專利名稱：通過化學(xué)修飾抗原性碳水化合物穩(wěn)定生物假體組織的方法
通過化學(xué)修飾抗原性碳水化合物穩(wěn)定生物假體組織的方法
相關(guān)申請
本申請根據(jù)35U. S. C. § 119(e)要求2010年6月17日提交的美國臨時申請?zhí)?61/355,948的優(yōu)先權(quán)。
領(lǐng)域
本文提供的方法涉及生物假體植入物的領(lǐng)域，更具體而言，涉及處理生物假體組織以減少宿主對象中的植入后的抗原性和鈣化。
背景
由動物組織制成的生物假體植入物的主要限制是移植受體中超急性排斥反應(yīng)的發(fā)生。這種反應(yīng)主要是由移植組織內(nèi)抗原性碳水化合物(糖類，carbohydrate)表位的存在而驅(qū)動，最常見的抗原性碳水化合物表位是α-GAL糖蛋白表位D半乳糖(a 1-3)半乳糖 (β 1-4) N乙酰基葡糖氨-R-基序(a-GAL),其被發(fā)現(xiàn)于除舊大陸猴(old world monkey)、 大猿和人以外的所有物種的血管內(nèi)皮組織上。在移植到人中以后，a-GAL在收獲的動物供體組織上的存在引起直接和強烈的免疫反應(yīng)，其會迅速毀壞周圍組織和/或器官。排斥反應(yīng)的迅速是由于在人對象中非常高水平的預(yù)形成的抗-a -GAL抗體(人血液中幾乎所有抗體的1%是抗_ a -GAL抗體)。聞水平的抗_ ct -GAL是對在人消化道中普遍存在的攜帶 a -GAL表位的細菌的適應(yīng)性·反應(yīng)。
用于異種(xenographic)生物假體組織的最常見的組織源是馬科動物(馬)、綿羊、豬和牛組織，其均攜帶a-GAL表位并且潛在地是抗原性性的。用于限制生物假體組織的抗原性的一種途徑是化學(xué)修飾(改變，modify)抗原性表位，以便它們不再被宿主抗體識別。這通常通過化學(xué)固定完成，所述化學(xué)固定包括使生物假體組織暴露于固定劑(或鞣劑)，其在組織的多肽內(nèi)形成交聯(lián)(分子內(nèi)交聯(lián))和/或在組織的多肽間形成交聯(lián)(分子間交聯(lián))。用于處理生物假體組織的固定劑的實例包括甲醛、戊二醛、雙醛淀粉、六亞甲基二異氰酸酯和聚環(huán)氧化合物。戊二醛是最廣泛使用的固定劑，并且，戊二醛處理是當前用于穩(wěn)定臨床有用的生物假體組織的標準方法。戊二醛固定的生物假體心瓣膜的實例包括 Carpentier- Edwards 帶支架的豬生物假體、Carpentier- Edwards PERIMOUNT 圍心生物假體和EdwardsPRIMA Plus 無支架主動脈生物假體，其均可從Edwards Lifesciences, Irvine, Calif. 92614 得至丨J。
盡管化學(xué)固定可以很大程度地限制生物假體組織的抗原性，但固定的組織，尤其是戊二醛固定的組織存在若干缺點。例如，戊二醛固定的保護作用在生物假體植入物的預(yù)期使用期限內(nèi)由于不穩(wěn)定的席夫堿(Schiff Base)交聯(lián)而趨于退化，導(dǎo)致免疫原性提高以及長期穩(wěn)定性和性能受損。另外，戊二醛處理使生物假體組織更容易受到鈣化，尤其在植入物保留在適當?shù)奈恢贸掷m(xù)延長的時間段(例如，大于10年)時，這是由于其高水平的殘留醛基團。結(jié)構(gòu)性瓣膜退化(SVD)是早期瓣膜外植的最常見原因，其中組織鈣化是生物假體植入物失敗的主要原因。這些戊二醛衍生的醛伴隨著高水平的鈣礦化。
Levy和Vyavahare的美國專利號6，861, 211描述了通過化學(xué)交聯(lián)穩(wěn)定生物假體組織的方法，所述化學(xué)交聯(lián)通過用劑諸如高碘酸鹽處理組織而受影響，所述劑氧化葡胺聚糖(GAG)的碳水化合物部分以產(chǎn)生醛，然后，用與碳水化合物醛以及鄰近蛋白質(zhì)上的反應(yīng)基團反應(yīng)的雙官能劑處理組織，以使GAG交聯(lián)到周圍組織基質(zhì)。像常規(guī)戊二醛固定一樣，該方法產(chǎn)生殘留的反應(yīng)性醛基團，其充當潛在的鈣結(jié)合位點，因而由于最終損害材料的生物機械性能而使組織不穩(wěn)定。
美國專利號6，38 3，732 (Stone)，描述化學(xué)修飾的替代方案，其利用酶α -半乳糖苷酶(galactosiadase)破壞a-GAL表位來限制生物假體組織的抗原性。酶方法遭受酶制備的普遍高成本以及這樣的事實，即，大尺寸的α-半乳糖苷酶和其它酶防止這些蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)深深穿透到組織諸如圍心生物假體組織的胞外基質(zhì)。因此，基于酶的處理并不消除由酶靶向的所有表位，尤其在生物假體植入物內(nèi)部。另外，α-半乳糖苷酶和其它酶對于特定的表位是特異性的(例如，在α半乳糖苷酶的情況下，α-GAL)，致使其非常難以限制包含多個和/或未知表位的組織的抗原性。酶促去除細胞組分和組織結(jié)構(gòu)也會使組織的生物機械特性退化。此外，這些酶處理不能與戊二醛固定的組織一起應(yīng)用，因為酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)將與殘留的醛反應(yīng)并與材料共價結(jié)合。結(jié)果是外源蛋白質(zhì)增加和組織性能的進一步退化。
