專利名稱：腫瘤凋亡誘導(dǎo)配體蛋白及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及在制備抗腫瘤藥物中應(yīng)用的腫瘤凋亡誘導(dǎo)配體基因和其表達(dá)的一種腫瘤凋亡誘導(dǎo)配體蛋白及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腫瘤是危害人類健康的重大疾病，已經(jīng)成為當(dāng)今危害人類健康和死亡率最高的疾病。至今還沒(méi)有有效的治療腫瘤的藥物。80年代發(fā)現(xiàn)的TNF，成為科研單位當(dāng)時(shí)研究的熱點(diǎn)，也為商家投資熱點(diǎn)。但是由于TNF副作用太大而無(wú)法臨床應(yīng)用。目前使用的干擾素、胸腺肽、白介素II等只是輔助治療腫瘤的藥物。Trail是TNF-related apoptosis-inducing ligand(腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體)的縮寫，也稱為Apo-2L。是Wiley 1995年首次克隆成功的一種新的抗腫瘤細(xì)胞因子，屬于腫瘤壞死因子(TNF)家族的一個(gè)成員。人TRAIL蛋白編碼281個(gè)氨基酸，它的基因位于染色體3q26。Trail與目前發(fā)現(xiàn)的TNF家族的其它主要成員，如TNF-α，TNF-β(也稱為淋巴毒素或LT-α)，淋巴毒素-β(LT-β)，41BBL，OX40L，CD27L，CD30L，CD40L和FasL(CD95L，也稱為Apo-1L)等配體均為II型膜蛋白，可水解形成可溶性同源三聚體，參與調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)的許多重要生物功能。Trail除了在免疫調(diào)節(jié)和炎性反應(yīng)方面起重要的作用外，還與TNF家族中的TNF-α、TNF-β、Fasl配體可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。Trail與這些配體的區(qū)別在于，除可特異性導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡外，不損傷正常細(xì)胞。這些細(xì)胞因子的跨膜受體含有死亡結(jié)構(gòu)閾，與配體結(jié)合導(dǎo)致引起凋亡的一系列蛋白酶反應(yīng)。
Trail因具有強(qiáng)大的導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞調(diào)亡，而使正常細(xì)胞逃逸它的殺傷作用，是一種理想的抗腫瘤和治療病毒感染的生物活性因子。這一特性預(yù)示著其在治療腫瘤患者和病毒感染中的廣泛應(yīng)用前景而受到關(guān)注。
因?yàn)門rail具有強(qiáng)大的導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞調(diào)亡，而使正常細(xì)胞逃逸它的殺傷作用，這一特性預(yù)示著其在治療腫瘤患者和病毒感染中的廣泛應(yīng)用前景而受到關(guān)注。世界上不少實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)開(kāi)始進(jìn)行Trail基因工程新藥的研究，但是目前均處于臨床前研究階段。我國(guó)上海第二軍醫(yī)大學(xué)也從事Trail的基因工程新藥研究。經(jīng)調(diào)查，這些實(shí)驗(yàn)室均是以Trail原形分子為開(kāi)發(fā)對(duì)象。但是TRAIL是受專利嚴(yán)格保護(hù)，難以模仿生產(chǎn)。據(jù)我們檢索數(shù)據(jù)看，目前在美國(guó)已經(jīng)申請(qǐng)TAIL的相關(guān)專利5項(xiàng)。
