專利名稱：芫花根總黃酮及其提取方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及化合物及其提取方法與應(yīng)用，特別是涉及芫花根總黃酮及其提取方法與其在制備預(yù)防和/或治療性抗腫瘤、提高機(jī)體免疫力及抗衰老藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腫瘤是一種常見、多發(fā)病，其中惡性腫瘤是目前嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界每年死于惡性腫瘤的人數(shù)達(dá)到690萬。20世紀(jì)70年代以來，我國(guó)的腫瘤發(fā)病率一直呈上升趨勢(shì)，目前我國(guó)每年腫瘤的發(fā)病人數(shù)約為200萬，死于腫瘤的人數(shù)超過140萬。
腫瘤是機(jī)體在各種致癌因素作用下，局部組織細(xì)胞過度增生和異常分化而形成的新生物，具有失去控制性生長(zhǎng)、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)。在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中，腫瘤的治療方法主要有三種化學(xué)療法、放射線療法及手術(shù)，其中化學(xué)療法被認(rèn)為是最好的治療方法，但是大多化學(xué)藥物對(duì)機(jī)體的正常細(xì)胞也會(huì)產(chǎn)生破壞作用。而來源于植物的抗腫瘤藥物與化學(xué)合成藥物相比有著不可替代的優(yōu)越性，如毒副作用小、制藥過程的污染較少等。因此，從藥用植物中尋找預(yù)防和治療性惡性腫瘤藥物始終是藥物化學(xué)家的研究目標(biāo)。傳統(tǒng)中藥中存在許多抗癌有效成分，我國(guó)利用中草藥治療腫瘤歷史悠久，一些古籍(如《黃帝內(nèi)經(jīng)》等)中已有一些腫瘤的癥狀及防治方法的記載。而且，中藥的抗腫瘤活性已得到國(guó)際認(rèn)可。我國(guó)藥用植物資源豐富，據(jù)統(tǒng)計(jì)，當(dāng)前已對(duì)藥用植物中的28個(gè)科(屬)，3000種以上的中草藥進(jìn)行了抗癌篩選，其中含有抗癌活性成分的中草藥約為200種(呂秀娟；王琴；呂圭源抗腫瘤中藥的研究進(jìn)展。中國(guó)現(xiàn)代中藥2006，8(5)34-35)。
芫花為瑞香科植物，廣泛分布于我國(guó)長(zhǎng)江流域各省和黃河流域的部分地區(qū)。芫花作為民間傳統(tǒng)用藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，至今已有2000余年的藥用歷史。芫花根具有消炎、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜等多種藥理作用。芫花根在民間曾被用來治療多種癌腫，療效顯著?，F(xiàn)代藥理研究表明芫花根具有抗腫瘤、治療腹水的作用?；瘜W(xué)成分研究表明芫花根主要含有黃酮、香豆素和二萜原酸酯類化合物，其中黃酮類化合物除了芫花素、芫花苷等少數(shù)單黃酮外，主要為毛瑞香素系列的雙黃酮，種類多且含量高，為芫花根次生物質(zhì)的主要成分(Zheng W，Shi F.Three Biflavonoids from Ethanol Extractof the Roots of Daphne Genkwa.Acta Pharmaceutica Sinica 2005.40438-442.)。黃酮類化合物是中藥中一類主要的有效成分，具有多方面的藥理活性。該類化合物對(duì)心血管疾病、癌癥、免疫系統(tǒng)疾病等均具有顯著的藥理作用，并且毒性較低(曹緯國(guó)等，黃酮類化合物藥理作用的研究進(jìn)展。西北植物學(xué)報(bào)，2003，23，(12)2241-2247)。大量研究結(jié)果也證實(shí)了黃酮類化合物能誘生和增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能、保護(hù)正常細(xì)胞、抑制腫瘤細(xì)胞、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡以及調(diào)節(jié)細(xì)胞因子等(曹緯國(guó)等，黃酮類化合物藥理作用的研究進(jìn)展。西北植物學(xué)報(bào)，2003，23，(12)2241-2247)。黃酮類化合物在天然抗腫瘤藥物的研究中顯得日益重要，具有較廣闊的開發(fā)和利用前景，因此，迫切需要一種簡(jiǎn)單易行且經(jīng)濟(jì)適用的芫花根總黃酮的提取方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是一種芫花根總黃酮及其簡(jiǎn)單易行且經(jīng)濟(jì)適用的提取方法。
本發(fā)明所提供的芫花根總黃酮的提取方法，包括以下步驟1)將芫花根粉碎；2)將芫花根與體積百分含量為80-100％乙醇按體積比為1∶3-5混合，在40-70℃下浸提12-48小時(shí)；3)去除提取液中的沉淀物；4)將提取液過大孔吸附樹脂，然后用水洗滌樹脂，以除去水溶性雜質(zhì)，再用體積百分含量為80-100％乙醇對(duì)樹脂進(jìn)行洗脫，得到黃色的洗脫液；5)將洗脫液減壓蒸餾后過200-300目硅膠柱，再用體積比為1∶1的氯仿∶甲醇混合液洗脫，對(duì)洗脫物進(jìn)行濃縮，得到芫花根總黃酮。
在上述提取方法中，步驟2)中芫花根與乙醇混合的體積比優(yōu)選為1∶4，浸提溫度優(yōu)選為60℃，浸提時(shí)間優(yōu)選為24小時(shí)。
步驟3)中可用離心或過濾的方法去除提取液中的沉淀物。
步驟4)中所用的大孔吸附樹脂的型號(hào)優(yōu)選為ADS-17，用于洗滌樹脂的水優(yōu)選為去離子水。
為獲得更好的提取效果，可將步驟4)重復(fù)1-3次，合并洗脫液。
步驟5)中的減壓蒸餾可在50-60℃下進(jìn)行。
此外，用上述方法獲得的芫花根總黃酮也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
同時(shí)，可以用上述方法獲得的芫花根總黃酮為活性成分制備成腫瘤的預(yù)防和/或治療性藥物，提高機(jī)體免疫力藥物及抗衰老藥物。
需要的時(shí)候，在本發(fā)明所述應(yīng)用中還可以加入一種或多種藥學(xué)上可接受的輔料，所述輔料包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤(rùn)劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、潤(rùn)滑劑、穩(wěn)定劑等，必要時(shí)還可加入香味劑、甜味劑及色素等。
本發(fā)明所述應(yīng)用除制成膠囊劑外，還可以制成片劑、粒劑、粉劑、口服劑、注射液等多種藥物形式。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。
上述藥物的成人口服用量一般為50-100mg/kg/d，可以一次或多次使用，療程為10至20天。
本發(fā)明提供了一種有效的芫花根總黃酮的提取方法。該提取方法具有以下優(yōu)點(diǎn)1、操作簡(jiǎn)單，易于進(jìn)行工業(yè)化應(yīng)用；2、提取成本低廉；3、所用提取溶劑的毒性較小，提取周期短；4、提取液中芫花根總黃酮含量高，含量可達(dá)9.7％。同時(shí)，可以用本發(fā)明方法獲得的芫花根總黃酮為活性成分制備成預(yù)防和/或治療性抗腫瘤，增強(qiáng)機(jī)體免疫力和抗衰老藥物。實(shí)驗(yàn)證明，用本發(fā)明方法獲得的芫花根總黃酮具有抗腫瘤、抗轉(zhuǎn)移、抗氧化和增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等藥理活性，給小鼠連續(xù)灌胃不會(huì)引起肝臟、腎臟和脾臟等臟器的生化指標(biāo)的明顯變化，對(duì)正常細(xì)胞的毒副作用較弱，此外，對(duì)因長(zhǎng)期用藥可能導(dǎo)致的免疫抑制而誘發(fā)的細(xì)菌、真菌感染也有抵抗作用。本發(fā)明為芫花根總黃酮的大規(guī)模生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)，并將在芫花根總黃酮的有效利用中發(fā)揮巨大作用，在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用前景廣闊。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。


