用于促進(jìn)成骨分化或血管化的肽及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種有效促進(jìn)成骨分化和血管化的蛋白，更具體而言，涉及表現(xiàn)出促進(jìn)成骨分化或成骨作用和血管化的活性的肽，以及其應(yīng)用。
【專利說明】
用于促進(jìn)成骨分化或血管化的肽及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及有效促進(jìn)成骨分化和血管化的蛋白，更具體而言，涉及表現(xiàn)出促進(jìn)成 骨分化或血管化的活性的肽，以及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 骨質(zhì)減少很大程度上受骨質(zhì)量的變化的影響。影響骨質(zhì)量變化的主要因素包括遺 傳因素、營(yíng)養(yǎng)攝取、激素變化、鍛煉和生活方式差異等。最近，已經(jīng)知曉老齡化、缺乏鍛煉、低 鈣飲食、更年期和切除卵巢會(huì)引起骨質(zhì)量減少，并由此導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。
[0003] 骨質(zhì)疏松是一種下述的疾?。浩渲?，骨骼隨鈣質(zhì)在骨組織中的沉積減少的癥狀的 進(jìn)程而變得非常薄弱，骨密度變低且髓腔變寬，由此容易引起骨相關(guān)疾病(如骨折)甚至輕 度休克的發(fā)生。
[0004] 盡管存在個(gè)體差異，骨再吸收水平在黑人中比在白人中更低，因此黑人具有較高 的骨質(zhì)量。通常，骨質(zhì)量在14~18歲之間達(dá)到最高水平，并在老齡時(shí)每年減少約1 %。特別 是，骨骼減少在女性中持續(xù)發(fā)生，因?yàn)樵?0歲和更年期時(shí)，由于激素變化而使骨骼減少快速 發(fā)生。也就是，一旦女性進(jìn)入更年期，其將經(jīng)歷雌激素水平的快速減少，特別是，B-淋巴細(xì)胞 大量生成，并且前B細(xì)胞累積在骨髓中。結(jié)果，IL-6的量增大，由此破骨細(xì)胞的活性增大并由 此使骨質(zhì)量減少。
[0005] 因此，盡管存在不同的程度，老年人、特別是絕經(jīng)后女性不能避免骨質(zhì)疏松，并且 在具有老齡化人群的發(fā)達(dá)國(guó)家中，對(duì)骨質(zhì)疏松及其治療劑存在越來越大的興趣。
[0006] 另外，除了骨質(zhì)疏松，骨相關(guān)疾病還包括骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)流失疾病等。骨關(guān)節(jié)炎是 在關(guān)節(jié)的軟骨變得受損時(shí)出現(xiàn)的局部退行性病變，并且還稱為退行性關(guān)節(jié)炎。骨關(guān)節(jié)炎的 出現(xiàn)有兩個(gè)主要原因，即，盡管關(guān)節(jié)的軟骨或骨骼正常，但由于關(guān)節(jié)上負(fù)荷過重而使關(guān)節(jié)組 織受損時(shí);或盡管關(guān)節(jié)上負(fù)荷正常，但軟骨或骨骼較弱時(shí)。
[0007] 骨質(zhì)流失疾病可能出現(xiàn)在身體的許多區(qū)域中，并且骨質(zhì)流失疾病的主要原因可能 包括伴隨骨組織流失的急性創(chuàng)傷、在手術(shù)期間伴隨由于組織移除所致骨質(zhì)流失的急性創(chuàng) 傷、伴隨骨骼切除術(shù)的慢性感染和伴隨骨節(jié)段流失的慢性骨不愈合等。
[0008] 已經(jīng)建立了與治療骨疾病相關(guān)的價(jià)值至少約1300億美元的全球市場(chǎng)，并且該市場(chǎng) 的規(guī)?？善谕谖磥砝^續(xù)進(jìn)一步增大，因此全球研究機(jī)構(gòu)和藥物公司已經(jīng)對(duì)用于治療骨疾 病的治療劑的開發(fā)投入不菲。
[0009] 特別是，在骨質(zhì)疏松的情況中，例如，骨質(zhì)疏松治療的實(shí)例包括雄激素合成代謝類 固醇、鈣制劑、磷酸鹽、氟制劑、依普黃酮和維生素 D3等。Merck&Co.，Inc.(美國(guó)）在1953年開 發(fā)出氨基雙膦酸鹽，Lilly Co.(美國(guó)）開發(fā)出用作選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERM)的雷洛 昔芬，作為用于治療骨質(zhì)疏松的治療劑。
[0010] 同時(shí)，作為骨再吸收抑制劑的雌激素最為廣泛地用作骨質(zhì)疏松治療。不過，雌激素 的常規(guī)應(yīng)用可能增大子宮內(nèi)膜癌和乳腺癌的發(fā)病率，并可能導(dǎo)致血栓形成、膽石病、高血 壓、水腫和乳腺痛等。對(duì)絕經(jīng)后女性(其同時(shí)施用雌激素和孕酮)的追蹤研究揭示了乳腺癌、 中風(fēng)和肺栓塞等的高發(fā)病率。