1.US 6284236“T Cytokine that induce apoptosis”2.US 6362801“T Nucleic acid encoding tumor necrosis factorreceptor”3.US 6214680“T Human tumor necrosis factor receptor”4.US 6072047“T Receptor that binds Trail”5.US 6363223“T DNA encoding a cytokine that induce apoptosis”上述專利文件4和5的發(fā)明人選定CVFF力場(chǎng)，利用DISCOVER-3程序包(如專利文件4所示)，對(duì)模建蛋白進(jìn)行分子力學(xué)優(yōu)化(如專利文件5所示)，在分子力學(xué)方法下經(jīng)過(guò)18000步、20000步、15000步(收斂判據(jù)0.5kcal/mol)，依次通過(guò)最陡下降、共軛梯度(Polak-Ribiere方法)、牛頓力學(xué)(Broyden、Fletcher、Goldfarb、Shanno[BFGS]方法)依次進(jìn)行能量?jī)?yōu)化；得到的構(gòu)型，經(jīng)過(guò)常溫分子動(dòng)力學(xué)動(dòng)態(tài)模擬，搜索其構(gòu)象空間，經(jīng)分子力學(xué)優(yōu)化得到常溫穩(wěn)定三維立體結(jié)構(gòu)。分子力學(xué)方法通過(guò)適當(dāng)力場(chǎng)下分子能量的計(jì)算與構(gòu)象調(diào)整，優(yōu)化初始分子結(jié)構(gòu)?？紤]到蛋白質(zhì)分子的柔性，必將使其存在各種旋轉(zhuǎn)位壘，分子力學(xué)方法下無(wú)法獲得蛋白質(zhì)分子整個(gè)構(gòu)象空間中的能量最低構(gòu)象。
最近發(fā)展的分子動(dòng)力學(xué)方法，克服了上述缺點(diǎn)，在經(jīng)典力場(chǎng)下搜索其構(gòu)象空間得到能量最小的優(yōu)勢(shì)構(gòu)象。分子動(dòng)力學(xué)模擬以成為研究蛋白質(zhì)、核酸結(jié)構(gòu)與功能的有力工具。對(duì)于蛋白質(zhì)與受體間相互作用的理解和研究是合理進(jìn)行蛋白質(zhì)工程研究的必不可少的步驟，通過(guò)蛋白質(zhì)分子間存在的相當(dāng)顯著的空間及電荷的互補(bǔ)性，利用分子對(duì)接(docking)方法研究蛋白質(zhì)與受體的作用機(jī)制、直觀考察蛋白質(zhì)與受體結(jié)合部位空間上的互補(bǔ)性、計(jì)算相互作用能量。要把TRAIL作為抗腫瘤和病毒感染藥物開(kāi)發(fā)研究，首先必須研究具有自己知識(shí)產(chǎn)權(quán)的、并且具有強(qiáng)大細(xì)胞毒作用的突變型TRAIL分子結(jié)構(gòu)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種腫瘤凋亡誘導(dǎo)配體蛋白及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案為腫瘤凋亡誘導(dǎo)配體蛋白Trail是TNF-related apoptosis-inducingligand(腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體)的縮寫，也稱為Apo-2L，腫瘤凋亡誘導(dǎo)配體蛋白是通過(guò)同源模建方法表達(dá)構(gòu)建的TRAIL-R三維結(jié)構(gòu)。是利用Biosym公司的InsightII的HOMOLOGY程序包，通過(guò)同源模建方法，選取的同源蛋白為已知的人TRAIL受體三維晶體結(jié)構(gòu)(PDB庫(kù)號(hào)1d0g，X射線晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，分辨率為0.24nm)，運(yùn)用BLAST、FASTA方法，通過(guò)序列比較確定保守區(qū)(SCR)及環(huán)區(qū)(Loop)，為TRAIL-R相應(yīng)的氨基酸序列賦坐標(biāo)，經(jīng)過(guò)初始結(jié)構(gòu)的調(diào)整，得到TRAIL-R的初始三維結(jié)構(gòu)。
提供的一種腫瘤凋亡誘導(dǎo)配體基因，由843個(gè)堿基組成，核苷酸序列如SEQ IDNO1所示。
提供另一種腫瘤凋亡誘導(dǎo)配體基因，由414個(gè)堿基組成，核苷酸序列如SEQ IDNO2所示。
