專利名稱：一種用于胃癌治療的藥物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于胃癌治療的藥物及其制備方法，該藥物通過一個(gè)雙功能連接劑將放射性核素間接標(biāo)記到單克隆抗體3H11，由于腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)特異抗原，利用抗體和抗原的特異性結(jié)合，使標(biāo)記的抗體注入體內(nèi)后濃聚于腫瘤部位，并利用放射性核素衰變釋放的β-粒子殺傷癌細(xì)胞以達(dá)到治療的目的。
背景技術(shù)：
腫瘤是危害人類生命和健康的主要疾病之一，如何早期診斷和治療是生物醫(yī)學(xué)工作者長(zhǎng)期以來不懈努力追求的目標(biāo)。腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)特異抗原，單克隆抗體具有識(shí)別抗原的特異性，因而可以利用單克隆抗體治療疾病。由于放射性核素標(biāo)記的單克隆抗體對(duì)腫瘤具有特異性和高親和力，同時(shí)也由于抗體工程技術(shù)的快速發(fā)展，近年來放射免疫治療已成為腫瘤治療的一個(gè)新的方法和手段，并在臨床上取得了引人注目的療效。
中國(guó)專利CN1166988A公開了一種抗人肝癌單克隆抗體HAb18放射免疫治療劑，而國(guó)內(nèi)外尚未有放射性核素通過間接法標(biāo)記的用于胃癌治療的藥物。
3H11是我國(guó)研制的抗胃癌單克隆抗體，并用99mTc、188Re和131I標(biāo)記進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究。上述研究采用的標(biāo)記方法均為直接標(biāo)記法，由于在標(biāo)記過程中加入還原劑或氧化劑，因此對(duì)抗體活性產(chǎn)生相對(duì)較大的影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目在于提供一種用于胃癌治療的藥物及其制備方法，該藥物通過一個(gè)雙功能連接劑將放射性核素標(biāo)記到單克隆抗體3H11，使標(biāo)記的抗體注入體內(nèi)后濃聚于腫瘤部位，并利用放射性核素衰變釋放的β-粒子殺傷癌細(xì)胞以達(dá)到治療的目的。
本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種用于胃癌治療的藥物，包括抗體及放射性核素，所述抗體為單克隆抗體3H11，所述放射性核素通過一個(gè)雙功能連接劑標(biāo)記所述單克隆抗體3H11，所述放射性核素標(biāo)記的單克隆抗體3H11為無(wú)色液體針劑。
一種用于胃癌治療的藥物的制備方法，其步驟如下I、將1.2mL濃度為5.0mg/mL的單克隆抗體3H11溶液和1mL濃度為1.0mM的EDTA溶液分別加入到超濾離心管中，在4℃條件下以每分鐘5000轉(zhuǎn)的速度離心45分鐘；II、向所述超濾離心管中加入pH值為7.5，濃度為0.1M的Na2HPO4溶液2.0mL，第二次在4℃條件下以每分鐘5000轉(zhuǎn)的速度離心45分鐘；III、向所述超濾離心管中加入pH值為7.5，濃度為0.1M的Na2HPO4溶液2.0mL，第三次在4℃條件下以每分鐘5000轉(zhuǎn)的速度離心45分鐘；IV、向所述超濾離心管中加入pH值為7.5，濃度為0.1M的Na2HPO4溶液2.0mL，第四次在4℃條件下以每分鐘5000轉(zhuǎn)的速度離心45分鐘；V、將超濾離心處理的單克隆抗體3H11溶液取出超濾離心管，在該單克隆抗體3H11溶液中加入Na2HPO4溶液稀釋至0.5mL，測(cè)量該溶液中單克隆抗體3H11的濃度并保存數(shù)據(jù)，在4℃條件下保存該抗體溶液，所述Na2HPO4溶液的pH值為7.5，濃度為0.1M，所述Na2HPO4溶液中含0.15mM NaCl；VI、用DMF溶解DOTA-NHS，配制成濃度為33.45g/L的溶液；取該溶液10μL分兩次加入到0.5mL的上述經(jīng)超濾離心處理的單克隆抗體3H11溶液中，該混和液在避光4℃條件下反應(yīng)12小時(shí)，獲得反應(yīng)溶液；VII、將所述反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)移到透析卡中，在1.0L Na2HPO4溶液中透析處理24小時(shí)，透析處理溫度為4℃，所述Na2HPO4溶液的pH值為7.5，濃度為0.1M，所述Na2HPO4溶液中含0.15mM NaCl；VIII、將經(jīng)過一次透析處理的所述反應(yīng)溶液使用1.0L NH4OAc溶液進(jìn)行第二次透析處理，透析處理時(shí)間為18小時(shí)，透析處理溫度為4℃；在相同條件下再重復(fù)所述透析過程3次；透析處理完成后，獲得DOTA-3H11溶液；在DOTA-3H11溶液中加入NH4OAc溶液進(jìn)行濃度調(diào)節(jié)，獲得濃度為2.8mg/mL的偶聯(lián)物DOTA-3H11溶液，所述的NH4OAc溶液的pH值為7.0、濃度為0.05M；對(duì)該溶液中偶聯(lián)物DOTA-3H11的濃度進(jìn)行測(cè)量并保存數(shù)據(jù)，在4℃條件下保存該偶聯(lián)物溶液；IX、將50μL的所述偶聯(lián)物DOTA-3H11溶液和100μL醋酸鈉緩沖液加入到反應(yīng)管中，所述醋酸鈉緩沖液的pH值為5.2、濃度為0.2M，再加入10μL90YCl3溶液或10μL177LuCl3溶液，所述90YCl3或177LuCl3溶于0.04M HCl溶液中；該混和液在43℃條件下反應(yīng)1小時(shí)，然后加入20μLEDTA，所述EDTA的pH值為5.0、濃度為6.0mM，在室溫條件下反應(yīng)10分鐘；將反應(yīng)物通過PD-10柱純化，獲得放射化學(xué)純度大于99％的放射性藥物90Y-DOTA-3H11或177Lu-DOTA-3H11。
