專利名稱：非受體酪氨酸激酶c－Abl特異性抑制劑的新用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及非受體酪氨酸激酶c-Abl特異性抑制劑的新用途，特別是涉及非受體酪氨酸激酶c-Abl特異性抑制劑在制備抗腫瘤藥物中的應用。
背景技術：
根據(jù)病人的遺傳背景和發(fā)病的分子機理進行腫瘤的個體化治療是腫瘤治療的發(fā)展方向。Galectin 3(Gal3)是β-半乳糖苷結合蛋白，具有多種生物功能，作為一種癌癥相關蛋白參與腫瘤細胞的黏附、增殖、分化、血管生成、惡化及轉移。臨床研究表明，在許多類型的組織細胞中，當細胞發(fā)生惡性轉化時，Gal3的表達量上調(例如在結腸、甲狀腺、中樞神經系統(tǒng)、胰腺、膀胱、腎臟、胃等器官的癌癥)，而且，腫瘤細胞中Gal3表達水平上調會使腫瘤的惡性程度和轉移侵潤能力也隨之增強。因此認為Gal3是一種癌癥相關蛋白，在致癌作用和腫瘤進程中起到重要作用。Gal3的抗凋亡活性表現(xiàn)在能夠抑制藥物誘導的細胞凋亡和錨著依賴性細胞凋亡從而使細胞存活。研究結果顯示，腫瘤細胞能夠分泌Gal3，分泌的Gal3通過與T細胞表面受體結合可誘導T細胞的凋亡，從而起到免疫逃避的作用，這樣使得腫瘤細胞在發(fā)展進程中能夠逃避T細胞的捕殺。目前，Gal3作為免疫細胞化學臨床檢測的一項指標，對腫瘤細胞的良惡性診斷和癌癥預后診斷都具有一定價值。因此，在多種類型的癌癥診斷和治療方面，Gal3作為一個新的靶標具有非常好的應用前景。
蛋白酪氨酸激酶是一類具有酪氨酸激酶活性的蛋白質，可分為受體型和非受體型兩種，它們能催化ATP上的磷酸基轉移到許多重要蛋白質的酪氨酸殘基上，使其發(fā)生磷酸化。蛋白酪氨酸激酶在細胞內的信號轉導通路中占據(jù)了十分重要的地位，調節(jié)著細胞的生長、分化、死亡等一系列生理化過程。
非受體蛋白酪氨酸激酶中的ABL家族包括兩個成員Abl和Ara。Abl基因位于9號染色體長臂(9q34.1)，編碼145kD的Abl蛋白。c-Abl蛋白具有酪氨酸激酶活性，含有SH3、SH2、PTK、DNA結合域、肌動蛋白結合結構域等(Blume-Jensen P，HunterT.Oncogenic kinase signalling.Nature，2001，411(6835)355-65)。
非受體酪氨酸激酶c-Abl特異性抑制劑可使普遍存在的Abelson酪氨酸激酶(Abl)失活。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供非受體酪氨酸激酶c-Abl特異性抑制劑的新用途，即在制備抗腫瘤藥物或腫瘤治療輔助藥物中的應用。
本發(fā)明所述的應用是以非受體酪氨酸激酶c-Abl特異性抑制劑為活性成分在制備抗腫瘤藥物或腫瘤治療輔助藥物中的應用所述非受體酪氨酸激酶c-Abl特異性抑制劑的選擇是多種多樣的，如STI571、Sunitinib、PKC412、vandetanib、Sorafenib、erlotinib、gefitinib或dasatinib等。
為提高抑瘤效果，在用非受體酪氨酸激酶c-Abl特異性抑制劑制備的抗腫瘤藥物或腫瘤治療輔助藥物中還可添加化療藥物如順鉑。
研究表明，Galectin 3在腫瘤細胞中廣泛表達，因而非受體酪氨酸激酶c-Abl特異性抑制劑具有廣譜的抑腫瘤作用，包括乳腺癌、前列腺癌，宮頸癌，肺腺癌，肝癌，結腸癌、甲狀腺癌、胰腺癌、神經內分泌腫瘤、膀胱癌、腎癌和胃癌等。
需要的時候，在本發(fā)明所述應用中還可以加入一種或多種藥學上可接受的輔料，所述輔料包括藥學領域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、吸收促進劑、表面活性劑、潤滑劑、穩(wěn)定劑等，必要時還可加入香味劑、甜味劑及色素等。