因此，在本領(lǐng)域中仍需要開發(fā)新的和改進的方法，用于減小抗原性和限制異種組織的鈣化，從而增強組織的耐用性、穩(wěn)定性和性能。這些增強的特性與體內(nèi)生物假體組織的要求一致，其包括維持，例如心臟瓣膜的結(jié)構(gòu)、機械和生物相容性質(zhì)。
發(fā)明簡述
本文提供這樣的方法，其通過化學(xué)修飾生物假體組織內(nèi)的抗原性碳水化合物來提高異種生物假體組織植入物的穩(wěn)定性、耐用性和/或性能。
在一些方面，所述方法包括以下步驟用氧化劑處理所述生物假體組織，所述氧化劑氧化抗原性碳水化合物的鄰二醇部分以形成醛或酸，和用封端劑處理生物假體組織，所述封端劑包括伯胺或醇，其與醛或酸結(jié)合以形成亞胺、酰胺或酯。
在一些方面，所述方法包括以下步驟用封端劑處理生物假體組織，封端劑包括伯胺或醇，其與醛或酸結(jié)合以形成亞胺、酰胺或酯，和用穩(wěn)定劑處理生物假體組織，穩(wěn)定劑將亞胺轉(zhuǎn)換成仲胺或?qū)ⅤマD(zhuǎn)換成酰胺。
在一些方面，所述方法包括以下步驟用氧化劑處理生物假體組織，所述氧化劑氧化抗原性碳水化合物的鄰二醇部分以形成醛或酸；用封端劑處理生物假體組織，所述封端劑包括伯胺或醇，其與醛或酸結(jié)合以形成亞胺、酰胺或酯；和用穩(wěn)定劑處理生物假體組織， 所述穩(wěn)定劑將亞胺轉(zhuǎn)換成仲胺或?qū)ⅤマD(zhuǎn)換成酰胺。
在一些方面，抗原性碳水化合物是N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Gc)，在一些方面，抗原性碳水化合物是福斯曼抗原(嗜異性抗原，F(xiàn)orssman antigen) (GalNAc α I, 3 GalNAc β 1,3 Gal α 1,4 Gal β I, 4 Glc-Cer)。在進一步的方面，抗原性碳水化合物包含α -半乳糖基(α-Gal)表位。
在一些方面，氧化劑是高碘酸鹽。在一些方面，高碘酸鹽相對于構(gòu)成生物假體組織的β _氨基醇和/或鄰二酮基團，選擇性地氧化抗原性碳水化合物的鄰二醇。
在一些方面，封端劑是伯胺。在進一步的方面，伯胺與生物假體組織上的醛反應(yīng)以形成亞胺。
在一些方面，封端劑是醇。在進一步的方面，醇與生物假體組織上的酸反應(yīng)以形成酯。
在一些方面，穩(wěn)定劑是還原劑。在進一步的方面，還原劑將生物假體組織亞胺轉(zhuǎn)換成仲胺和將酯轉(zhuǎn)換成酰胺。
在一些方面，生物假體組織在封端劑的存在下用氧化劑處理。在進一步的方面，生物假體組織在用還原劑處理之前被充分洗滌，以除去氧化劑。
在一些方面，生物假體組織在伯胺或醇封端劑的存在下用穩(wěn)定劑處理。在進一步的方面，生物假體組織用封端劑和穩(wěn)定劑同時處理。在再進一步的方面，生物假體組織在用封端劑和/或穩(wěn)定劑處之前被洗滌，以去除氧化劑。
在一些方面，生物假體組織用一種或多種表面活性劑和/或固定劑處理過。在各個方面，固定劑選自醛、二醛、聚醛、二異氰酸酯、碳二亞胺、光氧化劑和聚環(huán)氧化合物，表面活性劑選自陰離子表面活性劑、烷基磺酸鹽、聚氧乙烯醚、譜朗尼克或丁炔表面活性劑和烷基化的苯氧基聚乙氧基醇。
在一些優(yōu)選方面，生物假體組織用戊二醛處理過。
在一些優(yōu)選方面，生物假體植入物是心臟瓣膜。在進一步的方面，生物假體組織是牛心包膜或豬主動脈瓣。在再進一步的方面，生物假體植入物是兒童心瓣膜。
在一些方面，被氧化的生物假體組織在人宿主中基本上是非免疫原性的。在進一步的方面，被處理的生物假體組織的抗原性碳水化合物在人宿主中基本上是非抗原性的。 在再進一步的方面，被處理的生物假體組織在人宿主中基本上是非鈣化的。在一些方面，人宿主是兒童患者。
在一些方面，氧化劑是高碘酸鹽。在進一步的方面，高碘酸鹽是高碘酸鈉。在一些方面，高碘酸鈉以20nM的濃度被使用。在一些方面，生物假體組織在約25。C用高碘酸鈉處理約3小時。
在一些方面，所述方法還包括用一種或多種表面活性劑和固定劑處理生物假體組織。在進一步的方面，所述方法包括用醛固定劑處理生物假體組織。在再進一步的方面，所述方法包括用戊二醛處理生物假體組織。在一些方面，固定劑是碳二亞胺(如EDC)。在一些方面，固定劑是雙環(huán)氧化物(diepoxy)。
在一些方面，生物假體組織是新鮮組織。
在一些方面，所述方法還包括用生物負載還原溶液處理生物假體組織，該生物負載還原溶液包括甲醛、乙醇和吐溫 溶液。在一些方面，所述方法還包括用乙醇和丙三醇干燥生物假體組織。在一些方面，所述方法還包括用環(huán)氧乙烷對所述生物假體組織滅菌。