圖1為用本發(fā)明方法提取的芫花根總黃酮的HPLC指紋圖譜圖2為不同組小鼠的瘤體積變化情況圖3為用本發(fā)明方法提取的芫花根總黃酮對(duì)S180荷瘤小鼠NK細(xì)胞活性影響的檢測(cè)結(jié)果具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。
實(shí)施例1、芫花根總黃酮的提取及其HPLC檢測(cè)一、提取芫花根總黃酮選擇符合2005年版《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)的芫花根藥材，用下述方法從中提取芫花根總黃酮，包括以下步驟1)將芫花根粉碎；2)將芫花根與無水乙醇按體積比為1∶4混合，在60℃下浸提24小時(shí)；3)離心去除提取液中的沉淀物；4)將提取液過大孔吸附樹脂ADS-17(購自天津大學(xué)樹脂研究所)，然后用去離子水洗滌樹脂，以除去水溶性雜質(zhì)，再用無水乙醇對(duì)樹脂進(jìn)行洗脫，得到黃色的洗脫液；
5)將洗脫液在60℃下減壓蒸餾后過200目硅膠柱，再用體積比為1∶1的氯仿∶甲醇混合液洗脫，最后對(duì)洗脫物進(jìn)行濃縮，得到芫花根總黃酮。
二、HPLC檢測(cè)對(duì)步驟一提取的芫花根總黃酮用HPLC色譜儀(Waters 600E)進(jìn)行鑒定，具體方法為取芫花根總黃酮1mg，溶解于4mL甲醇溶液作為樣品液。取樣品液6μl進(jìn)樣。以甲醇/水(pH 5.0)(V/V)作為流動(dòng)相，按下列梯度進(jìn)行洗脫0-10min 25/75；11-20min 33/67；21-58min 41/59；59-79min 55/45；80-100min 85/15。檢測(cè)波長(zhǎng)275nm。色譜柱Inertsil，4.6×250mm；柱溫30℃。按上述色譜條件對(duì)各已知各種黃酮類化合物進(jìn)行色譜分析確定其保留時(shí)間，并根據(jù)各種黃酮類化合物的保留時(shí)間對(duì)芫花根總黃酮HPLC指紋圖譜中各峰所代表的化合物進(jìn)行歸屬。
步驟一提取的芫花根總黃酮的HPLC指紋圖譜如圖1所示(圖A芫花根總黃酮檢測(cè)樣品；圖B標(biāo)準(zhǔn)化合物1.芫花苷，2.芫花醇A，3.毛瑞香素H-3-甲醚，4.毛瑞香素H-3”-甲醚，5.毛瑞香素G 3”-甲醚，6.毛瑞香素H，7.毛瑞香素G，8.毛瑞香素B，9.芫花素)，共出現(xiàn)12個(gè)色譜峰(編號(hào)1-12)，其中2、6、7、8為主要峰。根據(jù)已知的各種黃酮類化合物色譜峰的保留時(shí)間，確定圖A中的峰1為芫根苷，峰2為芫花醇A，峰3為毛瑞香素H-3-甲醚，峰4為毛瑞香素H-3”-甲醚，峰5為毛瑞香素G-3”-甲醚，峰6為毛瑞香素H，峰7為毛瑞香素G，峰8為毛瑞香素B，峰9為芫花素，芫花根總黃酮中各化合物的相對(duì)保留時(shí)間見表1，證明用本發(fā)明的方法得到了芫花根總黃酮，含量達(dá)9.7％；其中峰8具有最大的峰面積，其次為峰7、6、2、1、9，表明毛瑞香素B為所提取的芫花根總黃酮的主要成分。
表1 芫花根總黃酮中各化合物的相對(duì)保留時(shí)間


實(shí)施例2、芫花根總黃酮的提取及其HPLC檢測(cè)一、提取芫花根總黃酮選擇符合2005年版《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)的芫花根藥材，用下述方法從中提取芫花根總黃酮，包括以下步驟1)將芫花根粉碎；2)將芫花根與80％乙醇(V/V)按體積比為1∶5混合，在70℃下浸提36小時(shí)；3)離心去除提取液中的沉淀物；4)將提取液過大孔吸附樹脂ADS-17(購自天津大學(xué)樹脂研究所)，然后用去離子水洗滌樹脂，以除去水溶性雜質(zhì)，再用80％乙醇(V/V)對(duì)樹脂進(jìn)行洗脫，得到黃色的洗脫液；5)將洗脫液在50℃下減壓蒸餾后過300目硅膠柱，再用體積比為1∶1的氯仿∶甲醇混合液洗脫，最后對(duì)洗脫物進(jìn)行濃縮，得到芫花根總黃酮。
用與實(shí)施例1相同的方法對(duì)所提取的芫花根總黃酮進(jìn)行HPLC鑒定，鑒定結(jié)果表明用本發(fā)明的方法得到了芫花根總黃酮，含量達(dá)9.7％，其中毛瑞香素B為所提取的芫花根總黃酮的主要成分。
實(shí)施例2、芫花根總黃酮的細(xì)胞毒活性實(shí)驗(yàn)定量稱取實(shí)施例1提取的芫花根總黃酮，用二甲基亞砜(DMSO)溶解后，再用DMEMF/12培養(yǎng)基(HYCLONE，USA)稀釋成5個(gè)濃度梯度(1、0.5、0.25、0.125、0.0625mg·mL-1)，加入預(yù)先培養(yǎng)48h的人宮頸癌Hela細(xì)胞、Walk-250細(xì)胞、人乳腺癌MCF-7細(xì)胞、HA-116細(xì)胞(均購自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院)、小鼠肉瘤S180細(xì)胞(購自購自中山醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所)和胎鼠成纖維細(xì)胞的96孔板中，每個(gè)濃度梯度重復(fù)5次，然后將上述細(xì)胞繼續(xù)在37℃、含5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后，用MTT法測(cè)定芫花根總黃酮對(duì)腫瘤細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的毒性。
生長(zhǎng)抑制率統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表2所示，表明芫花根總黃酮對(duì)實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤細(xì)胞株和胎鼠成纖維細(xì)胞表現(xiàn)出不同的細(xì)胞毒活性。在設(shè)定的5個(gè)劑量中，芫花根總黃酮對(duì)Hela細(xì)胞、S180細(xì)胞顯示出顯著的細(xì)胞毒活性，在濃度為0.125mg·mL-1時(shí)，對(duì)這兩種腫瘤細(xì)胞株的抑制率分別達(dá)到66.35％和45.39％。芫花根總黃酮對(duì)HA-116、MCF-7和Walk-250細(xì)胞株也表現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性，在濃度為0.25mg·mL-1時(shí)，對(duì)這三種腫瘤細(xì)胞株的抑制率分別為37.32％、42.27％和38.96％。與之對(duì)比，芫花根總黃酮對(duì)胎鼠成纖維細(xì)胞則表現(xiàn)出較低的細(xì)胞毒活性，在同等劑量下，芫花根總黃酮對(duì)胎鼠成纖維細(xì)胞的抑制率僅為腫瘤細(xì)胞的1/2-1/10。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明用本發(fā)明方法提取的芫花根總黃酮對(duì)腫瘤細(xì)胞具有顯著的抑制作用，而對(duì)正常細(xì)胞的毒性作用較小。
表2 對(duì)腫瘤細(xì)胞與胎鼠成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率(n＝10，x±s)

