溶性纖維，例如來自如燕麥和歐車前、堅(jiān)果、稻糠油的β-葡聚糖，其每一種都特別適用于食物、飲食補(bǔ)充物和食品添加劑組合物。還可使用已知的膽固醇降低劑，但不優(yōu)選用于食物和食品添加劑組合物中，但可用于藥物中。本領(lǐng)域技術(shù)熟練人員將很清楚膽固醇降低劑的選擇依據(jù)預(yù)定的傳遞介質(zhì)(如食物、添加物、藥物)以及給藥方式而定。因此，可降低膽汁中膽固醇吸收的降低劑不優(yōu)選用于靜脈內(nèi)給藥。類似地，如果傳遞介質(zhì)是食物，則具有較強(qiáng)藥物味道或氣味的膽固醇降低劑可能不符合要求。
植物甾醇是不溶于水并具有類似于膽固醇的分子量和結(jié)構(gòu)的植物甾醇。植物甾醇降低膽汁中的膽固醇吸收(包括內(nèi)源性和食物膽固醇)以及血清膽固醇水平(總水平和LDL)，同時(shí)本身并不被吸收?，F(xiàn)已證實(shí)了四十多種植物甾醇，但β-谷甾醇、菜油甾醇和豆甾醇是最豐富的?？蓱?yīng)用的甾醇的其它實(shí)例是菜子甾醇、鏈甾醇、chalinosterol、多孔甾醇、穿貝海綿甾醇?？墒褂锰烊粊碓椿蚝铣傻膯蝹€(gè)甾醇或甾醇混合物及其異構(gòu)體和衍生物。特別有用的是甾醇的飽和衍生物，即甾烷醇，其中環(huán)上的所有碳-碳鍵都是飽和的。適當(dāng)?shù)溺尥榇季哂?8或29個(gè)碳原子，包括β-谷甾烷醇、穿貝海綿甾烷醇、22,23-脫氫菜子甾烷醇和菜油甾烷醇。植物甾醇可以是固體(如粉末、顆粒)或液體(如油)形式。
在多種植物材料中可發(fā)現(xiàn)甾醇和甾烷醇，可見例如國際申請PCT/EP96/02344中的說明。甾醇/甾烷醇的來源實(shí)例為松樹皮、豆油、妥爾油、竹根提取物(見公開為WO98/57545的國際申請PCT/US98/12556中說明)、可可殼和油以及稻糠油。妥爾油是紙漿和紙工業(yè)的副產(chǎn)物，它是好的甾烷醇(即β-甾烷醇)資源。
可通過相對簡單和廉價(jià)的方法，從天然資源，如植物油、植物油漿、植物油蒸餾液以及其它植物油資源(如妥爾油)中獲得植物甾醇。例如，Hamunen在美國專利4,420,427中說明的通過采用溶劑(如甲醇)，從植物油漿中制備甾醇的方法。天然發(fā)現(xiàn)的甾烷醇的量較小，但它可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的各種任何方法，通過將甾醇?xì)浠?，很容易從甾醇中制備出來。?dāng)從植物材料制備甾醇原料時(shí)，它將含有多種不同甾醇的混合物，氫化后，所得到的甾烷醇也將是不同甾烷醇的混合物。該混合物適用于本發(fā)明中。但是，也可將純的特定甾醇原料氫化，制備也可應(yīng)用的純的甾烷醇。
可可殼中提取的可可油是一種好的植物甾醇資源。可可植物甾醇是游離和結(jié)合甾醇的混合物，該游離甾醇最高約占存在的該植物甾醇的90％。該植物甾醇包括菜油甾醇、β-谷甾醇、豆甾醇、環(huán)阿屯醇(cycloartenoyl)、24-亞甲基環(huán)阿屯醇以及極少量的其它植物甾醇。結(jié)合的植物甾醇包括所述植物甾醇的脂肪酸酯或阿魏酸酯衍生物。所述可可油還包括母育酚，后者包括生育酚(具有抗氧化作用)和生育三烯甘油酯(tocotrienol)(具有降低膽固醇的活性)。該可可油可通過包含以下步驟的方法制備(i)碾磨可可殼；(ii)用溶劑提取研磨后的可可殼得到植物甾醇；(iii)除去溶劑；和(iv)收集可可油?？煽蓺な强煽啥购婵镜母碑a(chǎn)物，可從干燥的發(fā)酵可可豆、微粉化的可可豆、烘烤的可可豆中得到，優(yōu)選從干燥的未發(fā)酵可可豆中得到，在該可可豆中含有最高的甾醇總量。優(yōu)選的可可豆來源于可可(Theobromacacao)。優(yōu)選的溶劑是石油醚、己烷、戊烷和乙醚。該溶劑可通過真空蒸餾回收。在一實(shí)施方案中，用Tekmar磨(Cincinatti，OH)將冷凍干燥的殼研磨成細(xì)粉，然后在Soxtec裝置(Fisher Scientific，Springfield，NJ)中，將研磨物用再蒸餾石油醚(b.p.38-39.6℃)進(jìn)行過夜提取。次日清晨，在氮?dú)饬飨?，通過慢慢蒸發(fā)，小心除去溶劑，將得到的提取物在-40℃下儲存。然后經(jīng)制備HPLC或柱層析純化該植物甾醇。
也可以使用甾醇和甾烷醇的酯化形式。酯化可使所述甾醇/甾烷醇更易溶于脂肪和油中，在某些情況下，這可幫助將它們加入到食品或其它傳遞介質(zhì)中。例如，可用脂肪酸酯將甾醇酯化。這些酯化的甾醇的實(shí)例包括乙酸谷甾醇酯、油酸谷甾醇酯和油酸豆甾醇酯?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域已知的方法以及例如van Amerongen等在美國專利6,031,118、Higgins等在美國專利5,892,068、Miettenen等在美國專利5,502,045以及國際申請PCT/CA99/00655(公開為WO00/04887)中說明的方法，制備甾烷醇酯。在一實(shí)施方案中，可按Miettenen等在美國專利5,958,913中說明，通過用C2-C22脂肪酸酯將至少一種甾醇酯化，制備有用的甾烷醇酯?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的其它方法增加哺乳動物服用的甾醇/甾烷醇的溶解度。Ostlund在美國專利5,932,562中說明了一種該方法，其中將所述甾醇/甾烷醇與卵磷脂混合得到水溶性粉末。
通過與其它成分混合，可將粉末形式的甾醇/甾烷醇加入到組合物中。如果是食物組合物，一般在混合步驟中加入甾醇/甾烷醇以及其它膽固醇降低劑。在制備降低膽固醇的巧克力時(shí)，例如，可將甾醇/甾烷醇加入到含有糖、融化油脂的干燥混合物中；研磨前的顆粒中；或者融化的巧克力中，后者較不優(yōu)選。為易于混合，可先將甾醇/甾烷醇溶解于加溶劑，如脂肪、植物油、單甘油酯、二甘油酯、三甘油酯、生育酚及其混合物中。制備甾醇/甾烷醇混懸液和乳液的有效載體是甾醇/甾烷醇至少部分溶于其中的水、醇類、多元醇類、其它食用化合物(如巧克力液體)及其混合物。
可以以任何已知的方式，如可以是游離的大豆蛋白、濃縮的大豆蛋白、蓬松的大豆蛋白或大豆粉末、餅和顆粒，將大豆蛋白加入到所述組合物中。也可按如實(shí)施例5中說明，使用谷?；蚱浞勰?。各種形式的大豆蛋白在本領(lǐng)域都是熟知的并可由市售提供。其性質(zhì)及制備方法可見如Acad.Press，NY，1979出版的Wilcke等編輯的SoyProtein and Human Nutrition中的說明?？蓪⒋蠖沟鞍着c任何基于甾醇和/或甾烷醇的膽固醇降低劑聯(lián)合使用。
可溶性植物纖維(如β-葡聚糖)具有降低血漿膽固醇的能力。本發(fā)明使用的纖維可從任何β-葡聚糖資源中獲得，優(yōu)選從燕麥顆?；蜓帑溈分蝎@得。可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，制備所述纖維，并加入到組合物中。它們是特別適于口服傳遞的組合物，如食物和飲食補(bǔ)充物。可將β-葡聚糖和其它可溶性植物纖維與任何基于甾醇和/或甾烷醇的膽固醇降低劑聯(lián)合應(yīng)用。
本發(fā)明組合物也可包含L-精氨酸，其可以以各種形式提供于本發(fā)明組合物中，如以純化合物形式、從含有L-精氨酸植物中提取的提取物形式或者種子/堅(jiān)果組分形式，如堅(jiān)果粉末，或者以整個(gè)種子/堅(jiān)果形式?？墒褂煤铣苫蛱烊坏娜魏蜭-精氨酸資源。優(yōu)選的L-精氨酸資源是大豆和堅(jiān)果肉，如花生、胡桃、杏仁和榛子?？墒褂妹撝虿糠置撝膱?jiān)果肉。可將它們研成粉末，均稱為堅(jiān)果粉。
所述組合物還可含有鈣、鉀、鎂、維生素E、維生素C、任何一種復(fù)合維生素B、類胡蘿卜素、瓜耳膠或者單或多不飽和脂肪酸(如ω-3脂肪酸)，它們均可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法獲得。可使用橄欖油、魚油或堅(jiān)果油形式的所述單或多不飽和脂肪酸。適于該用途的堅(jiān)果的實(shí)例包括花生、胡桃和杏仁。
