專利名稱：一種生物源人工小口徑血管及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)領(lǐng)域，涉及一種人工小口徑血管的交聯(lián)制備方法。
背景技術(shù)：
心血管病和外周血管病具有很高的發(fā)病率、致殘率和致死率[I]，2003年世界衛(wèi)生組織報(bào)告，全世界每年約有1670萬(wàn)人死于心血管病，占總死亡人數(shù)的1/3 [2]。初步統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每年大約有260萬(wàn)人死于心血管病，每12秒鐘，就有一人死于該病，每15秒鐘，就有一人因該病喪失工作能力。我國(guó)心血管病發(fā)病人數(shù)每年都在上升，所引起的死亡已經(jīng)占到疾病死亡人數(shù)的44%左右[3],這其中以小血管病變更為常見。治療嚴(yán)重小血管病變的常用辦法是，取自身大隱靜脈(saphenous vein)、乳房動(dòng)脈(internal artery)和放射狀動(dòng)脈(radial artery)移植,做搭橋(bypass)手術(shù),但約有10%的患者沒(méi)有健康可供移植的自身小血管。因此小血管病變的修復(fù)便需要人工小血管替代。而常用的人工合成材料滌綸 (Dacron)和聚四氟乙烯(ePTFE)制成的小血管，常因彈性差、不柔順、嚴(yán)重血栓、動(dòng)脈瘤和感染等造成修復(fù)失敗[4，5]。小于6mm直徑的小血管僅6個(gè)月后血栓率就超過(guò)40% [6]。所以人們將修復(fù)的希望寄托于新型生物材料的應(yīng)用和組織工程構(gòu)建。我國(guó)是人口大國(guó)，隨著老齡化的增長(zhǎng)，發(fā)病率將進(jìn)一步增高，小直徑人工血管的需求將是一個(gè)很大的市場(chǎng)。面對(duì)需求，有必要加大研究力度，逐步促成我國(guó)在這個(gè)市場(chǎng)中擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的產(chǎn)品。血管由內(nèi)到外分為三層結(jié)構(gòu)內(nèi)膜層(intima)，中膜(media)和外膜(adventitia)。內(nèi)膜是一層排列緊密的內(nèi)皮細(xì)胞層構(gòu)成，內(nèi)皮細(xì)胞層通過(guò)多糖性細(xì)胞間質(zhì)與很薄的內(nèi)膜下層黏結(jié)。內(nèi)膜下層是結(jié)締組織，由多條環(huán)狀彈性蛋白帶以及膠原蛋白相互交織而成。中膜由多層平滑肌細(xì)胞和結(jié)締組織細(xì)胞組成，細(xì)胞層間是環(huán)行排列的很厚的彈性蛋白纖維和多糖基質(zhì)。外膜由結(jié)締組織細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞組成。結(jié)締組織富含相互交織的膠原蛋白和彈性蛋白。血管所處的環(huán)境為內(nèi)膜與血液接觸，外膜與體液接觸。從病理生理學(xué)角度，血管內(nèi)皮損傷后，細(xì)胞外基質(zhì)或人工支架暴露于血液，引起血小板聚集，形成血栓。隨著時(shí)間的推移，血管平滑肌細(xì)胞遷移、增殖并分泌沉積大量胞外基質(zhì)，導(dǎo)致內(nèi)膜增生，使血管狹窄，進(jìn)一步促進(jìn)局部血栓，引起受血部位的器官如大腦、心肌和肢體末端出現(xiàn)缺血損傷癥狀。小血管修復(fù)后再狹窄，也主要是由于內(nèi)膜增生和血小板聚集二者共同作用引起[7]。理想的小口徑人工血管應(yīng)該具有以下性能[6，8，9] (1)生物相容性，包括不引起血栓，無(wú)免疫原性，抗感染；(2)具有連續(xù)、不活化的內(nèi)皮層，該內(nèi)皮層有應(yīng)激修復(fù)能力，但不會(huì)引起炎癥、鈣化、肥大性增生、纖維囊形成等，利于長(zhǎng)久抗血栓；(3)能夠在體內(nèi)局部環(huán)境的作用下進(jìn)行重塑(remodeling)，最終成為自體血管的一部分，并與自體血管沒(méi)有明顯區(qū)別；(4)具備適當(dāng)?shù)臋C(jī)械性能，包括生理環(huán)境下適當(dāng)?shù)目估鞆?qiáng)度，彈性摸量，可彎曲能力，耐血流長(zhǎng)期剪切作用，不形成動(dòng)脈瘤，尤其要能耐受極端血壓沖擊；(5)具備適當(dāng)?shù)臐B透能力，保證水分和溶解于水的物質(zhì)，甚至一些細(xì)胞可以透過(guò)；(6)具備生理活性，如血管收縮/舒張反應(yīng)，以維持正常血壓；(7)便于臨床處理和縫合。顯然，用于制備大血管的dacron和ePTFE材料不可能滿足上述要求。