[0011] 此外，雙膦酸鹽制劑(阿侖膦酸鈉和依替膦酸鈉）、維生素 D制劑、降血鈣素制劑和 鈣制劑等用作骨質(zhì)疏松用治療劑。不過，這些治療劑具有以下問題:雙膦酸鹽制劑的吸收速 率低、施用方法復(fù)雜，引起食管炎;維生素 D制劑昂貴且其效果尚未確認(rèn);降血鈣素制劑昂貴 且施用方法困難;且鈣制劑雖然具有較少的副作用，但是其有效用于防止而非治療骨質(zhì)疏 松。另外，骨質(zhì)疏松不能通過短期施用藥物治療，而必須長(zhǎng)期施用。因此，需要開發(fā)出一種具 有優(yōu)異效果的新型物質(zhì)來代替現(xiàn)存的治療物質(zhì)，而沒有上述副作用。
[0012] 當(dāng)前，對(duì)于骨形態(tài)生成活性而言，已經(jīng)報(bào)道了屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-e超家族的 骨形態(tài)生成蛋白質(zhì)（BMP) (Science 150,893-897，1965; Science 242; 1528-1534，1988)。已 知的BMP物種（species)來自BMP-1~BMP-14。其中，已知BMP-2~BMP-14表現(xiàn)出骨形態(tài)生成 活性。據(jù)認(rèn)為，BMP-2~BMP-14可有效用于各種骨功能紊亂和骨疾病的療法治療，不過其在 自然界以痕量存在。
[0013] 因此，為了大量獲得可用于上述治療的BMP-2~BMP-14以使其價(jià)格可接受，需要制 備重組蛋白。通常，重組蛋白的制備與低分子量化合物相比需要更高的花費(fèi)。另一方面，由 于蛋白特性，從物理性質(zhì)和施用角度來看，重組蛋白作為藥物制品具有許多限制。在這些背 景下，本發(fā)明人在先前已經(jīng)開發(fā)出骨肽蛋白1(BFP 1)，其由15個(gè)氨基酸構(gòu)成，并且作為低分 子量有機(jī)化合物具有與BMP蛋白相同的活性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 技術(shù)問題
[0015] 本發(fā)明人已經(jīng)制備和篩選出各種類型的人源蛋白，以制備具有與天然BMP相同或 比其更優(yōu)異的功能或作用的肽，所述肽可以低成本地制造并具有優(yōu)異的穩(wěn)定性。結(jié)果，可從 許多候選肽中選擇出不僅具有優(yōu)異的生理活性而且具有優(yōu)異穩(wěn)定性的肽，由此完成本發(fā) 明。
[0016] 因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種趨化因子來源的肽，其通過對(duì)成骨細(xì)胞或血 管內(nèi)皮細(xì)胞作用而促進(jìn)分化，由此表現(xiàn)出分化因子的活性。
[0017] 本發(fā)明的另一目的是提供一種組合物，其用于緩解或治療成骨分化因子或骨形態(tài) 生成因子或血管化因子的有效性的疾病或病癥。
[0018] 本發(fā)明的又一目的是提供一種組合物，其有效用于緩解或治療包括缺血性壞死在 內(nèi)的血管疾病，所述組合物包含能夠表現(xiàn)出促進(jìn)血管化的活性的肽作為活性成分。
[0019] 本發(fā)明的又一目的是提供一種藥物組合物，其具有優(yōu)異的藥物效應(yīng)而無副作用 (因?yàn)槠涫前?5個(gè)氨基酸構(gòu)成的肽作為活性成分的低分子量有機(jī)化合物），并且還具有 相對(duì)較低的制造成本。
[0020] 本發(fā)明的又一目的是提供一種用于成骨分化的培養(yǎng)組合物，其包含具有成骨分化 因子或骨形態(tài)生成因子活性的肽，能夠根據(jù)實(shí)驗(yàn)者的意圖控制骨形態(tài)生成速度。
[0021] 本發(fā)明的目的不限于以上描述的那些，并且以上未描述的其他目的及其優(yōu)勢(shì)能夠 由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過下文描述的本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】、權(quán)利要求和附圖而清楚了解。 [0022]技術(shù)方案
[0023]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種具有分化因子活性的肽，所述肽具有氨基酸 序列SEQ ID N0:1。
[0024] 在優(yōu)選實(shí)施方式中，所述肽具有細(xì)胞分化能力。