在一些方面，方法還包括用去細胞化方法使生物假體組織去細胞化，所述去細胞化方法包括用O. 1%SDS處理組織、沖洗組織和用DNAse處理組織。在一些方面，所述方法還包括干燥和電泳清洗生物假體組織。在一些方面，所述方法還包括用戊二醛對所述生物假體組織滅菌。
在一些方面，所述方法還包括用生物負載還原溶液處理生物假體組織，所述生物負載還原溶液包含乙醇和吐溫 溶液。
其它方面描述在共同擁有的2008年12月18日提交的美國公布號2009/0164005 中，其在此通過弓I用其整體被并入本文，用于所有目的。附圖簡介
圖I顯示本公開內(nèi)容中提供的組織處理方法的各個方面。如圖I所示，該方法一般包括鄰二醇(即，vie 二醇)氧化、用封端劑處理和/或用穩(wěn)定劑處理。
圖2顯示處理未固定組織后a -Gal表達的免疫組織化學(xué)。藍色是DNA (DAPI染色) 和綠色是a -Gal (同工凝集素ΙΒ4染色)。圖2Α顯示在用本文所述的方法(鄰二醇氧化、 封端劑和還原劑)處理的、新鮮未固定組織中的最小染色。圖2Β顯示在僅用高碘酸鹽處理的、新鮮未固定組織中密集a -Gal (同工凝集素ΙΒ4染色)的較淺區(qū)域。
圖3顯示用各種類型高碘酸鹽處理的、未固定組織上a -Gal表達的免疫組織化學(xué)。染色區(qū)域顯示為相對于較深背景的較淺區(qū)域。藍色是DNA(DAPI染色)和綠色是 a -Gal (同工凝集素ΙΒ4染色)。圖3Α顯示用l%SDS/DNAse去細胞化程序處理的未固定組織。圖3B顯示用商業(yè)可得的去細胞化的膠原組織處理的未固定組織。圖3C顯示用另一商業(yè)可得的去細胞化的膠原組織處理的未固定組織。
圖4顯示用戊二醛固定的組織具有嚴重的自身熒光。
圖5顯示在僅用ThermaFix (TFX)處理的固定組織上，a -Gal和DNA表達為較深的區(qū)域。棕色是a -Gal (同工凝集素_IB4，DAB)和藍色是核(蘇木精染色)。圖5還顯示用于該試驗的方法的流程圖。
圖6顯示在利用TFX和本文所述方法的固定組織的組合處理處理的固定組織上， α-Gal和DNA表達為較深區(qū)域。上面的圖顯示用乙醇胺處理的組織。下面的圖顯示用?；撬崽幚淼慕M織。棕色是α -Gal (同工凝集素-ΙΒ4，DAB)和藍色是核(蘇木精染色)。
圖7顯示在用封端、還原和干燥方法處理的固定組織上，a -Gal和DNA表達為較深的區(qū)域。圖7還顯示用于該試驗的方法的流程圖。棕色是a-Gal (同工凝集素-ΙΒ4，DAB) 和藍色是核(蘇木精染色)。
圖8顯示在用TFX以及如本文所述的鄰二醇氧化、用封端劑處理、用還原/穩(wěn)定劑處理和干燥的組合處理處理的固定組織上，a-Gal和DNA表達為較深區(qū)域。上面的圖顯示用乙醇胺處理的組織。下面的圖顯示用?；撬崽幚淼慕M織。棕色是α-Gal(同工凝集素-IB4，DAB)和藍色是核(蘇木精染色)。
圖9顯示由各種組織處理引起并與對照相比的、全部同工凝集素-B4-a-Gal結(jié)合抑制的百分比。


圖10顯示針對在靈長類對象中進行的以下處理的抗- a -Gal反應(yīng)戍二醒；TFX ； 鄰二醇氧化、用封端劑處理和用穩(wěn)定劑處理；和封端、還原和干燥處理。數(shù)據(jù)作為與初始值相比吸光度的百分比增長或下降被提供。
發(fā)明詳述
在本文中提供對本發(fā)明的描述是為了描述各個方面的目的，而并不意圖是窮盡性的或限制性的，因為本發(fā)明的范圍將僅由所附權(quán)利要求書限定。相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員會理解，根據(jù)這些方面的教導(dǎo)，許多修改和變化是可能的。
除非另有限定，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義。雖然本文中描述了示例性的方法和材料，但應(yīng)該理解，也可以使用與那些被描述的方法和材料類似或相當?shù)姆椒ê筒牧?。本文提及的所有出版物通過引用被并入，以公開和描述與它們被引用的有關(guān)的方法和/或材料。
必需注意，如在本說明書中所用的，單數(shù)形式“一 (“a”、“an”)”和“該(“the”)”包括復(fù)數(shù)指代，除非上下文另有明確相反的說明。
本文提供這樣的方法，其通過化學(xué)修飾組織內(nèi)的一種或多種抗原性碳水化合物同時使整體組織結(jié)構(gòu)基本上未被修飾來減輕異種生物假體組織的免疫原性。
在一些方面，所述方法包括以下步驟用氧化劑處理所述生物假體組織，所述氧化劑氧化抗原性碳水化合物的鄰二醇部分以形成醛或酸，和用封端劑處理生物假體組織，該封端劑包括伯胺或醇，其與醛或酸結(jié)合以形成亞胺、酰胺或酯。
在一些方面，所述方法包括以下步驟用封端劑處理生物假體組織，該封端劑包括伯胺或醇，其與醛或酸結(jié)合以形成亞胺或酯，和用穩(wěn)定劑處理生物假體組織，該穩(wěn)定劑將亞胺轉(zhuǎn)換成仲胺或?qū)ⅤマD(zhuǎn)換成酰胺。