近年來(lái)，研究人員采用新型生物材料支架結(jié)合組織工程學(xué)的原理、方法、技術(shù)構(gòu)建組織工程小口徑人工血管(Tissue engineering blood vessel, TEBV),發(fā)展了多種構(gòu)建方法。這些方法主要分為4類(1)合成高分子支架；(2)細(xì)胞薄膜的“組織自組裝”方法；(3)水凝膠和生物聚合物支架；(4)脫細(xì)胞組織支架。這4類方法分別都取得了可喜進(jìn)展[5]。 生物可降解高分子材料，如聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸、聚羥基鏈烷酸酯(polyhydroxyalkanoate)、聚_4_輕基丁酸酯、聚己酸內(nèi)酯-共-聚乳酸和聚乙二醇等，作為組織工程支架材料，可以很快成型為各種形狀，可以保證所需的力學(xué)強(qiáng)度，可以在成型后種植細(xì)胞，植入體內(nèi)后材料可被降解吸收，其降解吸收速率可依據(jù)利 于體內(nèi)重塑的要求，調(diào)整化學(xué)組成而調(diào)控。但其彈性和柔順度難以與正常血管匹配，沒(méi)有在體外構(gòu)建成熟的組織工程血管,植入體內(nèi)后支架材料的降解速度難以與細(xì)胞新形成的胞外基質(zhì)(extracellularmatrix, ECM)速度相匹配,容易引起血栓等嚴(yán)重問(wèn)題。高分子材料支架復(fù)合以患者自身細(xì)胞，體外構(gòu)建成熟的血管，已有一些臨床應(yīng)用成功的病例[10]。不過(guò)，這些病例植入的都是替代低血壓(20 30mmHg)肺循環(huán)的血管,其構(gòu)建時(shí)間長(zhǎng),不能隨時(shí)取用。Niklason等在體外加脈沖壓力動(dòng)態(tài)培養(yǎng)構(gòu)建，力學(xué)強(qiáng)度有很大提高，但植入后仍有材料引起的炎癥反應(yīng)。這類方法值得借鑒之處在于，支架復(fù)合細(xì)胞后，利用力學(xué)刺激環(huán)境提高人工血管的力學(xué)性能，促進(jìn)其重塑與成熟。細(xì)胞薄膜的“組織自組裝”方法是，將血管平滑肌細(xì)胞(SMC)培養(yǎng)于培養(yǎng)皿，加抗壞血酸，促其分泌大量膠原蛋白形成薄膜，將形成的薄膜用多孔小管卷成血管結(jié)構(gòu)，再將內(nèi)表面培養(yǎng)一層內(nèi)皮細(xì)胞，再在外面包裹一層成纖維細(xì)胞薄膜，繼續(xù)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，最后形成血管典型的3層結(jié)構(gòu)。這樣構(gòu)建的血管其力學(xué)強(qiáng)度可支持相當(dāng)于大隱靜脈的血壓(1680mmHg)。但其管壁中缺少?gòu)椥缘鞍?，柔順度雖然較ePTFE好，但比正常小血管差很多，容易引起內(nèi)膜增生性再狹窄[5]。這類方法值得借鑒之處在于，充分利用細(xì)胞本身的合成作用，以及利用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)方法促進(jìn)血管結(jié)構(gòu)形成。生物聚合物或水凝膠支架由I型膠原蛋白和纖溶蛋白構(gòu)成，加上內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞即構(gòu)建成“生物人工動(dòng)脈血管”(bioartificial artery, BAA)。I型膠原蛋白是人體含量最高、最常見的蛋白，也是細(xì)胞主要的天然支架材料。纖溶蛋白能夠促進(jìn)組織修復(fù)。將二者復(fù)合，加上細(xì)胞并壓緊后，通過(guò)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)可大量擴(kuò)增細(xì)胞，促使纖溶蛋白形成圍繞血管壁排列結(jié)構(gòu)，并可誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞也圍繞血管壁緊密排列，形成更近似于正常血管中膜的結(jié)構(gòu)，提高了力學(xué)強(qiáng)度，同時(shí)也促進(jìn)細(xì)胞更容易實(shí)現(xiàn)對(duì)血管的重塑。遺憾的是，這樣的血管也沒(méi)有彈性蛋白形成，僅靠細(xì)胞規(guī)則排列還不能實(shí)現(xiàn)較高的力學(xué)強(qiáng)度，僅能承受很低的血壓(約300mmHg)。目前這種血管還在做各種交聯(lián)處理和添加彈性蛋白，以提高力學(xué)強(qiáng)度[5]。