專利名稱：人白介素22在制備肝移植排斥反應(yīng)的標(biāo)志物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別涉及肝移植排斥反應(yīng)的標(biāo)志物。
背景技術(shù)：
肝移植手術(shù)，是指通過(guò)手術(shù)植入ー個(gè)健康的肝臟到患者體內(nèi)，使終末期肝病患者肝功能得到良好恢復(fù)的ー種外科治療手段。按照供肝種植部位不同，可分為原位肝移植術(shù)和異位肝移植木。原位肝移植(OLT)已成為肝臟外科手術(shù)的成熟技木，并且對(duì)許多終末期肝病患者而言，它是唯一有效的治療手段。盡管有免疫抑制劑的成功應(yīng)用，而由浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和其他炎癥細(xì)胞引起的急性移植物排斥反應(yīng)，依舊是早期供體損傷及移植后生存率的主要危險(xiǎn)因素之一。有研究表明，排斥反應(yīng)中起支配作用的IFNy對(duì)移植物損 傷并非是不可或缺的，暗示還有其他因子參與引起排斥反應(yīng)的炎癥反應(yīng)。最新研究表明，TH17細(xì)胞參與移植排斥反應(yīng)的免疫應(yīng)答。IL-22是IL-10家族的成員之一，主要由TH17細(xì)胞、TH22細(xì)胞、NK細(xì)胞及淋巴組織誘導(dǎo)細(xì)胞(LTi)等產(chǎn)生，IL-22主要作用于皮膚、肝臟及腎臟，發(fā)揮固有免疫、損傷保護(hù)及促進(jìn)再生的作用。IL-22對(duì)肝臟有著保護(hù)及促炎的雙重作用，研究證明IL-22對(duì)肝部分切除后的肝細(xì)胞再生起重要的促進(jìn)作用，最新的數(shù)據(jù)證明IL-22參與肝臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。推測(cè)IL-22參與肝移植術(shù)后的肝細(xì)胞再生及缺血再灌注等作用。但是，至今還沒(méi)有IL-22 (人白介素22)參與移植排斥反應(yīng)的免疫應(yīng)答的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之ー在于提供人白介素22的新應(yīng)用，該應(yīng)用為判斷肝移植排斥反應(yīng)提供了新的思路。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為人白介素22在制備肝移植排斥反應(yīng)的標(biāo)志物中的應(yīng)用。進(jìn)ー步，所述肝移植排斥反應(yīng)為原位性肝移植排斥。進(jìn)ー步，人白介素22的蛋白在制備肝移植的第1-3天肝移植排斥反應(yīng)的標(biāo)志物中的應(yīng)用。進(jìn)ー步，人白介素22的mRNA在制備肝移植排斥反應(yīng)的標(biāo)志物中的應(yīng)用。上述技術(shù)方案是通過(guò)如下實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)其功能的成功建立大鼠原位肝移植動(dòng)物模型，分為排斥組和耐受組(各15只)，取術(shù)后1，3，5，7天大鼠血漿及肝組織標(biāo)本，應(yīng)用免疫組化染色、Western blot及熒光定量PCR檢測(cè)其肝組織內(nèi)IL-17 (白介素-17)及IL_22(白介素-22)的細(xì)胞、蛋白及mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果顯示排斥組IL-17血漿濃度顯著高于耐受組；在肝組織中，IL-17及IL-22的淋巴細(xì)胞陽(yáng)性率、蛋白表達(dá)水平及mRNA表達(dá)水平排斥組顯著高于耐受組。由此可以證實(shí)人白介素22在制備肝移植排斥反應(yīng)的標(biāo)志物中的應(yīng)用。現(xiàn)有技術(shù)中IL_17可作用于自身免疫疾病和病原體的防御還參與移植物排斥反應(yīng)，在人及動(dòng)物的腎臟、心臟及肺移植中發(fā)現(xiàn)IL-17水平的升高。在肝移植中，有臨床研究表明TH17相關(guān)因子IL-17及IL-23在肝移植術(shù)后的患者血清中顯著增高。同IL-17相比，IL-17在排斥組肝組織內(nèi)術(shù)后第I天及第3天升高明顯，并在隨后的5、7天內(nèi)逐漸降低，IL-22在排斥組術(shù)后第I天升高明顯并從第3天起逐漸下降。排斥組的IL-17和IL-22表達(dá)相比于耐受組在術(shù)后均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。


圖I為HE組織切片，其中，TOL是指耐受組，REJ是指排斥組。圖2為HE組織切片Banff的RAI評(píng)分分析圖。圖3為大鼠肝移植模型建立后的肝功能指標(biāo)變化情況分析圖，其中，A為以ALT為指標(biāo)，B為以AST為指標(biāo)。圖4為免疫組化顯示移植后1，3，5，7天大鼠肝組織中IL-17及IL-22的變化情況。圖5為Western blotting檢測(cè)移植后1，3，5，7，天大鼠肝組織內(nèi)的IL-17、IL-22。圖6為Western blotting檢測(cè)移植后I，3，5，7，天大鼠肝組織內(nèi)的IL-17、IL-22變化分析圖，其中A為IL-17的變化分析圖，B為IL-22的變化分析圖，分析圖中，橫坐標(biāo)為時(shí)間，縱坐標(biāo)為用紫外分光光度計(jì)測(cè)定的相對(duì)濃度(與內(nèi)參GAPDH比值)。圖7為移植后I，3，5，7天大鼠肝組織中IL-17、IL-22的mRNA的變化分析圖，其中，a為IL-17的變化分析圖，b為IL-22的變化分析圖，橫坐標(biāo)為時(shí)間，縱坐標(biāo)為mRNA的表達(dá)水平(與內(nèi)參β -Actin比值)。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。本實(shí)施例通過(guò)掲示IL-22在肝移植急性排斥反應(yīng)中的表達(dá)情況及作用，證實(shí)IL-22可以用于制備肝移植排斥反應(yīng)的標(biāo)志物。通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，與耐受組動(dòng)物模型相比，排斥組動(dòng)物的其肝組織中的IL-17及IL-22的淋巴細(xì)胞陽(yáng)性率、蛋白表達(dá)水平及mRNA表達(dá)水平也明顯增高。同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)排斥組肝組織中STAT3 mRNA表達(dá)水平升高。這些結(jié)果表明，IL-22參與肝移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)的發(fā)生過(guò)程，并推測(cè)其通過(guò)激活STAT3通路發(fā)揮效 應(yīng)。