本發(fā)明范圍之內(nèi)還包括含有具有至少一種以下性質(zhì)的多酚以及膽固醇降低劑的組合物誘發(fā)血管舒張作用、抑制COX活性、抑制LOX活性、抑制LDL的氧化作用、增強(qiáng)NOS活性、增加NO水平、抑制血小板聚集作用、單核細(xì)胞粘附和血管平滑肌增殖作用、降低血壓作用、降低血栓形成作用以及調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激作用?？墒褂萌魏文懝檀冀档蛣?，如基于甾醇和/或甾烷醇的膽固醇降低劑。在該組合物中，基于甾醇和/或甾烷醇的膽固醇降低劑能增強(qiáng)多酚的生物利用度。這些多酚的實(shí)例為黃烷醇(如兒茶素、表兒茶精和及其沒食子酸鹽衍生物)、黃酮醇(如槲皮黃酮、kaempserol、楊梅酮及其糖基化衍生物)和矢車菊苷配質(zhì)(如矢車菊苷配質(zhì)二聚物，其可從可可中得到)。
本發(fā)明組合物可用作食物、食品添加劑、飲食補(bǔ)充物或藥物。該組合物可包含載體、稀釋劑或賦形劑。根據(jù)所指定的用途，可選擇適于人或獸用、食物、添加劑、添加物或藥物用途的載體、稀釋劑或賦形劑。
此處所用“食物”是指基本上由蛋白質(zhì)、碳水化合物和/或脂肪組成的物質(zhì)，其用于保持體內(nèi)器官的生長、修復(fù)和生命過程以及提供能量。食物也包含補(bǔ)充物，如礦物質(zhì)、維生素和調(diào)味品。見1993年第十版Merriam-Webster’s Collegiate Dictionary。術(shù)語食物包括適于人或動物食用的飲料。此處所用“食品添加劑”根據(jù)FDA中21C.F.R.170.3(e)(1)中定義，包括直接及間接的添加劑。此處所用“藥物”是醫(yī)用藥物。見1993年第十版Merriam-Webster’s Collegiate Dictionary。藥物(pharmaceutical)也可稱為藥物(medicament)。此處所用“飲食補(bǔ)充物”是一種用于補(bǔ)充飲食的產(chǎn)品(不是煙草)，其帶有或包含一種或多種以下食物成分維生素、礦物質(zhì)、草藥或其它植物性藥材、氨基酸、用于人體通過增加總?cè)粘z取來補(bǔ)充飲食的食物、或者這些組分的濃縮物、代謝物、組成分、提取物或混合物。
本發(fā)明范圍內(nèi)還包括任何通過使膽固醇降低劑與多酚如可可多酚及其衍生物聯(lián)合應(yīng)用，并任選與L-精氨酸、鈣、鉀、鎂、維生素E、維生素C、任何一種復(fù)合維生素B、類胡蘿卜素、瓜耳膠和/或單或多不飽和脂肪酸(如ω-3)聯(lián)合應(yīng)用而改良的常用食物(包括飲料)。
如果是可可多酚，則可通過以下任一種方式進(jìn)行改良(i)向不含有可可多酚的食物中加入可可多酚或其衍生物或(ii)當(dāng)食物中原來含有可可多酚時(shí)，如巧克力，可通過增加原制備的食物中所發(fā)現(xiàn)的多酚的水平進(jìn)行改良。這種改良提高可通過以下過程達(dá)到通過加入如提取物形式的添加的可可多酚；通過將可可多酚與另一種含有多酚的組分(如堅(jiān)果皮)聯(lián)合加入；通過按以上說明控制可可組分的處理及可可豆的選擇，以保護(hù)用于制造食品的可可成分中的可可多酚；或者通過按以上說明控制巧克力生產(chǎn)過程。因此與相當(dāng)?shù)某Ｓ檬澄?包括飲料)相比，這些食物(包括飲料)包含“水平升高的多酚”(包括可可矢車菊苷配質(zhì))。當(dāng)巧克力制造商將含有可可多酚的可可提取物加入到其以前市售的產(chǎn)品中的時(shí)候，就出現(xiàn)具有“水平升高的多酚”的巧克力的實(shí)例。該食物還可被稱為“高可可多酚食品”，即它們含有比其傳統(tǒng)對應(yīng)物更高水平的多酚。
含有可可多酚和至少一種膽固醇降低劑(如基于甾醇和/或甾烷醇的膽固醇降低劑)以及任選的L-精氨酸、鈣、鉀、鎂、維生素E、維生素C、任何一種復(fù)合維生素B、類胡蘿卜素、瓜耳膠或者單或多不飽和脂肪酸(如ω-3)的食物適于人或獸用，包括寵物食品。該食物不是糖果，但是但優(yōu)選的膽固醇降低劑食品是糖果，如有品質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)(SOI)或無-SOI的巧克力，如牛奶、甜味和中等甜度巧克力，包括黑巧克力、低脂巧克力和巧克力包裹的餅干。其它實(shí)例包括烘烤的產(chǎn)品(如界仁巧克力餅、烘烤的小吃、小甜餅、餅干)、調(diào)味品、燕麥花卷(granola)棒、太妃口嚼糖、麥片替代棒、涂抹醬、糖漿、粉末飲料混合物、可可或巧克力調(diào)味的飲料、布丁、米餅、米混合物、咸調(diào)味汁等。如果要求，這些食品可以是巧克力或可可味道。除包含可可多酚和膽固醇降低劑外，還包含L-精氨酸的食品優(yōu)選是包含堅(jiān)果(如花生、胡桃、杏仁和榛子)的巧克力和餅干，如燕麥花卷棒。應(yīng)指出向本發(fā)明說明的食品中加入帶皮的堅(jiān)果也可增加總的多酚含量，原因是例如花生皮含有大約17％矢車菊苷配質(zhì)，而杏仁皮含有大約30％矢車菊苷配質(zhì)。在一實(shí)施方案中，向含有膽固醇降低劑的巧克力糖果的杏仁蛋白糖中加入所述堅(jiān)果皮。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，含有膽固醇降低劑的非巧克力食品每克中包含至少約5μg-約10mg，例如至少5μg，優(yōu)選至少10μg，更優(yōu)選至少100μg的可可矢車菊苷配質(zhì)。如果需要，該非巧克力食品可含有比在以下說明的巧克力食品中發(fā)現(xiàn)的更高水平的可可矢車菊苷配質(zhì)。
特別優(yōu)選的食品是膽固醇降低糖果，最優(yōu)選是黑巧克力。在某些實(shí)施方案中，根據(jù)該產(chǎn)品中非脂肪可可固體的總量，該巧克力每克中包含至少3,600μg，優(yōu)選至少4,000μg，優(yōu)選至少4,500μg，更優(yōu)選至少5,000μg，最優(yōu)選至少5,500μg可可矢車菊苷配質(zhì)。在其它實(shí)施方案中，根據(jù)該產(chǎn)品中非脂肪可可固體的量，該巧克力每克中包含至少6,000μg，優(yōu)選至少6,500μg，更優(yōu)選至少7,000μg，最優(yōu)選至少8,000μg，更加優(yōu)選10,000μg可可矢車菊苷配質(zhì)。
根據(jù)牛奶巧克力產(chǎn)品中非脂肪可可固體的總量，膽固醇降低牛奶巧克力糖果每克中可包含至少1,000μg，優(yōu)選至少1,250μg，更優(yōu)選至少1,500μg，最優(yōu)選至少2,000μg可可矢車菊苷配質(zhì)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)該牛奶巧克力產(chǎn)品中非脂肪可可固體的總量，該牛奶巧克力每克中包含至少2,500μg，優(yōu)選至少3,000μg，更優(yōu)選至少4,000μg，最優(yōu)選至少5,000μg可可矢車菊苷配質(zhì)。
食品中L-精氨酸的量是可以變化的。一般地，相對于每100克部分脫脂的可可固體，可可包含1-1.1克L-精氨酸。每100g可可含0.8-1.5克。本發(fā)明的巧克力食品含有的L-精氨酸的量比該可可成分中天然存在的L-精氨酸的量高。由于知道食品中所用的可可成分和L-精氨酸的量，本領(lǐng)域一般技術(shù)人員可很容易確定終產(chǎn)品中L-精氨酸的總量。所述食品一般每克中含有至少5μg，優(yōu)選至少30μg或至少60μg，更優(yōu)選至少200μg的L-精氨酸。
食物中所述膽固醇降低劑的量根據(jù)所使用的降低劑的類型而定，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)本說明書的指導(dǎo)，尤其是以下提供的日劑量以及本領(lǐng)域的知識進(jìn)行測定。食品組合物例如每45g食品中可包含約0.5-約10g，優(yōu)選約1.5-約5g，最優(yōu)選約2-約4.5g的甾醇/甾烷醇。對于燕麥中的大豆蛋白和可溶性纖維，F(xiàn)DA已提供了每克食品中能滿足健康要求的最低量。根據(jù)FDA要求，含有β-葡聚糖的食品必須含有至少0.75g，含有大豆蛋白質(zhì)的食品必須含有至少6.25g大豆蛋白質(zhì)。也可將這些值用作確定食品中這些膽固醇降低劑的量的標(biāo)準(zhǔn)。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該膽固醇降低劑和該可可多酚的每日有效量以單一一份食品提供。因此，一種降低膽固醇的糖果(如巧克力)每份中含有至少1.5(如1.5-4.5g)甾醇/甾烷醇，并至少含有約100mg(如150-200，200-400mg)的可可矢車菊苷配質(zhì)。