該類方法值得借鑒之處在于充分利用細(xì)胞的天然支架材料I型膠原蛋白和彈性蛋白以及重塑促進(jìn)因子纖溶蛋白。但上述方法也還存在問(wèn)題，無(wú)法實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用。綜合起來(lái)，目前各類TEBV構(gòu)建方法還存在以下幾大關(guān)鍵問(wèn)題需要解決[5] =(I)TEBV必須具有有充足細(xì)胞來(lái)源的內(nèi)皮細(xì)胞襯里，確保其沒(méi)有血栓誘導(dǎo)因子；(2)TEBV必須具有適當(dāng)?shù)臋C(jī)械性能，包括與自體血管相匹配的彈性和拉伸強(qiáng)度；(3)TEBV必須具有體內(nèi)重塑的能力；(4)不能隨時(shí)供應(yīng)臨床。而要同時(shí)解決這些問(wèn)題，現(xiàn)有方法還過(guò)于復(fù)雜，且周期較長(zhǎng)種子細(xì)胞來(lái)源有限需要培養(yǎng)擴(kuò)增，構(gòu)建后需要體外脈動(dòng)培養(yǎng)。
脫細(xì)胞組織完全由天然胞外基質(zhì)組成，基質(zhì)中含有膠原蛋白、彈性蛋白和纖溶蛋白等，在機(jī)械性能方面和生物相容性方面具有極大的優(yōu)勢(shì)，可以直接植入體內(nèi)，原位由宿主細(xì)胞再細(xì)胞化。脫細(xì)胞組織來(lái)源廣泛，可以是脫細(xì)胞血管，可以是小腸黏膜下層(smallintestinal submucosa, SIS)等。一般采用去垢劑、酶、酶抑制劑和緩沖液，以及核酸酶等去除細(xì)胞而得到。如果是脫細(xì)胞血管，則可基本保持人工血管所要求的結(jié)構(gòu)和組成。然而，脫細(xì)胞過(guò)程也會(huì)帶來(lái)一些負(fù)面影響，如降低了拉伸強(qiáng)度、柔順度和去除了糖蛋白引起的大幅度收縮等，此外異種組織還容易引起感染和血栓，也抑制再細(xì)胞化。SIS雖然能消除一些缺陷，但血栓問(wèn)題始終難以解決[5]。這些研究提示如果能夠完全脫細(xì)胞，提高脫細(xì)胞組織材料的拉伸強(qiáng)度，保持柔順度，保持適當(dāng)?shù)膹椥?，抑制鈣化，抑制血小板聚集以防血栓形成，那么所制成的血管將較為理想。采用交聯(lián)劑對(duì)脫細(xì)胞血管組織進(jìn)行處理是改善其力學(xué)和生物學(xué)性能的有效方法。常規(guī)動(dòng)物組織常用戊二醛交聯(lián)，但戊二醛具有一定的毒性，而且其交聯(lián)的組織長(zhǎng)期植入體內(nèi)會(huì)發(fā)生鈣化[12]。原花青素(procyanidins,PC)是由2-4個(gè)兒茶素((+) catechin)和/或表兒茶素((-) epycatechin)為單體聚合而成[11]的多種聚合物的混合體。PC最初是由地中海沿岸·的海岸松(Pinus maritina)樹皮中提取而來(lái)，現(xiàn)已可從葡萄、山楂、可可和蘋果等水果中大量提取，是干紅葡萄酒的重要成分，沒(méi)有任何毒性。PC與蛋白質(zhì)脯氨酸殘基有高親和力，可結(jié)合蛋白質(zhì)分子表面0H、C00-、NH等，并形成氫鍵交聯(lián)。近年來(lái)的研究[13，14]發(fā)現(xiàn)其可用來(lái)交聯(lián)蛋白質(zhì)制備生物材料，交聯(lián)的材料不僅具有優(yōu)良的力學(xué)性能和穩(wěn)定性，還能抑制鈣化。國(guó)內(nèi)也有用PC交聯(lián)脫細(xì)胞心臟瓣膜制備人工生物瓣膜的專利(CN200510110957. 2)，但心臟瓣膜的結(jié)構(gòu)較簡(jiǎn)單，僅有外層的內(nèi)皮細(xì)胞和內(nèi)部的間質(zhì)細(xì)胞，遠(yuǎn)不如血管壁結(jié)構(gòu)復(fù)雜。瓣膜細(xì)胞外基質(zhì)的離心面為膠原蛋白，近心面為彈性蛋白[Frederick J. Schoen,I Robert J. Levy. Tissue heart valves Current challenges and future researchperspectives. J Biomed Mater Res, 47,439-465,1999. ], 二者不相互交叉排列，也不同于血管中的膠原蛋白和彈性蛋白的排列方式。人工生物瓣膜要求高度柔順，而血管要求適當(dāng)機(jī)械性能，以使管腔不致塌陷。心臟瓣膜所處環(huán)境為上下兩面均與血液接觸，不同于血管僅內(nèi)膜與血液接觸，而外膜與體液接觸。人工生物瓣膜對(duì)體內(nèi)細(xì)胞能否黏附?jīng)]有要求，而人工血管內(nèi)膜細(xì)胞黏附實(shí)現(xiàn)再細(xì)胞化，將能進(jìn)一步保證人工血管的長(zhǎng)期抗血栓性能。