[0025] 在優(yōu)選實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是成骨細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞。
[0026] 在優(yōu)選實(shí)施方式中，所述肽為源自SDF-ld蛋白。
[0027] 另外，本發(fā)明提供了一種用于治療或緩解骨質(zhì)疏松的藥物組合物，其包含以上描 述的任意一種肽作為活性成分。
[0028] 另外，本發(fā)明提供了一種用于治療或緩解骨關(guān)節(jié)炎的藥物組合物，其包含以上描 述的任意一種肽作為活性成分。
[0029] 另外，本發(fā)明提供了一種用于治療或緩解骨質(zhì)流失疾病的藥物組合物，其包含以 上描述的任意一種肽作為活性成分。
[0030] 另外，本發(fā)明提供了一種用于成骨分化的培養(yǎng)基，其包含以上描述的任意一種肽 作為活性成分。
[0031] 另外，本發(fā)明提供了一種用于治療或緩解血管疾病的藥物組合物，其包含以上描 述的任意一種肽作為活性成分。
[0032] 在優(yōu)選實(shí)施方式中，所述血管疾病為缺血性壞死。
[0033] 有益效果
[0034]本發(fā)明的效果如下。
[0035] 首先，本發(fā)明的肽通過對(duì)成骨細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞作用而促進(jìn)分化，由此表現(xiàn)出 分化因子的活性。
[0036] 另外，本發(fā)明的肽可用于緩解或治療成骨分化因子或骨形態(tài)生成因子或血管化因 子的有效性的疾病或病癥。
[0037] 另外，本發(fā)明的肽是由15個(gè)氨基酸構(gòu)成的低分子量有機(jī)化合物，其具有優(yōu)異的藥 物效應(yīng)而無副作用，并具有相對(duì)較低的制造成本。
[0038] 另外，本發(fā)明的藥物組合物通過包含肽而可以有效地作用于緩解或治療包括缺血 性壞死在內(nèi)的血管疾病，該肽作為活性成分而表現(xiàn)出血管化促進(jìn)因子的活性。
[0039] 另外，本發(fā)明的藥物組合物通過包含肽而可以有效地作用于緩解或治療骨質(zhì)疏 松、骨關(guān)節(jié)炎或骨質(zhì)流失疾病，該肽作為活性成分而表現(xiàn)出分化因子的活性。
[0040] 另外，用于成骨分化用培養(yǎng)基的組合物通過包含肽而能夠根據(jù)實(shí)驗(yàn)者的意圖控制 成骨分化速率或骨形態(tài)生成速率，該肽作為活性成分而表現(xiàn)出分化因子的活性。
[0041] 本發(fā)明的效果不限于以上描述的那些，并且未描述的那些效果將由本領(lǐng)域技術(shù)人 員基于下文提供的描述而清楚了解。
【附圖說明】
[0042] 圖1示出了SEQ ID N0:1的肽BFP 5的氨基酸序列。
[0043]圖2示出了本發(fā)明的SEQ ID N0:1的肽BFP 5的結(jié)構(gòu)。
[0044] 圖3示出了茜素紅染色法確認(rèn)的經(jīng)由BFP 5的成骨分化而累積的礦化作用的照片。
[0045] 圖4示出了描繪測(cè)量通過BFP 5引起的堿性磷酸酶(成骨細(xì)胞特異性基因）的表達(dá) 水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖示。
[0046]圖5示出了描繪測(cè)量通過BFP 5引起的Runx2、堿性磷酸酶、骨橋蛋白、1型膠原蛋 白、DLX5和〇SteriX(它們是成骨細(xì)胞特異性基因）的表達(dá)水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的照片。
[0047]圖6示出了描繪測(cè)量通過BFP 5引起的的堿性磷酸酶和Osterix(它們是在成骨細(xì) 胞中表達(dá)的蛋白）的表達(dá)水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的照片。
[0048]圖7示出了描繪在用不同濃度的BFP 5處理后的堿性磷酸酶(其是在成骨細(xì)胞中表 達(dá)的蛋白）的表達(dá)水平的照片。
[0049]圖8示出了描繪在用不同濃度的BFP 5處理后的Osterix(其是在成骨細(xì)胞中表達(dá) 的蛋白）的表達(dá)水平的照片。
[0050] 圖9示出了描繪通過用BFP 5與VEGF、FGF、SDF-la和SDF-lg-起處理細(xì)胞而得的 BFP 5對(duì)血管化的作用的照片。
【具體實(shí)施方式】