包含具有本發(fā)明所提性質(zhì)的多酚(如可可多酚或其衍生物)聯(lián)合膽固醇降低劑以及任選的L-精氨酸的藥物可通過多種途徑給藥，如口服、經(jīng)頰(bucally)、經(jīng)鼻、直腸、靜脈內(nèi)、非腸道和局部給藥。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)給藥方式確定適當(dāng)?shù)哪懝檀冀档蛣?。因此，適于各類型給藥的劑型也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，其包括固體、液體和半固體劑型，如片劑、膠囊劑、明膠膠囊、多劑量或單位劑量粉末劑或顆粒劑、乳劑、懸浮劑、糊劑、霜劑、凝膠劑、泡沫劑或膠狀劑。緩釋劑型也包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)，其可按美國專利5,024,843；5,091,190；5,082,668；4,612,008和4,327,725中說明制備，這些專利的相關(guān)部分結(jié)合到本發(fā)明中作為參考。適當(dāng)?shù)乃帉W(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑一般是本領(lǐng)域已知的，本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易確定。例如，片劑可包含有效量的含有可可多酚的組合物以及任選的載體，如山梨糖醇、乳糖、纖維素或磷酸二鈣。含有可可多酚、至少一種膽固醇降低劑以及任選的L-精氨酸的飲食補(bǔ)充物可通過本領(lǐng)域已知的方法制備，可包含例如營養(yǎng)素，如磷酸二鈣、硬脂酸鎂、硝酸鈣、維生素和礦物質(zhì)。
本發(fā)明范圍內(nèi)還包含一種商品，該商品包含一種食物、飲食補(bǔ)充劑或藥物以及說明(i)多酚和/或其衍生物存在或含量提高以及(ii)膽固醇降低劑存在的標(biāo)簽。該標(biāo)簽可任選說明L-精氨酸的含量，混合的多酚、膽固醇降低劑和任選L-精氨酸的有利性質(zhì)及其使用說明。此處所用有利的性質(zhì)包括降低血漿膽固醇、總量及LDL、抑制COX活性(包括COX1活性)、抑制LOX活性、增強(qiáng)氧化氮生成、增加動脈粥樣靜態(tài)與動脈粥樣產(chǎn)生因子(即產(chǎn)生的類花生酸和內(nèi)皮素)的比率和抑制LDL的氧化作用，其反過來可單獨(dú)或聯(lián)合起來幫助降低血管收縮和血小板聚集作用、抑制單核細(xì)胞粘附、抑制血管平滑肌的過度增殖、降低血栓形成、降低血壓，并由此降低與血管和心血管疾病(如動脈粥樣硬化和心血管疾病)有關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)。
本發(fā)明范圍內(nèi)也包含一種包裝，該商品包含(i)包含具有至少一種以下性質(zhì)的多酚和一種膽固醇降低劑如基于甾醇和/或甾烷醇的膽固醇降低劑的組合物誘發(fā)血管舒張作用、抑制COX活性、抑制LOX活性、抑制LDL的氧化作用、增強(qiáng)NOS活性、增加NO水平、抑制血小板聚集、單核細(xì)胞粘附和血管平滑肌增殖作用、降低血壓作用、降低血栓形成作用以及調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激作用；以及(ii)使用該組合物促進(jìn)血管健康(也可使用術(shù)語心血管健康)和/或降低心臟病風(fēng)險(xiǎn)的標(biāo)簽和/或說明書。當(dāng)使用基于甾醇和/或甾烷醇的膽固醇降低劑時(shí)，該標(biāo)簽和/或說明書可說明該組合物促進(jìn)或增加多酚的吸收作用。該標(biāo)簽和/或說明書也可說明以上提到的其它有利作用。它們是降低血漿膽固醇、總量及LDL、抑制COX活性、抑制LOX活性、增強(qiáng)氧化氮生成、增加動脈粥樣靜態(tài)與動脈粥樣產(chǎn)生因子(即產(chǎn)生的類花生酸和內(nèi)皮素)的比率和抑制LDL的氧化作用，其反過來可單獨(dú)或聯(lián)合起來幫助降低血管收縮和血小板聚集作用、抑制單核細(xì)胞粘附、抑制血管平滑肌的過度增殖作用、降低血栓形成、降低血壓，并由此降低與血管和心血管疾病(如動脈粥樣硬化和心血管疾病)有關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)。
本發(fā)明范圍也包括治療和/或預(yù)防與COX活性、LOX活性、NO產(chǎn)生、NOS活性、LDL氧化作用和血漿總量和LDL膽固醇增加有關(guān)或受這些因素調(diào)節(jié)的疾病和/或癥狀的方法。此處所用“治療”指通過影響相關(guān)疾病或癥狀的病理而改善存在的疾病狀態(tài)，如高血壓或動脈粥樣硬化。術(shù)語“預(yù)防”指降低與疾病發(fā)展有關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)，包括降低疾病的產(chǎn)生?？稍谝阎唢L(fēng)險(xiǎn)發(fā)病的個(gè)體或大規(guī)模人群中，采用預(yù)防措施以保持良好健康，如保持血管健康。該方法可用于人或動物(如狗、貓和馬)中。
與COX活性、LOX活性、NO產(chǎn)生、NOS活性、LDL氧化作用和/或高膽固醇有關(guān)或受這些因素調(diào)節(jié)的疾病和/或癥狀包括動脈粥樣硬化、高血壓、冠心病(CHD)、腦血管疾病、心臟病發(fā)作、中風(fēng)、外周血管疾病和腎衰竭。還包括治療或預(yù)防高膽固醇血癥(包括中度高膽固醇血癥)、誘發(fā)血管舒張作用、抑制COX(包括COX1)和LOX活性、抑制LDL的氧化作用、增強(qiáng)NOS活性和增加NO水平、抑制血小板聚集作用、單核細(xì)胞粘附和血管平滑肌增殖作用、降低血壓作用、降低血栓形成作用以及調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激作用的方法。
所述方法包括給予哺乳動物(優(yōu)選人或獸類動物)一定量的包含多酚(如可可多酚)和膽固醇降低劑以及任選L-精氨酸的組合物，以有效治療、預(yù)防或達(dá)到除降低膽固醇外的至少一種上述有利效能。所述方法還包括通過如測定血漿膽固醇水平來測定治療效果的方法。
可將該組合物給予健康哺乳動物以達(dá)到預(yù)防目的，或者給予需要此種治療或具有至少一種相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因素的哺乳動物。任何具有至少一種與血管健康問題相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)因素的個(gè)體都是本發(fā)明組合物治療的受者。有家族性膽固醇水平升高、絕經(jīng)期或絕經(jīng)后婦女、絕經(jīng)后婦女/心肌局部缺血后損傷、手術(shù)或化學(xué)性引起的雌激素缺乏的婦女、老年人、有高血糖、糖尿病、高血壓和肥胖癥以及吸煙的個(gè)體都是需要此處所述治療的敏感個(gè)體。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來講，其它易于發(fā)生血管健康問題的哺乳動物群體是顯而易見的受治療群體。
所述方法特別對于治療或預(yù)防再狹窄有用。美國每年約有330,000患者進(jìn)行冠狀和/或外周血管成形術(shù)(Marx，265 Science 320，1994)，即一種打通由動脈粥樣斑塊阻塞的血管(如冠狀動脈)而保持正常血液流動的方法。但是，這些患者中的近33％會發(fā)生再狹窄，即所治療的動脈很快再被阻塞。這些患者未見好轉(zhuǎn)，并且可能比進(jìn)行血管成形術(shù)之前更壞。血管壁平滑肌細(xì)胞(SMC)的過度增殖形成再狹窄。因此，可根據(jù)技術(shù)熟練的醫(yī)務(wù)人員決定，在進(jìn)行血管成形術(shù)之前或之后給予含有可可多酚和膽固醇降低劑(及任選L-精氨酸)的組合物。
可給予獸類動物(如狗、貓和馬)上述組合物以治療或預(yù)防心力衰竭、瓣膜退化和慢性腎衰竭。例如可給狗服用本發(fā)明組合物以治療下列癥狀慢性瓣膜疾病(房室瓣膜的心內(nèi)膜炎(endocardiosis)或粘液瘤的退化)、擴(kuò)張性cariomyopathy、心包病、心內(nèi)膜炎、早期心律失常和犬惡絲蟲病。