一種用于胃癌治療的藥物的制備方法，其步驟如下I、將1.2mL濃度為5.0mg/mL的單克隆抗體3H11溶液和1mL濃度為1.0mM的EDTA溶液分別加入到超濾離心管中，在4℃條件下以每分鐘5000轉(zhuǎn)的速度離心45分鐘；II、向所述超濾離心管中加入pH值為7.5，濃度為0.1M的Na2HPO4溶液2.0mL，第二次在4℃條件下以每分鐘5000轉(zhuǎn)的速度離心45分鐘；III、向所述超濾離心管中加入pH值為7.5，濃度為0.1 M的Na2HPO4溶液2.0mL，第三次在4℃條件下以每分鐘5000轉(zhuǎn)的速度離心45分鐘；IV、向所述超濾離心管中加入pH值為7.5，濃度為0.1M的Na2HPO4溶液2.0mL，第四次在4℃條件下以每分鐘5000轉(zhuǎn)的速度離心45分鐘；V、將超濾離心處理的單克隆抗體3H11溶液取出超濾離心管，在該單克隆抗體3H11溶液中加入Na2HPO4溶液稀釋至0.5mL，測(cè)量該溶液中單克隆抗體3H11的濃度并保存數(shù)據(jù)，在4℃條件下保存該抗體溶液，所述Na2HPO4溶液的pH值為7.5，濃度為0.1M，所述Na2HPO4溶液中含0.15mM NaCl；VI、用DMF溶解DTPA衍生物，配制成濃度為33.45g/L的溶液；取該溶液10μL分兩次加入到0.5mL的上述經(jīng)超濾離心處理的單克隆抗體3H11溶液中，該混和液在避光4℃條件下反應(yīng)12小時(shí)，獲得反應(yīng)溶液；VII、將所述反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)移到透析卡中，在1.0L Na2HPO4溶液中透析處理24小時(shí)，透析處理溫度為4℃，所述Na2HPO4溶液的pH值為7.5，濃度為0.1M，所述Na2HPO4溶液中含0.15mM NaCl；VIII、將經(jīng)過一次透析處理的所述反應(yīng)溶液使用1.0L NH4OAc溶液進(jìn)行第二次透析處理，透析處理時(shí)間為18小時(shí)，透析處理溫度為4℃；在相同條件下再重復(fù)所述透析過程3次；透析處理完成后，獲得DTPA-3H11溶液；在DTPA-3H11溶液中加入NH4OAc溶液進(jìn)行濃度調(diào)節(jié)，獲得濃度為2.8mg/mL的偶聯(lián)物DTPA-3H11溶液，所述的NH4OAc溶液的pH值為7.0、濃度為0.05M；對(duì)該溶液中偶聯(lián)物DTPA-3H11的濃度進(jìn)行測(cè)量并保存數(shù)據(jù)，在4℃條件下保存該偶聯(lián)物溶液；IX、將50μL的所述偶聯(lián)物DTPA-3H11溶液和100μL醋酸鈉緩沖液加入到反應(yīng)管中，所述醋酸鈉緩沖液的pH值為5.2、濃度為0.2M，再加入10μL90YCl3溶液或10μL177LuCl3溶液，所述90YCl3或177LuCl3溶于0.04M HCl溶液中；該混和液在室溫條件下反應(yīng)30分鐘，然后加入20μLEDTA，所述EDTA的pH值為5.0、濃度為6.0mM，在室溫條件下反應(yīng)10分鐘；將反應(yīng)物通過PD-10柱純化，獲得放射化學(xué)純度大于99％的放射性藥物90Y-DTPA-3H11或177Lu-DTPA-3H11。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比有如下優(yōu)點(diǎn)由于腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)特異抗原，利用抗體和抗原的特異性結(jié)合，通過抗體將放射性核素載帶到腫瘤部位，并利用放射性核素衰變釋放的β-粒子殺傷癌細(xì)胞以達(dá)到治療的目的。在已有技術(shù)中，對(duì)單克隆抗體3H11的標(biāo)記方法均為直接標(biāo)記法，由于在標(biāo)記過程中加入了還原劑或氧化劑，因此對(duì)抗體活性產(chǎn)生相對(duì)較大的影響。本發(fā)明采用間接標(biāo)記法，即在單克隆抗體和放射性核素之間引入一個(gè)雙功能連接劑。這既可減小對(duì)抗體活性的影響，又可增強(qiáng)放射性藥物的穩(wěn)定性，同時(shí)提高腫瘤對(duì)放射性藥物的攝取。與非放射性藥物相比，放射性藥物不僅能殺傷實(shí)體瘤表面的腫瘤細(xì)胞，同時(shí)通過放射性β-粒子殺傷實(shí)體瘤內(nèi)部的腫瘤細(xì)胞，具有更強(qiáng)的殺傷力。
以下結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。