提供上述基因表達(dá)的腫瘤凋亡誘導(dǎo)配體蛋白Trail在制備治療腫瘤細(xì)胞的藥物中的用途。
本發(fā)明的有益效果是TRAIL的突變、表達(dá)和基因工程開(kāi)發(fā)研究，將為我國(guó)腫瘤治療提供一種有效的治療藥物。由于其直接殺傷腫瘤的治療效果和極小的副作用，其巨大的臨床意義和經(jīng)濟(jì)效益將不可估量。我國(guó)人民因腫瘤死亡成為所有病因之首。按照腫瘤發(fā)病率為百分之零點(diǎn)六計(jì)算，我國(guó)患腫瘤人口就至少達(dá)800萬(wàn)人。如果能動(dòng)員其中十分之一的腫瘤患者使用Trail，每個(gè)病人每年用藥5個(gè)療程，每個(gè)療程用藥20只計(jì)算，每年至少會(huì)消耗Trail注射劑8000萬(wàn)只。如果每只按照200元收費(fèi)，其經(jīng)濟(jì)效益將不可估量


圖1為TRAIL與受體相互作用三維結(jié)構(gòu)
aTRAIL三維結(jié)構(gòu)；bTRAIL晶體結(jié)構(gòu)圖。
圖2為TRAIL突變體三維結(jié)構(gòu)c突變體I的三維結(jié)構(gòu)；d突變體II的三維結(jié)構(gòu)；e突變體III的三維結(jié)構(gòu)。
圖3為TRAIL突變體與其受體作用復(fù)合物三維結(jié)構(gòu)空間圖a突變體I與受體作用復(fù)合物三維結(jié)構(gòu)；b突變體II與受體作用復(fù)合物三維結(jié)構(gòu)。
圖4為工程菌構(gòu)建示意圖。
圖5為不同突變的TRAIL核苷酸序列分析。
圖6為IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)結(jié)果1-5道分別為誘導(dǎo)表達(dá)2-6hr；第六為中低分子量Marker；由大到小依次為97，66，43，31，20，14.4KD。
圖7為親和層析純化TRAIL融合表達(dá)蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)1.純化后TRAIL融合蛋白。2.TRAIL融合蛋白的表達(dá)。3.TRAIL蛋白。4.GST蛋白。5.中低分子量Marker。由大到小依次為97，66，43，31，20，14.4KD。
圖8為突變型Trail對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的殺滅作用。
A1BGC胃腺癌正常細(xì)胞形態(tài)；A2加入1μg/ml TRAIL后BGC細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞數(shù)量明顯減少；A3加入5μg/ml TRAIL后BGC細(xì)胞形態(tài)，大量細(xì)胞處于死亡狀態(tài)；B1正常B104神經(jīng)母細(xì)胞瘤形態(tài)；B2加入1μg/ml TRAIL后B104細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞突起減少，細(xì)胞死亡；B3加入5μg/ml TRAIL后B104細(xì)胞形態(tài)，死亡細(xì)胞數(shù)量增加；C1A172人膠質(zhì)瘤細(xì)胞正常形態(tài)；C2加入1μg/ml TRAIL后細(xì)胞死亡；C3加入5μg/ml TRAIL后狀態(tài)。
圖9為TRAIL對(duì)BGC胃腺癌細(xì)胞毒作用。
圖10為0.1μg/ml TRAIL對(duì)不同腫瘤細(xì)胞株的凋亡率。
圖11為不同劑量的突變型Trail對(duì)三種腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明提供一種腫瘤凋亡誘導(dǎo)配體蛋白及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