注與實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞相比較，aP＜0.01，bP＜0.001實(shí)施例3、檢測(cè)芫花根總黃酮對(duì)小鼠荷瘤S180細(xì)胞的抑制作用檢測(cè)實(shí)施例1提取的芫花根總黃酮對(duì)小鼠荷瘤S180細(xì)胞的抑制作用，實(shí)驗(yàn)方法為取小鼠120只，分為12組，每組10只，雌雄各半，其中11組小鼠按每鼠5×107細(xì)胞數(shù)將S180細(xì)胞接種于小鼠后肢腋下部位作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。給藥組(LLC+TFRD)將芫花根總黃酮用蒸餾水勻漿成濃度確定的懸浮液，按25、50和75mg·kg-1三個(gè)劑量對(duì)9組模型小鼠灌胃(ig)給藥，其中3組在腫瘤接種前7天給藥，3組在腫瘤接種的同時(shí)給藥，3組在腫瘤接種后7天給藥，每天1次，連續(xù)ig 14天；另設(shè)，正常對(duì)照組對(duì)正常組小鼠每天ig等體積的蒸餾水，空白對(duì)照組(LLC)ig與腫瘤接種等體積的蒸餾水，陽性對(duì)照組(LLC+5-FU)在腫瘤接種的同時(shí)按30mg·kg-1注射(ip)5-氟尿嘧啶(5-FU)。每天記錄小鼠體重，并在接入腫瘤的第7天開始用游標(biāo)卡尺量取腫瘤體積，每2天測(cè)量1次。根據(jù)公式腫瘤體積＝長(zhǎng)×寬2/2計(jì)算瘤體積。末次給藥24小時(shí)后，先眼眶取血0.5mL，加入含有約1mL 2％肝素鈉的指形管中，再小心移入盛有2mL淋巴細(xì)胞分離液(購自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院)的指形管中，用水平離心機(jī)1000g離心15min，吸出淋巴細(xì)胞層，臺(tái)盼藍(lán)染色，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)活細(xì)胞數(shù)。然后處死小鼠，取腫瘤稱重，按公式抑瘤率＝(模型組瘤重-給藥組瘤重)/模型組瘤重×100％。同時(shí)取胸腺、脾臟，計(jì)算胸腺指數(shù)與脾指數(shù)。
不同組小鼠的瘤體積變化情況如圖2所示(A，接種前7天給藥；B，接種同時(shí)給藥；C，接種后7天給藥)，表明3個(gè)劑量的芫花根總黃酮對(duì)腫瘤均表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，并隨給藥時(shí)間的延長(zhǎng)和給藥劑量的增加而呈增強(qiáng)的趨勢(shì)。3個(gè)不同時(shí)間給藥對(duì)實(shí)驗(yàn)肉瘤的生長(zhǎng)的抑制作用略有差異。接種腫瘤前7天給藥或后7天給藥，高劑量給藥組(75mg·kg-1)和中劑量組(50mg·kg-1)對(duì)實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤的生長(zhǎng)均表現(xiàn)出顯著的抑制作用。而與接種腫瘤同時(shí)給藥的高劑量組則顯示出相對(duì)較弱的抑制作用。腫瘤接種前7天和腫瘤接種后7天的三個(gè)劑量組以及與腫瘤接種同時(shí)給藥的中劑量組對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用均明顯地高于陽性對(duì)照組。
各組小鼠體重、免疫器官、血液中淋巴細(xì)胞細(xì)胞數(shù)的影響以及對(duì)腫瘤抑制率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3，荷瘤小鼠體重增長(zhǎng)明顯低于正常小鼠(P＜0.05)。芫花根總黃酮在腫瘤接種同時(shí)給藥或提前7天給藥則使荷瘤小鼠體重恢復(fù)至正常水平以上。腫瘤接種7天后給藥小鼠只有低劑量組小鼠的體重恢復(fù)至正常水平，中高劑量組小鼠體重則低于正常組。荷瘤小鼠的脾指數(shù)、胸腺指數(shù)顯著低于正常小鼠(P＜0.05，P＜0.01)。芫花根總黃酮3種不同時(shí)間給藥可使荷瘤小鼠脾指數(shù)恢復(fù)正常水平。與接種腫瘤同時(shí)給藥的3個(gè)劑量組、提前7天給藥的高劑量組和腫瘤接種后7天給藥的中劑量組可使荷瘤小鼠胸腺指數(shù)恢復(fù)至正常水平。荷瘤小鼠淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著減少(P＜0.01)。與腫瘤接種同時(shí)給藥的芫花根總黃酮可使小鼠血液淋巴細(xì)胞數(shù)量恢復(fù)至正常水平，提前7天給藥或接種腫瘤7天后給藥的小鼠血液淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著高于陽性對(duì)照組小鼠。3種不同時(shí)間給藥對(duì)實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤的抑制率均在45％以上。其中，提前7天給藥和種后7天給藥的芫花根總黃酮對(duì)腫瘤的抑制作用呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。與腫瘤接種同時(shí)給藥或提前7天給藥的3個(gè)劑量組以及腫瘤接種后給藥的中高劑量組對(duì)實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤的抑制作用均顯著地高于陽性對(duì)照。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明用本發(fā)明方法提取的芫花根總黃酮對(duì)腫瘤細(xì)胞具有顯著的抑制作用。
表3 對(duì)小鼠體重、免疫器官、血液中淋巴細(xì)胞細(xì)胞數(shù)的影響以及對(duì)腫瘤的抑制率統(tǒng)計(jì)結(jié)果(n＝10，x±s)