圖1為本發(fā)明DOTA偶聯(lián)單抗3H11的分析圖；圖2為本發(fā)明反應(yīng)pH值對(duì)標(biāo)記率影響的示意圖；圖3為本發(fā)明反應(yīng)溫度及時(shí)間對(duì)標(biāo)記率影響的示意圖；圖4為本發(fā)明抗體濃度對(duì)標(biāo)記率影響的示意圖；圖5為本發(fā)明90Y-DOTA-3H11在三種介質(zhì)中的穩(wěn)定性示意圖；圖6為抗體偶聯(lián)前后免疫活性對(duì)比示意圖；圖7為本發(fā)明90Y-DOTA-3H11的放射免疫活性分?jǐn)?shù)示意圖；圖8為本發(fā)明90Y-DOTA-3H11小鼠血液藥代動(dòng)力學(xué)曲線圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一一種用于胃癌治療的藥物，包括抗體及放射性核素，所述抗體為單克隆抗體3H11，所述放射性核素通過一個(gè)雙功能連接劑標(biāo)記所述單克隆抗體3H11，所述放射性核素標(biāo)記的單克隆抗體3H11為無(wú)色液體針劑。
本發(fā)明中，所述單克隆抗體3H11包括鼠源性抗體及片斷，基因工程制備的單鏈抗體(ScFv)、雙鏈抗體(Diabody)、小型化抗體(Minibody)及嵌合抗體(Chimeric)。
本發(fā)明中，所述放射性核素為90Y，所述雙功能連接劑為DOTA(1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-N′，N″，N，N′-四乙酸，1，4，7，10-tetraazacyclododecanetetraaceticacid)，所述放射性核素標(biāo)記的單克隆抗體為90Y-DOTA-3H11。
本發(fā)明中，所述雙功能連接劑包括DOTA的衍生物。
本發(fā)明中，所述雙功能連接劑包括DTPA(二乙烯三胺五乙酸，diethylenetriaminepentaacetic acid)。
本發(fā)明中，所述雙功能連接劑包括DTPA的衍生物。
以DOTA-NHS和90Y為例，90Y-DOTA-3H11的制備和分析如下將1.2mL抗體3H11(5.0mg/mL)和1mL 1.0mM乙二胺四乙酸(EDTA)分別加入到超濾離心管中(Centricon-30，10K，Amicon)，在4℃條件下以每分鐘5000轉(zhuǎn)的速度離心45分鐘，離心管中溶液約剩0.2mL。然后向離心管加入Na2HPO4溶液(pH7.5，0.1M，含0.15mM NaCl)2.0mL，在4℃條件下以每分鐘5000轉(zhuǎn)的速度離心45分鐘，重復(fù)該過程3次。將抗體取出加Na2HPO4溶液(pH7.5，0.1M)稀釋至0.5mL，于紫外280nm測(cè)量抗體濃度后4℃保存。
抗體預(yù)處理的目的為調(diào)節(jié)pH值并去除抗體溶液中的各種雜質(zhì)。與DOTA-NHS偶聯(lián)時(shí)反應(yīng)溶液的最佳pH值為7.5。加入1.0mM EDTA的作用為絡(luò)合抗體溶液中的其它金屬離子，通過超濾離心使其去除?？贵w預(yù)處理后的收率為83％，抗體濃度為10.0mg/mL。
用無(wú)水二甲基甲酰胺(DMF)溶解1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-N′，N″，N，N′-四乙酸-N-羥基硫代琥珀酰亞胺酯(DOTA-NHS，N-Hydroxysulfosuccinimidyl-1，4，7，10-tetraazacyclododecanetetraacetic acid)，配制濃度為33.45g/L的溶液。取10μL(0.667μmol，0.3345mg)分兩次加入到0.5mL上述3H11抗體(10.0mg/mL，0.0333μmol)中，避光條件下4℃反應(yīng)12小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)移反應(yīng)溶液于透析卡(Slide-A-Lyzer，10K，Pierce)中，在1.0L Na2HPO4溶液(pH7.5，0.1M，含0.15mM NaCl)中4℃條件下透析24小時(shí)。然后用1.0L NH4OAc溶液(pH7.0，0.05M)4℃條件下透析處理18小時(shí)，在相同條件下再重復(fù)此透析過程3次。將透析后的3H11偶聯(lián)物(DOTA-3H11)在紫外280nm測(cè)量抗體濃度，并用HPLC方法評(píng)價(jià)純度。用NH4OAc溶液(pH7.0，0.05M)稀釋DOTA-3H11至2.8mg/mL，4℃保存待用。
參見圖1，圖1為本發(fā)明DOTA偶聯(lián)單抗3H11在透析前后的HPLC分析圖，其中，(a)為透析純化前偶聯(lián)物在紫外280nm吸收曲線，(b)為透析純化后偶聯(lián)物在紫外280nm吸收曲線；如圖1所示，HPLC分析顯示透析后的偶聯(lián)抗體未見DOTA-NHS的紫外吸收，說明沒有游離的DOTA。
90Y標(biāo)記DOTA-3H11及純化采用以下方法取50μLDOTA-3H11加入到100μL醋酸鈉緩沖液(pH5.2，0.2M)中，再加入10μL90YCl3(溶于0.04M HCl溶液中)，43℃反應(yīng)1小時(shí)，然后加入20μLEDTA(pH5.0，6.0mM)，室溫反應(yīng)10分鐘。將反應(yīng)物通過PD-10柱(G-25 Sephadex，Pharmacia)純化，以PBS(pH7.5，0.1M)為淋洗液，純化后收集標(biāo)記物并測(cè)量放射化學(xué)純度。