本發(fā)明還提供一種促進(jìn)多酚吸收入人或獸類動物(如寵物)血中的方法。該方法其本質(zhì)上是增加對人或動物健康有益的多酚的生物利用度，其包括聯(lián)合給予該人或動物(i)具有至少一種以下性質(zhì)的多酚誘發(fā)血管舒張作用、抑制COX活性、抑制LOX活性、抑制LDL的氧化作用、增強(qiáng)NOS活性、增加NO水平、抑制血小板聚集作用、單核細(xì)胞粘附和血管平滑肌增殖作用、降低血壓作用、降低血栓形成作用以及調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激作用，和(ii)基于甾醇和/或甾烷醇的膽固醇降低劑。所述多酚可以是如黃烷醇或黃酮醇，其實(shí)例上文已提供。該方法可通過將所述多酚和所述甾醇/甾烷醇以同一組合物的組分形式給予或者分別給予來進(jìn)行。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可采用本說明書提供的指導(dǎo)以及本領(lǐng)域的一般知識來確定該有效量。例如，采用甾醇/甾烷醇要獲得降低膽固的作用，應(yīng)該給予超過非素食者平均飲食中一般存在的量。一典型北美飲食的人每日吸收約200-400mg。因此，當(dāng)用植物甾醇(如谷甾醇)降低膽固醇水平時(shí)，應(yīng)該給予約至少1g/日，優(yōu)選至少約3g/日。優(yōu)選使用至少約1g/日，優(yōu)選至少約4.5g/日，至約20g/日的范圍。但是，該量將根據(jù)所述植物甾醇降低膽固醇的效能而定，因此，例如如果使用效能更強(qiáng)的谷甾醇，則該量可以降低至約1-約3g/日。可采用Roger等在J.Amer.Oil Chem.Soc.70(30)1993和Carpenter等在J.Amer.OilChem.Soc.71(8)1994中說明的分析方法來確定該量。大豆蛋白可給予例如至少約25g/日。也可見National Res.Council/National Acad.Sci.，Washington，D.C.出版的第9版Recommended Daily Allowances中的指導(dǎo)?？扇苄岳w維可給予例如至少3g/日?？煽啥喾涌山o予約50mg/日至約1000mg/日，優(yōu)選約100-150mg/日至約900mg/日，最優(yōu)選約300mg/日至約500mg/日。但是，如果多酚天然存在于食物中且無毒性時(shí)，可使用比上述更高的量。L-精氨酸可給予約2g/日至約50g/日，優(yōu)選約3g/日至約10g/日，最優(yōu)選約6g/日至約8g/日。同樣，如果L-精氨酸天然存在于食物中，可使用比上述更高的量。多酚一般可以以本領(lǐng)域所知的量給予。當(dāng)確定該有效量時(shí)，也可將甾醇/甾烷醇存在時(shí)增強(qiáng)的吸收作用考慮在內(nèi)。
治療/預(yù)防性給藥可按給藥方案，如每日、每月、每兩個(gè)月、每年或者必要時(shí)按技術(shù)熟練的醫(yī)務(wù)工作者確定的其它給藥方案繼續(xù)進(jìn)行。優(yōu)選每日，最優(yōu)選每日2或3次，例如早晨和夜晚，給予所述組合物以保持哺乳動物體內(nèi)有效化合物的水平。為達(dá)到最佳效果，可給予該組合物至少約30-約60日。這些方案可周期性重復(fù)。
本發(fā)明還可通過以下非限定實(shí)施例說明。
根據(jù)Grossman & Zakut(Methods Biochem.Anal.25303-329，1979)方法，用乳化劑吐溫20，使亞油酸增溶。將脂氧合酶以5000U/mL溶解于pH8.6的PBS中。將可可酚溶解于純水中，然后用以下儲備液稀釋。將1-6聚物以1mM濃度溶解，提取物以1mg/mL(1g粗品丙酮提取物/L～3.0mM單體，1g富含5聚物提取物/L～3.4mM)溶解。
根據(jù)下式計(jì)算各套樣品6個(gè)反應(yīng)池(1個(gè)用水的對照樣本，5個(gè)酚的水溶液試驗(yàn)樣本)的抑制作用％抑制作用＝(對照品Δabs.-試驗(yàn)品Δabs.)/對照品Δabs.)×100。該反應(yīng)混合液中包含溶解于pH7.4的PBS中的亞油酸(100μM)加上/減去試驗(yàn)酚的水溶液。加入終濃度為100U/mL的脂氧合酶開始反應(yīng)。用Beckman Du-600UV分光光度計(jì)(37℃，吸光度234nm)，通過記錄5或10分鐘內(nèi)的動力學(xué)掃描，測定亞油酸的過氧化氫形成的共軛二烯量度。
該可可組分的高UV吸收度未給出準(zhǔn)確濃度下的IC50值。因此，通過將該對數(shù)回歸曲線(％抑制率對log酚濃度)外推至推出試驗(yàn)物質(zhì)達(dá)到50％抑制脂氧合酶活性下的濃度，計(jì)算出IC50值。外推的IC50值給出可可多酚提取物的脂氧合酶抑制活性的粗略值。
NDGA是大豆和幾種哺乳動物脂氧合酶的既定抑制劑(Kemal等，Biochemistry 267064-7072，1987)。商業(yè)上可用作脂肪和油類的抗氧化劑。NDGA用作陽性對照，因?yàn)槠銲C50值為2×10-6M，其它試驗(yàn)酚類未能達(dá)到該值。假定(+)-兒茶素和(-)-表兒茶精結(jié)構(gòu)上與可可多酚單體類似。
在摩爾基礎(chǔ)上對所述酚類進(jìn)行比較。(+)-兒茶素的脂氧合酶抑制作用(3×10-3M)比(-)-表兒茶精(3×10-1M)強(qiáng)兩個(gè)數(shù)量級，并與+可可單體(5×10-3M)、二聚物(2×10-3M)和三聚物(2×10-3M)的抑制作用非常類似。高級低聚物的脂氧合酶抑制作用與其摩爾濃度的對數(shù)值關(guān)系不大。在終濃度0.3-25μM下，四聚物、五聚物和六聚物抑制5-30％脂氧合酶的活性。但是，酚的濃度和抑制作用并不明顯相關(guān)。粗丙酮提取物呈現(xiàn)出與濃度相關(guān)的脂氧合酶抑制作用(IC50＝5μM，以單體為基礎(chǔ)比較)，比單體至三聚物部分弱大約3個(gè)數(shù)量級。富含五聚物的提取物(IC50＝59M)在合理的水平上未呈現(xiàn)抑制脂氧合酶的活性。
可可酚提取物的大豆脂氧合酶抑制活性與(+)-兒茶素的類似。如果在摩爾水平上比較，單體至三聚物的活性之間差別很小，因此推斷為對該酶的空間抑制。對于低分子量的組分(單體至三聚物)，該抑制作用可能是特異性的，原因是四聚物至六聚物化合物呈現(xiàn)出非常小的脂氧合酶抑制活性，而富含五聚物的提取物比含有大部分單體至三聚物低聚物部分的粗品提取物抑制作用更低。因此，可可多酚或者可通過螯合彌補(bǔ)性鐵離子或者通過在氧化反應(yīng)中借助于酚羥基清除游離基來抑制大豆脂氧合酶，其中游離基包括游離基中間體。較大的低聚物(四聚物至六聚物)可能被立體屏蔽，并因此不能解讀該酶的催化部位。
實(shí)施例2可可矢車菊苷配質(zhì)提取物和可可矢車菊苷配質(zhì)低聚體部分對基礎(chǔ)內(nèi)皮細(xì)胞釋放的前列腺素類和總內(nèi)皮素(ET)的影響研究在培養(yǎng)基內(nèi)，經(jīng)純化的矢車菊苷配質(zhì)單體和可可多酚提取物中五聚物對牛和人體內(nèi)皮細(xì)胞中前列腺素類前列腺環(huán)素、前列腺素(PGE2)和血栓烷以及總內(nèi)皮素釋放的影響。
吲哚美辛購自Cayman(Ann Arbor，MI USA)。通過1996年9月10日授權(quán)的美國專利5,554,645的實(shí)施例1-5中說明的方法，從富含矢車菊苷配質(zhì)的可可豆(通過2000年1月18日公開的美國專利6,015,913中說明的方法處理)純化單體和五聚體的矢車菊苷配質(zhì)部分。
根據(jù)Hammerstone等(J.Agric.Food Chem.，472490-496，1999)的方法分析所述樣本。通過質(zhì)譜獲得分子量純度的確認(rèn)。
根據(jù)Schramm等先前說明(J.Nutr.Biochem.8647-651，1997；J.Agric.and Food Chem.，46(5)1900-1905，1998)，在Eagle氏極限必需培養(yǎng)基中培養(yǎng)牛主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(BAEC)和人體主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(HAEC)。
