專利名稱：低聚糖在制備超急性排斥反應(yīng)藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬糖化合物，涉及低聚糖的用途，主要涉及水蘇糖和毛蕊糖在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
器官移植術(shù)后的排斥反應(yīng)分為超急性、急性和慢性三類。超急性排斥反應(yīng)從免疫學(xué)上來說是由于移植器官細(xì)胞膜上的抗原和受者的循環(huán)抗體之間發(fā)生識(shí)別和結(jié)合所致。因?yàn)檫@些抗體都是預(yù)先存在于受體內(nèi)，所以，超急性排斥反應(yīng)在移植術(shù)后便迅速發(fā)生，一般在術(shù)后幾分鐘或幾小時(shí)內(nèi)即出現(xiàn)。由于人體器官的短缺，利用豬的器官代替人體器官是目前研究的熱點(diǎn)。但由于豬的細(xì)胞表面抗原Gal-α-1，3-Gal(半乳糖-α-1，3-半乳糖)結(jié)構(gòu)能與人體內(nèi)預(yù)存的天然抗體結(jié)合產(chǎn)生超急性排斥反應(yīng)而無法應(yīng)用到臨床。針對(duì)此問題，目前，國內(nèi)外主要有以下幾種方法第一種方法是轉(zhuǎn)基因豬，主要是通過把豬身上表達(dá)此抗原的基因除去，從而使生產(chǎn)出來的豬不帶有此抗原(例如日本已克隆出8只次類小豬)，一旦得到了轉(zhuǎn)基因豬，通過常規(guī)的繁殖傳代就可以得到大量的轉(zhuǎn)基因豬，理論上應(yīng)該說這是一種非常理想的解決途徑，但是目前還因?yàn)橐恍﹩栴}而無法應(yīng)用到臨床。總的來說克隆和轉(zhuǎn)基因還不是一種完全成熟的技術(shù)，許多通過此途徑生產(chǎn)出的動(dòng)物都存在著或多或少的生理上的不正常，容易夭折。其次，還要考慮由于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的某些未知的基因變異而對(duì)受移植者帶來損害的可能性。第二種方法是通過對(duì)免疫抑制劑的開發(fā)和改良來解決問題，這是一種常規(guī)的思路。目前的免疫抑制劑有環(huán)孢素A、糖皮質(zhì)激素、硫唑嘌呤、抗淋巴細(xì)胞球蛋白、環(huán)磷酰胺等，但遺憾的是不能解決超急性排斥反應(yīng)問題，并且有各種各樣的副作用，比如常見的就有骨髓抑制、肝腎毒性、上消化道出血、脫發(fā)等等。雖然有報(bào)道某些研發(fā)機(jī)構(gòu)在進(jìn)行新的免疫抑制劑的開發(fā)，但前景不明。
水蘇糖是天然存在的一種四糖，分子式為C24H42O21，相對(duì)分子質(zhì)量為666.59，簡單的結(jié)構(gòu)表示式為果糖-葡萄糖-半乳糖-半乳糖。同樣，毛蕊糖也是天然存在的五糖，分子式為C30H52O26，相對(duì)分子質(zhì)量為828.7，簡單的結(jié)構(gòu)表示式為果糖-葡萄糖-半乳糖-半乳糖-半乳糖，兩者均屬于低聚半乳糖，無毒，可直接食用，屬易溶類物質(zhì)。目前國內(nèi)制備工藝成熟，商業(yè)上主要作為促進(jìn)腸道雙歧桿菌增殖的功能性低聚糖。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供低聚糖在制備抗豬→人異種器官移植引起的超急性排斥反應(yīng)藥物中的應(yīng)用，所說的低聚糖主要選用水蘇糖或毛蕊糖，所制備的藥物還含有制劑允許的藥物賦形劑或載體，所說的水蘇糖具有以下分子結(jié)構(gòu)圖 所說的毛蕊糖具有以下分子結(jié)構(gòu)圖 所制備的藥物的制劑形式包括液體制劑、顆粒劑、片劑或膠丸。所制備藥物的給藥方式包括口服給藥或注射給藥。