采用以下方法對(duì)所述放射性藥物90Y-DOTA-3H11的標(biāo)記率及純化后的放射化學(xué)純度進(jìn)行測(cè)定1.ITLC方法10μL標(biāo)記物中加入20μLEDTA(pH5.0，6.0mM)，室溫反應(yīng)10分鐘，取1μL點(diǎn)樣于ITLC-SG上，然后在10.0mM EDTA展開液中上行展開10cm，其中90Y-DOTA-3H11保留在原點(diǎn)(Rf＝0.0)，90Y-EDTA展至前沿(Rf＝0.9-1.0)。
2.HPLC方法10μL標(biāo)記物中加入20μLEDTA(pH5.0，6.0mM)，室溫反應(yīng)10分鐘，取20μL上樣HPLC，色譜柱為TSK G3000 WXL(7.8×300mm，TosoHaas)，磷酸緩沖液(pH6.5，0.02M，含有0.9％NaCl及0.05％NaN3)為流動(dòng)相，流速1.0mL/min。90Y-DOTA-3H11的保留時(shí)間為8.2min，90Y-EDTA的保留時(shí)間為12.3min。
反應(yīng)pH值、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度及抗體濃度均對(duì)標(biāo)記率有影響。參見圖2，圖2為本發(fā)明反應(yīng)pH值對(duì)標(biāo)記率影響的示意圖，當(dāng)反應(yīng)pH值為5.2時(shí)，可以獲得最高的標(biāo)記率。參見圖3，圖3為本發(fā)明反應(yīng)溫度及時(shí)間對(duì)標(biāo)記率影響的示意圖，反應(yīng)溫度對(duì)標(biāo)記率的影響很大，43℃時(shí)溫育后1小時(shí)標(biāo)記率接近最高，并隨著時(shí)間的增加趨于平緩，而在室溫和4℃條件下溫育3小時(shí)后標(biāo)記率仍不到20％。參見圖4，圖4為本發(fā)明抗體濃度對(duì)標(biāo)記率影響的示意圖，標(biāo)記率隨著抗體濃度的增加而增大，當(dāng)抗體終濃度大于1.0mg/mL時(shí)，可獲得較高的標(biāo)記率。
90Y-DOTA-3H11的標(biāo)記率大于90％，純化后的放射化學(xué)純度大于99％。
90Y-DOTA-3H11的體外穩(wěn)定性采用以下方法測(cè)定取50μL標(biāo)記物分別加入到100μL以下3種體系中生理鹽水(0.9％NaCl)、EDTA(pH5.0，10.0mM)、裸鼠血清(Nude Mice Serum，NMS)。37℃振搖溫育，分別于0、3、15、24、36、48、70、148小時(shí)取樣，通過ITLC方法測(cè)量放射化學(xué)純度，評(píng)價(jià)標(biāo)記物的體外穩(wěn)定性。參見圖5，圖5為本發(fā)明標(biāo)記物在三種介質(zhì)中的穩(wěn)定性示意圖，該圖顯示90Y-DOTA-3H11在體外有很好的穩(wěn)定性，溫育148小時(shí)，標(biāo)記物在三種介質(zhì)中的放化純均大于90％。
免疫活性檢測(cè)可以采用以下方法參見圖6，圖6為抗體偶聯(lián)前后免疫活性對(duì)比示意圖，使用ELISA方法檢測(cè)DOTA-3H11的免疫活性，發(fā)現(xiàn)DOTA-3H11較3H11免疫活性有一定程度的降低，偶聯(lián)后免疫活性下降了20％-30％。
90Y-DOTA-3H11的放射免疫活性檢測(cè)參照Lindmo方法，即7×107個(gè)BGC823細(xì)胞以每分鐘1000轉(zhuǎn)的速度離心5分鐘，用含有1％BSA的PBS(pH7.4，0.01M)洗兩遍，再用含有1％BSA的PBS倍比稀釋5個(gè)滴度；標(biāo)記物稀釋至40μg/L。將細(xì)胞和標(biāo)記物混合，在37℃溫育2小時(shí)，測(cè)量總放射性計(jì)數(shù)(T)和沉淀細(xì)胞的放射性計(jì)數(shù)(B)，計(jì)算不同濃度細(xì)胞數(shù)對(duì)應(yīng)的T/B值。以T/B值對(duì)細(xì)胞濃度倒數(shù)(1/F)作圖，所得曲線的延長(zhǎng)線于y軸的截距的倒數(shù)即為標(biāo)記物保留的放射免疫活性分?jǐn)?shù)。參見圖7，圖7為本發(fā)明90Y-DOTA-3H11的放射免疫活性分?jǐn)?shù)示意圖，計(jì)算求得標(biāo)記物的放射免疫活性分?jǐn)?shù)為72.4％，說明標(biāo)記物保持了良好的免疫活性。
90Y-DOTA-3H11在荷人胃癌裸鼠體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果如下將BALB/C荷人胃癌裸鼠隨機(jī)分3組，每組5只，取100μL90Y-DOTA-3H11(～185kBq)及陰性對(duì)照100μL90Y-DOTA-IgG(～185kBq)經(jīng)尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)(90Y-DOTA-3H11兩組，90Y-DOTA-IgG一組)，并于注射后4和24小時(shí)處死小鼠，取血及主要臟器，稱重并測(cè)量放射性計(jì)數(shù)，經(jīng)衰變校正后計(jì)算每克組織百分注射劑量率(％ID/g)。