將ECs(傳代＜11)接種于裝有EMEM的24孔培養(yǎng)板中，該EMEM中包含2mmol谷氨酰胺/L、10％胎牛血清、100單位青霉素/L、0.1mg鏈霉素/L和0.25pg兩性霉素/L。將匯合細(xì)胞在250ml含有適當(dāng)治療化合物的無酚紅EMEM中處理。在加入矢車菊苷配質(zhì)部分(10、20和30pmol/L)并用ECs培養(yǎng)0和20分鐘后，對用EC’s培養(yǎng)的培養(yǎng)基進(jìn)行分析。將該培養(yǎng)基在-70℃下儲存，直至通過以下說明的免疫試驗(yàn)進(jìn)行分析。根據(jù)Bioadjieras等在Methods in Lab.Invest.50239-246，1984中說明，通過錐蟲藍(lán)排斥試驗(yàn)監(jiān)測EC完整性。
根據(jù)Westcott等在Prostaglandins32857-873，1986；Yakota等在Adv.Prostgl.Thrombox.Leukot.Res.1533-34，1985；Schramm等在1997；1998；1999中說明的方法實(shí)施免疫試驗(yàn)步驟。用Cayman免疫試驗(yàn)#583151測定培養(yǎng)基總ET(ET-1+ET-2+ET-3)。用Cayman酶免疫試驗(yàn)#515211測定前列腺環(huán)素(PGI2)代謝物6-酮基前列腺素F1-α，用Cayman酶免疫試驗(yàn)#519031測定血栓烷(TXA2)代謝物TXB2，用Cayman免疫試驗(yàn)#514016測定PGE2。
所建立的試驗(yàn)條件模仿以前用過的那些條件，表明質(zhì)量＜3000的酒劑部分比質(zhì)量＞3000的酒劑部分對EC前列腺素合成直接產(chǎn)生不同的影響(Schramm等，J.Agric.and Food Chem.，46(5)1900-1905，1998)。測定對基礎(chǔ)細(xì)胞功能的作用。細(xì)胞存活和細(xì)胞形態(tài)都不受可可矢車菊苷配質(zhì)處理的影響。用BAECs培養(yǎng)20分鐘的每毫升對照培養(yǎng)基中包含73.5＝+/-0.044ng TXB2和294+/-6.3pg PGE2。
如圖2中所示，當(dāng)與單獨(dú)的對照培養(yǎng)基比較時(shí)，向用BAECs培養(yǎng)了20分鐘的培養(yǎng)基中加入單體或五聚物可可矢車菊苷配質(zhì)，可改變培養(yǎng)基前列腺素和ET的濃度。含有單體(A1)或五聚物(A2)矢車菊苷配質(zhì)的培養(yǎng)基比對照培養(yǎng)基包含更多的6-酮基-PGF1-α?？赏ㄟ^單體部分(B1)以劑量依賴性方式以及通過以30μM的五聚物部分(B2)降低培養(yǎng)基PGE2?？煽墒杠嚲哲张滟|(zhì)對培養(yǎng)基TXB(C1-2)未呈現(xiàn)出明顯的作用。雖然所述單體和五聚物可可矢車菊苷配質(zhì)部分對6-酮基-PGF1-α和PGE2具有相似的作用，但它們對培養(yǎng)基ET作用相反，單體部分(D1)在30μM下增加培養(yǎng)基中ET的濃度，而五聚物部分(D2)以劑量依賴性方式降低培養(yǎng)基中的ET濃度。
圖3A-B中的數(shù)據(jù)表明單體和五聚物可可矢車菊苷配質(zhì)以相似的方式影響牛(BAEC)和人體(HAEC)中的主動脈ECs。
以上數(shù)據(jù)表明所述可可矢車菊苷配質(zhì)引發(fā)類花生酸和內(nèi)皮素作用，其起到舒張血管和降低血小板聚集/血栓形成的作用，即引發(fā)前列腺環(huán)素和抑制內(nèi)皮素和前列腺素。
實(shí)施例3飲用富含矢車菊苷配質(zhì)的可可飲料對血小板活性的影響研究飲用可可飲料對調(diào)節(jié)血小板活性和初期淤血的影響。
將30位無心臟病或淤血病病史的健康、不吸煙成人分成3個(gè)治療組(a)10人(4男，6女，24-49歲)，飲用可可飲料(b)10人(4男，5女，26-50歲)，飲用咖啡因飲料作為對照組，和(c)10人(4男，6女，24-50歲)，飲用水作為對照組。所有女性均為絕經(jīng)前并未服用雌激素。在試驗(yàn)前和試驗(yàn)期間，受試者至少在4日內(nèi)禁止服用非甾族抗炎藥物，至少2日內(nèi)禁止飲用酒精飲料，并且至少24小時(shí)內(nèi)禁止食用含咖啡因或可可堿的食物。
早晨8-10點(diǎn)期間，從每位受試者體中取血，將樣本收集在2個(gè)裝有0.5ml 3.2％檸檬酸鈉緩沖溶液(Becton Dickinson，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ)的5ml排空的管中。然后試驗(yàn)組成員飲用300ml含有18.75g富含矢車菊苷配質(zhì)可可粉末(其提供大約960mg的總矢車菊苷配質(zhì)、17mg咖啡因和285mg可可堿)和12.5g蔗糖與蒸餾水混合的飲料(見Adamson，G.E.等，J.Ag.Food Chem.；1999；47(10)4184-4188)。對照組成員飲用含有17mg咖啡因和12.5g蔗糖的飲料或者飲用純水。飲用所述飲料后2和6小時(shí)，再收集血液樣本。一名女性成員在飲用可可飲料后6小時(shí)取血時(shí)未出現(xiàn)。
矢車菊苷配質(zhì)定量如下組合標(biāo)準(zhǔn)品用市售提供的(-)-表兒茶精制備，純品的二聚體至十聚體通過Hammerstone J.F.等在J.Ag.FoodChem.；1999；47(10)490-496中、Lazarus S.A.等在J.Ag.Food Chem.；1999；47(9)3693-3701中以及Adamson，G.E.等在J.Ag.Food Chem.；1999；47(10)4184-4188中說明的方法制備。使用這些化合物的標(biāo)準(zhǔn)儲備液采用以上摘引的Adamson文獻(xiàn)中的正相HPLC方法分析，該方法的熒光檢測的激發(fā)和發(fā)射波長分別為276nm和316nm。將所有異構(gòu)體的任何級別的低聚物的色譜峰分類，并將其峰面積加和，用二次方程擬和法做出校準(zhǔn)曲線。單體和較小的低聚物幾乎成線性，這與以前使用線性回歸做出的以單體和二聚物為基礎(chǔ)的校準(zhǔn)曲線一致。
然后用這些校準(zhǔn)曲線計(jì)算以下制備的樣本中的矢車菊苷配質(zhì)水平首先，用己烷三次提取(每次45mL)將所述可可或巧克力樣本(約8g)脫脂。然后將1g脫脂物質(zhì)用5mL丙酮/水/乙酸混合液(70∶29.5∶0.5v/v)提取。然后通過將該樣本的HPLC數(shù)據(jù)與按如上說明的得到的校準(zhǔn)曲線(其采用純的低聚物)相比較，確定所述脫脂物質(zhì)中的矢車菊苷配質(zhì)的量。采用Association of Official Analytical Chemists(AOACOfficial Method 920.177)的標(biāo)準(zhǔn)方法，測定樣本(1g巧克力樣本或0.5g液體樣本)中的脂肪百分率。然后計(jì)算原樣本(帶有脂肪)中總的矢車菊苷配質(zhì)水平的量。在每個(gè)樣本試驗(yàn)之前進(jìn)行校正，以防止柱與柱之間的變化。
在抽血后10分鐘內(nèi)，將全血在聚苯乙烯試管中在存在或不存在肽Arg-Gly-Asp-Ser(Sigma，St.Louis，MO)的情況下與10μl HEPES緩沖液(pH7.4，未經(jīng)刺激的對照)、20或100μM ADP或20μM腎上腺素(BioData，Horsham，PA))在室溫下孵育5分鐘。5分鐘后，將樣品懸浮于1ml HEPES緩沖液中，然后將100μM樣品轉(zhuǎn)移到裝有飽和濃度(20μL)的每種以下熒光標(biāo)記的單克隆抗體的試管中PAC1-異硫氰酸熒光素(FITC)、抗CD62P-藻紅蛋白(PE)和抗CD42a-PerCP。PAC1識別纖維蛋白原結(jié)合受體GPIIb-IIIa的活化構(gòu)象，而抗CD62P識別存在于活化血小板表面的P-選擇蛋白。抗CD42a識別存在于活化血小板和靜息血小板兩者表面的GP1b-1X。小鼠IgG、FITC和小鼠IgG、PE用作同種型對照。使用Arg-Gly-Asp-Ser-肽阻斷所述PAC1抗體與血小板的結(jié)合，從而在流式細(xì)胞儀上設(shè)置陰性對照標(biāo)記。抗體和同種型對照購自Becton Dickinson Immunocytometry Systems，Inc.，SanJose，CA。