本發(fā)明采用PC交聯(lián)脫細(xì)胞動(dòng)物如牛、豬等的小口徑血管材料，包括頸動(dòng)脈或隱靜脈脫細(xì)胞小口徑血管材料，制備性能要求不同于瓣膜的新型人工小口徑血管，用作臨床所需的小口徑血管替代品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的，在于提供一種抗張強(qiáng)度高，細(xì)胞相容性好、血液相容性優(yōu)良，抗血栓、抗鈣化和低免疫原性的人工生物小口徑血管。本發(fā)明旨在采用純天然的、日常食物中存在的、無(wú)毒的并具有一定生理保護(hù)功效的、全新交聯(lián)劑，交聯(lián)脫細(xì)胞哺乳動(dòng)物頸動(dòng)脈和隱靜脈血管材料，或其它來(lái)源材料(如來(lái)源于豬的小口徑血管)，制備人工生物小口徑血管，以滿足臨床上病人對(duì)小口徑血管移植物的需求。本發(fā)明通過(guò)上述全新交聯(lián)劑對(duì)哺乳動(dòng)物頸動(dòng)脈或隱靜脈脫細(xì)胞小口徑血管的交聯(lián)而實(shí)現(xiàn)。與常規(guī)戊二醛交聯(lián)結(jié)果相比，本發(fā)明制備的小口徑血管材料不僅能降低所交聯(lián)小口徑血管的毒性，而且可保持小口徑血管的天然形態(tài)、柔軟性，提高小口徑血管的力學(xué)強(qiáng)度和穩(wěn)定性，有良好的血管細(xì)胞相容性、血液相容性，低免疫原性，并有較強(qiáng)的抗血栓性能和抑制小口徑血管鈣化的潛能。與PC交聯(lián)脫細(xì)胞心臟瓣膜相比，由于血管壁中膠原蛋白和彈性蛋白交織排列，PC有更多機(jī)會(huì)將膠原蛋白和彈性蛋白分子同時(shí)交聯(lián)，穩(wěn)定或提高血管管腔結(jié)構(gòu)，不致塌陷。本發(fā)明提供一種人工小口徑血管的制備方法，所述方法包括D-Hanks使用原花青素作為交聯(lián)劑對(duì)脫細(xì)胞的哺乳動(dòng)物小口徑血管材料進(jìn)行交聯(lián)處理的步驟。在一具體實(shí)施例中，所述方法包括以下步驟(I)獲得哺乳動(dòng)物小口徑血管材料；(2)對(duì)所述小口徑血管材料進(jìn)行脫細(xì)胞處理，獲得仍保存血管形狀的天然胞外基 質(zhì)；和(3)使用原花青素交聯(lián)所述天然胞外基質(zhì)。在一具體實(shí)施例中，所述哺乳動(dòng)物小口徑血管材料來(lái)自新鮮的哺乳動(dòng)物頸動(dòng)脈和隱靜脈血管。在一具體實(shí)施例中，所述脫細(xì)胞處理包括(a)將清洗后的血管浸泡在D-Hanks溶液中；(b)用含有O. 20 O. 30%的胰蛋白酶的D-Hanks溶液灌流，然后浸泡在該D-Hanks溶液中，30 40°C下消化；(c)灌流4°C以下的D-Hanks溶液終止消化，清洗；(d)將步驟(C)所得血管浸入包含triton X-100、脫氧膽酸鈉和乙二胺四乙酸二鈉溶液的D-Hanks混合溶液中，持續(xù)溫和搖動(dòng)，以脫去血管表面和內(nèi)部的細(xì)胞；(e)將步驟(d)所得血管依次浸泡在用D-Hanks液配制的核糖核酸酶溶液和用D-Hanks液配制的脫氧核糖核酸酶溶液中，或者浸泡在含有核糖核酸酶和脫氧核糖核酸酶的混合溶液中，以除去小口徑血管內(nèi)部細(xì)胞殘余的細(xì)胞核成分；和(f)清洗步驟(e)所得血管，從而實(shí)現(xiàn)脫細(xì)胞處理。在一具體實(shí)施例中，所述脫細(xì)胞處理前還包括用I 6°C的D-Hanks溶液清洗清除了脂肪和雜質(zhì)的血管。在一具體實(shí)施例中，所述交聯(lián)通過(guò)以每厘米血管長(zhǎng)度I IOmL含O. I 10mg/mL原花青素的D-Hanks溶液浸泡脫細(xì)胞的哺乳動(dòng)物小口徑血管材料而實(shí)現(xiàn)。在一具體實(shí)施例中，所述原花青素的濃度為2. 5 5mg/mL，以每厘米血管長(zhǎng)度3 5mL的量使用該含花青素的D-Hanks溶液。在一具體實(shí)施例中，交聯(lián)條件為4 40°C下60 360rpm搖動(dòng)交聯(lián)I 96小時(shí)。在一具體實(shí)施例中，交聯(lián)條件為30 40°C，搖動(dòng)轉(zhuǎn)速為120 180rpm，交聯(lián)時(shí)間為24 72小時(shí)。在一具體實(shí)施例中，所述步驟(C)中的D-Hanks混合溶液為含有O. 3 O. 6%triton Χ-100、0· 3 O. 6%脫氧膽酸鈉和O. 01 O. 05%乙二胺四乙酸二鈉的D-Hanks溶液。在一具體實(shí)施例中，所述步驟(d)中的核糖核酸酶和脫氧核糖核酸酶的濃度分別為 10 30 μ g/mL 和 100 300 μ g/mL。