由于人體內(nèi)預(yù)存的天然抗體與豬細(xì)胞表面抗原Gal-α-1，3-Gal的結(jié)合是產(chǎn)生超急性排斥反應(yīng)的主要原因(David L，Kooyman，Steven B，et al.Identificationand characterization of a galactosyl peptide mimetic[J].Transplantation，1996，61(6)851-855)，為了解決這一難題，我們希望能開發(fā)出一種可以模擬Gal-α-1，3-Gal結(jié)構(gòu)的小分子化合物。目前已知蜜二糖由于有α-Gal的空間結(jié)構(gòu)，從而具有與人體內(nèi)預(yù)存的天然抗體結(jié)合的能力，但它對(duì)人的肝腎有毒性，限制了它在這一方面的進(jìn)一步開發(fā)和利用。本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)水蘇糖和毛蕊糖也具有α-Gal的空間結(jié)構(gòu)，通過抑制GS-I-B4(西非單葉豆凝集素，它能與Gal-α-1，3-Gal特異性結(jié)合)與豬紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)(實(shí)施例圖1)和抑制人血清與豬紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)(實(shí)施例圖2)，說明這兩種糖也能預(yù)先與人血清中預(yù)存的抗Gal-α-1，3-Gal抗體或GS-I-B4特異性結(jié)合并使其失活，從而可以抑制超急性排異反應(yīng)的發(fā)生，同時(shí)，這兩種糖無毒，可直接食用，屬易溶類物質(zhì)，有望開發(fā)成抗豬器官異種移植超急性排斥反應(yīng)的新藥。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是(1)兩個(gè)低聚糖的序列結(jié)構(gòu)清楚，并且生產(chǎn)技術(shù)完全成熟(已經(jīng)商品化)，此糖化合物能在工業(yè)上大量合成或自然界提取，從制備的成本上遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于轉(zhuǎn)基因方法，故可以大量合成滿足市場需求。(2)兩個(gè)低聚糖與人體內(nèi)預(yù)存的天然抗體的結(jié)合位點(diǎn)是特異性的，正好是我們要求它結(jié)合上去起到封閉人類天然抗體作用的位點(diǎn)。從而避免了由于作用位點(diǎn)特異性不強(qiáng)而帶來的副作用。(3)這兩種低聚糖無毒，可直接食用，屬易溶類物質(zhì)。(4)由于均為低聚糖，分子量較小，開發(fā)成藥物后容易被機(jī)體利用而起效。
本發(fā)明選用小分子化合物低聚糖，使它能預(yù)先與人體內(nèi)預(yù)存的抗體結(jié)合，從而使抗體不能與豬細(xì)胞表面的抗原結(jié)合而引起超急性排斥反應(yīng)；在控制超急性排斥反應(yīng)的基礎(chǔ)上，采用相應(yīng)的對(duì)策，誘導(dǎo)免疫耐受，使得動(dòng)物組織在人體中存活。與第一種轉(zhuǎn)基因方法相比，本發(fā)明選用的此糖化合物能在工業(yè)上大量合成或自然界提取，從制備的成本上遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于轉(zhuǎn)基因方法；并且糖化合物本身就是作用于抗體，針對(duì)性強(qiáng)。同時(shí)沒有由于基因變異而對(duì)受移植者帶來損害的顧慮。與第二種方法相比，在理論上本發(fā)明不僅能抑制超急性排斥反應(yīng)的發(fā)生，也不會(huì)存在上述的骨髓抑制、肝腎毒性、上消化道出血等等嚴(yán)重副作用；同時(shí)，也不會(huì)降低人體整體的免疫功能。