注與正常對(duì)照組相比，aP＜0.05，bP＜0.01；與空白對(duì)照組相比，cP＜0.05，dP＜0.01實(shí)施例4、檢測(cè)芫花根總黃酮對(duì)S180荷瘤小鼠脾淋巴細(xì)胞增值的影響檢測(cè)實(shí)施例1提取的芫花根總黃酮對(duì)S180荷瘤小鼠脾淋巴細(xì)胞增值的影響，實(shí)驗(yàn)方法為取小鼠120只，分為12組，每組10只，雌雄各半，其中11組小鼠按每鼠5×107細(xì)胞數(shù)將S180細(xì)胞接種于小鼠后肢腋下部位作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。給藥組將芫花根總黃酮用蒸餾水勻漿成濃度確定的懸浮液，按25、50和75mg·kg-1三個(gè)劑量對(duì)9組模型小鼠ig給藥，其中3組在腫瘤接種前7天給藥，3組在腫瘤接種的同時(shí)給藥，3組在腫瘤接種后7天給藥，每天1次，連續(xù)ig14天；另設(shè)，正常對(duì)照組對(duì)正常組小鼠每天ig等體積的蒸餾水，空白對(duì)照組ig與腫瘤接種等體積的蒸餾水，陽性對(duì)照組在腫瘤接種的同時(shí)按30mg·kg-1ip 5-氟尿嘧啶。末次給藥24h后處死小鼠，無菌制備小鼠脾淋巴細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)細(xì)胞活力。用RMPI1640完全培養(yǎng)基(Hyclone，USA)調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106mL-1，加入96孔板，每孔100μl。將各處理組小鼠淋巴細(xì)胞分為3組，其中2組分別加入刀豆蛋白A(ConA，Sigma，St.Louis MO，USA)，使其終濃度為5μg·mL-1，或加入脂多糖(LPS，Sigma，St.Louis MO，USA)，使其終濃度為10μg·mL-1。另1組作為平行對(duì)照，不加Con A或LPS。每組重復(fù)5次。在37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)68h，再向每孔加入5mg·mL-1MTT溶液(Sigma，St.LouisM0，USA)10μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h。棄去上清液后，每孔加入DMSO 150μl，靜置20min。用酶標(biāo)儀在570nm測(cè)定吸光值(A)。淋巴細(xì)胞增值能力以刺激指數(shù)(StimulationIndex，SI)表示，即SI＝ACon A或ALPS/A。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4，荷瘤小鼠淋巴細(xì)胞對(duì)ConA引起的增值反應(yīng)略低于正常小鼠，而對(duì)LPS引起的增值反應(yīng)則明顯低于正常小鼠。芫花根總黃酮預(yù)給藥的荷瘤小鼠淋巴細(xì)胞增值反應(yīng)顯著地高于陽性對(duì)照組小鼠，其中中劑量組可使荷瘤小鼠的淋巴細(xì)胞增值反應(yīng)水平超過正常小鼠。與腫瘤接種同時(shí)給藥或接種7天后給藥的小鼠淋巴細(xì)胞增值隨劑量的增加呈上升趨勢(shì)。其中經(jīng)中高劑量組處理的荷瘤小鼠淋巴細(xì)胞增值水平高于正常小鼠。
表4 對(duì)荷瘤小鼠淋巴細(xì)胞增值的影響(n＝10，x±s)

注與正常組相比較，aP＜0.05；與空白對(duì)照組相比較，cP＜0.05，dP＜0.01實(shí)施例5、檢測(cè)芫花根總黃酮對(duì)S180荷瘤小鼠NK細(xì)胞殺傷活性的影響檢測(cè)實(shí)施例1提取的芫花根總黃酮對(duì)S180荷瘤小鼠NK細(xì)胞殺傷活性的影響，實(shí)驗(yàn)方法為取小鼠120只，分為12組，每組10只，雌雄各半，其中11組小鼠按每鼠5×107細(xì)胞數(shù)將S180細(xì)胞接種于小鼠后肢腋下部位作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。給藥組將芫花根總黃酮用蒸餾水勻漿成濃度確定的懸浮液，按25、50和75mg·kg-1三個(gè)劑量對(duì)9組模型小鼠ig給藥，其中3組在腫瘤接種前7天給藥，3組在腫瘤接種的同時(shí)給藥，3組在腫瘤接種后7天給藥，每天1次，連續(xù)ig14天；另設(shè)，正常對(duì)照組對(duì)正常組小鼠每天ig等體積的蒸餾水，空白對(duì)照組ig與腫瘤接種等體積的蒸餾水，陽性對(duì)照組在腫瘤接種的同時(shí)按30mg·kg-1ip 5-氟尿嘧啶。末次給藥24h后處死小鼠，無菌條件下取小鼠脾淋巴細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，用DMEM完全培養(yǎng)基(Hyclone，USA)調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106mL-1，加入96孔板，每孔100μl。另取Hela細(xì)胞作靶細(xì)胞，用完全DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105mL-1，加入含有小鼠脾細(xì)胞的96孔板中，每孔100μl。同時(shí)設(shè)效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照組(淋巴細(xì)胞200μl)與靶細(xì)胞對(duì)照組(Hela細(xì)胞200μl)。將上述細(xì)胞在37℃、5％CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h。培養(yǎng)結(jié)束后向每孔中加入5mg·mL-1的MTT溶液10μl。繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄去上清液。每孔加入DMSO 150μl，靜置20min，用酶標(biāo)儀測(cè)定570nm吸光值。按公式NK細(xì)胞殺傷率＝1-(實(shí)驗(yàn)組A值-效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照組A值)/靶細(xì)胞對(duì)照組A值測(cè)定NK細(xì)胞的殺傷活性。
各劑量組的檢測(cè)結(jié)果如圖3所示(A，接種前7天給藥；B，接種同時(shí)給藥；C，接種后7天給藥)，荷瘤小鼠NK細(xì)胞殺傷活性顯著低于正常小鼠(P＜0.01)。芫花根總黃酮的3個(gè)劑量在3個(gè)不同時(shí)間給藥均能使荷瘤小鼠NK細(xì)胞殺傷活性恢復(fù)到正常水平以上，并顯著地高于陽性對(duì)照組小鼠的NK細(xì)胞殺傷活性。其中3種不同給藥時(shí)間的中劑量組(50mg·kg-1)和腫瘤接種7天給后藥的高劑量組使荷瘤小鼠NK細(xì)胞殺傷活性顯著地高出正常小鼠(P＜0.05，P＜0.01)。
實(shí)施例6、檢測(cè)芫花根總黃酮對(duì)Lewis肺癌的抑制作用檢測(cè)實(shí)施例1提取的芫花根總黃酮對(duì)Lewis肺癌的抑制作用，實(shí)驗(yàn)方法為選C57BL/6小鼠50只，隨機(jī)分為5祖，每組10只，分為空白對(duì)照組、5-Fu組30mg·kg-1、芫花根總黃酮50mg·kg-1組、100mg·kg-1組和200mg·kg-1組，每只小鼠無菌接種Lewis肺癌細(xì)胞(2×107/mL)懸液0.2mL；同時(shí)設(shè)正常對(duì)照組，灌胃等體積的生理鹽水。于接種后24h開始灌胃，灌胃21天，最后一次灌胃24h后處死，剝?nèi)×鰤K，稱重，計(jì)算抑瘤率，抑瘤率＝(模型組平均瘤重-給藥組平均瘤重)/模型組平均瘤重×100％。同時(shí)取胸腺與脾臟，稱重，計(jì)算胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù)。切離肺臟，稱重，以實(shí)驗(yàn)組小鼠肺重與正常小鼠肺重的差值作為瘤重，計(jì)算抑瘤率。將稱重后的肺按其原始5葉切開，以Bouin’s液固定24h，再用95％乙醇沖洗，計(jì)數(shù)肉眼可見各組肺癌轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)總數(shù)。
芫花根總黃酮對(duì)Lewis肺癌的抑制作用檢測(cè)結(jié)果見表5，3個(gè)劑量組的芫花根總黃酮對(duì)Lewis荷瘤小鼠的腫瘤均表現(xiàn)較好的抑制作用，其中以100mg·kg-1組的效果最為顯著，抑瘤率為45.51％，高于陽性對(duì)照組5-Fu組(36.71％)。與空白對(duì)照組的瘤重相比，給藥組的各組瘤重均有顯著的減輕，且100mg·kg-1組有極顯著性差異(p＜0.01)。荷瘤小鼠體重增長(zhǎng)明顯低于正常小鼠(P＜0.05，P＜0.01)，芫花根總黃酮給藥組小鼠體重水平有恢復(fù)，其中100mg·kg-1劑量組能恢復(fù)至正常水平。空白組荷瘤小鼠的脾指數(shù)、胸腺指數(shù)與正常組相比均有顯著降低(P＜0.05，P＜0.01)，芫花根總黃酮給藥組的Lewis肺癌小鼠的脾指數(shù)、胸腺指數(shù)與空白對(duì)照組相比有顯著提高，且高于陽性對(duì)照組(5-Fu組)芫花根總黃酮對(duì)Lewis肺癌小鼠轉(zhuǎn)移影響的檢測(cè)結(jié)果見表6，表明芫花根總黃酮對(duì)Lewis肺癌轉(zhuǎn)移有抑制作用，各劑量均能明顯減少肺癌轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)，特別是100mg·kg-1組表現(xiàn)最為突出(p＜0.01)。而且對(duì)轉(zhuǎn)移后的腫瘤生長(zhǎng)有明顯抑制作用，給藥組各組肺重顯著低于空白組的肺重，以50mg·kg-1組效果最好(p＜0.01)。
表5 對(duì)Lewis肺癌的抑制作用(n＝10，x±s)