本發(fā)明所述應用除制成口服液外，還可以制成膠囊劑、片劑、粉劑、粒劑、注射液等多種藥物形式。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學領域的常規(guī)方法制備。
該藥物的成人口服用量一般為400mg/kg/d，可以一次或多次使用，療程為20天-30天。
本發(fā)明提供了一種非受體酪氨酸激酶c-Abl特異性抑制劑的新用途，即在制備抗腫瘤藥物或腫瘤治療輔助藥物中的應用。實驗證明非受體酪氨酸激酶c-Abl特異性抑制劑通過抑制c-Abl的激酶活性可導致Gal3發(fā)生變性聚集并通過溶酶體降解，致使腫瘤細胞中Gal3蛋白水平顯著降低，從而使腫瘤細胞發(fā)生自噬性細胞凋亡而死亡。同時，非受體酪氨酸激酶c-Abl特異性抑制劑還可使腫瘤細胞對多種腫瘤治療藥物極為敏感，短時間內低濃度的凋亡誘導劑即可使細胞全部死亡，因而非受體酪氨酸激酶c-Abl特異性抑制劑可增強現(xiàn)有細胞毒類化療藥物的治療效果，并可通過降低化療藥物的使用劑量，使毒副作用大大減輕。以非受體酪氨酸激酶c-Abl特異性抑制劑為活性成分制備抗腫瘤藥物具有以下優(yōu)點1)療效顯著，抑瘤率可達79.34％；2)安全性高；3)主要用藥途徑為口服，用藥方便；4)該抑制劑價格低廉，因而以其制備抗腫瘤藥物的成本較低，從而可減輕病人的經濟負擔。本發(fā)明為腫瘤的防治提供了一條新途徑，在醫(yī)藥學領域的應用前景廣闊。
下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。


圖1為非受體酪氨酸激酶c-Abl對Gal3特異性磷酸化作用的免疫沉淀及免疫印跡檢測結果圖2為非受體酪氨酸激酶c-Abl特異性抑制劑STI571對c-Abl特異磷酸化抑制作用的免疫沉淀及免疫印跡檢測結果圖3為免疫染色法檢測經10uM STI571處理的MCF-7細胞中Gal3蛋白分布情況的結果圖4為免疫染色法檢測經5uM STI571、0.5uM凋亡誘導劑STS單獨處理及兩者共同處理的MCF-7細胞中Gal3蛋白量變化的結果圖5為免疫印跡法檢測經5uM STI571、0.5uM凋亡誘導劑STS單獨處理及兩者共同處理的MCF-7細胞中Gal3蛋白量變化的結果圖6為經10uM STI571、0.5uM STS單獨處理及兩者共同處理的MCF-7細胞凋亡情況的TUNEL法檢測結果圖7為經10uM STI571、0.5uM STS單獨處理及兩者共同處理的MCF-7細胞凋亡情況的Annexin-V-FLUOS法檢測結果圖8為不同藥物處理的抑瘤率統(tǒng)計結果具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。
實施例1、檢測非受體酪氨酸激酶c-Abl對Gal3特異性磷酸化作用及非受體酪氨酸激酶c-Abl特異性抑制劑STI571對c-Abl磷酸化作用的抑制作用一、Flag-Gal3表達載體的構建1、重組載體pcDNA 3-Flag的構建將編碼Flag標簽的DNA序列(含8個氨基酸的肽段Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)克隆入載體pcDNA3(Invitrogen公司)多克隆位點的限制性內切酶Kpn I和BamH I酶切位點之間，得到含有Flag標簽編碼序列的重組載體，命名為pcDNA 3-Flag。
2、Gal3基因的PCR擴增以Gal3基因(GenBank號BC001120)為模板，在引物P1(上游引物)5’-CGGATCCATGGCAGACAATTTTTCGCTCCA-3’(帶下劃線堿基為限制性內切酶BamHI識別位點)和P2(下游引物)5’-CGGAATTCTTATATCATGGTATATGAAGCA-3’(帶下劃線堿基為限制性內切酶EcoRI識別位點)的引導下PCR擴增Gal3基因，并在基因片段的兩端分別添加限制性內切酶BamHI和EcoRI識別位點，反應結束后，對PCR擴增產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果獲得了753bp的DNA片段，與預期結果相符，回收并純化該目的片段，測序，測序結果表明獲得了序列正確的Gal3基因片段。