[0051] 本發(fā)明選擇使用的術(shù)語(yǔ)是考慮到功能而當(dāng)前廣泛使用的那些術(shù)語(yǔ)，不過，這些術(shù) 語(yǔ)根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的意圖、判例和新技術(shù)的出現(xiàn)等而可能改變。另外，在特定情況中， 還存在
【申請(qǐng)人】任意選擇的術(shù)語(yǔ)，其中該術(shù)語(yǔ)將在本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中解釋。因此，本發(fā) 明使用的術(shù)語(yǔ)應(yīng)當(dāng)基于該術(shù)語(yǔ)具備的含義和本發(fā)明整個(gè)說明書的內(nèi)容而非該術(shù)語(yǔ)單純的 名稱限定。
[0052]下面，將參照附圖及其優(yōu)選實(shí)施方式詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)特征。除非另外指出， 否則固體/固體是指(重量/重量)份或％，固體/液體是指(重量/體積)份或％，且液體/液體 是指(體積/體積)份或％。
[0053] 不過，本發(fā)明可以局限于下文說明的實(shí)施方式，但是也可實(shí)施為不同形式。在整個(gè) 說明書中用于解釋本發(fā)明的相似標(biāo)記表示相似元素。
[0054] 本發(fā)明人已經(jīng)制備和篩選出各種類型的人源蛋白，以制備具有與天然BMP相同或 比其更優(yōu)異的功能或作用的肽，所述肽可以低成本地制造并具有優(yōu)異的穩(wěn)定性。結(jié)果，可從 許多候選肽中選擇出不僅具有優(yōu)異的生理活性而且具有優(yōu)異穩(wěn)定性的肽。
[0055]特別是，本發(fā)明人并非基于與BMP的功能相關(guān)的區(qū)域合成出本發(fā)明的肽，而是本發(fā) 明的技術(shù)特征在于，本發(fā)明的肽基于人類趨化因子的特定區(qū)域合成。也就是，本發(fā)明的肽基 于A形狀的基質(zhì)細(xì)胞源因子l(SDF-l)的部分區(qū)域合成，該因子也稱為C-X-C模序趨化因子 12(CXCL12)〇
[0056]事實(shí)上，趨化因子是選擇性控制白細(xì)胞亞組的細(xì)胞粘附、化學(xué)吸引作用和活化等 的細(xì)胞因子，并主要涉及細(xì)胞迀移。趨化因子是具有四個(gè)分子量為10kD(90~130個(gè)氨基酸） 的保守性半胱氨酸殘基的物質(zhì)，其根據(jù)兩個(gè)連續(xù)的半胱氨酸殘基的位置可劃分為兩種類型 (即，CC趨化因子和CXC趨化因子），不過，事實(shí)上，趨化因子不具有成骨分化功能。
[0057]本發(fā)明的肽包括選自由SDF-ld源氨基酸組成的組的氨基酸序列。特別是，本發(fā)明 的肽基本上由圖1所示的SEQ ID NO: 1的氨基酸序列組成。本發(fā)明的肽具有由SEQ ID NO: 1 所示的15個(gè)氨基酸構(gòu)成的新型序列，并且本發(fā)明人將SEQ ID N0:1的肽命名為骨形成肽5 (BFP 5)〇
[0058]如本文所用，術(shù)語(yǔ)"肽"是指經(jīng)肽鍵相互連接的氨基酸殘基形成的線性分子。本發(fā) 明的肽可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的化學(xué)合成方法制備，具體而言，根據(jù)固相合成技術(shù) (MerrifieId，J.Amer·Chem.Soc·85:2149-54(1963);Stewart等，Sol id Phase Peptide Synthesis,第二版，Pierce Chem.Co. :Rockford, 111(1984))制備。
[0059] SEQ ID NO: 1的肽發(fā)揮與天然BMP和趨化因子中至少一個(gè)相似的作用，并通過與受 體結(jié)合而發(fā)揮諸如分化因子等功能。特別是，SEQ ID NO: 1的肽起到促進(jìn)成骨細(xì)胞或血管內(nèi) 皮細(xì)胞的分化的作用。
[0060] 本發(fā)明的肽不僅表現(xiàn)出幾乎與天然BMP或趨化因子相同的優(yōu)異生理活性，或比天 然BMP或趨化因子更優(yōu)異，而且具有優(yōu)異的熱穩(wěn)定性和對(duì)諸如酸、堿等物理化學(xué)因子的穩(wěn)定 性。因此，具有優(yōu)異的長(zhǎng)期保存性的本發(fā)明的肽可以有利地應(yīng)用于需要長(zhǎng)期存儲(chǔ)的產(chǎn)品，如 藥物制品和準(zhǔn)藥品。
[0061 ]本發(fā)明的肽可以作為活性成分而包含于藥物組合物中。
[0062] 因此，本發(fā)明的藥物組合物是包含(a)藥學(xué)有效量的本發(fā)明的肽和(b)藥學(xué)可接受 載體的藥物組合物。