在一些方面，所述方法包括以下步驟用氧化劑處理所述生物假體組織，所述氧化劑氧化抗原性碳水化合物的鄰二醇部分以形成醛或酸；用封端劑處理生物假體組織，所述封端劑包括伯胺或醇，其與醛或酸結(jié)合以形成亞胺或酯；和用穩(wěn)定劑處理生物假體組織，所述穩(wěn)定劑將亞胺轉(zhuǎn)換成仲胺或?qū)ⅤマD(zhuǎn)換成酰胺。
不受具體理論限制，據(jù)信用于穩(wěn)定異種組織的戊二醛固定和其它確立的方法遭受與生物假體植入物的抗原性、鈣化和長期失敗有關(guān)的若干限制。戊二醛和其它固定劑通過在組織內(nèi)的某些反應(yīng)性部分之間形成交聯(lián)來穩(wěn)定組織，而不必改變或消除抗原性表位。由于宿主免疫細胞、抗體和血清蛋白對戊二醛固定組織表面上的富集的(集中的， concentrated)醛基團的吸收，戊二醛固定在很大程度上以間接的方式降低抗原性，形成隔離組織與宿主免疫因子的天然分子的包衣。然而，這種蛋白質(zhì)包衣隨著時間退化，使組織暴露于宿主免疫系統(tǒng)。另外，由于戊二醛通過被處理組織的緩慢穿透和擴散速率，戊二醛固定組織的內(nèi)部常常含有高水平的“潛在抗原”。結(jié)果，戊二醛固定的生物假體組織可隨著時間變得越來越具有抗原性，導(dǎo)致生物假體植入物的鈣化、組織疲勞和最終的故障。
有利地，本文提供的方法通過解決與戊二醛固定和/或其它確立的方法有關(guān)的一個或多個限制，降低生物假體組織的抗原性和/或鈣化。根據(jù)本發(fā)明方法用高碘酸鹽處理生物假體組織選擇性地氧化抗原性碳水化合物，導(dǎo)致對異種抗原的共價修飾。另外，高碘酸鹽和其它化學(xué)劑均是小分子，其容易擴散通過生物假體組織——包括化學(xué)固定的組織，以消除遍及組織的潛在抗原。本文提供的方法應(yīng)用封端劑將由高碘酸鹽氧化和/或戊二醛固定產(chǎn)生的醛基團轉(zhuǎn)換成亞胺，和使用還原劑將水解不穩(wěn)定性亞胺轉(zhuǎn)換成穩(wěn)定的和基本上非抗原性仲胺。所述方法因而消除反應(yīng)性和毒性醛并防止醛進一步氧化成作為潛在鈣結(jié)合位點的酸。此外，通過修飾潛在抗原和產(chǎn)生的生物假體組織降低的免疫原性，鈣化被進一步降低。有利地，本文提供的方法提高生物假體組織植入物的穩(wěn)定性、耐用性和/或性能。
在一些方面，被本發(fā)明方法靶向修飾的“抗原性碳水化合物”是葡胺聚糖(GAG) 多糖，其被發(fā)現(xiàn)于異種組織的糖蛋白和/或糖脂上并被人對象的免疫系統(tǒng)識別為外源的。 生物假體組織內(nèi)的抗原性碳水化合物可以觸發(fā)改變免疫反應(yīng)的水平，這會降低植入物的性能、耐用性和/或預(yù)期使用期限并潛在地要求直接醫(yī)療干涉來取代植入物。在一些方面，根據(jù)本文提供的方法修飾的抗原性碳水化合物是“對高碘酸鹽不穩(wěn)定的(periodate labile) ”，因為它們包含一個或多個暴露的鄰二醇(R1-CH(OH)CH(OH)-R2)部分，其能夠被高碘酸鹽氧化，以產(chǎn)生側(cè)(pendant)醛(R1CHO)15有利地，對抗原性碳水化合物的高碘酸鹽氧化修飾其結(jié)構(gòu)，以便其不再被循環(huán)抗體識別。在一些優(yōu)選方面，根據(jù)本文提供的方法用高碘酸鹽處理戊二醛固定組織基本上消除對高碘酸鹽不穩(wěn)定的抗原性碳水化合物表位。在進一步的方面，根據(jù)本文提供的方法用高碘酸鹽處理戊二醛固定組織致使組織基本上是非抗原性的。
在一些方面，根據(jù)本發(fā)明方法修飾的抗原性碳水化合物是a -GAL表位 (Gal a ^3Gal β ^4GlcNAc-R)。根據(jù)本文提供的方法用高碘酸鹽處理表達a -GAL的異種組織導(dǎo)致a-GAL端半乳糖的鄰二醇的氧化，產(chǎn)生兩個側(cè)醛。側(cè)醛優(yōu)選被含有伯胺的“封端劑” 轉(zhuǎn)換成亞胺，并且亞胺被還原劑轉(zhuǎn)換成穩(wěn)定的仲胺。有利地，對端半乳糖單元的高碘酸鹽氧化修飾a-GAL表位，以便它不再被人抗-a-GAL( “抗_GAL”)抗體識別，從而基本上降低生物假體組織的抗原性性。
在進一步的方面，根據(jù)本發(fā)明方法修飾的抗原性碳水化合物是唾液酸N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Gc),即所謂的Hanganutziu-Deicher (HD)抗原，其包含具有對高碘酸鹽不穩(wěn)定的鄰二醇的九-碳糖。Neu5Gc常見于哺乳動物組織，尤其是豬組織中，但不是由人內(nèi)源合成的。然而，由于對人糖蛋白中少量Neu5Gc的飲食攝取和可能的代謝摻入(metabolic incorporation),有時在人中檢測到Neu5Gc處于相對穩(wěn)定的水平。人對象具有不同水平的循環(huán)抗體抵抗Neu5Gc，其中最高水平可與抗-GAL抗體的水平相當。有利地，對異種組織中 Neu5Gc唾液酸殘基的高碘酸鹽氧化修飾Neu5Gc表位，以便它對于人對象不再是抗原性的。