3、pcDNA 3-Flag-Gal3表達載體的獲得將步驟2克隆的Gal3基因片段用限制性內切酶BamHI和EcoRI進行雙酶切，將酶切片段與經相同酶雙酶切的步驟1構建的載體pcDNA 3-Flag進行連接，將連接產物用氯化鈣法轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，篩選陽性轉化子，提質粒，用限制性內切酶BamHI和EcoRI進行酶切鑒定，經酶切獲得5400bp和753bp片段的為陽性克隆，再對陽性克隆質粒用PCR的方法做進一步鑒定，所用引物為P1和P2，對PCR產物進行測序，檢測結果表明Gal3基因片段已插入pcDNA 3-Flag的BamHI和EcoRI酶切位點之間，且序列正確，將此重組表達載體命名為Flag-Gal3。Gal3基因可以在CMV啟動子的作用下表達帶有Flag標簽的融合蛋白。
二、Myc-c-Abl、Myc-c-Abl(K290R)表達載體的構建1、Myc-c-Abl表達載體的構建1)c-Abl基因的PCR擴增以野生型c-Abl基因(GenBank號NM_005157)為模板，在引物Myc-Abl-1(上游引物) (帶下劃線堿基為限制性內切酶EcoRI識別位點)和Myc-Abl-2(下游引物) (帶下劃線堿基為限制性內切酶BglI識別位點)的引導下PCR擴增c-Abl基因，并在基因片段的兩端分別添加限制性內切酶EcoRI和BglI識別位點，反應結束后，對PCR擴增產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果獲得了3393bp的DNA片段，與預期結果相符，回收并純化該目的片段，測序，測序結果表明獲得了序列正確的c-Abl基因片段。
2)Myc-c-Abl表達載體的獲得將步驟1)克隆的c-Abl基因片段用限制性內切酶EcoRI和BglI進行雙酶切，將酶切片段與經相同酶雙酶切的載體pMyc-CMV(Clotech公司)進行連接，將連接產物用氯化鈣法轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，篩選陽性轉化子，提質粒，用限制性內切酶EcoRI和BglI進行酶切鑒定，經酶切獲得3800bp和3393bp片段的為陽性克隆，再對陽性克隆質粒用PCR的方法做進一步鑒定，所用引物為Myc-Abl-1和Myc-Abl-2，對PCR產物進行測序，檢測結果表明c-Abl基因片段已插入pMyc-CMV的EcoRI和BglI酶切位點之間，且序列正確，將此重組表達載體命名為Myc-c-Abl。Abl基因可以在CMV啟動子的作用下表達帶有Myc標簽的融合蛋白。
2、Myc-c-Abl(K290R)表達載體的構建1)Myc-c-Abl(K290R)點突變基因的PCR擴增以野生型c-Abl基因(GenBank號NM_005157)為模板，在引物Myc-Abl-1 (帶下劃線堿基為限制性內切酶EcoRI識別位點)和K290R-II5’-GGTGTCCTCCTTCAAGGTCCTCACGGCCACCGTCAGGC-3’(帶下劃線堿基為突變位點)的引導下PCR擴增擴增c-Abl的5’端序列(命名為M1)，再在引物Myc-Abl-2 (帶下劃線堿基為限制性內切酶BglI識別位點)和K290R-I5’-GCCGTACGGTGGCCGTGAGGACCTTGAAGGAGGACACC-3’(帶下劃線堿基為突變位點)的引導下PCR擴增c-Abl的3’端序列(命名為M2)，反應結束后，對上述PCR擴增產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果獲得了888bp的M1片段和2405bp的M2片段，與預期結果相符，回收并純化兩個目的片段，然后，取M1和M2各1μl，混合，以此為模板，在引物Myc-Abl-1和Myc-Abl-2的引導下PCR擴增c-Abl突變基因的全序列，反應結束后，對PCR擴增產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果獲得了3393bp的DNA片段，與預期結果相符，回收并純化該目的片段。