注與正常對(duì)照組相比aP＜0.01；與空白對(duì)照組相比cP＜0.05，dP＜0.01表6 對(duì)Lewis肺癌小鼠轉(zhuǎn)移的影響(n＝10，x±SD)

注與正常對(duì)照組相比，aP＜0.01；與空白對(duì)照組相比，cP＜0.05，dP＜0.01實(shí)施例7、檢測(cè)芫花根總黃酮對(duì)Lewis肺癌小鼠CTL細(xì)胞活性的影響檢測(cè)實(shí)施例2提取的芫花根總黃酮對(duì)Lewis肺癌小鼠CTL細(xì)胞活性的影響，實(shí)驗(yàn)方法為選C57BL/6小鼠50只，隨機(jī)分為5組，每組10只，分為空白對(duì)照組、5-Fu組30mg·kg-1、芫花根總黃酮50mg·kg-1組、100mg·kg-1組和200mg·kg-1組，每只小鼠無菌接種Lewis肺癌細(xì)胞(2×107/mL)懸液0.2mL；同時(shí)設(shè)正常對(duì)照組，灌胃等體積的生理鹽水。于接種后24h開始灌胃，灌胃21天。最后一次灌胃24h后處死，無菌取脾，制成單細(xì)胞懸液作為效應(yīng)細(xì)胞，用完全1640培養(yǎng)基調(diào)整脾細(xì)胞濃度為2×106mL-1。按效/靶比為20∶1的比例分別加入活的Lewis細(xì)胞作為靶細(xì)胞，同時(shí)設(shè)效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照孔和靶細(xì)胞對(duì)照孔。繼續(xù)培養(yǎng)8h，用MTT法測(cè)其570nmA值。計(jì)算CTL殺傷活性，CTL細(xì)胞殺傷率＝1-(實(shí)驗(yàn)組A值-效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照組A值)/靶細(xì)胞對(duì)照組A值。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表7，空白組荷瘤小鼠的CTL細(xì)胞活性與正常組相比顯著降低(p＜0.01)，給藥組荷瘤小鼠CTL細(xì)胞活性與空白對(duì)照組相比有顯著的提高，特別是50mg·kg-1劑量組與正常水平相接近，CTL細(xì)胞活性隨著給藥劑量的增加有逐漸減少的趨勢(shì)。
表7 對(duì)Lewis肺癌小鼠的CTL細(xì)胞活性的影響(n＝10，x±s)

注與正常對(duì)照組相比，aP＜0.01；與空白對(duì)照組相比，cP＜0.05，dP＜0.01實(shí)施例8、檢測(cè)芫花根總黃酮對(duì)Lewis肺癌小鼠LAK細(xì)胞殺傷活性的影響檢測(cè)實(shí)施例2提取的芫花根總黃酮對(duì)Lewis肺癌小鼠CTL細(xì)胞活性的影響，實(shí)驗(yàn)方法為選C57BL/6小鼠50只，隨機(jī)分為5祖，每組10只，分為空白對(duì)照組、5-Fu組30mg·kg-1、芫花根總黃酮50mg·kg-1組、100mg·kg-1組和200mg·kg-1組，每只小鼠無菌接種Lewis肺癌細(xì)胞(2×107/mL)懸液0.2mL；同時(shí)設(shè)正常對(duì)照組，灌胃等體積的生理鹽水。于接種后24h開始灌胃，灌胃21天。最后一次灌胃24h后處死，無菌取脾，制成單細(xì)胞懸液作為效應(yīng)細(xì)胞，用RMPI1640完全培養(yǎng)基調(diào)整脾細(xì)胞濃度為5×106mL-1。移入培養(yǎng)瓶中，加入IL-2使其終濃度為1000u·mL-1，將培養(yǎng)瓶置37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)3d，更換含IL-2為1000u·mL-1的RMPI1640完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)3d即孵化成LAK細(xì)胞。使用前用RMPI1640培養(yǎng)基洗兩遍，調(diào)濃度為2×106mL-1。按效/靶比為10∶1的比例分別加入K293細(xì)胞作為靶細(xì)胞，同時(shí)設(shè)效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照孔和靶細(xì)胞對(duì)照孔。繼續(xù)培養(yǎng)8h，用MTT法測(cè)其570nm A值。LAK細(xì)胞殺傷率(％)＝{1-[A(效+靶)-A(效)]/A(靶)}×100％。
檢測(cè)結(jié)果見表8，空白組荷瘤小鼠的LAK細(xì)胞殺傷活性與正常組相比顯著降低(p＜0.01)，芫花根總黃酮給藥組的LAK細(xì)胞活性與空白對(duì)照組相比有顯著的提高，特別100mg·kg-1劑量組與正常水平相接近。
表8 對(duì)Lewis肺癌小鼠的LAK細(xì)胞殺傷活性的影響(n＝10，x±s)