表一列出90Y-DOTA-3H11及陰性對(duì)照90Y-DOTA-IgG在荷瘤裸鼠體內(nèi)分布數(shù)據(jù)。90Y為親骨核素，當(dāng)它在體內(nèi)脫落后會(huì)濃聚在骨組織中，本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，骨中的放射性濃度隨著時(shí)間的延長(zhǎng)并沒有出現(xiàn)增高的趨勢(shì)，并且較其它組織沒有明顯的偏高，說明制備的90Y-DOTA-3H11具有良好的體內(nèi)穩(wěn)定性。與陰性對(duì)照組相比，注射后24小時(shí)腫瘤對(duì)90Y-DOTA-3H11的攝取明顯高于對(duì)照組，說明90Y-DOTA-3H11保持了良好的免疫活性，對(duì)人胃癌腫瘤細(xì)胞具有良好的親和力。
表一90Y-DOTA-3H11及90Y-DOTA-IgG荷瘤裸鼠分布(n＝5，％ID/g±SD)

90Y-DOTA-3H11藥代動(dòng)力學(xué)測(cè)試方法如下選取狀態(tài)良好的BALB/C小白鼠12只，每只小鼠經(jīng)尾靜脈注射100μL90Y-DOTA-3H11(～185kBq)，分別于注射后10分鐘、1、2、4、6、8、12、20、24、35和48小時(shí)于眼眶后靜脈采血，稱重并測(cè)量放射性計(jì)數(shù)，經(jīng)衰變校正后計(jì)算％ID/g。參見圖8，圖8為本發(fā)明90Y-DOTA-3H11小鼠血液藥代動(dòng)力學(xué)曲線圖，采用Prism4.0軟件擬合，藥代動(dòng)力學(xué)符合二室模型，計(jì)算血漿清除參數(shù)分別為T1/2α＝1.5h，T1/2β＝70.2h。
DOTA的衍生物以及DTPA及其衍生物與抗體3H11的偶聯(lián)和純化方法與DOTA與抗體3H11的偶聯(lián)和純化方法相同，對(duì)所形成的抗體偶聯(lián)物的90Y標(biāo)記方法及質(zhì)控方法與上述90Y-DOTA-3H11的標(biāo)記方法和質(zhì)控方法相同。
90Y-DOTA-3H11的用藥劑量將根據(jù)核醫(yī)學(xué)臨床顯像結(jié)果進(jìn)行劑量計(jì)算后確定。
實(shí)施例二本實(shí)施例是用另一種放射性核素標(biāo)記所述單克隆抗體3H11，所述放射性核素為177Lu(镥-177)，所述雙功能連接劑為DOTA(1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-N′，N″，N，N″″-四乙酸，1，4，7，10-tetraazacyclododecanetetraacetic acid)，所述放射性藥物為177Lu-DOTA-3H11。
本發(fā)明中，所述雙功能連接劑包括DOTA的衍生物。
本發(fā)明中，所述雙功能連接劑包括DTPA(二乙烯三胺五乙酸，diethylenetriaminepentaacetic acid)。
本發(fā)明中，所述雙功能連接劑包括DTPA的衍生物。
177Lu-DOTA-3H11的制備及質(zhì)控方法與90Y-DOTA-3H11相同。
DOTA的衍生物以及DTPA及其衍生物與抗體3H11的偶聯(lián)和純化方法與DOTA與抗體3H11的偶聯(lián)和純化方法相同，對(duì)所形成的抗體偶聯(lián)物的177Lu標(biāo)記方法及質(zhì)控方法與上述90Y-DOTA-3H11的標(biāo)記方法和質(zhì)控方法相同。
177Lu-DOTA-3H11的用藥劑量將根據(jù)核醫(yī)學(xué)臨床顯像結(jié)果進(jìn)行劑量計(jì)算后確定。
實(shí)施例三一種用于胃癌治療的藥物的制備方法，具體步驟如下I、將1.2mL濃度為5.0mg/mL的單克隆抗體3H11溶液和1mL濃度為1.0mM的EDTA溶液分別加入到超濾離心管中，在4℃條件下以每分鐘5000轉(zhuǎn)的速度離心45分鐘；II、向所述超濾離心管中加入pH值為7.5，濃度為0.1M的Na2HPO4溶液2.0mL，第二次在4℃條件下以每分鐘5000轉(zhuǎn)的速度離心45分鐘；III、向所述超濾離心管中加入pH值為7.5，濃度為0.1M的Na2HPO4溶液2.0mL，第三次在4℃條件下以每分鐘5000轉(zhuǎn)的速度離心45分鐘；IV、向所述超濾離心管中加入pH值為7.5，濃度為0.1M的Na2HPO4溶液2.0mL，第四次在4℃條件下以每分鐘5000轉(zhuǎn)的速度離心45分鐘；V、將超濾離心處理的單克隆抗體3H11溶液取出超濾離心管，在該單克隆抗體3H11溶液中加入Na2HPO4溶液稀釋至0.5mL，測(cè)量該溶液中單克隆抗體3H11的濃度并保存數(shù)據(jù)，在4℃條件下保存該抗體溶液，所述Na2HPO4溶液的pH值為7.5，濃度為0.1M，所述Na2HPO4溶液中含0.15mM NaCl；VI、用DMF溶解DOTA-NHS，配制成濃度為33.45g/L的溶液；取該溶液10μL分兩次加入到0.5mL的上述經(jīng)超濾離心處理的單克隆抗體3H11溶液中，該混和液在避光4℃條件下反應(yīng)12小時(shí)，獲得反應(yīng)溶液；VII、將所述反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)移到透析卡中，在1.0L Na2HPO4溶液中透析處理24小時(shí)，透析處理溫度為4℃，所述Na2HPO4溶液的pH值為7.5，濃度為0.1M，所述Na2HPO4溶液中含0.15mM NaCl；VIII、將經(jīng)過一次透析處理的所述反應(yīng)溶液使用1.0L