在一具體實(shí)施例中，所述方法還包括交聯(lián)后處理，所述后處理是將交聯(lián)后的完全脫細(xì)胞的小口徑血管浸入D-Hanks溶液中I 40天。本發(fā)明包括采用本發(fā)明方法制備得到的人工小口徑血管。在一具體實(shí)施例中，本發(fā)明的人工小口徑血管含有原花青素和哺乳動(dòng)物小口徑血管天然胞外基質(zhì)。在一具體實(shí)施例中，本發(fā)明的人工小口徑血管含有原花青素和哺乳動(dòng)物小口徑血管脫細(xì)胞處理后的產(chǎn)物。在一具體實(shí)施例中，本發(fā)明的人工小口徑血管含有經(jīng)原花青素交聯(lián)處理的哺乳動(dòng)物小口徑血管天然胞外基質(zhì)。在一具體實(shí)施例中，本發(fā)明在經(jīng)原花青素交聯(lián)處理后的人工小口徑血管中，每厘米長(zhǎng)含有約3 15mg原花青素。 在其它實(shí)施例中，本發(fā)明在經(jīng)原花青素交聯(lián)處理后的人工小口徑血管中，每厘米長(zhǎng)含有約3 8mg原花青素。。在一具體實(shí)施例中，所述哺乳動(dòng)物小口徑血管脫細(xì)胞處理后的產(chǎn)物為所述天然胞外基質(zhì)。在一具體實(shí)施例中，所述天然胞外基質(zhì)主要由膠原蛋白、彈性蛋白和纖溶蛋白等組成。在一具體實(shí)施例中，所述血管還包括內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞。在一具體實(shí)施例中，所述哺乳動(dòng)物選自牛、豬、羊、兔和狗。在一具體實(shí)施例中，所述哺乳動(dòng)物小口徑血管選自哺乳動(dòng)物的頸動(dòng)脈和隱靜脈血管。本發(fā)明提供一種組合物，所述組合物含有本發(fā)明的人工小口徑血管和用于保存該血管的溶液。


圖I顯示，小牛小口徑血管中的細(xì)胞成分經(jīng)脫細(xì)胞處理之后細(xì)胞已全部去除干凈，相對(duì)于正常致密的血管壁(圖1B)，脫細(xì)胞血管壁變地疏松而富有空隙(圖ID中的箭頭)，同時(shí)血管壁中也無(wú)正常壁中的細(xì)胞核物質(zhì)(圖IB中的箭頭)。圖2為本發(fā)明的小血管形態(tài)照片?？梢钥闯?，新鮮血管呈正常的圓柱狀，經(jīng)脫細(xì)胞處理后，顏色變白，變軟。經(jīng)戊二醛(GA)和本發(fā)明所使用的原花青素交聯(lián)后都稍變硬，而且隨著原花青素交聯(lián)濃度的增大，硬度有增大趨勢(shì)。血管呈不同的顏色變化戊二醛交聯(lián)后血管呈淡黃色，而PC交聯(lián)后血管呈棕紅色。原花青素在濃度為2. 5mg/mL和5mg/mL時(shí)交聯(lián)效果較好。圖3為本發(fā)明所交聯(lián)的脫細(xì)胞血管樣品力學(xué)性能的測(cè)試結(jié)果。圖3A顯示新鮮血管的最大抗拉強(qiáng)度為I. 84MPa，而經(jīng)脫細(xì)胞和交聯(lián)處理后最大抗拉強(qiáng)度顯著增大至2 5倍，而經(jīng)各個(gè)濃度原花青素交聯(lián)后的最大抗拉強(qiáng)度更大。圖3B顯示新鮮血管的彈性模量為
I.96MPa，而經(jīng)脫細(xì)胞和交聯(lián)處理后的彈性模量為顯著增大至IOMPa左右，而經(jīng)各個(gè)濃度原花青素交聯(lián)后的彈性模量更大。說(shuō)明本發(fā)明原花青素交聯(lián)處理的脫細(xì)胞小口徑血管具有較高的力學(xué)性能。
圖4A顯示，脫細(xì)胞未交聯(lián)組(對(duì)照)膠原酶降解快速，Ih降解80%多，24h降解近98% ;而本發(fā)明原花青素交聯(lián)組降解速度慢；經(jīng)膠原酶降解4h后，各個(gè)實(shí)驗(yàn)組血管降解幾乎達(dá)到最大值，與24h時(shí)間點(diǎn)的降解率并沒(méi)有明顯的差異。因此，選取4h時(shí)間點(diǎn)做更精確的降解檢測(cè)。圖4B顯示，經(jīng)膠原酶體外降解4h后，原花青素能有效的抗體外酶降解，與戍二醒的抗降解能力相當(dāng)。圖5A為本發(fā)明交聯(lián)制備的小血管中原花青素的交聯(lián)穩(wěn)定性。從中可以看出交聯(lián)血管浸泡于D-Hanks溶液中初期有小部分未交聯(lián)的原花青素釋放快速,前4天基本釋放完畢，30天之后檢測(cè)不到各個(gè)交聯(lián)濃度血管原花青素的釋放。由圖5B、5C可以看出隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，累積釋放量及釋放率均增大，前3d增大速度最快，之后平緩增長(zhǎng)，最后趨于平穩(wěn)狀態(tài)。