本實(shí)施例中的方法統(tǒng)計(jì)方法數(shù)據(jù)以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS13. O統(tǒng)計(jì)軟件行單因素方差分析，組間比較行t檢驗(yàn)。P < O. 05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)施例ー動(dòng)物建模I實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及大鼠原位肝移植模型的建立雄性BN(RTln)大鼠和LEW(RTl1)大鼠，SPF級(jí)動(dòng)物，體重220_270g，購(gòu)于第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)于恒溫、清潔環(huán)境，維持12小時(shí)晝夜節(jié)律，遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用及管理原則。供、受體術(shù)前8小時(shí)禁食，術(shù)后不禁飲食。大鼠肝移植排斥模型分為排斥組和耐受組，排斥組為L(zhǎng)EW(RTl1)大鼠為供體BN(RTln)大鼠為受體，耐受組BN(RTln)大鼠為供體LEW(RTli)大鼠為受體，每組15對(duì)。應(yīng)用改良“ニ袖套”法建立大鼠原位肝移植動(dòng)物模型，“ニ袖套”法具體參照“不同原位肝移植模型大鼠的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量變化的研究[J].免疫學(xué)雜志，2011，27 (4) =283-286分別在肝移植術(shù)后第I、第3、第5、第7天處死排斥組和耐受組動(dòng)物各3只，提取外周血及肝臟組織備檢。
2肝臟組織病理及免疫組化分析切取肝組織置于體積分?jǐn)?shù)為10%甲醛中固定48小時(shí)，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋、5 μ m厚切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察。根據(jù)肝組織炎癥浸潤(rùn)及壞死情況進(jìn)行病理分級(jí)。結(jié)果從圖I所示的HE組織切片中可以看到排斥組比耐受組模型發(fā)生明顯的移植排斥反應(yīng)，排斥組移植肝病理檢查均提示光鏡下肝細(xì)胞變性腫大，伴大量肝細(xì)胞壞死，血竇擴(kuò)張充血，內(nèi)皮細(xì)胞腫脹明顯，整個(gè)肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，匯管區(qū)及中央靜脈出現(xiàn)以淋巴細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，膽小管破壞伴炎細(xì)胞浸潤(rùn)，符合急性排斥反應(yīng)的病理表現(xiàn)?；贐anff的RAI評(píng)分(對(duì)匯管區(qū)、膽管及靜脈內(nèi)皮炎癥進(jìn)行排斥活動(dòng)指數(shù)計(jì)分，總積分為9分，RAI0-2分定為無(wú)排斥，2-3分為交界性急性排斥反應(yīng)，3-4分為輕度急性排斥反應(yīng)I級(jí)，5-6分為中度急性排斥反應(yīng)II級(jí)，7-9分為重度急性排斥反應(yīng)III級(jí))，結(jié)果如圖2所示排斥組的評(píng)分明顯高于耐受組的評(píng)分。3肝功能檢測(cè) 于各時(shí)間點(diǎn)經(jīng)下腔靜脈抽血約5mL置于抗凝管中，離心取血漿標(biāo)本用全自動(dòng)生化儀(Olympus)檢測(cè)血清肝功能丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和天門(mén)冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)的變化。結(jié)果術(shù)后各組血清ALT、TBIL濃度及變化趨勢(shì)術(shù)后2組肝功能均有不同程度升高，可以看出排斥組ALT明顯大于耐受組，且在第5天差異最明顯。排斥組的TBIL在第7天明顯高于耐受組。ΓΡ < O. 05)，詳見(jiàn)圖3，結(jié)果見(jiàn)下表，表I為0、1、3、5及7天對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的變化情況，表2為0、1、3、5及7天對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組AST的變化情況。表I和表2中數(shù)字的単位均為U/L。表I
權(quán)利要求
1.人白介素22在制備肝移植排斥反應(yīng)的標(biāo)志物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于所述肝移植排斥反應(yīng)為原位性肝移植排斥。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于人白介素22的蛋白在制備肝移植的第1-3天肝移植排斥反應(yīng)的標(biāo)志物中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于人白介素22的mRNA在制備肝移植排斥反應(yīng)的標(biāo)志物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別涉及人白介素22在制備肝移植排斥反應(yīng)的標(biāo)志物中的應(yīng)用，在肝移植中，有臨床研究表明TH17相關(guān)因子IL-17及IL-23在肝移植術(shù)后的患者血清中顯著增高；同IL-17相比，IL-17在排斥組肝組織內(nèi)術(shù)后第1天及第3天升高明顯，并在隨后的5、-7天內(nèi)逐漸降低，IL-22在排斥組術(shù)后第1天升高明顯并從第3天起逐漸下降。排斥組的IL-17和IL-22表達(dá)相比于耐受組在術(shù)后均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
文檔編號(hào)G01N33/68GK102735847SQ20121021862
公開(kāi)日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2012年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月28日
發(fā)明者倪兵, 張軼 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)