NH4OAc溶液進(jìn)行第二次透析處理，透析處理時(shí)間為18小時(shí)，透析處理溫度為4℃；在相同條件下再重復(fù)所述透析過程3次；透析處理完成后，獲得DOTA-3H11溶液；在DOTA-3H11溶液中加入NH4OAc溶液進(jìn)行濃度調(diào)節(jié)，獲得濃度為2.8mg/mL的偶聯(lián)物DOTA-3H11溶液，所述的NH4OAc溶液的pH值為7.0、濃度為0.05M；對(duì)該溶液中偶聯(lián)物DOTA-3H11的濃度進(jìn)行測(cè)量并保存數(shù)據(jù)，在4℃條件下保存該偶聯(lián)物溶液；IX、將50μL的所述偶聯(lián)物DOTA-3H11溶液和100μL醋酸鈉緩沖液加入到反應(yīng)管中，所述醋酸鈉緩沖液的pH值為5.2、濃度為0.2M，再加入10μL90YCl3溶液或10μL177LuCl3溶液，所述90YCl3或177LuCl3溶于0.04M HCl溶液中；該混和液在43℃條件下反應(yīng)1小時(shí)，然后加入20μLEDTA，所述EDTA的pH值為5.0、濃度為6.0mM，在室溫(20℃-25℃)條件下反應(yīng)10分鐘；將反應(yīng)物通過PD-10柱純化，獲得放射化學(xué)純度大于99％的放射性藥物90Y-DOTA-3H11或177Lu-DOTA-3H11。
在本實(shí)施例中，所使用的單克隆抗體3H11是溶于PBS溶液，其濃度為5.0mg/mL。所使用的EDTA是乙二胺四乙酸溶液，其pH值為5.0，濃度為6.0mM，是常規(guī)試劑。所使用的DMF是無(wú)水二甲基甲酰胺溶液，是常規(guī)試劑。所使用的DOTA-NHS是雙功能連接劑，其中文名稱為1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-N′，N″，N，N″″-四乙酸-N-羥基硫代琥珀酰亞胺酯，其英文名稱為N-Hydroxysulfosuccinimidyl-1，4，7，10-tetraazacyclododecanetetraacetic acid，購(gòu)于美國(guó)Macrocyclic公司。所述PD-10柱是常規(guī)實(shí)驗(yàn)材料，從Pharmacia公司購(gòu)買。所述超濾離心管是常規(guī)實(shí)驗(yàn)材料，從Amicon公司購(gòu)買。
實(shí)施例四I、將1.2mL濃度為5.0mg/mL的單克隆抗體3H11溶液和1mL濃度為1.0mM的EDTA溶液分別加入到超濾離心管中，在4℃條件下以每分鐘5000轉(zhuǎn)的速度離心45分鐘；II、向所述超濾離心管中加入pH值為7.5，濃度為0.1M的Na2HPO4溶液2.0mL，第二次在4℃條件下以每分鐘5000轉(zhuǎn)的速度離心45分鐘；III、向所述超濾離心管中加入pH值為7.5，濃度為0.1M的Na2HPO4溶液2.0mL，第三次在4℃條件下以每分鐘5000轉(zhuǎn)的速度離心45分鐘；
IV、向所述超濾離心管中加入pH值為7.5，濃度為0.1M的Na2HPO4溶液2.0mL，第四次在4℃條件下以每分鐘5000轉(zhuǎn)的速度離心45分鐘；V、將超濾離心處理的單克隆抗體3H11溶液取出超濾離心管，在該單克隆抗體3H11溶液中加入Na2HPO4溶液稀釋至0.5mL，測(cè)量該溶液中單克隆抗體3H11的濃度并保存數(shù)據(jù)，在4℃條件下保存該抗體溶液，所述Na2HPO4溶液的pH值為7.5，濃度為0.1M，所述Na2HPO4溶液中含0.15mM NaCl；VI、用DMF溶解DTPA衍生物，配制成濃度為33.45g/L的溶液；取該溶液10μL分兩次加入到0.5mL的上述經(jīng)超濾離心處理的單克隆抗體3H11溶液中，該混和液在避光4℃條件下反應(yīng)12小時(shí)，獲得反應(yīng)溶液；VII、將所述反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)移到透析卡中，在1.0L Na2HPO4溶液中透析處理24小時(shí)，透析處理溫度為4℃，所述Na2HPO4溶液的pH值為7.5，濃度為0.1M，所述Na2HPO4溶液中含0.15mM NaCl；VIII、將經(jīng)過一次透析處理的所述反應(yīng)溶液使用1.0L NH4OAc溶液進(jìn)行第二次透析處理，透析處理時(shí)間為18小時(shí)，透析處理溫度為4℃；在相同條件下再重復(fù)所述透析過程3次；透析處理完成后，獲得DTPA-3H11溶液；在DTPA-3H11溶液中加入NH4OAc溶液進(jìn)行濃度調(diào)節(jié)，獲得濃度為2.8mg/mL的偶聯(lián)物DTPA-3H11溶液，所述的NH4OAc溶液的pH值為7.0、濃度為0.05M；對(duì)該溶液中偶聯(lián)物DTPA-3H11的濃度進(jìn)行測(cè)量并保存數(shù)據(jù)，在4℃條件下保存該偶聯(lián)物溶液；IX、將50μL的所述偶聯(lián)物DTPA-3H11溶液和100μL醋酸鈉緩沖液加入到反應(yīng)管中，所述醋酸鈉緩沖液的pH值為5.2、濃度為0.2M，再加入10μL90YCl3溶液或10μL177LuCl3溶液，所述90YCl3或177LuCl3溶于0.04M HCl溶液中；該混和液在室溫條件下反應(yīng)30分鐘，然后加入20μLEDTA，所述EDTA的pH值為5.0、濃度為6.0mM，在室溫條件下反應(yīng)10分鐘；將反應(yīng)物通過PD-10柱純化，獲得放射化學(xué)純度大于99％的放射性藥物90Y-DTPA-3H11或177Lu-DTPA-3H11。