注與正常對(duì)照組相比，aP＜0.01；與空白對(duì)照組相比，cP＜0.05，dP＜0.01實(shí)施例9、檢測(cè)芫花根總黃酮對(duì)Lewis肺癌小鼠淋巴細(xì)胞增值的影響檢測(cè)實(shí)施例2提取的芫花根總黃酮對(duì)Lewis肺癌小鼠淋巴細(xì)胞增值的影響，實(shí)驗(yàn)方法為C57BL/6小鼠50只，隨機(jī)分為5組，每組10只，分為空白對(duì)照組、5-Fu組30mg·kg-1、芫花根總黃酮50mg·kg-1組、100mg·kg-1組和200mg·kg-1組，每只小鼠無菌接種Lewis肺癌細(xì)胞(2×107/mL)懸液0.2mL；同時(shí)設(shè)正常對(duì)照組，灌胃等體積的生理鹽水。于接種后24h開始灌胃，灌胃21天。最后一次灌胃24h后處死，無菌取脾，制成單細(xì)胞懸液，用RMPI1640完全培養(yǎng)基調(diào)整脾細(xì)胞濃度為1×106mL-1。加入96孔板，每孔100μl。將各處理組小鼠淋巴細(xì)胞分為3組，其中2組分別加入ConA，使其終濃度為5μg·mL-1，或加入LPS，使其終濃度為10μg·mL-1。另1組作為平行對(duì)照，不加Con A或LPS。每組重復(fù)5次。在37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)68h，再向每孔加入5mg·mL-1的MTT溶液10μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h。棄去上清液后，每孔加入DMSO150μl，靜置20min。用酶標(biāo)儀在570nm測(cè)定吸光值(A)。淋巴細(xì)胞增值能力以刺激指數(shù)(Stimulation Index，SI)表示，即SI＝ACon A或ALPS/A。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表9，荷瘤小鼠淋巴細(xì)胞對(duì)ConA引起的增值反應(yīng)略低于正常小鼠(P＜0.05)，而對(duì)LPS引起的增值反應(yīng)則明顯低于正常小鼠(P＜0.05)。芫花根總黃酮給藥組淋巴細(xì)胞增值反應(yīng)顯著高于荷瘤小鼠組。ConA誘導(dǎo)的淋巴增值以中劑量效果最好，高于正常水平。LPS誘導(dǎo)的淋巴增值以低劑量效果最好，接近正常水平，且隨用藥劑量的增加而減少。
表9 對(duì)Lewis肺癌小鼠淋巴細(xì)胞增值的影響(n＝10，x±s)

注與正常對(duì)照組相比，aP＜0.01，bP＜0.01；與空白對(duì)照組相比，cP＜0.05，dP＜0.01實(shí)施例10、檢測(cè)芫花根總黃酮對(duì)超氧自由基的清除作用采用鄰苯三酚自氧化法檢測(cè)實(shí)施例2提取的芫花根總黃酮對(duì)超氧自由基的清除作用，檢測(cè)方法為取0.05mol·L-1，pH8.2的Tris·HCl緩沖液4.5mL于試管中，4.2mL蒸餾水，置25℃水浴中預(yù)熱20min。分別加入不同濃度(0.5、0.25.0.125.0.0625、0(空白對(duì)照)mg·mL-1)的芫花根總黃酮0.1mL，立即加入在25℃水浴中預(yù)熱的3mmol·L-1鄰苯三酚(由10mmol·L-1HCL配制)0.4mL，混勻后25℃水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)4min，立即加入8mol·L-1HCl 2滴終止反應(yīng)，蒸餾水調(diào)零，在420nm處測(cè)定吸光度?？瞻捉M以0.1mL蒸餾水代替樣品試液。按以下公式計(jì)算清除率。清除率＝(A空白-A樣品)/A空白×100％。
結(jié)果見表10，O2-清除劑能抑制鄰苯三酚自氧化過程，使體系的A420特征吸收峰減弱，加入芫花根總黃酮溶液后A420值變小，與對(duì)照管比較有顯著性差異(P＜0.05)。根據(jù)A420值變化，表明各濃度的芫花根總黃酮對(duì)O2-具有清除能力。
表10 對(duì)O2-自由基的清除作用(n＝5，x±s)

注與空白對(duì)照組相比，aP＜0.05，bP＜0.01實(shí)施例11、檢測(cè)芫花根總黃酮對(duì)羥基自由基的清除作用用鄰二氮菲-Fe2+氧化法檢測(cè)實(shí)施例2提取的芫花根總黃酮對(duì)Fe2+/H2O2體系中產(chǎn)生的羥基(·OH)自由基的清除作用，檢測(cè)方法為依次加入鄰二氮菲1.5mL，pH7.4的磷酸緩沖溶液及芫花根總黃酮溶液(對(duì)照管及未損傷管不加芫花根總黃酮，用蒸餾水補(bǔ)充體積)混勻，再加FeSO4立即混勻，最后加H2O2(未損傷管不加)。最終濃度鄰二氮菲0.75mmol·L-1、FeSO40.75mmol·L-1、H2O20.01％，總體積9mL。各管置恒溫水浴箱37℃保溫60min，分別測(cè)各管A536。OH清除率％＝(A樣品-A損傷)/(A未損-A損傷)×100％。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表11，加入芫花根總黃酮后與對(duì)照組相比有顯著性差異，表明用本發(fā)明方法獲得的芫花根總黃酮對(duì)Fe2+/H2O2體系中產(chǎn)生的羥基自由基具有清除作用，且在0.5-0.0625mg·mL-1范圍內(nèi)隨芫花根總黃酮濃度的降低清除率下降。
表11 對(duì)·OH自由基的清除作用(n＝5，x±s)

注與對(duì)照管比較，ap＜0.05，bp＜0.01實(shí)施例12、檢測(cè)芫花根總黃酮含藥血清對(duì)自由基的清除作用檢測(cè)實(shí)施例2提取的芫花根總黃酮含藥血清對(duì)自由基的清除作用，檢測(cè)方法為取正常小鼠50只，灌胃200mg·kg-1的芫花根總黃酮溶液，一天2次，7次后分別在15min、30min、60min、90min、120min取血，分離血清。正常組灌胃生理鹽水，制備正常血清。用與實(shí)施例10、11相同的方法測(cè)定芫花根總黃酮含藥血清對(duì)超氧自由基、羥基自由基的清除作用。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表12，灌胃3天后，血清中藥物濃度具有一定的積累，芫花根總黃酮含藥血清對(duì)超氧自由基具有較強(qiáng)的清除作用。與正常血清組相比，15min的含藥血清不能增強(qiáng)清除能力，30min之后隨著血藥濃度的降低對(duì)超氧自由基的清楚率逐漸增加(p＜0.01)。與正常血清組相比，芫花根總黃酮含藥血清對(duì)羥基有顯著的清除作用(P＜0.01)，且與血清中血藥濃度變化一致，30min血藥濃度最大時(shí)清除作用效果最好。
表12 芫花根總黃酮含藥血清對(duì)自由基的清除作用(n＝5，X±s)

注與正常血清組，aP＜0.01實(shí)施例13、檢測(cè)芫花根總黃酮含藥血清中的酶活性檢測(cè)實(shí)施例2提取的芫花根總黃酮含藥血清中的酶活性，檢測(cè)方法為取正常小鼠50只，灌胃200mg·kg-1的芫花根總黃酮溶液，一天2次，7次后分別在15min、30min、60min、90min、120min取血，分離血清。正常組灌胃生理鹽水，制備正常血清。根據(jù)試劑盒說明測(cè)定血清中SOD活性、GSH-PX活性、CAT活性。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表13，與正常血清組相比，芫花根總黃酮含藥血清中SOD活性有顯著的增加(P＜0.05，P＜0.01)，血藥濃度在灌胃后0-30min逐漸上升，30-60min逐漸下降。含藥血清中SOD活性在血藥濃度達(dá)到高峰時(shí)最大。含藥血清中GSH-PX活性隨著給藥后時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，與正常血清組相比有顯著增加(P＜0.05，P＜0.01)。與正常血清組相比，給藥后血清中CAT活性有顯著的提高(P＜0.01，P＜0.01)，CAT活性隨著給藥后時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸減弱。
表13 血清中SOD、GSH-PX、CAT活性的測(cè)定(n＝5，X±s)