在存在和不存在激動劑ADP和腎上腺素的情況下，將全血樣品與單克隆抗體或同種型對照在室溫下避光孵育20分鐘。然后將樣品在經(jīng)過濾的1％低聚甲醛(pH7.2)中固定，于2-8℃避光保存。所有樣品都在48小時(shí)內(nèi)在FACScan流式細(xì)胞儀上運(yùn)用LYSYS II軟件進(jìn)行分析。該流式細(xì)胞儀的性能使用1μm、2μm和10μm校準(zhǔn)微珠(BectonDickinson Immunocytometry Systems，Inc.，San Jose，CA和FlowCytometry Systems，Research Triangle Park，NC)加以證實(shí)。以列表方式收集2萬個(gè)事件的對數(shù)代碼(in logarithmic code)的全光散射和熒光參數(shù)?；诠馍⑸浜虲D42a表達(dá)門控血小板。活化血小板定義為共表達(dá)GPIIb-IIIa或P-選擇蛋白活化構(gòu)象的CD42a陽性事件百分率。血小板微粒定義為大小小于2μm的CD42a陽性事件百分率。
采用血小板功能分析儀(PFA-100TM，Dade Behring International，Miami，F(xiàn)L)，根據(jù)生產(chǎn)廠指導(dǎo)說明，在四小時(shí)內(nèi)，分析三個(gè)研究時(shí)間點(diǎn)各自所取的血液樣本。見Mammen等在Sem.Thromb.Hemostas.24195-202，1998和Fressinaud等在Blood 911325-31，1998中說明。將功能作為以秒計(jì)的閉合時(shí)間測量，該閉合時(shí)間被定義為血液閉合試驗(yàn)?zāi)ねǖ赖目讖剿枰臅r(shí)間。
采用秩的Friedman重復(fù)測定ANOVA方法，按順序?qū)Ω髦委熃M和對照組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析(SigmaStat for Windows，SPSS，Richmond，CA)。用Student-Newman-Keuls多次對比法確定基線與2和6小時(shí)飲用后結(jié)果之間的差別。認(rèn)為P值小于0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
在攝食后2和6小時(shí)時(shí)，飲用可可能抑制未經(jīng)刺激的(P＝0.035，圖4A)離體腎上腺素誘發(fā)(P＝0.008，圖4B)的活化GPIIb-IIIa的表達(dá)。在攝食后0、2和6小時(shí)時(shí)，未受刺激的表達(dá)活化GPIIb-IIIa的血小板的中值百分率分別為0.9、0.5和0.3％，對應(yīng)的腎上腺素誘發(fā)的中值百分率分別為9.6、6.8和3.3％。而飲用咖啡因飲料的對照組中的腎上腺素刺激的活化GPIIb-IIIa表達(dá)增加(P＝0.048，飲用后0、2和6小時(shí)時(shí)的中值＝5.3％、6.5％和7.5％)。飲水的對照組中沒有變化。
攝食后2和6小時(shí)，所述可可能降低血小板上20μM ADP-誘發(fā)的活化GPIIb-IIIa的表達(dá)(P＜0.001，圖4C，攝食后0、2和6小時(shí)時(shí)間點(diǎn)處的中值分別為58.5、44.2和38.8％)。當(dāng)通過100pm ADP誘發(fā)活化時(shí)，該趨勢認(rèn)定能降低攝食可可后血小板上活化GPIIb-IIIa的表達(dá)(P＝0.067，攝食后0、2和6小時(shí)時(shí)間點(diǎn)處的中值分別為76.5、68.7和57.6％)。在飲用咖啡因飲料和水的對照組別中，ADP誘發(fā)的活化GPIIb-IIIa的表達(dá)無變化。
監(jiān)測到攝食可可后沒有降低P-選擇蛋白表達(dá)(P＝0.053，圖5A)的明顯趨勢。飲用可可能降低攝食后2和6小時(shí)時(shí)的20μM ADP-誘發(fā)的P-選擇蛋白表達(dá)(P＝0.007，圖5C)，攝食后0、2和6小時(shí)時(shí)的100μM ADP-誘發(fā)的P-選擇蛋白分別為56.1、54.7和41.7％。
沒有發(fā)現(xiàn)飲用含咖啡因飲料或水的對照組中血小板興奮或抑制作用的現(xiàn)象。
通過血細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測的飲用可可飲料后的血小板微粒數(shù)目在從基線開始2小時(shí)時(shí)降低，在6小時(shí)時(shí)進(jìn)一步降低(參見表1)。相反地，在飲水后2和6小時(shí)以及在飲用含咖啡因飲料后6小時(shí)時(shí)，血小板微粒數(shù)目增加。血小板微粒是在生理性血小板活化期間形成的具有止血活性、含豐富磷脂的微泡。
↑總CD42正向作用的微粒百分率。數(shù)值代表中值(范圍)，每組n＝10。
*與“飲用之前”明顯不同(P＜0.05)。
飲用所述可可飲料后6小時(shí)，使膠原蛋白-腎上腺素誘發(fā)的閉合時(shí)間延長(見表2)。由此表明飲用可可飲料能延緩與血小板相關(guān)的初期淤血。觀察到在膠原蛋白-ADP-誘導(dǎo)后閉合時(shí)間的延長趨勢(p＝0.097)；在所述咖啡因?qū)φ战M中，閉合時(shí)間沒有變化。
↑以秒計(jì)與血小板相關(guān)的初期淤血閉合時(shí)間。數(shù)值代表中值(范圍)，每組n＝10。
*與“飲用之前”明顯不同(P＜0.05)。
采用秩的Friedman重復(fù)測定ANOVA方法，然后用Student-Newman-Keuls多次對比法。
結(jié)果表明飲用所述巧克力飲料可改變?nèi)梭w中的血小板功能。首先，在攝食可可后，血小板活化降低，該活化通過血小板活化標(biāo)記物對體外弱激動劑的響應(yīng)表達(dá)測定。其次，攝食可可后，血小板微粒形成降低。第三，所述可可的攝食對血小板功能引起阿司匹林樣效應(yīng)，該效應(yīng)可通過與血小板相關(guān)的初期淤血測定。所述咖啡因飲料對照組引起腎上腺素誘發(fā)的活化GPIIb-IIIa表達(dá)以及微粒形成的增加的事實(shí)表明可可飲料中存在的可可矢車菊苷配質(zhì)具有抑制血小板活化和作用的功能。
實(shí)施例4口服可可對膽固醇抑制血管內(nèi)皮依賴性松弛(EDR)的影響已有報(bào)道表明某些含有黃酮類化合物的植物提取物能體外誘發(fā)家兔主動脈的EDR。我們研究了慢性口服可可對EDR的影響，并研究了其對食用膽固醇時(shí)出現(xiàn)的EDR損失的保護(hù)性活性。以4種食物，將新西蘭白兔喂養(yǎng)7周(1)食物，(2)食物+200mg可可/日，(3)2％膽固醇3周，接著4周食物，(4)2％膽固醇3周，接著4周食物+200mg可可/日。在懸垂于器官浴液(20ml)中的主動脈環(huán)上測定EDR。將該環(huán)用去甲腎上腺素(NE)(10-5M)預(yù)收縮。EDR對乙酰膽堿(Ach)和可可五聚物提取物(10-7-10-5M)的效應(yīng)按對NE松弛作用的百分率測定。
*與表欄中其它數(shù)據(jù)明顯不同實(shí)施例5口服可可矢車菊苷配質(zhì)、植物甾醇及其混合物的作用本試驗(yàn)結(jié)果表明食用妥爾油(“植物甾醇”)中的非酯化植物甾醇和植物甾烷醇與可可粉(CPd，含約70mg/g總可可矢車菊苷配質(zhì))混合物(1)對氧化應(yīng)激和損傷的指數(shù)以及(2)對膽固醇水平的影響，并說明植物甾醇與可可矢車菊苷配質(zhì)聯(lián)合服用的協(xié)同作用。
在純蛋殼中補(bǔ)充植物甾醇(2wt％)和/或CPd(0、0.5、1、2wt％)，給雄性大鼠喂食2周。將所述大鼠分成8組(每組3只)，根據(jù)下表每日喂食20-25克對照和試驗(yàn)食物飲食+2％植物甾醇(440mg/d)飲食-植物甾醇1組 0％CPd(0.0mg/d) 5組0％CPd(0.0mg/d)2組 .5％CPd(110mg/d) 6組.5％CPd(110mg/d)3組 1％CPd(220mg/d) 7組1％CPd(220mg/d)4組 2％CPd(440mg/d) 8組2％CPd(440mg/d)無限制喂水，通過稱量在食物杯下收集的剩余/濺落的食物的重量，確定食用量。每日測定食用的食物量，每隔一日給大鼠稱重。