從釋放率圖5C可以看出，30d后各個(gè)交聯(lián)濃度的釋放率(相當(dāng)于原始交聯(lián)溶液中的PC量)分別為24%、20%、25%、27%、27%，基本趨于穩(wěn)定一致。這些結(jié)果說(shuō)明原花青素能夠穩(wěn)定地存在于被交聯(lián)的血管中，同時(shí)也說(shuō)明原花青素能夠穩(wěn)定地交聯(lián)脫細(xì)胞血管材料。圖6為脫細(xì)胞血管樣品浸泡于SBF中IOd后，脫細(xì)胞未交聯(lián)組(control)及·6. 25mg/mL GA交聯(lián)組分別生長(zhǎng)了致密的一層羥基磷灰石，說(shuō)明在該位點(diǎn)發(fā)生了鈣化。而經(jīng)各個(gè)濃度原花青素交聯(lián)的脫細(xì)胞血管亦有零星的沉積位點(diǎn)，EDS顯示Ca/P均在I. 36
I.57之間，并且隨著交聯(lián)濃度的增大，沉積位點(diǎn)逐漸減少。該結(jié)果表明，原花青素交聯(lián)有明顯的抗鈣化作用，并且隨著濃度的增大，抗鈣化能力逐漸加強(qiáng)。原花青素在濃度大于5mg/mL時(shí)抗鈣化效果較理想。圖7為采用脫細(xì)胞血管支架表面種植細(xì)胞試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)交聯(lián)血管的生物相容性。圖7中可以看出，細(xì)胞接種2天后，脫細(xì)胞未交聯(lián)對(duì)照(control)組血管表面細(xì)胞生長(zhǎng)、伸展較好，形成連續(xù)的細(xì)胞單層，細(xì)胞形態(tài)呈鵝卵石狀。GA交聯(lián)血管支架表面并沒(méi)有細(xì)胞貼附生長(zhǎng)，可見一些細(xì)胞碎片，說(shuō)明GA具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性，而不同濃度原花青素交聯(lián)的血管支架表面細(xì)胞也生長(zhǎng)貼附良好，細(xì)胞形態(tài)良好，隨著交聯(lián)濃度的增大，形成的細(xì)胞單層不連續(xù)，而高濃度lOmg/mL交聯(lián)組血管表面貼附細(xì)胞略少。說(shuō)明原花青素交聯(lián)血管支架對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)沒(méi)有明顯的毒性。圖8顯示脫去細(xì)胞的小牛小口徑血管(隱靜脈)HE染色照片。圖9A為各種交聯(lián)樣品與抗凝血孵育60min后3000rpm離心5min后的照片?？梢钥闯?，陽(yáng)性對(duì)照全部溶血(溶血率100% )，脫細(xì)胞未交聯(lián)，GA交聯(lián)，2. 5mg/mL原花青素交聯(lián)組均沒(méi)有溶血現(xiàn)象。圖9B為根據(jù)測(cè)定的上清OD值，結(jié)果計(jì)算得出脫細(xì)胞未交聯(lián)血管(control組,η = 3)的溶血率為0. 49%，而GA和2. 5mg/mL原花青素交聯(lián)血管的溶血率均稍有下降，分別為0. 25%,0. 35%，溶血率都遠(yuǎn)低于ISO 10993-4 :2002規(guī)定的血液相容性標(biāo)準(zhǔn)最大溶血率5 %。因此，原花青素同戊二醛相當(dāng)，無(wú)溶血現(xiàn)象。圖10A為血管內(nèi)表面血小板粘附的掃描電鏡照片，可以看出，脫細(xì)胞未交聯(lián)組(control組)表面粘附較多血小板，呈顆粒狀，但并未完全覆蓋血管表面，仍可見血管纖維結(jié)構(gòu)；6. 25mg/mL戍二醒交聯(lián)組血管表面血小板粘附致密,完全覆蓋住血管表面；而2. 5mg/mL原花青素交聯(lián)的血管表面粘附少量血小板，血管纖維狀結(jié)構(gòu)清晰可見。圖10B顯示粘附前后血小板溶液血小板計(jì)數(shù)(η = 3)定量分析結(jié)果，表明脫細(xì)胞未交聯(lián)組血小板粘附率為9. 10%，戊二醛交聯(lián)組血小板粘附率顯著增大，為21. 55%，而原花青素交聯(lián)組血小板粘附率顯著下降，為2. 94%，與脫細(xì)胞未交聯(lián)組有顯著性差異，與戊二醛交聯(lián)組有極顯著性差異?？梢?，原花青素能明顯的抑制血小板粘附，從而抑制血栓形成。圖11為本發(fā)明的原花青素交聯(lián)制備的脫細(xì)胞小口徑血管的免疫原性測(cè)試結(jié)果。