下面結(jié)合附圖具體說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案實(shí)驗(yàn)例1，構(gòu)建TRAIL-R三維結(jié)構(gòu)、利用Biosym公司的InsightII的HOMOLOGY程序包，通過(guò)同源模建方法構(gòu)建TRAIL-R三維結(jié)構(gòu)；選取的同源蛋白為已知的人TRAIL受體三維晶體結(jié)構(gòu)(PDB庫(kù)號(hào)1d0g，X射線晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，分辨率為0.24nm)，運(yùn)用BLAST、FASTA方法，通過(guò)序列比較確定保守區(qū)(SCR)及環(huán)區(qū)(Loop)，為TRAIL-R相應(yīng)的氨基酸序列賦坐標(biāo)，經(jīng)過(guò)初始結(jié)構(gòu)的調(diào)整，得到TRAIL-R的初始三維結(jié)構(gòu)(如圖1、圖3所示)。選定CVFF力場(chǎng)，利用DISCOVER-3程序包(如專利US 6072047)，對(duì)模建蛋白進(jìn)行分子力學(xué)優(yōu)化[5]，在分子力學(xué)方法下經(jīng)過(guò)18000步、20000步、15000步(收斂判據(jù)0.5kcal/mol)，依次通過(guò)最陡下降、共軛梯度(Polak-Ribiere方法)、牛頓力學(xué)(Broyden、Fletcher、Goldfarb、Shanno[BFGS]方法)依次進(jìn)行能量?jī)?yōu)化；得到的構(gòu)型經(jīng)過(guò)常溫分子動(dòng)力學(xué)動(dòng)態(tài)模擬，搜索其構(gòu)象空間，經(jīng)分子力學(xué)優(yōu)化得到常溫穩(wěn)定三維立體結(jié)構(gòu)(如圖3所示)。分子力學(xué)方法通過(guò)適當(dāng)力場(chǎng)下分子能量的計(jì)算與構(gòu)象調(diào)整，優(yōu)化初始分子結(jié)構(gòu)?？紤]到蛋白質(zhì)分子的柔性，必將使其存在各種旋轉(zhuǎn)位壘，分子力學(xué)方法下無(wú)法獲得蛋白質(zhì)分子整個(gè)構(gòu)象空間中的能量最低構(gòu)象，最近發(fā)展的分子動(dòng)力學(xué)方法，克服了上述缺點(diǎn)，在經(jīng)典力場(chǎng)下搜索其構(gòu)象空間得到能量最小的優(yōu)勢(shì)構(gòu)象。分子動(dòng)力學(xué)模擬以成為研究蛋白質(zhì)、核酸結(jié)構(gòu)與功能的有力工具。對(duì)于蛋白質(zhì)與受體間相互作用的理解和研究是合理進(jìn)行蛋白質(zhì)工程研究的必不可少的步驟，通過(guò)蛋白質(zhì)分子間存在的相當(dāng)顯著的空間及電荷的互補(bǔ)性，利用分子對(duì)接(docking)方法研究蛋白質(zhì)與受體的作用機(jī)制、直觀考察蛋白質(zhì)與受體結(jié)合部位空間上的互補(bǔ)性、計(jì)算相互作用能量。
下表表示TRAIL突變體和受體的作用能，單位(KJ/mol)。


實(shí)驗(yàn)例2.突變得到Trail寡核苷酸序列1.具有下列序列突變的的寡核苷酸所表達(dá)蛋白質(zhì)ATG GCT ATG ATG GAG GTC CAGGGTGGTCCGAGC CTG GGT CAG ACC TGC GTGCTG ATC GTG 60 ATC TTC ACA GTG CTC CTG CAG TCT CTC TGT GTG GCT GTA ACTTAG GTG TAC TTT ACC AAC 120 GAG CTG AAG CAG ATG CAG GAC AAG TAC TCC AAAAGT GGC ATT GCT TGT TTC TTA AAA GAA 180 GAT GAC AGT TAT TGG GACCCGAATGAC GAA GAG AGT ATG AAC AGCCCGTGC TGG CAA GTC 240 AAG TGG CAA CTC CGTCAG CTC GTTCGTAAG ATG ATT TTGCGTACC TCT GAG GAA ACC ATT 300 TCT ACAGTT CAA GAA AAG CAA CAA AAT ATT TCTCCGCTGGTGCGTGAACGTGTT CCT CAG360CGTGTA GCA GCT CACATCACTGGTACCCGTGGACGTAGC AAC ACA TTG TCTTCT CCA AAC 