圖1為蜜二糖，水蘇糖和毛蕊糖抑制GS-I-B4凝集豬紅細(xì)胞的反應(yīng)結(jié)果圖。
圖2為蜜二糖和水蘇糖抑制人血清凝集豬紅細(xì)胞結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明結(jié)合以下實(shí)施例及附圖作進(jìn)一步說明。
實(shí)施例1蜜二糖，水蘇糖，毛蕊糖能抑制GS-I-B4引起的豬紅細(xì)胞凝集反應(yīng)試驗(yàn)方法先把制備好的新鮮2％豬紅細(xì)胞懸浮在PH＝7.4的磷酸緩沖液中備用。在V型血凝板的孔里，先加入40μl用磷酸緩沖液依次逐孔倍比稀釋后的糖溶液，然后依次每孔分別加入40μl的GS-I-B4(0.042mM)和40μl 2％的豬紅細(xì)胞。然后把此120μl混合液在室溫下先用震蕩器震蕩1分鐘，再靜置1小時(shí)后觀察凝集結(jié)果。如果紅細(xì)胞沉淀到孔的底部，呈一邊緣光滑的圓點(diǎn)，則此為沒有凝集。如果紅細(xì)胞形成一網(wǎng)絡(luò)，并不下沉到孔底呈一邊緣光滑的圓點(diǎn)，此為出現(xiàn)凝集。試驗(yàn)必須設(shè)空白、陽性對(duì)照。
試驗(yàn)結(jié)果參見圖1，其中A1-A3孔是豬紅細(xì)胞用PBS稀釋的結(jié)果，為空白對(duì)照可以看出，沒有出現(xiàn)凝集；A4-A9孔是GS-I-B4和豬紅細(xì)胞混合后的結(jié)果，為陽性對(duì)照，出現(xiàn)凝集；B1-B9、C1-C9孔為蜜二糖抑制GS-I-B4引起的豬紅細(xì)胞凝集(兩條為重復(fù)實(shí)驗(yàn)，蜜二糖濃度從12mM開始，1-9孔倍比稀釋)；D1-D9、E1-E9孔為水蘇糖抑制GS-I-B4引起的豬紅細(xì)胞凝集(兩條為重復(fù)實(shí)驗(yàn)，水蘇糖濃度從12mM開始，1-9孔倍比稀釋)；F1-F9、G1-G9孔為毛蕊糖抑制GS-I-B4引起的豬紅細(xì)胞凝集(兩條為重復(fù)實(shí)驗(yàn)，毛蕊糖濃度從12mM開始，1-9孔倍比稀釋)。
參見圖1三個(gè)糖均在低至12/26mM濃度(倍比稀釋第7孔)的時(shí)候就能抑制GS-I-B4引起的豬紅細(xì)胞凝集。說明它們預(yù)先均能與GS-I-B4結(jié)合，使它失活。這樣GS-I-B4就不能再與豬紅細(xì)胞上的Gal-α-1，3-Gal抗原結(jié)合，從而使豬紅細(xì)胞凝集起來。
本實(shí)驗(yàn)用形象而直接的方式說明了低聚糖與GS-I-B4的結(jié)合位點(diǎn)是特異性的，正好是我們要求它結(jié)合上去起到封閉GS-I-B4作用的位點(diǎn)(即是α-Gal結(jié)構(gòu)位點(diǎn))，從而避免了由于作用位點(diǎn)特異性不強(qiáng)而帶來的副作用。
實(shí)施例2蜜二糖和水蘇糖能抑制人血清凝集豬紅細(xì)胞的反應(yīng)試驗(yàn)方法先把制備好的新鮮2％豬紅細(xì)胞懸浮在PH＝7.4的磷酸緩沖液中備用。在V型血凝板的孔里，先加入40μl用磷酸緩沖液依次逐孔倍比稀釋后的糖溶液，然后每孔分別加入40μl適當(dāng)稀釋的A型血人血清和40μl 2％的豬紅細(xì)胞。然后把此120μl混合液在室溫下先用震蕩器震蕩1分鐘，再靜置1小時(shí)后觀察凝集結(jié)果。同實(shí)施例1，如果紅細(xì)胞沉淀到孔的底部，呈一邊緣光滑的圓點(diǎn)，則此為沒有凝集。如果紅細(xì)胞形成一網(wǎng)絡(luò)，并不下沉到孔底呈一邊緣光滑的圓點(diǎn)，此為出現(xiàn)凝集。試驗(yàn)必須設(shè)空白、陽性對(duì)照。