注與正常血清組相比，aP＜0.01，bP＜0.01實(shí)施例14、檢測(cè)芫花根總黃酮對(duì)H2O2誘導(dǎo)的紅細(xì)胞氧化溶血能力檢測(cè)實(shí)施例2提取的芫花根總黃酮對(duì)H2O2誘導(dǎo)的紅細(xì)胞氧化溶血能力，檢測(cè)方法為正常小鼠眼眶取血，制成抗凝血，1000g離心10min，移棄血漿和白細(xì)胞，向沉淀的紅細(xì)胞中加入等滲的生理鹽水，混勻，1000g離心10min，棄上清液，如此反復(fù)2次洗滌紅細(xì)胞，將紅細(xì)胞制成0.5％的懸浮液。取紅細(xì)胞懸液1mL，實(shí)驗(yàn)組加不同濃度的芫花根總黃銅溶液，同時(shí)設(shè)未誘導(dǎo)溶血的空白對(duì)照管與模型溶血管，最后加100mmol/L的H2O2，混勻，37℃溫浴60min，用生理鹽水稀釋5倍，1000g離心10min，取上清液，于415nm處測(cè)定吸光度值。計(jì)算溶血抑制率，抑制率＝(模型組溶血率-實(shí)驗(yàn)組溶血率)/(模型組溶血率-空白組溶血率)×100％。
結(jié)果見表14，與空白組相比，加入芫花根總黃酮后，H2O2誘導(dǎo)的紅細(xì)胞氧化溶血能力被明顯抑制(p＜0.05，p＜0.01)，且隨著給藥劑量的減小，溶血抑制率也逐漸降低。
表14 對(duì)H2O2誘導(dǎo)的紅細(xì)胞氧化溶血影響(n＝5，X±s)

注與空白組相比，aP＜0.01，bP＜0.01實(shí)施例15、檢測(cè)芫花根總黃酮給藥后對(duì)離體組織脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的抑制作用檢測(cè)實(shí)施例2提取的芫花根總黃酮對(duì)離體組織脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的抑制作用，檢測(cè)方法為小鼠禁食12h，處死，取肝、腦臟器，在0-4℃下用生理鹽水制成10％的組織勻漿，各管4℃下離心10min，4000r·min-1，取上清液。用MDA試劑盒(購自南京建成生物技術(shù)研究所)并根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)不同濃度的芫花根總黃酮(1、0.5、0.25.0.125.0.0625、0(空白對(duì)照)mg·mL-1)對(duì)離體組織脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的抑制作用，在535nm處測(cè)吸光度值(A)。
結(jié)果見表15，芫花根總黃酮不同劑量給藥組的A值均顯著低于空白組，對(duì)離體組織肝臟脂質(zhì)過氧化抑制作用先是隨濃度降低增加，然后再逐漸減少，濃度為0.125mg·mL-對(duì)離體組織肝臟脂質(zhì)過氧化抑制作用最為顯著(p＜0.01)。對(duì)離體腦組織脂質(zhì)過氧化抑制作用是隨濃度的增加而逐漸增強(qiáng)的，濃度為1mg·mL-1效果最為明顯(P＜0.01)。
表15 對(duì)離體組織脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的測(cè)定(n＝5，x±s)

注與空白對(duì)照相比較，ap＜0.05；bp＜0.01實(shí)施例16、檢測(cè)芫花根總黃酮對(duì)荷瘤小鼠組織勻漿與血清中MDA、SOD、GSH-Px、CAT活性的影響檢測(cè)芫花根總黃酮對(duì)荷瘤小鼠組織勻漿與血清中MDA含量、SOD、GSH-Px、CAT活性的影響，實(shí)驗(yàn)方法為ICR小鼠分為正常組、空白組、芫花根總黃酮25mg·kg-1、50mg·kg-1和75mg·kg-1劑量組，每組10只，ig14d，眼球取血，分離血清。脫頸處死，取肝、腦，用冷的生理鹽水洗凈血液，在冷的生理鹽水中剪碎，加冷生理鹽水作10％組織勻漿。各管4℃下離心10min，4000r·min-1，取上清液，用氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)及過氧化氫酶(CAT)試劑盒(南京建成生物技術(shù)研究所)并根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)上清液中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)及過氧化氫酶(CAT)的活性。MDA含量采用考馬斯亮蘭法測(cè)定。
荷瘤小鼠腦組織中的MDA含量、SOD、GSH-Px、CAT活性檢測(cè)結(jié)果見表16，顯著低于空白組(p＜0.01)，接近或低于正常組的水平，其中75mg·kg-1劑量組MDA含量低于正常組；SOD、GSH-PX、CAT的活性較空白組有顯著的提高(p＜0.05，p＜0.01)，50mg·kg-1劑量組中三者活性均是最高。荷瘤小鼠肝臟組織中的MDA含量、SOD、GSH-Px、CAT活性檢測(cè)結(jié)果見表17，與空白組相比，給藥組的肝臟中MDA含量顯著降低(p＜0.01)，其中50mg·kg-1劑量組表現(xiàn)最為顯著、接近正常水平；SOD、GSH-PX、CAT的活性較空白組有顯著的提高(p＜0.05，p＜0.01)，SOD、GSH-PX均是75mg·kg-1劑量組的效果最好，而CAT卻是25mg·kg-1劑量最好。芫花根總黃酮給藥組小鼠血清中的MDA含量、SOD、GSH-Px、CAT活性檢測(cè)結(jié)果見表18，給藥組小鼠血清中的MDA含量較空白組有顯著降低，且隨著給藥量的增加MDA含量逐漸減少(p＜0.05，p＜0.01)；與空白組相比，給藥組小鼠血清中的SOD、GSH-PX、CAT活性均有顯著提高(p＜0.05，p＜0.01)。
表16 荷瘤小鼠腦組織中MDA含量、SOD活性、GSH-Px活性及CAT活性的檢測(cè)結(jié)果(n＝5，x±s)

注與正常對(duì)照相比較，ap＜0.01，bp＜0.001；與空白對(duì)照組相比，cp＜0.05，dp＜0.01表17 荷瘤小鼠肝組織中MDA含量、SOD活性、GSH-Px活性及CAT活性的檢測(cè)結(jié)果(n＝5，x±s)


注與正常對(duì)照相比較，ap＜0.01，bp＜0.001；與空白對(duì)照組相比，cp＜0.05，dp＜0.01表18 荷瘤小鼠血清中MDA含量、SOD活性、GSH-Px活性及CAT活性的檢測(cè)結(jié)果(n＝5，x±s)