測定該氧化損傷/應(yīng)激參數(shù)、膽固醇水平以及表兒茶精吸收入血漿中的水平。
采用Yagi(Biochem Med 15212-6，1976)說明的改進(jìn)方法，測定血漿TBARS。將100μL全血加入到1ml生理鹽水中，以1700g速度離心15分鐘。收集上清液，在-70℃下冷凍至分析使用。用磷鎢酸/硫酸體系將脂質(zhì)沉淀、分離。然后使該脂質(zhì)部分與硫代巴比土酸反應(yīng)，用1，1’，3，3’-四乙氧基丙烷作標(biāo)準(zhǔn)物，通過熒光測定法測定所得產(chǎn)物。結(jié)果以每毫升血漿中MDA的納摩爾表示，是血漿多不飽和脂肪酸的濃度的函數(shù)。
按如下方法測定8-羥基-2’-脫氧鳥苷(8OH2’dG)。采用Wako DNA提取WB試劑盒(Wako Chemical USA，Inc.，Richmond，VA)分離核DNA。將組織(100-250mg)或細(xì)胞(106細(xì)胞)在該試劑盒溶胞緩沖液中均化，然后在4℃下，以10,000g的速度離心20秒。將沉淀用該溶胞緩沖液處理，將得到的沉淀溶解于該試劑盒的酶反應(yīng)溶液中。加入RNA酶至終濃度20μg/ml，將樣本在50℃下溫育10分鐘。加入試劑盒的蛋白酶溶液，繼續(xù)在50℃下再溫育1小時(shí)。室溫下，將樣本以10,000g的速度離心5分鐘，將上清液用試劑盒的NaI溶液和異丙醇處理，純化DNA。室溫下，以10,000g的速度離心10分鐘收集沉淀，用試劑盒中的溶液A和B洗滌。將最后的沉淀物簡單進(jìn)行空氣干燥，然后再混懸于200μlpH 4.8的0.1mM desferyl/20mM乙酸鈉中。根據(jù)Shigenaga等(Methods Enzymol 23416-33，1994)的稍許修改方法，進(jìn)行該DNA酶切消化和分析。簡單地講，通過在65℃下與終濃度為0.1mg/ml的核酸酶P1一起溫育15分鐘，將DNA消化成核苷酸5’-單磷酸酯。用pH 8.5的1M Tris-HCl調(diào)節(jié)pH，然后用牛小腸堿性磷酸酯酶進(jìn)一步將樣本消化成核苷酸(1小時(shí)，37℃)。用pH 5.1的3M醋酸鈉緩沖液調(diào)節(jié)樣本pH，加入0.1mM EDTA/0.1mM desferyl抑制金屬誘發(fā)的氧化反應(yīng)。通過30,000MW斷流旋轉(zhuǎn)濾器過濾樣本，然后置于HPLC注射瓶中。在制備48小時(shí)內(nèi)分析樣本以防止人工產(chǎn)物形成。分析時(shí)，將樣本注入裝備有電化學(xué)檢測器(ESA，Coulochem II)的Hewlett Packard 1100 HPLC中。采用Supelcosil LC-18-DB柱(150×4.6mm，3微米粒度)，以帶有5％甲醇的100mM乙酸鈉緩沖液pH5.2為流動相，以1.0ml/min流速的無梯度洗脫進(jìn)行分離。采用電化學(xué)檢測器，在450mV下檢測OH8dG，用UV檢測器在248nm下檢測2’-脫氧鳥苷(dG)。以相對于樣本中dG的量表達(dá)OH8dG的水平。
按Rein等在J.of Nutr.，2000，130(8S)，2109S-2114S中說明的方法測定表兒茶精的吸收。
結(jié)果該結(jié)果確證了聯(lián)合給服植物甾醇和多酚的出乎意料的好處。
參見圖6，吸收的表兒茶精的量以劑量依賴性方式增加。令人驚奇的是，服用植物甾醇能增加表兒茶精的吸收，因此，例如與攝食不含植物甾醇的食物相比，服用2wt％CPd的食物，表兒茶精血漿水平增高約30％因此，所述植物甾醇能增大表兒茶精的生物利用度。
參見圖7，CPd以劑量依賴方式抑制對DNA的氧化損傷。令人驚奇的是，在服用高劑量CPd(2wt％)時(shí)，觀測到在對DNA的氧化損傷中的意外的降低作用，這表明植物甾醇和CPd在抑制對DNA氧化損傷中的協(xié)同作用。
參見圖8，喂食含有植物甾醇的食物可令人吃驚地引起比對照食物組更高的氧化應(yīng)激，即將植物甾醇與食物(不含可可矢車菊苷配質(zhì))一起食用加重該氧化應(yīng)激，該方法是本申請?zhí)岢鲋氨绢I(lǐng)域中所推薦的方法。喂食可可矢車菊苷配質(zhì)能逆轉(zhuǎn)或減弱植物甾醇的這種副作用。
也對總血漿膽固醇進(jìn)行了測定，結(jié)果見表3。
表3血漿總膽固醇
參見表3，如所料想的一樣，植物甾醇能降低膽固醇水平。但是，令人驚奇的是，當(dāng)將植物甾醇與CPd一起服用時(shí)，膽固醇水平以劑量依賴方式更加降低。例如，喂食含植物甾醇食物的3只大鼠的平均總膽固醇水平為84mg/dl。將該食物中補(bǔ)充2wt％CPd使總膽固醇水平降至80mg/dl，該結(jié)果表明了這兩種化合物的協(xié)同作用。喂食對照食物的大鼠其平均膽固醇水平為88.3mg/dl。
實(shí)施例6包含膽固醇降低劑并結(jié)合含有可可矢車菊苷配質(zhì)的可可或巧克力的食物組合物制備包含膽固醇降低劑的黑巧克力、太妃口嚼糖和燕麥花卷棒。
太妃口嚼糖的制備，可采用表4中所示的組分，通過先將糖與可可混合，再與焦糖混合進(jìn)行。將游離的植物甾醇(原型或粉末化)加入到該糖和可可的混合物中。
表4.含植物甾醇的太妃口嚼糖
含有游離甾醇的黑巧克力可采用市售提供的黑巧克力(Mars公司的DOVE Dark)制備。為易于與熔化的巧克力混合并避免對該巧克力結(jié)構(gòu)產(chǎn)生任何負(fù)面影響，用IKA制造的Universal Muche M20，將顆粒形式的植物甾醇/甾烷醇研磨30-60秒，混合，再研磨30秒，直至該顆粒的大小與巧克力的體積相當(dāng)。將黑巧克力熔化，通過慢慢混合加入植物甾醇，以保證甾醇顆粒的均勻分布。得到的組合物見表5所示。
表5.含植物甾醇的黑巧克力
采用表6和7中所列的組分制備包含具有降低膽固醇作用的燕麥纖維的燕麥花卷棒。該糖漿粘合劑可通過將棕櫚核油在45C融化，然后在該溫度下保存?zhèn)溆脕碇苽洹⒂衩滋菨{、甘油、可可粉、紅糖、鹽、卵磷脂和沒食子酸丙酯混合，然后加入棕櫚核油。將混合液保溫。為制備燕麥花卷，將漲泡的燕麥或大豆(購自Sovex Food，Collegedale，TN)與所述巧克力片一起混合，將按以上說明制備的溫?zé)崽菨{粘合劑合并入混合液中。然后將該燕麥花卷混合物制成厚片，撒上10X糖(62％)、可可粉(33％)和桂皮(5％)的混合物，切成片狀。該混合物中所用的可可粉可根據(jù)Kealey等的美國專利6,015,913的方法制備。
表6.含巧克力和燕麥的燕麥花卷棒
表7.含巧克力和大豆蛋白的燕麥花卷棒
權(quán)利要求
1.一種藥物、飲食補(bǔ)充劑或食品添加劑，其包含可可矢車菊苷配質(zhì)單體和/或低聚物以及基于甾醇和/或甾烷醇的膽固醇降低劑。
2.權(quán)利要求1的藥物、飲食補(bǔ)充劑或食品添加劑，其還包含大豆蛋白、可溶性纖維和/或L-精氨酸。
3.權(quán)利要求1的藥物、飲食補(bǔ)充劑或食品添加劑，其還包含至少一種以下物質(zhì)鈣、鉀、鎂、維生素E、維生素C、任何一種復(fù)合維生素B、類胡蘿卜素、瓜耳膠或者單或多不飽和脂肪酸。
4.權(quán)利要求1的藥物、飲食補(bǔ)充劑或食品添加劑，其中所述可可矢車菊苷配質(zhì)單體和/或低聚物以可可成分、含有矢車菊苷配質(zhì)的可可提取物或者含有至少一種矢車菊苷配質(zhì)單體或低聚物的可可提取物的部分的形式存在。
5.一種不是糖果的食品，其包含可可矢車菊苷配質(zhì)單體和/或低聚物以及基于甾醇和/或甾烷醇的膽固醇降低劑。
6.權(quán)利要求5的食品，其還包含大豆蛋白、可溶性纖維和/或L-精氨酸。
7.權(quán)利要求5的食品，其還包含至少一種以下物質(zhì)鈣、鉀、鎂、維生素E、維生素C、任何一種復(fù)合維生素B、類胡蘿卜素、瓜耳膠或者單或多不飽和脂肪酸。
8.權(quán)利要求5的食品，其中所述可可矢車菊苷配質(zhì)單體和/或低聚物以可可成分、含有矢車菊苷配質(zhì)的可可提取物或者含有至少一種矢車菊苷配質(zhì)單體或低聚物的可可提取物的部分的形式存在。
9.權(quán)利要求5的食品，其中所述食品為飲料。
10.權(quán)利要求5的食品，其中所述食品為寵物食品。
11.一種降低膽固醇的糖果，其包含可可矢車菊苷配質(zhì)單體和/或低聚物以及基于甾醇和/或甾烷醇的膽固醇降低劑。
12.權(quán)利要求11的糖果，其還包含大豆蛋白、可溶性纖維和/或L-精氨酸。