[0063] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"藥學(xué)有效量"是指足以實(shí)現(xiàn)所述肽的上述效果或活性的量。
[0064] 本發(fā)明的藥物組合物中包含的藥學(xué)上可接受的載體是制劑中通常使用的那些，可 以包括:乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯膠、磷酸鈣、藻酸鹽、明膠、硅酸 鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、糖漿、甲基纖維素、甲基羥基苯甲酸酯、丙基 羥基苯甲酸酯、滑石、硬脂酸鎂、礦物油等，但并不限于此。除了上述組分，本發(fā)明的藥物組 合物可以還包括潤(rùn)滑劑、濕潤(rùn)劑、甜味劑、香味劑、乳化劑、懸浮劑和防腐劑等。適當(dāng)?shù)乃帉W(xué) 上可接受的載體和制劑的實(shí)例如Remington's Pharmaceutical Sciences(第19版，1995) 中詳細(xì)所述。
[0065] 本發(fā)明的藥物組合物可以口服施用或非腸道施用，并且優(yōu)選的是非腸道施用。對(duì) 于非腸道施用而言，藥物組合物可以經(jīng)由靜脈注射、皮下注射、肌肉內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射、局 部施用或經(jīng)皮膚施用等進(jìn)行施用。
[0066] 本發(fā)明的藥物組合物的適當(dāng)劑量可以根據(jù)諸如配制方法、施用方法、患者的年齡、 體重和性別、疾病嚴(yán)重性、飲食、施用時(shí)間、施用途徑、排泄率和反應(yīng)敏感性等因素而區(qū)別規(guī) 定。同時(shí)，本發(fā)明的藥物組合物的劑量為〇. OOOlyg/日~lOOyg/日，優(yōu)選為〇. 000lyg/mL~?μ g/mL〇
[0067] 根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易實(shí)施的方法，通過配制藥學(xué)可接受載體和/或賦形 劑，本發(fā)明的藥物組合物可以制備為單位劑型或封入多劑容器中。特別是，制劑可以為在油 或水性介質(zhì)中的溶液、懸浮液或乳液、提取物、粉末、顆粒、片劑或膠囊的形式，并還可以包 括分散劑或穩(wěn)定劑。
[0068] 實(shí)施例
[0069] Pr〇-Pr〇-Arg-Ala-Cys-Pr〇-Thr-Ala-Arg-Ala-Leu-Cys-Glu-Ile-Arg(SEQ ID NO: 1)的合成
[0070] 向反應(yīng)容器中添加量為700mg的氯代三苯甲基氯樹脂(CTL樹脂，Nova Biochem產(chǎn) 品目錄號(hào)01-64-0021)和10mL二氯甲烷(MC)，并攪拌3分鐘。在除去溶液中，向其中添加10mL 二甲基甲酰胺(DMF)，攪拌3分鐘，并除去溶劑。向反應(yīng)容器中添加二氯甲烷(1 OmL)、200mmo 1 Fmoc_Arg(pbf )-〇H(Bachem,瑞士)和400mmol二異丙基乙基胺(DIEA)，經(jīng)攪拌良好溶解并反 應(yīng)，同時(shí)攪拌1小時(shí)。在反應(yīng)完成后，即刻洗滌所得物，與溶解在二氯甲烷(DCM)中的甲醇和 DIEA(比例2:1)反應(yīng)10分鐘，并用過量的DCM/DMF(比例1:1)洗滌。在除去溶液后，向其中添 加 lOmL二甲基甲酰胺(DMF)，攪拌3分鐘，并除去溶劑。向反應(yīng)容器中添加量為lOmL的脫保護(hù) 溶液(20%的哌啶/DMF)，在室溫下攪拌10分鐘，并除去溶液。向其中添加等量的脫保護(hù)溶 液，反應(yīng)維持10分鐘，并除去溶液，分別用DMF洗滌兩次，用MC洗滌一次，并用DMF洗滌一次， 共3分鐘，并從中制備出Arg(pbf)-CTL樹脂。
[0071 ]向新反應(yīng)容器中添加 DMF溶液（10mL)、200mmo1 Fmoc-I le_0H(Bachem，瑞士）、 200mmol HoBt和200mmol Bop，并經(jīng)攪拌良好溶解。向反應(yīng)容器中分兩部分添加 DIEA (400_〇1)，攪拌至少5分鐘，直至全部固體變?nèi)芙狻Ｏ蚍磻?yīng)容器中添加包含脫保護(hù)樹脂的溶 解后的氨基酸混合物溶液，并在室溫反應(yīng)1小時(shí)，同時(shí)攪拌。除去反應(yīng)溶液，并與DMF溶液攪 拌3次，每次5分鐘并除去。收集少量的反應(yīng)后樹脂，并通過Kaiser測(cè)試(Nihydrin測(cè)試)檢測(cè) 反應(yīng)程度。使用脫保護(hù)溶液，以與上述相同的方式進(jìn)行脫保護(hù)反應(yīng)兩次，并由此制備Ile-Arg(pbf )-CTL樹脂。