420 TCC AAG AAT GAA AAG GCT CTG GGC CGC AAAATCAAC TCC TGGGAA TCA TCAAGAAGTGGT480 CAT TCA TTC CTG AGC AAC TTG CAC TTGAGAAATGGT GAA CTG GTC ATC CAT GAA AAAGGT540 TTT TAC TAC ATC TAT TCC CAA ACATAC TTTCGTTTT CAG GAG GAAATCAAA GAA AAC ACA 600 AAG AAC GAC AAA CAAATG GTC CAA TAT ATT TAC AAA TAC ACA ATG TAT CCT GAC CCTATC660 TTG TTGATG AAA AGT GCTCGTAAT AGT TGT TGG TCT AAA GAT GCA GAA TATGGTCTC TAT720 TCC ATC TAT CAAGGTGGTATC TTT GAG CTT AAG GAA AAT GAC CGT ATT TTTGTT TCT GTA 780 ACA AAT GAG CAC TTGATCGAC ATG GAC CAT GAA GCC AGT TTTTTCGGTGCC TTT TTA GTT 840 GGC2.具有下列序列突變的寡核苷酸所表達(dá)蛋白質(zhì)CCA AAC 420 TCC AAG AAT GAA AAG GCT CTG GGC CGC AAAATCAAC TCC TGGGAA TCA TCAAGAAGTGGT480 CAT TCA TTC CTG AGC AAC TTG CAC TTGAGAAATGGT GAA CTG GTC ATC CAT GAA AAAGGT540 TTT TAC TAC ATC TAT TCC CAA ACATAC TTTCGTTTT CAG GAG GAAATCAAA GAA AAC ACA 600 AAG AAC GAC AAA CAAATG GTC CAA TAT ATT TAC AAA TAC ACA ATG TAT CCT GAC CCTATC660 TTG TTGATG AAA AGT GCTCGTAAT AGT TGT TGG TCT AAA GAT GCA GAA TATGGTCTC TAT720 TCC ATC TAT CAAGGTGGTATC TTT GAG CTT AAG GAA AAT GAC CGT ATT TTTGTT TCT GTA 780 ACA AAT GAG CAC TTGATCGAC ATG GAC CAT GAA GCC AGT TTTTTCGGT實(shí)驗(yàn)例3、人TRAIL寡核苷酸合成及表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)上述Trail突變結(jié)果，先分段合成TRAIL寡核苷酸片段，再進(jìn)行全長(zhǎng)拼接，測(cè)序。合成的寡核苷酸亞克隆至pGEX-2T質(zhì)粒構(gòu)成pGEX-2T-TRAIL，然后轉(zhuǎn)化受體菌E.coli DH-5α，篩選穩(wěn)定高效表達(dá)TRAIL的工程菌。繼而構(gòu)建了PBV220工程質(zhì)粒(如圖4)。
實(shí)驗(yàn)例4序列分析檢查插入突變基因正確性檢驗(yàn)(如圖5)實(shí)施例5突變寡核苷酸在大腸桿菌中的高效表達(dá)，表達(dá)蛋白占菌體總蛋白的35％(如圖6)。
實(shí)施例6突變寡核苷酸表達(dá)蛋白質(zhì)的純化檢測(cè)電泳后檢測(cè)結(jié)果，Trail蛋白的純度達(dá)到98％(見(jiàn)圖7)。
實(shí)施例7突變型Trail蛋白對(duì)多種腫瘤殺滅作用。分別用不同劑量的突變型Trail與多種惡性腫瘤細(xì)胞共同培養(yǎng)，可使腫瘤細(xì)胞大量出現(xiàn)調(diào)亡(見(jiàn)圖8)。