在本實(shí)施例中，所使用的單克隆抗體3H11是溶于PBS的溶液，其濃度為5.0mg/mL。所使用的EDTA是乙二胺四乙酸溶液，其pH值為5.0，濃度為6.0mM，是常規(guī)試劑。所使用的DMF是無(wú)水二甲基甲酰胺溶液，是常規(guī)試劑。所使用的DTPA衍生物購(gòu)于美國(guó)Macrocyclic公司。所述PD-10柱是常規(guī)實(shí)驗(yàn)材料，從Pharmacia公司購(gòu)買。所述超濾離心管是常規(guī)實(shí)驗(yàn)材料，從Amicon公司購(gòu)買。
權(quán)利要求
1.一種用于胃癌治療的藥物，包括抗體及放射性核素，其特征在于所述抗體為單克隆抗體3H11，所述放射性核素通過一個(gè)雙功能連接劑標(biāo)記所述單克隆抗體3H11，所述放射性核素標(biāo)記的單克隆抗體3H11為無(wú)色液體針劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于胃癌治療的藥物，其特征在于所述單克隆抗體3H11包括鼠源性抗體及片斷，基因工程制備的單鏈抗體、雙鏈抗體、小型化抗體及嵌合抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于胃癌治療的藥物，其特征在于所述放射性核素為90Y，所述雙功能連接劑為DOTA，所述放射性核素標(biāo)記的單克隆抗體為90Y-DOTA-3H11。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于胃癌治療的藥物，其特征在于所述放射性核素為177Lu，所述雙功能連接劑為DOTA，所述放射性核素標(biāo)記的單克隆抗體為177Lu-DOTA-3H11。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的用于胃癌治療的藥物，其特征在于所述雙功能連接劑包括DOTA的衍生物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于胃癌治療的藥物，其特征在于所述放射性核素為90Y，所述雙功能連接劑為DTPA，所述放射性核素標(biāo)記的單克隆抗體為90Y-DTPA-3H11。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于胃癌治療的藥物，其特征在于所述放射性核素為177Lu，所述雙功能連接劑為DTPA，所述放射性核素標(biāo)記的單克隆抗體為177Lu-DTPA-3H11。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的用于胃癌治療的藥物，其特征在于所述雙功能連接劑包括DTPA的衍生物。
9.一種用于胃癌治療的藥物的制備方法，其特征在于I、將1.2mL濃度為5.0mg/mL的單克隆抗體3H11溶液和1mL濃度為1.0mM的EDTA溶液分別加入到超濾離心管中，在4℃條件下以每分鐘5000轉(zhuǎn)的速度離心45分鐘；II、向所述超濾離心管中加入pH值為7.5，濃度為0.1M的Na2HPO4溶液2.0mL，第二次在4℃條件下以每分鐘5000轉(zhuǎn)的速度離心45分鐘；III、向所述超濾離心管中加入pH值為7.5，濃度為0.1M的Na2HPO4溶液2.0mL，第三次在4℃條件下以每分鐘5000轉(zhuǎn)的速度離心45分鐘；IV、向所述超濾離心管中加入pH值為7.5，濃度為0.1M的Na2HPO4溶液2.0mL，第四次在4℃條件下以每分鐘5000轉(zhuǎn)的速度離心45分鐘；V、將超濾離心處理的單克隆抗體3H11溶液取出超濾離心管，在該單克隆抗體3H11溶液中加入Na2HPO4溶液稀釋至0.5mL，測(cè)量該溶液中單克隆抗體3H11的濃度并保存數(shù)據(jù)，在4℃條件下保存該抗體溶液，所述Na2HPO4溶液的pH值為7.5，濃度為0.1M，所述Na2HPO4溶液中含0.15mM NaCl；VI、用DMF溶解DOTA-NHS，配制成濃度為33.45g/L的溶液；取該溶液10μL分兩次加入到0.5mL的上述經(jīng)超濾離心處理的單克隆抗體3H11溶液中，該混和液在避光4℃條件下反應(yīng)12小時(shí)，獲得反應(yīng)溶液；VII、將所述反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)移到透析卡中，在1.0L Na2HPO4溶液中透析處理24小時(shí)，透析處理溫度為4℃，所述Na2HPO4溶液的pH值為7.5，濃度為0.1M，所述Na2HPO4溶液中含0.15mM NaCl；VIII、將經(jīng)過一次透析處理的所述反應(yīng)溶液使用1.0L NH4OAc溶液進(jìn)行第二次透析處理，透析處理時(shí)間為18小時(shí)，透析處理溫度為4℃；在相同條件下再重復(fù)所述透析過程3次；透析處理完成后，獲得DOTA-3H11溶液；在DOTA-3H11溶液中加入NH4OAc溶液進(jìn)行濃度調(diào)節(jié)，獲得濃度為2.8mg/mL的偶聯(lián)物DOTA-3H11溶液，所述的NH4OAc溶液的pH值為7.0、濃度為0.05M；對(duì)該溶液中偶聯(lián)物DOTA-3H11的濃度進(jìn)行測(cè)量并保存數(shù)據(jù)，在4℃條件下保存該偶聯(lián)物溶液；IX、將50μL的所述偶聯(lián)物DOTA-3H11溶液和100μL醋酸鈉緩沖液加入到反應(yīng)管中，所述醋酸鈉緩沖液的pH值為5.2、濃度為0.2M，再加入10μL90YCl3溶液或10μL177LuCl3溶液，所述90YCl3或177LuCl3溶于0.04M HCl溶液中；該混和液在43℃條件下反應(yīng)1小時(shí)，然后加入20μL EDTA，所述EDTA的pH值為5.0、濃度為6.0mM，在室溫條件下反應(yīng)10分鐘；將反應(yīng)物通過PD-10柱純化，獲得放射化學(xué)純度大于99％的放射性藥物90Y-DOTA-3H11或177Lu-DOTA-3H11。