樹脂用DMF和MC充分洗滌，并再次進(jìn)行Kaiser測(cè)試，并與上述相同的方 式進(jìn)行隨后的氨基酸粘附測(cè)試。基于所選擇的氨基酸序列，以Fmoc-Glu、Fmoc-Cys(trt)、 Fmoc-Leu、Fmoc-Ala、Fmoc-Arg、Fmoc-Ala、Fmoc-Thr、Fmoc-Pro、Fmoc-Cys(trt)、Fmoc_Ala、 Fmoc-Arg、Fmoc-Pro和Fmoc-Pro的順序進(jìn)行鏈反應(yīng)。Fmoc保護(hù)基團(tuán)與脫保護(hù)溶液反應(yīng)兩次， 每次10分鐘，并通過洗滌良好除去。向其中添加乙酸酐、DIEA和HoBt來進(jìn)行1小時(shí)的乙?；?， 并分別用DMF、MC和甲醇洗滌3次肽基樹脂，通過向其中緩慢吹入氮?dú)飧稍铮ㄟ^在P205下降 至真空而完全干燥，并添加30mL脫水溶液（三氟乙酸（95% )、蒸餾水（2.5 % )、茴香硫醚 (2.5% ))，并且反應(yīng)在室溫保持2小時(shí)，同時(shí)不定期振蕩。樹脂通過過濾而進(jìn)行過濾，用少量 TFA溶液洗滌，并與母液合并。所得物在減壓下進(jìn)行蒸餾直至整個(gè)體積降至約一半，并通過 添加50mL冷醚誘發(fā)沉淀。通過離心過濾收集析出物，并用更冷的醚洗滌兩次。在除去母液 后，所得物在氮?dú)庀鲁浞指稍?，并合成出?· 65g NH2-Pr〇-Pr〇-Arg-Ala-Cys-Pr〇-Thr_Ala-Arg-Ala-Leu-Cys-Glu-Ile-Arg-〇H肽，然后進(jìn)行純化(收率93% ) 〇
[0072] 實(shí)驗(yàn)例1
[0073] 通過使用在線PEP-F0LD服務(wù)器提供的程序添加15個(gè)氨基酸序列而確認(rèn)了實(shí)施例 中制得的SEQ ID NO: 1的結(jié)構(gòu)。結(jié)果如圖2所示。
[0074]從圖2可以觀察到，SEQ ID NO: 1的肽具有α-螺旋結(jié)構(gòu)。
[0075] 實(shí)驗(yàn)例2
[0076]為了確認(rèn)BFP 5(其是實(shí)施例中制備的SEQ ID NO: 1的肽)對(duì)成骨分化的活性的效 果，進(jìn)行了下述實(shí)驗(yàn)。
[0077] 1.成骨細(xì)胞和成骨分化用培養(yǎng)基的制備
[0078]將從Balb/c小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞克隆的間充質(zhì)干細(xì)胞（1χ104)等分至10%含F(xiàn)BS的 DMEM中，并在大氣（約37°C，5%C02)中培養(yǎng)3天，由此制備出在本實(shí)驗(yàn)中用作成骨細(xì)胞的間 充質(zhì)干細(xì)胞。成骨分化培養(yǎng)基(下文稱為〃〇DM〃）由DMEM構(gòu)成，其包含50yg/mL抗壞血酸、10- 8Μ 地塞米松和ΙΟπιΜβ-甘油磷酸鹽等。
[0079] 2.礦物化的測(cè)量
[0080] 間充質(zhì)干細(xì)胞至成骨細(xì)胞的分化引起鈣累積。此處，鈣累積的程度是指成骨細(xì)胞 的分化程度，并且鈣離子的累積程度可以通過觀察經(jīng)茜素紅染色而染成紅色的細(xì)胞的染色 程度而確認(rèn)。關(guān)于這一點(diǎn)，經(jīng)茜素紅染色測(cè)量礦物化。也就是，隨著至成骨細(xì)胞的分化得到 促進(jìn)，存在更多的區(qū)域能夠被茜素紅染色。因此，成骨分化的程度可以通過下述過程確認(rèn)： 向成骨分化培養(yǎng)基中添加茜素紅、使用SEQ ID NO: 1(BFP 5)的肽處理并觀察茜素紅染色的 程度。
[0081]更具體而言，將所制備的成骨細(xì)胞、即間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)移至成骨分化培養(yǎng)基，添加 濃度為〇 · 01yg/yL、0 · 1μg/μL、1μg/μL和10yg/yL的BFP 5，并溫育另外兩天。然后，將經(jīng)培養(yǎng) 的間充質(zhì)干細(xì)胞在冰上冷卻，用70%乙醇固定1小時(shí)，并用茜素紅-s溶液染色約10分鐘，并 通過鈣沉積的程度確認(rèn)礦物化。結(jié)果如圖3所示。