2)Myc-c-Abl(K290R)表達載體的獲得將步驟1)克隆的c-Abl點突變基因片段用限制性內切酶EcoRI和BglI進行雙酶切，將酶切片段與經相同酶雙酶切的載體pMyc-CMV進行連接，將連接產物用氯化鈣法轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，篩選陽性轉化子，提質粒，用限制性內切酶EcoRI和BglI進行酶切鑒定，經酶切獲得3800bp和3893bp片段的為陽性克隆，再對陽性克隆質粒用PCR的方法做進一步鑒定，所用引物為Myc-Abl-1和Myc-Abl-2，對PCR產物進行測序，檢測結果表明c-Abl點突變基因片段已插入pMyc-CMV的EcoRI和BglI酶切位點之間，且序列正確，將此重組表達載體命名為Myc-c-Abl(K290R)。Abl點突變基因可以在CMV啟動子的作用下表達帶有Myc標簽的融合蛋白。
三、檢測非受體酪氨酸激酶c-Abl對Gal3的特異性磷酸化作用c-Abl作為非受體酪氨酸激酶，主要通過使蛋白質酪氨酸磷酸化調節(jié)細胞的生命過程?，F(xiàn)用免疫沉淀和免疫印跡(Western blot)的方法驗證Gal3可被c-Abl特異磷酸化，并避免另一種細胞內源性非受體酪氨酸激酶Arg的磷酸化干擾，具體方法包括以下步驟1、共轉染將pcDNA 3-Flag-Gal3分別與pCMV-Myc-c-Abl、pCMV-Myc空載體、c-Abl負顯性突變體的表達載體pCMV-Myc-c-Abl(K290R)共轉染Abl、Arg雙敲除的小鼠成纖維細胞MEF(Abl/Arg double knockout mouse embryo fibroblast cells，DKO細胞，表型為Abl-/-Arg-/-，Koleske AJ，Essential roles for the Abl and Arg tyrosine Kinasesin neurulation，Neuron 1998 Dec；21(6)1259-72)。
2、用抗-Flag抗體進行免疫沉淀(Immunoprecipitation，IP)轉染36-48小時后裂解轉染細胞，用抗-Flag抗體(M5，Sigma公司)進行免疫沉淀，該過程的所有操作應嚴格在冰浴或低溫條件進行，具體方法為收集細胞，1000g離心3分鐘，棄盡培養(yǎng)基。用5mL冰預冷的1×PBS洗滌細胞，1000g離心2分鐘，棄上清，相同方法洗三次。Φ100mm的每皿細胞需加入600μl單去污劑裂解液(50mmol/LTris·Cl，150mmol/L NaCl，0.02％疊氮鈉，1％NP-40以及蛋白酶抑制劑(Roche，Inc)1片/25mL)，Φ60mm的每皿細胞加入200μl單去污劑裂解液。將細胞與裂解液混勻，冰浴5-10分鐘，16000g離心10分鐘。小心吸取細胞裂解上清，加入10-15μl抗-Flag抗體交聯(lián)的瓊脂糖珠(Sigma)，在4℃旋轉孵育2小時，進行免疫沉淀反應。2小時后，1000g離心30秒，小心棄去上清，將IP產物用250μl裂解液洗滌三次，盡量將洗液吸凈。向IP產物中加入40μl 1×SDS凝膠上樣緩沖液，100℃水浴5分鐘，10000g離心2分鐘。取離心上清及5μl蛋白質預染Marker(Invitrogen，Inc)進行SDS-PAGE凝膠電泳，電壓設定為80-100伏。