在進一步的方面，抗原性碳水化合物是福斯曼抗原(GalNAc α I, 3GalNAc β I, 3Gal α I, 4Gal β 1，4Glc_Cer)。M. Ezzelarab 等，Immunology and Cell Biology 83,396-404(2005)。
在一些優(yōu)選方面，根據(jù)本文提供的方法處理生物假體組織顯著降低人對象中組織的抗原性。在進一步的方面，根據(jù)本文提供的方法處理生物假體組織使該組織在人對象中基本上是非抗原性的。在再進一步的方面，本文提供的方法顯著降低人兒童對象中組織的抗原性和/或致使組織在人兒童對象中基本上是非抗原性的。
在一些方面，根據(jù)本發(fā)明方法處理的生物假體組織用固定劑處理過。如本文中所使用的，術(shù)語“固定的”或“固定”一般是指用化學(xué)劑(固定劑)處理生物組織的過程，其在結(jié)構(gòu)內(nèi)和結(jié)構(gòu)間形成分子間和分子內(nèi)交聯(lián)，以穩(wěn)定組織結(jié)構(gòu)并防止降解。例如，通過防止蛋白酶接近可能的底物蛋白所需的解折疊和變性，固定降低組織對蛋白酶剪切的易感性。戊二醛、甲醛、雙醛淀粉和其它醛交聯(lián)劑是在準備外科手術(shù)植入過程中用于處理生物假體組織的最常用的固定劑。雖然用固定劑進行固定對于穩(wěn)定組織是期望的，但固定也會在組織中產(chǎn)生反應(yīng)性化學(xué)部分，其能夠結(jié)合鈣、磷酸鹽、免疫原性因子或其它的鈣化前體。例如，戊二醛固定產(chǎn)生高濃度的游離醛，其本質(zhì)上是有毒性的，而且可以進一步被氧化，以形成帶負電荷的羧酸基團，該羧酸基團充當帶正電荷的鈣離子的可能結(jié)合位點。
如本文中所使用的，術(shù)語“鈣化”意為一種或多種鈣化合物諸如磷酸鈣、鈣羥基磷灰石和/或碳酸鈣在生物假體組織內(nèi)的沉積，其會導(dǎo)致不期望的生物假體的硬化和/或降解。盡管鈣化的確切機制還不清楚，但通常已知鈣化是由血漿鈣離子與游離醛、磷脂和其它組織成分的相互作用而發(fā)生在生物假體組織中。另外，生物假體組織在兒童對象中尤其易于鈣化。鈣化就生物假體組織而言可以是內(nèi)在的或外在的。內(nèi)在的鈣化以鈣和磷酸鹽離子在生物假體組織諸如胞外基質(zhì)和剩余細胞內(nèi)的位點沉淀為特征。外在的鈣化以鈣和磷酸鹽離子通過，例如血栓形成或表面斑塊的發(fā)展，在生物假體組織上外部位點上的沉淀為特征。有利地，本文提供的方法同時降低內(nèi)在和外在形式的鈣化。
在一些優(yōu)選方面，根據(jù)本文提供的方法處理生物假體組織顯著降低該組織中的鈣化水平和/或該組織在人對象中鈣化的傾向。在進一步優(yōu)選的方面，根據(jù)本文提供的方法處理生物假體組織致使組織在人對象中基本上是非鈣化的。在再進一步的方面，本文提供的方法顯著降低組織鈣化的水平和/或組織鈣化的傾向和/或致使組織在人兒童對象中基本上是非鈣化的。
本發(fā)明方法對降低和/或消除異種抗原、游離醛和/或鈣化(或鈣化的傾向)的作用可利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種方法檢測?？乖蕴妓衔锏臏p少可以通過， 例如直接半乳糖分析(a -GAL表位)、免疫組織化學(xué)染色(例如，利用抗_ a -GAL和/或抗-Neu5GC抗體)和常規(guī)組織學(xué)來監(jiān)測。游離醛在組織中的水平可以利用比色試劑諸如4-氨基-3-肼基-5-巰基(mercato) _1，2，4-三唑(可以商品名PURPALD獲得)經(jīng)分光光度測定被測量，所述比色試劑與醛特異地反應(yīng)，以產(chǎn)生著色的6-巰基-均三唑并-(4，3-b)-對稱四嗪，其可在550nm處檢測，如在例如Dickinson和Jacobsen, Cem. Commun.，1719(1970)中描述的。生物假體組織中游離醛濃度的降低也可以被測量為組織毒性的降低。例如，生物假體組織(或其樣品)可用作用于接種培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞的底物，并且，內(nèi)皮細胞單細胞層在生物假體組織底物上的生長可以提供組織中殘留醛的數(shù)量和濃度的敏感生物指示物。
生物假體組織鈣化的程度可以利用本領(lǐng)域已知的各種方法諸如分光光度法(例如，由 Mirzaie 等.,Ann. Thorac. Cardiovasc. Surg. , 13:2 (2007)所描述的)和光譜法(例如，硝酸灰化后的電感應(yīng)耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS))進行測量。組織鈣化也可以通過組織學(xué)染色(例如，Von Kossa染色)或通過使用鈣化指示物(例如，鉻黑T、紫脲酸銨或鄰甲酹酞，如在例如Sarkar等，Anal Biochem, 20:155-166 (1967)中所描述的)進行分析。另外，心臟瓣膜生物假體植入物的鈣化可通過組織機械特點的相關(guān)變化來檢測，諸如硬化增加，其可被目測和/或利用本領(lǐng)域中已知的各種方法來測量。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將熟悉這些和其它方法。