注與正常對(duì)照相比較，ap＜0.05，bp＜0.01；與空白對(duì)照組相比，cp＜0.05，dp＜0.01實(shí)施例17、芫花根總黃酮含藥血清的淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)制備正常小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液2×106mL-1，加入96孔板中。實(shí)驗(yàn)設(shè)正常血清組、含藥血清組(芫花根總黃酮含量為0.279μg·mL-1，獲得方法參見實(shí)施例16)、含藥血清+ConA組和含藥血清+LPS組，血清的添加量都分別為10％、20％、30％、40％和50％，每孔終體積為200μl，每組5復(fù)孔。放入37℃、5％CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)68h，每孔加入5mg·mL-1的MTT溶液10μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h。培養(yǎng)結(jié)束后，棄上清，加入150μl的DMSO，用酶標(biāo)儀測(cè)定570nm處的OD值。
結(jié)果見表19，表明芫花根總黃酮含藥血清對(duì)正常小鼠的脾淋巴細(xì)胞增值反應(yīng)有促進(jìn)作用。與相等添加量正常血清組相比，20％芫花根總黃酮含藥血清對(duì)脾淋巴細(xì)胞增值有顯著的促進(jìn)作用(P＜0.05)；在Con A的誘導(dǎo)下，僅有芫花根總黃酮含藥血清添加量為30％時(shí)有顯著性促進(jìn)作用(P＜0.05)，在LPS的誘導(dǎo)下，芫花根總黃酮含藥血清添加量為20-40％對(duì)淋巴細(xì)胞增值有顯著(P＜0.05)。
表19 含藥血清對(duì)淋巴細(xì)胞增信的影響(A570，n＝5，x±s)

注與正常血清組相比，aP＜0.05實(shí)施例18、芫花根總黃酮含藥血清對(duì)NK、LAK細(xì)胞殺傷活性的影響無菌制備脾淋巴細(xì)胞(效應(yīng)細(xì)胞)2×106mL-1，人慢性髓系白血病K562細(xì)胞(靶細(xì)胞)濃度為2×105mL-1，以每孔50μl分別加入96孔板。實(shí)驗(yàn)孔分別加入不同量的含藥血清(芫花根總黃酮含量為0.279μg·mL-1，獲得方法參見實(shí)施例16)或正常血清，效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞對(duì)照孔分別加入相同體積的正常血清，每組5個(gè)復(fù)孔，最終每孔加入RMPI1640完全培養(yǎng)基補(bǔ)足至200μl，血清添加量為10％、20％、30％、40％和50％。放入37℃、5％CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，每孔加入5mg·mL-1MTT溶液10μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄去上清液。每孔加入150μl的DMSO，靜置20min，充分溶解晶體。用酶標(biāo)儀在570nm處測(cè)定OD值，計(jì)算殺傷率(％)＝{1-[A(效+靶)-A(效)]/A(靶)}×100％。另無菌制備小鼠脾細(xì)胞懸液，調(diào)細(xì)胞濃度為5×106mL-1，移入培養(yǎng)瓶中，加入IL-2使其終濃度為1000u·mL-1，將培養(yǎng)瓶置37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)3d，更換含IL-2為1000u·mL-1的培養(yǎng)基，培養(yǎng)3d即孵化成LAK細(xì)胞。使用前用RMPI1640完全培養(yǎng)基洗兩遍，調(diào)濃度為2×106mL-1。LAK細(xì)胞活性的檢測(cè)參照NK殺傷活性的測(cè)定方法，LAK細(xì)胞殺傷率(％)＝{1-[A(效+靶)-A(效)]/A(靶)}×100％。
檢測(cè)結(jié)果見表20，芫花根總黃酮含藥血清能顯著提高NK、LAK細(xì)胞的殺傷活性。與相等添加量的正常血清對(duì)照組相比，含藥血清添加量為30％的作用表現(xiàn)最為顯著(p＜0.01)；其次是含藥血清添加量為20％和40％的(p＜0.05)。
表20 含藥血清對(duì)NK、LAK細(xì)胞的殺傷作用(n＝5，x±S)


注與正常血清組相比，aP＜0.05，bP＜0.01實(shí)施例19、檢測(cè)芫花根總黃酮含藥血清對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響采用中性紅吞噬試驗(yàn)檢測(cè)芫花根總黃酮含藥血清對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響，試驗(yàn)方法為按文獻(xiàn)(Zhang S；Wang Q，Li W F，et al.Enhanced antitumorimmunity by murine cytokine activated T lymphocytes after cocultured with bonemarrow derived dendritic cells pulsed with whole tumor lysates.Leukemia Res2004，28(10)1085-1088.)制備腹腔巨噬細(xì)胞懸液，調(diào)細(xì)胞濃度為1×106mL-1，每孔100μl，再加入10％、20％、30％、40％和50％的含藥血清或正常血清，用DMEM完全培養(yǎng)基補(bǔ)足200μl，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。每孔加入0.075％無菌中性紅生理鹽水溶液50μl后，繼續(xù)培養(yǎng)30min，離心后棄去上清液，PBS洗3遍，每孔加細(xì)胞裂解液(乙酸∶乙醇＝1∶1)200μ1，用酶標(biāo)儀測(cè)定540nm的OD值。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表21，表明含藥血清對(duì)正常小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能具有增強(qiáng)作用，但是與相等添加量的正常血清組相比，只有含藥血清添加量為30％時(shí)有顯著性差異(P＜0.05)。
表21 含藥血清對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響(A540，n＝5，x±S)

注與正常血清組相比，aP＜0.0權(quán)利要求
1.一種芫花根總黃酮的提取方法，包括以下步驟1)將芫花根粉碎；2)將芫花根與體積百分含量為80-100％乙醇按體積比為1∶3-5混合，在40-70℃下浸提12-48小時(shí)；3)去除提取液中的沉淀物；4)將提取液過大孔吸附樹脂，然后用水洗滌樹脂，再用體積百分含量為80-100％乙醇對(duì)樹脂進(jìn)行洗脫，得到洗脫液；5)將洗脫液減壓蒸餾后過200-300目硅膠柱，再用體積比為1∶1的氯仿∶甲醇混合液洗脫，對(duì)洗脫物進(jìn)行濃縮，得到芫花根總黃酮。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于所述步驟2)中芫花根與乙醇混合的體積比為1∶4，浸提溫度為60℃，浸提時(shí)間為24小時(shí)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于所述步驟3)中用離心或過濾的方法去除提取液中的沉淀物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于所述步驟4)中的大孔吸附樹脂的型號(hào)為ADS-17，用于洗滌樹脂的水為去離子水。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于將所述步驟4)重復(fù)1-3次，合并洗脫液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于所述步驟5)中的減壓蒸餾在50-60℃下進(jìn)行。
7.用權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述方法得到的芫花根總黃酮。
8.權(quán)利要求7所述的芫花根總黃酮在制備預(yù)防和/或治療性抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求7所述的芫花根總黃酮在制備提高機(jī)體免疫力藥物中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求7所述的芫花根總黃酮在制備抗衰老藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種芫花根總黃酮及其提取方法與應(yīng)用。其目的是提供一種芫花根總黃酮及其提取方法與其在制備預(yù)防和/或治療性腫瘤藥物中的應(yīng)用。該提取方法包括以下步驟1)將芫花根粉碎；2)將芫花根與體積百分含量為80－100％乙醇按體積比為1∶3－5混合，在40－70℃下浸提12－48小時(shí)；3)去除提取液中的沉淀物；4)將提取液過大孔吸附樹脂，然后用水洗滌樹脂，再用體積百分含量為80－100％乙醇對(duì)樹脂進(jìn)行洗脫，得到洗脫液；5)將洗脫液減壓蒸餾后過200－300目硅膠柱，再用體積比為1∶1的氯仿∶甲醇混合液洗脫，對(duì)洗脫物進(jìn)行濃縮，得到芫花根總黃酮。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1915335SQ20061008905
公開日2007年2月21日 申請(qǐng)日期2006年7月31日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月31日
發(fā)明者鄭維發(fā), 高曉雯 申請(qǐng)人:徐州師范大學(xué)