人單核細(xì)胞經(jīng)PMA誘導(dǎo)處理48h后可分化為巨噬細(xì)胞,經(jīng)D-Hanks洗去未貼壁巨噬細(xì)胞后，得到的細(xì)胞為巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞處理16h后通過(guò)掃描電鏡觀察細(xì)胞的貼壁狀況，巨噬細(xì)胞黏附越多則免疫原性越強(qiáng)。從圖IlA可以看出脫細(xì)胞未交聯(lián)血管(Control組)與2. 5mg/mL原花青素交聯(lián)血管表面都有巨噬細(xì)胞貼附，形態(tài)良好；而戊二醛交聯(lián)組細(xì)胞也有貼附，但細(xì)胞呈不規(guī)則形態(tài)，這進(jìn)一步說(shuō)明戊二醛具有細(xì)胞毒性。圖IlB的細(xì)胞個(gè)數(shù)統(tǒng)計(jì)可以看出，三組血管間無(wú)差異，對(duì)巨噬細(xì)胞的吸附效果基本一致，相對(duì)于Control組，原花青素交聯(lián)不會(huì)引起強(qiáng)免疫原性。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明包括制備人工小口徑血管的方法，該方法包括使用原花青素作為交聯(lián)劑對(duì)脫細(xì)胞的哺乳動(dòng)物小口徑血管材料進(jìn)行交聯(lián)處理的步驟。在一具體實(shí)施例中，本發(fā)明的制備方法主要包括脫細(xì)胞處理和交聯(lián)處理步驟。在一具體實(shí)施例中，本發(fā)明的制備方法包括(I)獲得哺乳動(dòng)物小口徑血管材料；(2)對(duì)所述小口徑血管材料進(jìn)行脫細(xì)胞處理，獲得仍保存血管形狀的天然胞外基質(zhì)；和(3)使用原花青素交聯(lián)所述天然胞外基質(zhì)。本文中，小口徑血管指哺乳動(dòng)物中內(nèi)徑小于等于6mm的血管。本發(fā)明主要采用哺乳動(dòng)物(優(yōu)選較大型哺乳動(dòng)物，例如豬、牛、兔、羊和狗等)的小口徑血管制備本發(fā)明的人工小口徑血管。優(yōu)選的，使用?；蜇i的主動(dòng)脈；更優(yōu)選地，使用牛或豬的頸動(dòng)脈和隱靜脈。例如，可取出生48小時(shí)左右、體重50±10公斤重、新宰殺的牛頸動(dòng)脈和隱靜脈血管?；蛘?，可取宰殺4小時(shí)以內(nèi)、體重90±30公斤重的豬頸動(dòng)脈和隱靜脈血管。剪取的哺乳動(dòng)物的小口徑血管材料，可放入I 6°C的平衡鹽緩沖液D-Hanks液中。用于本發(fā)明的D-Hanks溶液的配方如下
權(quán)利要求
1.一種人工小口徑血管，其特征在于，所述人工小口徑血管含有經(jīng)原花青素交聯(lián)處理的哺乳動(dòng)物小口徑血管天然胞外基質(zhì)。
2.如權(quán)利要求I所述的人工小口徑血管，其特征在于，所述血管還包括內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞。
3.如權(quán)利要求I 2中任一項(xiàng)所述的人工小口徑血管，其特征在于，所述哺乳動(dòng)物選自牛、豬、羊、兔和狗。
4.如權(quán)利要求I 3中任一項(xiàng)所述的人工小口徑血管，其特征在于，所述哺乳動(dòng)物小口徑血管選自哺乳動(dòng)物的頸動(dòng)脈和隱靜脈血管。
5.如權(quán)利要求I 4中任一項(xiàng)所述的人工小口徑血管，其特征在于，每厘米所述人工小口徑血管含有3 15mg原花青素。
6.如權(quán)利要求I 5中任一項(xiàng)所述的人工小口徑血管，其特征在于，所述人工小口徑血管的最大抗張強(qiáng)度在4 IlMPa的范圍之內(nèi)。
7.一種組合物，其特征在于，所述組合物含有權(quán)利要求I 6任一項(xiàng)所述的人工小口徑血管和用于保存該血管的溶液。
8.權(quán)利要求I所述的人工小口徑血管的制備方法，其特征在于，所述方法包括使用D-Hanks液溶解的原花青素作為交聯(lián)劑對(duì)脫細(xì)胞的哺乳動(dòng)物小口徑血管材料進(jìn)行交聯(lián)處理的步驟。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟 (1)獲得哺乳動(dòng)物小口徑血管材料； (2)對(duì)所述小口徑血管材料進(jìn)行脫細(xì)胞處理，獲得仍保存血管形狀的天然胞外基質(zhì)；和 (3)使用原花青素交聯(lián)所述天然胞外基質(zhì)。
10.如權(quán)利要求8 9中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述哺乳動(dòng)物小口徑血管材料來(lái)自新鮮的哺乳動(dòng)物頸動(dòng)脈和隱靜脈血管。