如本文中所使用的，術(shù)語“生物假體”是指被植入到哺乳動物對象，優(yōu)選地人對象中并全部或部分源自動物或其它器官組織(一個或多個)的任何假體。本文提供的方法中應(yīng)用的生物假體植入物包括組織“補片(patches)”、心臟瓣膜和其它心臟成分、心替換物、 血管替換物或移植物、尿道和膀胱替換物、腸和組織切除術(shù)等等。
根據(jù)本文提供的方法處理的生物假體植入物可源自任何生物組織，包括但不限于心瓣膜、血管、皮膚、硬膜(dura mater)、心包膜、軟骨、韌帶和腱。在一些方面，用于制備生物假體植入物的組織根據(jù)柔韌性或剛性程度被選擇，所述柔韌性或剛性隨著組織內(nèi)存在的膠原和彈性蛋白的相對量、組織的結(jié)締組織構(gòu)架(例如，膠原和彈性蛋白纖維的排列)的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象和/或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其因子而變化。生物假體組織具有相對高水平的膠原，諸如心瓣膜組織和圍心組織，其被發(fā)現(xiàn)特別適于生物假體心瓣膜植入物。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到，本發(fā)明方法可以用于處理由任何合適的組織制造的生物假體植入物。
在一些優(yōu)選方面，生物假體植入物是心臟瓣膜植入物，其源自異種哺乳動物供體組織并意圖用于人對象。在進一步優(yōu)選的方面，生物假體植入物源自除了大猿或舊大陸猴以外的異種哺乳動物供體，諸如但不限于馬科動物供體、綿羊供體、豬供體或牛供體。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認識到，本發(fā)明方法特別有益于處理植入后降解和/或鈣化引起重要的臨床問題的那些假體(prostheses)。例如，在一些方面，生物假體植入物是心瓣膜，其由牛心包膜或豬主動脈瓣形成并被設(shè)計用于植入人對象。在再進一步優(yōu)選的方面，生物假體植入物源自異種哺乳動物供體組織并被設(shè)計用于植入人兒童對象。
根據(jù)本發(fā)明方法的“氧化劑”包括任何適于選擇性氧化具有鄰二醇的抗原性碳水化合物以產(chǎn)生游離醛或酸部分的溫和氧化劑。根據(jù)本公開內(nèi)容的氧化劑可以是鹵素系列氧化劑或過氧化物系列氧化劑等等。氧化劑的實例包括但不限于高碘酸、高碘酸的鹽諸如高碘酸鈉、四乙酸鉛、過氧化氫、亞氯酸鈉、次氯酸鈉、高錳酸鉀、氧、鹵素諸如溴和本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的其它氧化劑。
在一些方面，氧化劑是高碘酸鹽。根據(jù)本文提供的方法，“高碘酸鹽”是包含高碘酸鹽離子(IO4-)的化合物，如下面反應(yīng)方案所示地，所述高碘酸鹽離子能夠與抗原性碳水化合物的鄰二醇部分(I)進行反應(yīng)，產(chǎn)生兩個側(cè)醛部分(2)以及甲酸和H20。
權(quán)利要求
1.提高生物假體植入物性能的方法，所述方法包括用氧化劑處理生物假體組織，所述組織表達包含鄰二醇的抗原性碳水化合物，所述鄰二醇被所述氧化劑氧化以形成醛或酸，和用封端劑處理所述生物假體組織，所述封端劑包含伯胺或醇，其與所述醛或酸結(jié)合以形成亞胺、酰胺或酯。
2.權(quán)利要求I所述的方法，還包括用穩(wěn)定劑處理所述生物假體組織，所述劑將所述亞胺轉(zhuǎn)換成仲胺或?qū)⑺鲺マD(zhuǎn)換成酰胺。
3.權(quán)利要求I所述的方法，其中所述抗原性碳水化合物是N-羥乙酰神經(jīng)氨酸 (Neu5Gc)或福斯曼抗原(GalNAc a I, 3GalNAc β I, 3Gal α I, 4Gal β I, 4Glc_Cer)。
4.權(quán)利要求1-2任一項所述的方法，其中所述抗原性碳水化合物包含α-半乳糖基 (a -Gal)表位。
5.權(quán)利要求I或2所述的方法，其中所述氧化劑能夠相對于構(gòu)成所述生物假體組織的 β-氨基醇和鄰二酮基團選擇性地氧化所述抗原性碳水化合物的所述鄰二醇。
6.權(quán)利要求I或2所述的方法，其中所述氧化劑是高碘酸鹽或乙酸鹽。
7.權(quán)利要求6所述的方法，其中所述高碘酸鹽是高碘酸鈉。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述高碘酸鈉以20ηΜ的濃度被使用，并且其中所述生物假體組織用高碘酸鈉在大約25 ° C下處理約4小時。