13.權(quán)利要求11的糖果，其還包含至少一種以下物質(zhì)鈣、鉀、鎂、維生素E、維生素C、任何一種復(fù)合維生素B、類胡蘿卜素、瓜耳膠或者單或多不飽和脂肪酸。
14.權(quán)利要求11的糖果，其中所述可可矢車菊苷配質(zhì)單體和/或低聚物以可可成分、含有矢車菊苷配質(zhì)的可可提取物或者含有至少一種矢車菊苷配質(zhì)單體或低聚物的可可提取物的部分的形式存在。
15.權(quán)利要求11的糖果，其中所述糖果是巧克力、巧克力包裹的餅干、烘烤產(chǎn)品和燕麥花卷棒。
16.權(quán)利要求11的糖果，其中所述糖果具有至少一種以下的性質(zhì)誘發(fā)血管舒張、抑制LOX活性、抑制LDL的氧化作用、增強(qiáng)NOS活性、增加NO水平、抑制血小板聚集、單核細(xì)胞粘附和血管平滑肌增殖、降低血壓、降低血栓形成以及調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激。
17.一種降低膽固醇的巧克力，其包含可可矢車菊苷配質(zhì)單體和/或低聚物以及基于甾醇和/或甾烷醇的膽固醇降低劑。
18.一種包裝，其包含權(quán)利要求5-10中任一項(xiàng)的食品或權(quán)利要求11-17中任一項(xiàng)的糖果以及使用所述食品或糖果促進(jìn)心血管健康和/或降低心臟疾病風(fēng)險(xiǎn)的標(biāo)簽和/或說明書。
19.一種包裝，其包含權(quán)利要求5-10中任一項(xiàng)的食品或權(quán)利要求11-17中任一項(xiàng)的糖果以及使用所述食品或糖果誘發(fā)血管舒張、抑制LOX活性、抑制LDL的氧化作用、增強(qiáng)NOS活性、增加NO水平、抑制血小板聚集、單核細(xì)胞粘附和血管平滑肌增殖、降低血壓、降低血栓形成以及對抗氧化應(yīng)激的標(biāo)簽和/或說明書。
20.一種包裝，其包含權(quán)利要求5-10中任一項(xiàng)的食品或權(quán)利要求11-17中任一項(xiàng)的糖果以及用于說明該食品或糖果能促進(jìn)和/或增強(qiáng)可可矢車菊苷配質(zhì)吸收的標(biāo)簽和/或說明書。
21.一種包裝，它包含(i)一種組合物，該組合物包含一種具有至少一種以下性質(zhì)的多酚和一種基于甾醇和/或甾烷醇的膽固醇降低劑誘發(fā)血管舒張、抑制COX活性、抑制LOX活性、抑制LDL的氧化作用、增強(qiáng)NOS活性、增加NO水平、抑制血小板聚集、單核細(xì)胞粘附和血管平滑肌增殖、降低血壓、降低血栓形成以及調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激；以及(ii)使用該組合物促進(jìn)心血管健康、降低心臟病風(fēng)險(xiǎn)和/或促進(jìn)或增強(qiáng)該多酚吸收的標(biāo)簽和/或說明書。
22.權(quán)利要求21的包裝，其中所述多酚是黃烷醇。
23.權(quán)利要求21的包裝，其中所述多酚是黃酮醇。
24.一種包裝，它包含(i)一種組合物，該組合物包含一種具有至少一種以下性質(zhì)的多酚和一種膽固醇降低劑誘發(fā)血管舒張、抑制COX活性、抑制LOX活性、抑制LDL的氧化作用、增強(qiáng)NOS活性、增加NO水平、抑制血小板聚集、單核細(xì)胞粘附和血管平滑肌增殖、降低血壓、降低血栓形成以及調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激；以及(ii)使用該組合物促進(jìn)血管健康和/或降低心臟病風(fēng)險(xiǎn)的標(biāo)簽和/或說明書。
25.權(quán)利要求24的包裝，其中所述多酚是黃烷醇。
26.權(quán)利要求25的包裝，其中所述黃烷醇是可可黃烷醇。
27.權(quán)利要求24的包裝，其中所述多酚是黃酮醇。
28.權(quán)利要求24的包裝，其中所述多酚是與黃烷醇相關(guān)的低聚物。
29.權(quán)利要求28的包裝，其中所述與黃烷醇相關(guān)的低聚物是可可矢車菊苷配質(zhì)低聚物。
30.一種組合物，其包含一種具有至少一種以下性質(zhì)的多酚和一種膽固醇降低劑誘發(fā)血管舒張、抑制COX活性、抑制LOX活性、抑制LDL的氧化作用、增強(qiáng)NOS活性、增加NO水平、抑制血小板聚集、單核細(xì)胞粘附和血管平滑肌增殖、降低血壓、降低血栓形成以及調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激。
31.一種促進(jìn)人或動物的心血管和/或血管健康的方法，它包括給予該人或動物一種包含多酚和膽固醇降低劑的組合物。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述多酚是可可矢車菊苷配質(zhì)單體和/或低聚物。
33.權(quán)利要求31的方法，其中所述膽固醇降低劑是基于甾醇和/或甾烷醇的膽固醇降低劑。
34.權(quán)利要求32的方法，其中所述膽固醇降低劑是基于甾醇和/或甾烷醇的膽固醇降低劑。
35.一種促進(jìn)多酚吸收入人或動物血中的方法，該方法包括聯(lián)合給予該人或動物(i)一種具有至少一種以下性質(zhì)的多酚誘發(fā)血管舒張、抑制COX活性、抑制LOX活性、抑制LDL的氧化作用、增強(qiáng)NOS活性、增加NO水平、抑制血小板聚集、單核細(xì)胞粘附和血管平滑肌增殖、降低血壓、降低血栓形成以及調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激，和(ii)一種基于甾醇和/或甾烷醇的膽固醇降低劑。
36.權(quán)利要求35的方法，其中將所述多酚和所述基于甾醇和/或甾烷醇的膽固醇降低劑分別給予。
37.權(quán)利要求35的方法，其中將所述多酚和所述基于甾醇和/或甾烷醇的膽固醇降低劑在同一組合物中給予。
38.權(quán)利要求35的方法，其中所述多酚是黃烷醇。
39.權(quán)利要求36的方法，其中所述多酚是黃烷醇。
40.權(quán)利要求37的方法，其中所述多酚是黃烷醇。
41.可可矢車菊苷配質(zhì)和基于甾醇和/或甾烷醇的膽固醇降低劑在制造用于促進(jìn)人或動物血管健康的藥物、食品、飲食補(bǔ)充劑或食品添加劑中的用途。
42.基于甾醇和/或甾烷醇的膽固醇降低劑在制造與可可矢車菊苷配質(zhì)一起應(yīng)用來促進(jìn)人或動物血管健康的藥物、食品、飲食補(bǔ)充劑或食品添加劑中的用途。
43.可可矢車菊苷配質(zhì)在制造與基于甾醇和/或甾烷醇的膽固醇降低劑一起應(yīng)用來促進(jìn)人或動物血管健康的藥物、食品、飲食補(bǔ)充劑或食品添加劑中的用途。
44.多酚和基于甾醇和/或甾烷醇的膽固醇降低劑在制造用于促進(jìn)多酚吸收入人或動物血中的藥物、食品、飲食補(bǔ)充劑或食品添加劑中的用途。
45.基于甾醇和/或甾烷醇的膽固醇降低劑在制造與多酚一起應(yīng)用來促進(jìn)多酚吸收入人或動物血中的藥物、食品、飲食補(bǔ)充劑或食品添加劑中的用途。
46.多酚在制造與基于甾醇和/或甾烷醇的膽固醇降低劑一起應(yīng)用來促進(jìn)多酚吸收入人或動物血中的藥物、食品、飲食補(bǔ)充劑或食品添加劑中的用途。
47.權(quán)利要求44-46中任一項(xiàng)的用途，其中所述多酚是黃烷醇。
48.權(quán)利要求47的用途，其中所述黃烷醇是可可黃烷醇。
49.一種促進(jìn)血管健康的產(chǎn)品，其包含分別、同時(shí)或順次應(yīng)用的多酚和基于甾醇和/或甾烷醇的膽固醇降低劑。
50.聯(lián)合應(yīng)用促進(jìn)血管健康的多酚和基于甾醇和/或甾烷醇的膽固醇降低劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有多酚例如可可多酚(如矢車菊苷配質(zhì))和至少一種膽固醇降低劑的組合物，以及促進(jìn)血管健康包括治療和預(yù)防動脈粥樣硬化和心血管疾病的方法。
文檔編號A61K36/61GK1436047SQ01810924
公開日2003年8月13日 申請日期2001年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2000年4月14日
發(fā)明者H·H·施米茨, K·A·徹沃西, A·多姆布羅施基, R·杰羅梅 申請人:馬爾斯公司