10.一種用于胃癌治療的藥物的制備方法，其特征在于I、將1.2mL濃度為5.0mg/mL的單克隆抗體3H11溶液和1mL濃度為1.0mM的EDTA溶液分別加入到超濾離心管中，在4℃條件下以每分鐘5000轉(zhuǎn)的速度離心45分鐘；II、向所述超濾離心管中加入pH值為7.5，濃度為0.1M的Na2HPO4溶液2.0mL，第二次在4℃條件下以每分鐘5000轉(zhuǎn)的速度離心45分鐘；III、向所述超濾離心管中加入pH值為7.5，濃度為0.1M的Na2HPO4溶液2.0mL，第三次在4℃條件下以每分鐘5000轉(zhuǎn)的速度離心45分鐘；IV、向所述超濾離心管中加入pH值為7.5，濃度為0.1M的Na2HPO4溶液2.0mL，第四次在4℃條件下以每分鐘5000轉(zhuǎn)的速度離心45分鐘；V、將超濾離心處理的單克隆抗體3H11溶液取出超濾離心管，在該單克隆抗體3H11溶液中加入Na2HPO4溶液稀釋至0.5mL，測(cè)量該溶液中單克隆抗體3H11的濃度并保存數(shù)據(jù)，在4℃條件下保存該抗體溶液，所述Na2HPO4溶液的pH值為7.5，濃度為0.1M，所述Na2HPO4溶液中含0.15mM NaCl；VI、用DMF溶解DTPA衍生物，配制成濃度為33.45g/L的溶液；取該溶液10μL分兩次加入到0.5mL的上述經(jīng)超濾離心處理的單克隆抗體3H11溶液中，該混和液在避光4℃條件下反應(yīng)12小時(shí)，獲得反應(yīng)溶液；VII、將所述反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)移到透析卡中，在1.0L Na2HPO4溶液中透析處理24小時(shí)，透析處理溫度為4℃，所述Na2HPO4溶液的pH值為7.5，濃度為0.1M，所述Na2HPO4溶液中含0.15mM NaCl；VIII、將經(jīng)過一次透析處理的所述反應(yīng)溶液使用1.0L NH4OAc溶液進(jìn)行第二次透析處理，透析處理時(shí)間為18小時(shí)，透析處理溫度為4℃；在相同條件下再重復(fù)所述透析過程3次；透析處理完成后，獲得DTPA-3H11溶液；在DTPA-3H11溶液中加入NH4OAc溶液進(jìn)行濃度調(diào)節(jié)，獲得濃度為2.8mg/mL的偶聯(lián)物DTPA-3H11溶液，所述的NH4OAc溶液的pH值為7.0、濃度為0.05M；對(duì)該溶液中偶聯(lián)物DTPA-3H11的濃度進(jìn)行測(cè)量并保存數(shù)據(jù)，在4℃條件下保存該偶聯(lián)物溶液；IX、將50μL的所述偶聯(lián)物DTPA-3H11溶液和100μL醋酸鈉緩沖液加入到反應(yīng)管中，所述醋酸鈉緩沖液的pH值為5.2、濃度為0.2M，再加入10μL90YCl3溶液或10μL177LuCl3溶液，所述90YCl3或177LuCl3溶于0.04M HCl溶液中；該混和液在室溫條件下反應(yīng)30分鐘，然后加入20μLEDTA，所述EDTA的pH值為5.0、濃度為6.0mM，在室溫條件下反應(yīng)10分鐘；將反應(yīng)物通過PD-10柱純化，獲得放射化學(xué)純度大于99％的放射性藥物90Y-DTPA-3H11或177Lu-DTPA-3H11。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于胃癌治療的藥物及其制備方法，該藥物包括抗體及放射性核素，抗體為單克隆抗體3H11，放射性核素通過一個(gè)雙功能連接劑標(biāo)記所述單克隆抗體3H11。由于腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)特異抗原，利用抗體和抗原的特異性結(jié)合，通過抗體將放射性核素載帶到腫瘤部位，并利用放射性核素衰變釋放的β－粒子殺傷癌細(xì)胞以達(dá)到治療的目的。本發(fā)明采用間接標(biāo)記法，即在單克隆抗體和放射性核素之間引入一個(gè)雙功能連接劑。這既可減小對(duì)抗體活性的影響，又可增強(qiáng)放射性藥物的穩(wěn)定性，同時(shí)提高腫瘤對(duì)放射性藥物的攝取。與非放射性藥物相比，放射性藥物不僅能殺傷實(shí)體瘤表面的腫瘤細(xì)胞，同時(shí)通過放射性β－粒子殺傷實(shí)體瘤內(nèi)部的腫瘤細(xì)胞，具有更強(qiáng)的殺傷力。
文檔編號(hào)A61P35/00GK101091799SQ20061008896
公開日2007年12月26日 申請(qǐng)日期2006年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月27日
發(fā)明者王凡, 賈兵, 楊志 申請(qǐng)人:北京大學(xué)