實(shí)驗(yàn)例8測(cè)定TRAIL對(duì)BGC胃腺癌細(xì)胞的細(xì)胞調(diào)亡率的影響(圖9)；2.TRAIL對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的凋亡作用(圖10)。得出結(jié)論TRAIL可明顯導(dǎo)致BGC胃腺癌等腫瘤細(xì)胞株的凋亡，凋亡率從47.8-82.3％。TRAIL同樣也可明顯地導(dǎo)致人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡，而對(duì)大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞株凋亡卻不明顯，可能與鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞與人膠質(zhì)瘤細(xì)胞表面的TRAIL受體存在著差異有關(guān)，影響了人TRAIL分子與其結(jié)合。
實(shí)驗(yàn)例9突變后的Trail蛋白殺傷腫瘤細(xì)胞有明顯的計(jì)量依賴。當(dāng)Trail濃度達(dá)到0.5μg/ml時(shí)，即有明確的殺滅腫瘤效應(yīng)；劑量達(dá)到0.5-1μg/ml之間時(shí)，對(duì)腫瘤細(xì)胞殺滅作用明顯增加。濃度繼續(xù)增加，對(duì)腫瘤殺滅作用繼續(xù)增強(qiáng)，但是殺滅效率增加幅度明顯變緩(見(jiàn)圖11)。
權(quán)利要求
1.一種腫瘤凋亡誘導(dǎo)配體蛋白，其特征在于，所述腫瘤凋亡誘導(dǎo)配體蛋白由843個(gè)堿基組成，核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
2.一種腫瘤凋亡誘導(dǎo)配體蛋白，其特征在于，由414個(gè)堿基組成，核苷酸序列如SEQ ID NO2所示。
3.權(quán)利要求1所述的腫瘤凋亡誘導(dǎo)配體蛋白，其特征在于，表達(dá)的腫瘤凋亡誘導(dǎo)配體蛋白Trail。
4.權(quán)利要求2所述的腫瘤凋亡誘導(dǎo)配體蛋白，其特征在于，表達(dá)的腫瘤凋亡誘導(dǎo)配體蛋白Trail。
5.權(quán)利要求3或4所述的腫瘤凋亡誘導(dǎo)配體蛋白，其特征在于，Trail在制備治療腫瘤細(xì)胞的藥物中的用途。
6.腫瘤凋亡誘導(dǎo)配體蛋白在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于，突變型Trail蛋白對(duì)多種腫瘤殺滅作用，分別用不同劑量的突變型Trail與多種惡性腫瘤細(xì)胞共同培養(yǎng)，可使腫瘤細(xì)胞大量出現(xiàn)調(diào)亡。
7.權(quán)利要求6所述腫瘤凋亡誘導(dǎo)配體蛋白在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于，突變后的Trail蛋白殺傷腫瘤細(xì)胞有明顯的計(jì)量依賴；當(dāng)Trail濃度達(dá)到0.5μg/ml時(shí)，即有明確的殺滅腫瘤效應(yīng)；劑量達(dá)到0.5-1μg/ml之間時(shí)，對(duì)腫瘤細(xì)胞殺滅作用明顯增加，濃度繼續(xù)增加，對(duì)腫瘤殺滅作用繼續(xù)增強(qiáng)，但是殺滅效率增加幅度明顯變緩。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域的一種腫瘤凋亡誘導(dǎo)配體蛋白及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明公開(kāi)兩個(gè)腫瘤凋亡誘導(dǎo)配體基因寡核苷酸序列，核苷酸序列分別如SEQ ID No1、SEQ ID No2所示。本發(fā)明還公開(kāi)了上述基因表達(dá)的腫瘤凋亡誘導(dǎo)配體蛋白Trail及其在制備治療腫瘤細(xì)胞的藥物中的用途。這一結(jié)果對(duì)于開(kāi)發(fā)有效的治療腫瘤的藥物具有重要意義。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1932017SQ20061011348
公開(kāi)日2007年3月21日 申請(qǐng)日期2006年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月29日
發(fā)明者劉少君, 關(guān)良, 馮建男, 時(shí)小燕, 鄭黎燕, 劉農(nóng)樂(lè), 鄒民吉, 闕海平, 王國(guó)華 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所