9.權(quán)利要求1-2任一項所述的方法，其中所述封端劑是R4-M-NH2，其中R4是H、C1^6烷基、S (=0) 20R5、C1^6烷氧基或羥基；M是接頭，其中所述接頭是Cu亞烷基；和R5是H或CV6烷基。
10.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述封端劑是胺、烷基胺、羥基胺、氨基醚、氨基磺酸酯或其組合。
11.權(quán)利要求9所述的方法，其中R4是Cu烷氧基。
12.權(quán)利要求9所述的方法，其中R4是H。
13.權(quán)利要求9所述的方法，其中R4是S(=0)20R5和R5是H。
14.權(quán)利要求1-2任一項所述的方法，其中所述封端劑是乙醇胺、?；撬?、乙胺或2-甲氧基乙胺。
15.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述穩(wěn)定劑是還原劑。
16.權(quán)利要求15所述的方法，其中所述還原劑選自硼氫化鈉和氰基硼氫化鈉。
17.權(quán)利要求I或2所述的方法，其中所述生物假體組織在所述封端劑的存在下用所述氧化劑處理。
18.權(quán)利要求I或2所述的方法，其中所述生物假體組織在用所述穩(wěn)定劑處理之前被洗滌，以去除所述氧化劑。
19.權(quán)利要求1-2任一項所述的方法，其中所述生物假體組織已經(jīng)用一種或多種表面活性劑和固定劑進行了處理。
20.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述固定劑選自醛、二醛、二異氰酸酯、碳二亞胺、光氧化劑和聚環(huán)氧化合物。
21.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述表面活性劑選自陰離子表面活性劑、烷基磺酸鹽、聚氧乙烯醚、譜朗尼克或丁炔表面活性劑、和烷基化的苯氧基聚乙氧基醇。
22.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述生物假體組織已經(jīng)用戊二醛處理過。
23.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述生物假體組織已經(jīng)用表面活性劑和固定劑處理過。
24.權(quán)利要求1-2任一項所述的方法，其中所述生物假體植入物是心瓣膜。
25.權(quán)利要求24所述的方法，其中所述生物假體組織是牛心包膜或豬主動脈瓣。
26.權(quán)利要求25所述的方法，其中所述生物假體植入物是兒童心瓣膜。
27.權(quán)利要求1-2任一項所述的方法，其中所述被處理的生物假體組織在人宿主中基本上是非免疫原性的。
28.權(quán)利要求1-2任一項所述的方法，其中所述被處理的生物假體組織的所述抗原性碳水化合物在人宿主中基本上是非抗原性的。
29.權(quán)利要求1-2任一項所述的方法，其中所述被處理的生物假體組織在人宿主中基本上是非鈣化的。
30.權(quán)利要求29所述的方法，其中所述人宿主是兒童患者。
31.權(quán)利要求I所述的方法，還包括用一種或多種表面活性劑和固定劑處理所述生物假體組織。
32.權(quán)利要求31所述的方法，其中所述固定劑是醛固定劑。
33.權(quán)利要求32所述的方法，其中所述醛固定劑是戊二醛。
34.權(quán)利要求31所述的方法，其中所述固定劑是二酸或具有碳二亞胺(EDC)的二胺。
35.權(quán)利要求31所述的方法，其中所述固定劑是雙環(huán)氧化物。
36.權(quán)利要求1-2任一項所述的方法，其中所述生物假體組織是新鮮組織。
37.權(quán)利要求1-2任一項所述的方法，還包括用生物負載還原溶液處理所述生物假體組織，所述生物負載還原溶液包含甲醛、乙醇和吐溫 溶液。
38.權(quán)利要求1-2任一項所述的方法，還包括用乙醇和丙三醇干燥所述生物假體組織。
39.權(quán)利要求1-2任一項所述的方法，還包括用環(huán)氧乙烷對所述生物假體組織滅菌。
40.權(quán)利要求1-2任一項所述的方法，還包括用去細胞化方法使所述生物假體組織去細胞化，所述去細胞化方法包括用O. P/oSDS處理所述組織、沖洗所述組織和用DNAse處理所述組織。
41.權(quán)利要求1-2任一項所述的方法，還包括干燥和電泳清洗所述生物假體組織。
42.權(quán)利要求1-2任一項所述的方法，還包括用戊二醛對所述生物假體組織滅菌。
43.權(quán)利要求1-2任一項所述的方法，還包括用生物負載還原溶液處理所述生物假體組織，所述生物負載還原溶液包含乙醇和吐溫 溶液。