試驗(yàn)結(jié)果在圖2中，A1-A3孔是豬紅細(xì)胞用PBS稀釋的結(jié)果，為空白對(duì)照，可以看出，沒有出現(xiàn)凝集；A4-A9孔是GS-I-B4和豬紅細(xì)胞混合后的結(jié)果，為陽性對(duì)照，出現(xiàn)凝集；B1-B12、C1-C12孔為蜜二糖抑制人血清引起的豬紅細(xì)胞凝集(兩條為重復(fù)實(shí)驗(yàn)，蜜二糖濃度從1mg/ml開始，1-9孔倍比稀釋)；D1-D12、E1-E12孔為水蘇糖抑制人血清引起的豬紅細(xì)胞凝集(兩條為重復(fù)實(shí)驗(yàn)，水蘇糖濃度從1mg/ml開始，1-9孔倍比稀釋)。
從圖2中可以看出，蜜二糖，水蘇糖分別在低至0.125mg/ml和0.5mg/ml濃度的時(shí)候就能抑制A型血人血清引起的豬紅細(xì)胞凝集。說明它們預(yù)先均能與A型血人血清特異性結(jié)合，使它失活。這樣A型血人血清就不能再與豬紅細(xì)胞上的Gal-α-1，3-Gal抗原結(jié)合，從而使豬紅細(xì)胞凝集起來。
本實(shí)驗(yàn)用形象而直接的方式說明了低聚糖與人體內(nèi)預(yù)存抗體的結(jié)合位點(diǎn)是特異性的，正好是我們要求它結(jié)合上去起到封閉抗體作用的位點(diǎn)(即是α-Gal結(jié)構(gòu)位點(diǎn))。從而避免了由于作用位點(diǎn)特異性不強(qiáng)而帶來的副作用。
權(quán)利要求
1.一種低聚糖在制備超急性排斥反應(yīng)藥物中的應(yīng)用，其特征是在制備抗豬→人異種器官移植引起的超急性排斥反應(yīng)藥物中的應(yīng)用，所制備的藥物還含有制劑允許的藥物賦形劑或載體，所述低聚糖選用水蘇糖或毛蕊糖，水蘇糖具有以下分子結(jié)構(gòu) 毛蕊糖具有以下分子結(jié)構(gòu)
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的低聚糖在制備超急性排斥反應(yīng)藥物中的應(yīng)用，其特征是所述藥物的制劑形式包括液體制劑、顆粒劑、片劑或膠丸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的低聚糖在制備超急性排斥反應(yīng)藥物中的應(yīng)用，其特征是所述藥物的給藥方式包括口服給藥或注射給藥。
全文摘要
本發(fā)明提供一種低聚糖在制備抗豬→人異種器官移植引起的超急性排斥反應(yīng)藥物中的應(yīng)用，所述低聚糖選用水蘇糖或毛蕊糖，所制備的藥物還含有制劑允許的藥物賦形劑或載體。本發(fā)明選用小分子化合物低聚糖，使它能預(yù)先與人體內(nèi)預(yù)存的天然抗體結(jié)合，從而使天然抗體不能與豬細(xì)胞表面的抗原結(jié)合而引起超急性排斥反應(yīng)。本發(fā)明選用的低聚糖能在工業(yè)上大量合成或自然界提取，制備成本低；并且該低聚糖本身就是作用于抗體，針對(duì)性強(qiáng)；同時(shí)克服由于基因變異而對(duì)受移植者帶來損害的顧慮，不僅能抑制超急性排斥反應(yīng)的發(fā)生，也不會(huì)存在骨髓抑制、肝腎毒性、上消化道出血等嚴(yán)重副作用，也不會(huì)降低人體整體的免疫功能，開發(fā)成藥物后容易被機(jī)體利用而起效。
文檔編號(hào)A61K9/16GK1879636SQ20061005068
公開日2006年12月20日 申請(qǐng)日期2006年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月11日
發(fā)明者詹金彪, 張暉, 許林海, 嚴(yán)志焜 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)