3、轉膜電泳結束后，將蛋白轉移至硝酸纖維素膜(NC膜)，具體方法為將兩張2.5mm厚的濾紙(Bio-Rad，Inc.)及一張硝酸纖維素膜裁剪成凝膠大小，在1×轉移緩沖液(39mmol/L甘氨酸，48mmol/L Tris，0.037％ SDS以及20％甲醇)中浸泡30分鐘。隨后，自上而下按照濾紙-凝膠-硝酸纖維素膜-濾紙的順序在半干轉移儀(Bio-Rad，Inc.)上放置好，盡量趕盡夾層中的氣泡。轉膜電壓15V，2-2.5小時后將NC膜取出，加入5mL封閉液(含有5％脫脂奶粉的1×PBST)，放在平緩搖動的水平搖床上室溫溫育1小時。封閉后，用1×PBST洗膜三次，每次5-10分鐘。
4、免疫雜交用含有0.2‰疊氮鈉的PBST配制靶蛋白特異性的非標記抗磷酸化酪氨酸抗體作為一抗(anti-P-Tyr，4G10，Upstate Biotechnology，Inc.)；用含5％脫脂奶粉和0.2‰疊氮鈉的PBST配制辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗鼠抗體(HRP-mouse Ig G)作為二抗(Amersham Pharmacia Biotech，Inc)。將步驟3封閉后的NC膜與一抗在室溫溫育1小時后，用1×PBST洗膜三次，每次5-10分鐘；隨后加入酶標二抗，同樣在室溫溫育1小時后，用1×PBST洗膜三次，每次5-10分鐘。上述溫育過程均在水平搖床上進行。
5、顯色最后進行化學發(fā)光反應，方法為將含有辣根過氧化物酶底物3，3’-二氨基聯(lián)苯胺的顯色液WESTERN LIGHTNING(PerkinElmer Life Sciences，Inc.)均勻地滴在NC膜上，反應1分鐘后將顯色液吸干，用X光片進行曝光(X光片及顯影液、定影液均購自Kodak公司)。
結果如圖1所示(“+”表示轉染，“-”表示未轉染)，與pCMV-Myc空載體轉染結果相比，F(xiàn)lag-Gal3轉染細胞的表達產物可以被Myc-c-Abl的表達產物磷酸化，但是Myc-c-Abl(K290R)轉染細胞的表達產物不能被Myc-c-Abl的表達產物磷酸化，原因是Abl的K290位點是c-Abl激酶結構域中ATP結合位點的關鍵氨基酸，被突變?yōu)榫彼岷笫筩-Abl喪失酪氨酸激酶活性，上述檢測結果表明Gal3可特異性地被c-Abl磷酸化。
四、檢測非受體酪氨酸激酶c-Abl特異性抑制劑STI571對c-Abl磷酸化作用的抑制作用檢測非受體酪氨酸激酶c-Abl特異性抑制劑STI571對c-Abl磷酸化作用的抑制作用，檢測方法為將Flag-Gal3質粒轉染293細胞，24小時后用10μmol/L STI571對轉染細胞處理12小時，以用等量DMSO(STI571的溶劑)處理的轉染細胞為對照，裂解細胞，用與步驟三相同的方法進行免疫沉淀及免疫印跡檢測。
結果如圖1所示(“+”表示經STI571處理，“-”表示未經STI571處理)，等量DMSO處理的轉染細胞中Flag-Gal3的表達產物Gal3可以被酪氨酸磷酸化，但是經10μmol/L STI571處理的轉染細胞中表達的Gal3的酪氨酸磷酸化被抑制。該結果證明Gal3可以特異性的被細胞內源性c-Abl磷酸化，同時STI571對c-Abl的磷酸化作用具有抑制作用。
實施例2、檢測經STI571處理的MCF-7細胞中Gal3蛋白的變化一、檢測經10uM STI571處理的MCF-7細胞中Gal3蛋白的分布情況用免疫染色法檢測經STI571處理的MCF-7細胞中Gal3蛋白的分布情況，具體方法為將人乳腺癌細胞MCF-7接種到2個培養(yǎng)皿(Glass Bottom Culture Dishes，購自軍事醫(yī)學科學院儀器分析測試中心)中，接種量102個/皿，細胞貼壁24h后進行下述處理第一組細胞不處理，第二組細胞用10uM STI571處理18h，然后對兩組細胞進行線粒體探針(Invitrogen公司)標記將細胞培養(yǎng)皿中的DMEM培養(yǎng)液(Gibco公司)換成預熱好的已加入0.2uM mito-probe溶液的DMEM培養(yǎng)液，在37℃培養(yǎng)箱中孵育15min，然后用新鮮的DMEM培養(yǎng)液對細胞進行清洗，用含3.7％多聚甲醛的DMEM液固定細胞，在37℃培養(yǎng)箱中孵育15min，用PBS洗三次，每次5min。