44.用于提高生物假體植入物性能的方法，所述方法包括如下步驟獲得生物假體組織，其中所述生物假體組織是新鮮組織；用包含戊二醛的固定劑固定所述生物假體組織；用生物負載還原溶液處理所述生物假體組織，所述生物負載還原溶液包含甲醛、乙醇和吐溫 溶液；用氧化劑處理所述生物假體組織，所述組織表達包含鄰二醇的抗原性碳水化合物，其中所述鄰二醇被氧化劑氧化以形成醛或酸；、用封端劑處理所述生物假體組織，其中所述封端劑包含伯胺或醇，其中所述伯胺與醛相互作用以形成亞胺，或與酸相互作用以形成酰胺；以及所述醇與酸相互作用以形成酯； 用穩(wěn)定劑處理所述生物假體組織，其中所述穩(wěn)定劑與所述亞胺相互作用以形成仲胺和與酯相互作用以形成酰胺；用乙醇和丙三醇干燥所述生物假體組織；和用環(huán)氧乙烷對所述生物假體組織滅菌。
45.用于提高生物假體植入物性能的方法，所述方法包括如下步驟獲得生物假體組織，其中所述生物假體組織是新鮮組織；使所述生物假體組織去細胞化；用包含戊二醛的固定劑固定所述生物假體組織；用生物負載還原溶液處理所述生物假體組織，所述生物負載還原溶液包含甲醛、乙醇和吐溫 溶液；用氧化劑處理所述生物假體組織，所述組織表達包含鄰二醇的抗原性碳水化合物，其中所述鄰二醇被氧化以形成·醛或酸；用封端劑處理所述生物假體組織，其中所述封端劑包含伯胺或醇，其中所述伯胺與醛相互作用以形成亞胺，或與酸相互作用以形成酰胺；和所述醇與酸相互作用以形成酯；用穩(wěn)定劑處理所述生物假體組織，其中所述穩(wěn)定劑與所述亞胺相互作用以形成仲胺和與所述酯相互作用以形成酰胺；干燥和電泳清洗所述生物假體組織；和用環(huán)氧乙烷對所述生物假體組織滅菌。
46.用于提高生物假體植入物性能的方法，所述方法包括如下步驟獲得生物假體組織，其中所述生物假體組織是新鮮組織；用包含戊二醛的固定劑固定所述生物假體組織；；用生物負載還原溶液處理所述生物假體組織，所述生物負載還原溶液包含甲醛、乙醇和吐溫 溶液；用氧化劑處理所述生物假體組織，所述組織表達包含鄰二醇的抗原性碳水化合物，其中所述鄰二醇被氧化以形成醛或酸；用封端劑處理所述生物假體組織，其中所述封端劑包含伯胺或醇，其中所述伯胺與所述醛相互作用以形成亞胺，或與酸相互作用以形成酰胺；和所述醇與所述酸相互作用以形成酯；用穩(wěn)定劑處理所述生物假體組織，其中所述穩(wěn)定劑與所述亞胺相互作用以形成仲胺和與所述酯相互作用以形成酰胺；和用戊二醛對所述生物假體組織滅菌。
47.用于提高生物假體植入物性能的方法，所述方法包括如下步驟獲得生物假體組織，其中所述生物假體組織是新鮮組織；使所述生物假體組織去細胞化；用生物負載還原溶液處理所述生物假體組織，所述生物負載還原溶液包含乙醇和吐溫 溶液；用氧化劑處理所述生物假體組織，所述組織表達包含鄰二醇的抗原性碳水化合物，其中所述鄰二醇被高碘酸鹽氧化以形成醛或酸；用封端劑處理所述生物假體組織，其中所述封端劑包含伯胺或醇，其中所述伯胺與所述醛相互作用以形成亞胺，或與酸相互作用以形成酰胺；和所述醇與所述酸相互作用以形成酯；用穩(wěn)定劑處理所述生物假體組織，其中所述穩(wěn)定劑與所述亞胺相互作用以形成仲胺和與所述酯相互作用以形成酰胺；干燥和電泳清洗所述生物假體組織；和用環(huán)氧乙烷對所述生物假體組織滅菌。
48.權(quán)利要求44-47任一項所述的方法，其中所述氧化劑是高碘酸鹽。
49.權(quán)利要求44-48任一項所述的方法，其中所述穩(wěn)定劑是還原劑。
50.權(quán)利要求44-49任一項所述的方法，還包括利用制造設(shè)備從所述生物假體組織至少部分地制備生物假體產(chǎn)品或裝置。
51.用于提高生物假體植入物性能的方法，所述方法包括如下步驟獲得生物假體組織，其中所述生物假體組織是新鮮組織；使所述生物假體組織去細胞化；用包含戊二醛的固定劑固定所述生物假體組織；使所述組織暴露于初始生物負載還原溶液；利用制造設(shè)備從所述生物假體組織至少部分地制備生物假體產(chǎn)品或裝置；用第二生物負載還原溶液處理所述至少部分制備的生物假體組織產(chǎn)品或裝置，所述第二生物負載還原溶液包含甲醛、乙醇和吐溫 溶液；用高碘酸鹽處理所述至少部分制備的生物假體組織產(chǎn)品或裝置，其中所述組織表達包含鄰二醇的抗原性碳水化合物，并且其中所述鄰二醇被高碘酸鹽氧化以形成醛；用封端劑處理所述生物假體組織，其中所述封端劑包含伯胺，并且其中所述伯胺與所述醛反應(yīng)以形成亞胺；用還原劑處理所述生物假體組織，其中所述還原劑與所述亞胺反應(yīng)以形成仲胺；干燥所述生物假體組織；和用環(huán)氧乙烷對所述至少部分制備的生物假體產(chǎn)品或裝置滅菌。
全文摘要
本文提供用于這樣的方法，其通過氧化鄰二醇以形成醛或酸并隨后還原胺化醛以形成穩(wěn)定的仲胺或酰胺化或酯化酸以形成穩(wěn)定的酰胺或酯來修飾異種生物假體組織內(nèi)的抗原性碳水化合物表位。有利地，本文提供的方法減輕生物假體組織的抗原性同時使整體組織結(jié)構(gòu)基本上不受干擾，從而增強生物假體植入物的耐用性、安全性和性能。
文檔編號A61L2/16GK102946916SQ201180029720
公開日2013年2月27日 申請日期2011年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月17日
發(fā)明者J·S·德夫, T·托德 申請人:愛德華茲生命科學(xué)公司