[0082]如測(cè)量經(jīng)由BFP 5(其是本發(fā)明的SEQ ID NO: 1肽）的成骨分化而累積的礦物化的 茜素紅染色所確認(rèn)的，由圖3的照片可以確認(rèn)，添加有Uig/yL BFP 5的細(xì)胞顯示出最強(qiáng)的染 色。另外，當(dāng)使用BFP 1確認(rèn)成骨分化時(shí)，染色與BFP 5相比相同或較弱。此外，雖然尚不知道 趨化因子SDF Ια的成骨分化能力，不過從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中確認(rèn)了較弱的染色，因此，據(jù)推測(cè)趨化 因子SDF Ια可以促進(jìn)成骨分化。因此，可以推斷出，作為來源于趨化因子的合成肽的BFP 5 的促進(jìn)成骨分化的能力與BFP 1相同或高于BFP 1 (其是來源于ΒΜΡ-7的合成肽）。
[0083] 實(shí)驗(yàn)例3
[0084]進(jìn)行測(cè)量由BFP 5(其是實(shí)施例中制備的SEQ ID NO: 1的肽）引起的堿性磷酸酶(其 是成骨細(xì)胞特異性基因）的表達(dá)水平的實(shí)驗(yàn)來使用試劑盒測(cè)量堿性磷酸酶的酶活性，且結(jié) 果示出于圖4中。成骨細(xì)胞特異性基因在分化至成骨細(xì)胞時(shí)表達(dá)，特別是，通過逆轉(zhuǎn)錄基因 擴(kuò)增(RT-PCR)測(cè)量作為成骨細(xì)胞特異性基因的堿性磷酸酶的表達(dá)水平，結(jié)果確認(rèn)，在lyg/μ L BFP 5下觀察到堿性磷酸酶的強(qiáng)表達(dá)。
[0085] 實(shí)驗(yàn)例4
[0086]為了確認(rèn)BFP 5(其是實(shí)施例中制備的SEQ ID NO: 1的肽)對(duì)成骨分化活性的效果， 使用抗體在熒光顯微鏡下分析了由BFP 5引起的成骨細(xì)胞特異性基因（如Runx2、堿性磷酸 酶、骨橋蛋白、1型膠原蛋白、DLX5和Osterix)的表達(dá)水平，并且所得照片分別在圖5中示出。 [0087]從圖5中可確認(rèn)，在成骨細(xì)胞中表達(dá)的Runx2、堿性磷酸酶、骨橋蛋白、1型膠原蛋 白、DLX5和Osterix的基因在用BFP 5處理的細(xì)胞中強(qiáng)表達(dá)。
[0088]成骨細(xì)胞特異性蛋白在分化至成骨細(xì)胞時(shí)表達(dá)。當(dāng)針對(duì)該蛋白的抗體與細(xì)胞反應(yīng) 時(shí)，利用熒光顯微鏡確認(rèn)結(jié)合程度。結(jié)果，可確認(rèn)，堿性磷酸酶(其是用作成骨作用標(biāo)記物并 在成骨分化中期產(chǎn)生的酶)在BFP 5時(shí)有強(qiáng)表達(dá)，并且Runx-2(其是在成骨細(xì)胞的成骨細(xì)胞 特異性蛋白的制造中起到重要作用的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子)在成骨分化中發(fā)揮重要作用。Runx-2 還顯示出在BFP 5時(shí)強(qiáng)表達(dá)。
[0089] 實(shí)驗(yàn)例5
[0090]為了確認(rèn)作為實(shí)施例中制備的SEQ ID NO: 1的肽的BFP 5對(duì)成骨分化活性的效果， 確認(rèn)了成骨細(xì)胞中表達(dá)的蛋白水平，并在圖6中示出結(jié)果。
[0091] 如圖6所示，可觀察到堿性磷酸酶和Osterix由BFP 5引起強(qiáng)表達(dá)。
[0092] 實(shí)驗(yàn)例6
[0093]為了確認(rèn)作為實(shí)施例中制備的SEQ ID NO: 1的肽的BFP 5對(duì)成骨分化活性的有效 濃度，使用不同濃度的BFP 5處理細(xì)胞，并在圖7中示出在成骨細(xì)胞中表達(dá)的堿性磷酸酶的 表達(dá)水平及結(jié)果。
[0094]由圖7可確認(rèn)，當(dāng)影響成骨分化活性的BFP 5以0.1yg/mL~lyg/mL的濃度處理時(shí)， 成骨細(xì)胞的表達(dá)為最高水平。
[0095] 實(shí)驗(yàn)例7
[0096] 為了確認(rèn)作為實(shí)施例中制備的SEQ ID NO: 1的肽的BFP 5對(duì)成骨分化活性的有效 濃度，使用不同濃度的BFP 5處理細(xì)胞，并在圖8中示出在成骨細(xì)胞中表達(dá)的Osterix的表達(dá) 水平及結(jié)果。
[0097]由圖8可確認(rèn)，當(dāng)影響成骨分化活性的BFP 5以0.1yg/mL的濃度處理時(shí)，成骨細(xì)胞 的表達(dá)為最高水平。
[0098] 實(shí)驗(yàn)例8
[0099]為了確認(rèn)作為實(shí)施例中制備的SEQ ID NO: 1的肽的BFP 5對(duì)血管化活性的效果，使 用BFP 5與VEGF、FGF、SDF-la和SDF-lg處理細(xì)胞，并觀察BFP 5對(duì)血管化的效果。結(jié)果示出在 圖9中。
[0100]圖9對(duì)與血管化相關(guān)的蛋白VEGF的表達(dá)進(jìn)行了確認(rèn)，由圖9可確認(rèn)，使用BFP5處理 的細(xì)胞顯示出VEGF的強(qiáng)表達(dá)。