加入0.1％TritonX-100，室溫孵育5min，再用PBS洗三次，每次5min。然后用1％的BSA封閉1h，再用PBS洗三次，每次5min。Gal3蛋白染色和溶酶體染色一抗為分別為galectin-3(H-160)(santa cruzbiotechnology.inc)抗體和LAMP-2抗體(santa cruz biotechnology.inc)，使用時按1∶200比例進行稀釋，室溫孵育1h，用PBS洗三次，每次5min。Gal3蛋白染色二抗為FITC-rabbit(北京中杉金橋公司)，使用時按1∶200比例進行稀釋，室溫孵育1h，再用PBS洗三次，每次5min。最后進行細胞核染色，核染料Hochest33342(購自鼎國生物技術公司)的使用濃度為1ug/mL，室溫孵育30min，用PBS洗三次，每次5min。置熒光顯微鏡下觀察。
未經STI571處理的MCF-7細胞的免疫染色結果見圖3中的圖A，紅色為線粒體，綠色為Gal3，藍色為細胞核，Gal3分布于全細胞，并與線粒體有共定位；經10uM STI571處理18h后的MCF-7細胞的免疫染色結果見圖3中的圖B和圖C，Gal3蛋白發(fā)生點狀聚集，此時Gal3蛋白的聚集體與線粒體沒有共定位，而是與溶酶體共定位，即進入溶酶體。上述檢測結果表明非受體酪氨酸激酶c-Abl特異性抑制劑STI571可通過抑制c-Abl的激酶活性而導致Gal3發(fā)生變性聚集并通過溶酶體降解。
二、檢測經5uM STI571、0.5uM凋亡誘導劑STS單獨處理及兩者共同處理的MCF-7細胞中Gal3蛋白量的變化1、免疫染色檢測用免疫染色法檢測經5uM STI571、0.5uM凋亡誘導劑STS單獨處理及兩者共同處理的MCF-7細胞中Gal3蛋白量的變化，實驗分為四組第一組細胞不處理；第二組細胞經5uM STI571處理18h；第三組細胞經0.5uM凋亡誘導劑STS(strurosporine)處理150min，第四組細胞經5uM STI571處理18h后加入0.5uM STS再處理150min。免疫染色方法與步驟一相同。
結果如圖4所示(左上圖未經處理細胞，右上圖經0.5uM凋亡誘導劑STS處理150min細胞，左下圖經5uM STI571處理18h細胞，右下圖經5uM STI571處理18h后加入0.5uM STS處理150min細胞)，紅色為線粒體，綠色為Gal3，藍色為細胞核，細胞單獨用凋亡誘導劑STS處理時，細胞中Gal3沒有發(fā)生明顯變化；當用STI571處理時，細胞中Gal3發(fā)生聚集；當用STI和STS共同處理細胞時，Gal3蛋白量明顯減少。
2、免疫印跡檢測將MCF-7細胞接種到4個100mm細胞培養(yǎng)皿中，與上述免疫染色實驗相同的處理分為四組，用免疫印跡Western blot法對細胞中Gal3蛋白量的變化作進一步檢測，Gal3檢測一抗為galectin-3(B-2)(santa cruz biotechnology.inc)，二抗為HRP-mouse Ig G(santa cruz biotechnology.inc)，以β-actin作為內參(一抗為β-actin單克隆抗體(santa cruz biotechnology.inc)，二抗為HRP-mouse Ig G(santa cruzbiotechnology.inc)，以上抗體均購自友誼中聯(lián)生物科技有限公司。
結果如圖5所示(“+”表示添加，“-”表示未添加)在β-actin平衡的情況下檢測到，用STI571處理后，細胞中Gal3含量下降；用STS和STI571共同處理后Gal3蛋白幾乎全部消失；而單獨使用STS處理時，細胞中Gal3含量幾乎沒有改變。檢測結果與步驟1的免疫染色結果相符。