11.如權(quán)利要求8 10中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述脫細(xì)胞處理包括 (a)將清洗后的血管浸泡在D-Hanks溶液中； (b)用含有O.20 O. 30%的胰蛋白酶的D-Hanks溶液灌流，然后浸泡在該D-Hanks溶液中，30 40°C下消化； (c)灌流4°C以下的D-Hanks溶液終止消化，清洗； (d)將步驟(c)所得血管浸入包含tritonX-100、脫氧膽酸鈉和乙二胺四乙酸二鈉溶液的D-Hanks混合溶液中，持續(xù)溫和搖動(dòng)，以脫去血管表面和內(nèi)部的細(xì)胞； (e)將步驟(d)所得血管依次浸泡在用D-Hanks液配制的核糖核酸酶溶液和用D-Hanks液配制的脫氧核糖核酸酶溶液中，或者浸泡在含有核糖核酸酶和脫氧核糖核酸酶的混合溶液中，以除去小口徑血管內(nèi)部細(xì)胞殘余的細(xì)胞核成分；和 (f)清洗步驟(e)所得血管，從而實(shí)現(xiàn)脫細(xì)胞處理。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述脫細(xì)胞處理前還包括用I 6°C的D-Hanks溶液清洗清除了脂肪和雜質(zhì)的血管。
13.如權(quán)利要求8 12中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述交聯(lián)通過(guò)以每厘米血管長(zhǎng)度I IOmL含O. I 10mg/mL原花青素的D-Hanks溶液浸泡脫細(xì)胞的哺乳動(dòng)物小口徑血管材料而實(shí)現(xiàn)。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述原花青素的濃度為2.5 5mg/mL，以每厘米血管長(zhǎng)度3 5mL的量使用該含花青素的D-Hanks溶液。
15.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，交聯(lián)條件為4 40°C下60 360rpm搖動(dòng)交聯(lián)I 96小時(shí)。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，交聯(lián)條件為30 40°C，搖動(dòng)轉(zhuǎn)速為120 180rpm，交聯(lián)時(shí)間為24 72小時(shí)。
17.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述步驟(c)中的D-Hanks混合溶液為含有O. 3 O. 6% triton X-100,0. 3 (λ 6%脫氧膽酸鈉和O. 01 O. 05%乙二胺四乙酸二鈉的D-Hanks溶液。
18.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述步驟(d)中的核糖核酸酶和脫氧核糖核酸酶的濃度分別為10 30 μ g/mL和100 300 μ g/mL。
19.如權(quán)利要求8 18中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法還包括交聯(lián)后處理，所述后處理是將交聯(lián)后的完全脫細(xì)胞的小口徑血管浸入D-Hanks溶液中I 40天。
20.采用權(quán)利要求8 19中任一項(xiàng)所述方法制備得到的人工小口徑血管。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人工小口徑血管及其制備方法，包括采用原花青素對(duì)血管的天然胞外基質(zhì)進(jìn)行交聯(lián)的步驟。本發(fā)明的人工小口徑血管力學(xué)強(qiáng)度和穩(wěn)定性提高，無(wú)毒，抗體內(nèi)酶降解，抗鈣化，抗血小板黏附，免疫原性低，交聯(lián)劑和小口徑血管本身蛋白質(zhì)釋放極微。這些交聯(lián)特性使本發(fā)明的人工小口徑血管在植入體內(nèi)后，利于人體自身小口徑血管平滑肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的移入、增殖、覆蓋和長(zhǎng)期抗鈣化。
文檔編號(hào)A61L27/38GK102836464SQ201110165428
公開日2012年12月26日 申請(qǐng)日期2011年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月20日
發(fā)明者常江, 翟萬(wàn)銀, 侯永泰, 吳劍英 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海硅酸鹽研究所, 上海利康瑞生物工程有限公司