[0101]由這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以確認(rèn)，由于作為本發(fā)明的SEQ ID N0:1的肽的BFP 5與BMP-7或BFP 1(之前已知它們可促進(jìn)成骨分化)相比對(duì)促進(jìn)成骨分化具有更重要的作用，因而毫 無疑問的是BFP 5可以在更寬的范圍誘發(fā)快速成骨作用，具有與BMP-7相同或比BMP-7更高 的成骨強(qiáng)度。另外，明顯的是，作為本發(fā)明的SEQ ID N0:1的肽的BFP 5在明顯低于BFP 1的 處理濃度下具有與BFP 1相同或比BFP 1更高的成骨促進(jìn)功能。
[0102] 結(jié)果，本發(fā)明的藥物組合物可以用作骨質(zhì)疏松和/或骨關(guān)節(jié)炎的有效治療劑。另 外，以相同的方式，當(dāng)本發(fā)明的藥物組合物填充或施用至骨質(zhì)流失疾病的骨質(zhì)流失區(qū)域時(shí)， 通過促進(jìn)成骨作用可以有效地進(jìn)行骨恢復(fù)。另外，通過包含表現(xiàn)出促進(jìn)血管化活性的肽作 為活性成分，本發(fā)明的藥物組合物可以用作用于緩解或治療包括缺血性壞死在內(nèi)的血管疾 病的有效治療劑。
[0103] 同時(shí)，盡管未提供【具體實(shí)施方式】，不過明顯的是，當(dāng)將作為本發(fā)明的SEQ ID NO: 1 的肽的BFP 5添加至用于成骨分化的培養(yǎng)組合物時(shí)，實(shí)驗(yàn)者可在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的同時(shí)控制實(shí)驗(yàn) 的速度，因而能夠容易地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
[0104] 已經(jīng)參照示例性實(shí)施方式說明了本發(fā)明。不過，本發(fā)明的范圍不應(yīng)限制于這些實(shí) 施方式，并且本領(lǐng)域普通技術(shù)人員使用所附權(quán)利要求中限定的本發(fā)明的基本構(gòu)思得出的各 種修改和改進(jìn)形式也囊括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0105]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種表現(xiàn)出分化因子活性的肽，其具有氨基酸序列SEQ ID NO: 1。2. 如權(quán)利要求1所述的肽，其中，所述肽具有促進(jìn)細(xì)胞分化的能力。3. 如權(quán)利要求2所述的肽，其中，所述細(xì)胞是成骨細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞。4. 如權(quán)利要求1所述的肽，其中，所述肽來源于SDF-ld蛋白。5. -種用于治療或緩解骨質(zhì)疏松的藥物組合物，其包含權(quán)利要求1~4中任一項(xiàng)所述的 肽作為活性成分。6. -種用于治療或緩解骨關(guān)節(jié)炎的藥物組合物，其包含權(quán)利要求1~4中任一項(xiàng)所述的 肽作為活性成分。7. -種用于治療或緩解骨質(zhì)流失疾病的藥物組合物，其包含權(quán)利要求1~4中任一項(xiàng)所 述的肽作為活性成分。8. -種用于成骨細(xì)胞分化的培養(yǎng)基組合物，其包含權(quán)利要求1~4中任一項(xiàng)所述的肽作 為活性成分。9. 一種用于治療或緩解血管疾病的藥物組合物，其包含權(quán)利要求1~4中任一項(xiàng)所述的 肽作為活性成分。10. 如權(quán)利要求9所述的藥物組合物，其中，所述血管疾病為缺血性壞死。
【文檔編號(hào)】A61P9/10GK106084029SQ201610248837
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年4月20日 公開號(hào)201610248837.7, CN 106084029 A, CN 106084029A, CN 201610248837, CN-A-106084029, CN106084029 A, CN106084029A, CN201610248837, CN201610248837.7
【發(fā)明人】尹擇林, 金亨根, 宣鐘根, 金枝賢, 姜周延
【申請(qǐng)人】全南大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團(tuán), 全南大學(xué)校病院