上述實驗結果表明，非受體酪氨酸激酶c-Abl特異性抑制劑STI571通過對c-Abl激酶活性的抑制使Gal3蛋白的激酶依賴性穩(wěn)定性喪失而發(fā)生降解，失去了Gal3作為癌癥相關蛋白的功能，從而可以抑制腫瘤細胞的黏附、增殖、分化、血管生成、惡化及轉移。
實施例3、檢測經10uM STI571、0.5uM STS單獨處理及兩者共同處理的MCF-7細胞的凋亡情況實驗分為四組第一組MCF-7細胞不處理；第二組MCF-7細胞經10uM STI571處理18h；第三組MCF-7細胞經0.5uM凋亡誘導劑STS處理4-5h，第四組MCF-7細胞經10uM STI571處理18h后加入0.5uM STS再處理4-5h。
一、TUNEL法檢測經10uM STI571、0.5uM STS單獨處理及兩者共同處理的MCF-7細胞的凋亡情況用TUNEL-FLUOS試劑盒(購自Roche公司)并參照試劑盒說明書檢測上述經不同處理的四組MCF-7細胞的凋亡情況，具體方法為用新配制的4％多聚甲醛在室溫下對細胞固定30min，PBS洗片后與阻斷劑(H2O2甲醇溶液)在室溫下孵育30min，PBS洗片，加入0.1％的Triton X-100在冰浴中孵育2min。PBS洗兩次，滴加50μl TUNEL反應混合液，在濕盒中37℃孵育60min，PBS洗三次，然后進行Gal3蛋白免疫染色和細胞核染色，免疫染色方法見實施例2，染色后在熒光顯微鏡下觀察。
結果如圖6所示(紅色為Gal3蛋白，綠色為FITC標記酶標記抗體顯示的細胞凋亡情況，藍色為細胞核)，如圖6中的圖1所示，正常的MCF-7細胞檢測不到細胞凋亡，即細胞核中沒有綠色熒光，但可以看到紅色的Gal3蛋白分布于全胞質；如圖6中的圖2所示，細胞經10uM STI571處理18h后有細胞凋亡，可以看到細胞核中有綠色熒光，紅色的Gal3蛋白呈點狀聚集；如圖6中的圖3所示，細胞經0.5uM STS處理4-5h后也有細胞凋亡，可以看到細胞核中有綠色熒光，紅色的Gal3蛋白依然分布于全胞質；如圖6中的圖4所示，細胞經10uM STI571處理18h后加入0.5uM STS再處理4-5h后，可以看到很強的綠色熒光在細胞核中表達，而且細胞核變小皺縮，此時紅色的Gal3蛋白表達極弱，細胞凋亡顯著。
上述檢測結果表明非受體酪氨酸激酶c-Abl特異性抑制劑STI571可使Gal3蛋白降解從而誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡。
二、Annexin-V-FLUOS法檢測經10uM STI571、0.5uM STS單獨處理及兩者共同處理的MCF-7細胞的凋亡情況再用Annexin-V-FLUOS試劑盒(購自Roche公司)并參照試劑盒說明書檢測上述經不同處理的四組MCF-7細胞的凋亡情況，具體方法為500g離心5min收集細胞，用PBS重懸細胞，洗一次，將細胞重懸于200μl的binding buffer(試劑盒自帶)中，加入10μl Annexin-V-FITC和5μl PI，輕輕混勻，避光室溫孵育15min，用流式細胞檢測儀檢測。
結果如圖7所示(左上圖正常的MCF-7細胞，右上圖經0.5uM凋亡誘導劑STS處理4-5h的MCF-7細胞，左下圖經10uM STI571處理18h的MCF-7細胞，右下圖經10uM STI571處理18h后加入0.5uM STS再處理4-5h的MCF-7細胞)，用STI571和STS單獨處理均可使MCF-7細胞發(fā)生一定程度的凋亡，當用STI571和STS共同處理時細胞凋亡顯著，進一步證明非受體酪氨酸激酶c-Abl特異性抑制劑STI571可誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡。
實施例4、檢測STI571對裸鼠移植性腫瘤生長的抑制情況以BABL/C裸鼠(雄性，18-20g，購自軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心)為實驗動物。取對數(shù)生長期的MCF-7細胞，胰酶消化后按每只1×106的細胞數(shù)接種裸鼠，5天后將裸鼠隨機分成7組空白對照組、對照藥物環(huán)磷酰胺(CTX)組，順鉑組、STI571組、STI571加順鉑聯(lián)合用藥組、Sutent組、Sutent加順鉑聯(lián)合用藥組、每組6只，按以下方式給藥對照組接種后未予任何藥物治療；CTX組每只裸鼠使用劑量100mg/kg，隔天給藥一次，每天固定時間給藥；順鉑(CDDP)組每只裸鼠使用劑量7mg/kg，每周腹腔注射1次，于接種移植瘤的次日開始注射，隔周給藥；STI組每只裸鼠每天口服STI571 50mg/kg，每天固定時間給藥；STI571加順鉑聯(lián)合用藥組STI571和順鉑同時應用，方法與單獨用藥相同。
Sutent組每只裸鼠每天口服Sutent 12.5mg/kgSutent加順鉑聯(lián)合用藥組Sutent和順鉑同時應用，方法與單獨用藥相同。
給藥4周后用脫頸法處死裸鼠，解剖取瘤塊，稱瘤重，根據(jù)以下公式計算腫瘤生長抑瘤率IR＝(1-治療組瘤重/對照組瘤重)×100％
不同藥物處理對裸鼠腫瘤的抑制效果見表1，其中抑瘤率統(tǒng)計結果的柱狀圖如圖8所示，與對照藥物環(huán)磷酰胺給藥組相比，聯(lián)合用藥組的腫瘤生長抑制率雖然低，但是聯(lián)合用藥組的裸鼠未見任何異常，體重也和生理鹽水組的裸鼠差不多，處死后，解剖裸鼠發(fā)現(xiàn)，環(huán)磷酰胺組的裸鼠脾臟明顯萎縮，重量也明顯輕于生理鹽水組和聯(lián)合用藥組，聯(lián)合用藥組各臟器未見異常；另外，環(huán)磷酰胺給藥組組裸鼠肝臟腫大，色澤較蒼白，并布滿腫瘤轉移灶，生理鹽水組和聯(lián)合用藥組組肝臟均色澤紅潤，只有2-3個腫瘤轉移灶。上述結果表明STI571加順鉑聯(lián)合用藥及Sutent加順鉑聯(lián)合用藥組對MCF-7腫瘤的生長具有顯著的抑制作用，并能有效的抑制腫瘤細胞的轉移，且毒副作用微弱。
表1不同藥物處理組腫瘤的抑制效果

與生理鹽水組比較*P＜0.05，**P＜0.01。
權利要求
1.非受體酪氨酸激酶c-Abl特異性抑制劑在制備抗腫瘤藥物或腫瘤治療輔助藥物中的應用。
2.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于所述腫瘤為表達Galectin 3的腫瘤。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的應用，其特征在于所述非受體酪氨酸激酶c-Abl特異性抑制劑為STI571、Sunitinib、PKC412、vandetanib、Sorafenib、erlotinib、gefitinib或dasatinib。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種非受體酪氨酸激酶c－Abl特異性抑制劑的新用途，即在制備抗腫瘤藥物或腫瘤治療輔助藥物中的應用。實驗證明非受體酪氨酸激酶c－Abl特異性抑制劑通過抑制c－Abl的激酶活性可導致Gal3發(fā)生變性聚集并通過溶酶體降解，致使腫瘤細胞中Gal3蛋白水平顯著降低，從而使腫瘤細胞發(fā)生自噬性細胞凋亡而死亡。以非受體酪氨酸激酶c－Abl特異性抑制劑為活性成分制備抗腫瘤藥物具有以下優(yōu)點1)療效顯著；2)安全性高；3)主要用藥途徑為口服，用藥方便；4)該抑制劑價格低廉，因而以其制備抗腫瘤藥物的成本較低。本發(fā)明為腫瘤的防治提供了一條新途徑，在醫(yī)藥學領域的應用前景廣闊。
文檔編號A61K31/553GK1899616SQ20061008885
公開日2007年1月24日 申請日期2006年7月20日 優(yōu)先權日2006年7月20日
發(fā)明者李曉明, 曹誠, 馬清鈞, 劉萱, 靳彥文 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所