專利名稱：：靶向ebv-lmp1的脫氧核酶在制備治療ebv相關(guān)實(shí)體瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種脫氧核酶的醫(yī)藥用途，具體地是一種靶向EBV-LMP1的脫氧核酶的醫(yī)藥用途。
背景技術(shù)：
：EB(Epstein-Barr)病毒是一種與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的外部致病因子，它除了與鼻咽癌、Burkitt淋巴瘤、HIV感染或其他免疫抑制疾病有關(guān)的B淋巴細(xì)胞瘤、T細(xì)胞淋巴瘤、Hodgkin病的發(fā)病有關(guān)外，最近的研究發(fā)現(xiàn)EB病毒還與肺癌、胃癌、乳腺癌、膽管癌、平滑肌瘤、結(jié)腸癌、前列腺癌等多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)["。其中鼻咽癌是--'種具有種族和地理分布差異的上皮細(xì)胞性惡性腫瘤，在中國(guó)南方人群中發(fā)病率比白種人高100倍以上[4'51。鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展與EBV(EB病毒)感染密切相關(guān)16，71,EBV編碼的癌蛋白LMP1(LatentMembraneProtein)在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有重要作用，并且在鼻咽癌病人中，LMP1陽(yáng)性率髙達(dá)75W以上W。在EBV相關(guān)腫瘤中EBV基因組的持續(xù)存在為腫瘤治療提供了一個(gè)新的以病毒為靶的基因治療策略。LMP1是EBV編碼的目前已被確證的具有瘤基因功能的與原代B細(xì)胞、鼠成纖維細(xì)胞和人上皮細(xì)胞等轉(zhuǎn)化有關(guān)的致瘤蛋白，在EBV相關(guān)腫瘤的發(fā)病中起著重要作用。本發(fā)明的發(fā)明人對(duì)LMPl在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的作用進(jìn)行了大量研究，己經(jīng)證實(shí)LMPl主要介導(dǎo)NF-kB、AP-1和STAT三條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及這些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之間的信息交流(cross-talk),導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂、凋亡阻滯和細(xì)胞增殖失控[9_121。目前，以LMPl為靶點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)研究正在興起。在EBV陽(yáng)性的鼻咽癌細(xì)胞系C666中，應(yīng)用RNAi技術(shù)抑制LMPl的表達(dá)能夠顯著抑制細(xì)胞的侵襲潛能131。在EBV陽(yáng)性的鼻咽癌細(xì)胞系C611中，應(yīng)用RNAi技術(shù)抑制LMPl的表達(dá)能夠顯著抑制細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)14。應(yīng)用反義核酸技術(shù)抑制LMPl的表達(dá)能夠抑制EBV感染的B細(xì)胞的增殖，并且能夠調(diào)節(jié)一些表面分子的表達(dá)115，161。我們的研究也證實(shí)，將LMPl的反義核酸表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入鼻咽癌細(xì)胞中，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11。脫氧核酶(deoxyribozyme/DNAzyme)是利用體外分子進(jìn)化技術(shù)獲得的一種具有催化功能的單鏈DNA片段，具有高效的催化活性和結(jié)構(gòu)識(shí)別能力。自1994年Breaker等首次發(fā)現(xiàn)脫氧核酶以來(lái)，迄今為止己發(fā)現(xiàn)了多種不同類型的脫氧核酶[26'27。脫氧核酶化學(xué)本質(zhì)為寡脫氧核苷酸，因而性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定。其結(jié)構(gòu)特征為分子量小，相對(duì)簡(jiǎn)單。從酶學(xué)角度上，其對(duì)底物的趨近性好，催化效率和特異性高。在實(shí)際應(yīng)用方面，脫氧核酶的副作用低，靶位點(diǎn)選擇的限制少，易于合成且價(jià)格低廉。設(shè)計(jì)不同的脫氧核酶可以切割任何mRNA，從而調(diào)控蛋白質(zhì)的表達(dá)。作為一種新型的RNA水平強(qiáng)效基因滅活因子，脫氧核酶為治療腫瘤、病毒感染性疾病以及其它相關(guān)疾病提供了一條全新的策略[28'3()。申請(qǐng)人公開(kāi)了如何通過(guò)利用生物信息學(xué)技術(shù)、二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件結(jié)合LMP1的功能域?qū)ふ野形稽c(diǎn)，并構(gòu)建靶向LMP1的脫氧核酶的方法。參考文獻(xiàn)31，本申請(qǐng)人具體公開(kāi)了在B95-8細(xì)胞中篩選出3條有活性的脫氧核酶(DZ1、DZ7和DZ10)，能夠有效抑制LMP1的表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[31]。其中3條有活性的脫氧核酶的DNA序列如下SEQN0.1:gcaaaggaaGGCTAGCTACAACGAagaggacaa(Dzl)SEQN0.2:agggagtcaGGCTAGCTACAACGAcgtggtggt(Dz7)SEQN0.3:cgtgttccaGGCTAGCTACAACGAggtcagggt(Dzl0)為了增加脫氧核酶在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性，可以通過(guò)修飾的方法實(shí)現(xiàn)?，F(xiàn)有技術(shù)中公開(kāi)了對(duì)脫氧核酶進(jìn)行修飾的方法，以避免脫氧核酶被酶解，參見(jiàn)文獻(xiàn)32，33。另一方面，放射治療是腫瘤治療的主要方法之一,尤其對(duì)鼻咽癌病人的治療多以放射治療為主。但是長(zhǎng)期放療易誘導(dǎo)放療抵抗[17—191。提高腫瘤病灶對(duì)放射的敏感性是提高放射療效的主要手段。放射增敏劑是一類當(dāng)與放療聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，能增加放射線致死效應(yīng)的化學(xué)物質(zhì)。其研究始于上世紀(jì)50年代中期，對(duì)放射增敏劑的研究，主要是通過(guò)增加乏氧細(xì)胞對(duì)放射的敏感性而提高放療效果。最近有研究表明，抗病毒藥物Cidofovir能夠下調(diào)病毒癌基因(LMP1、EBNA-2)的表達(dá)，并增強(qiáng)EBV相關(guān)腫瘤對(duì)放療的敏感性12，對(duì)放療抵抗的分子機(jī)制研究表明，腫瘤細(xì)胞對(duì)放療抵抗與細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子NF-kB的活化密切相關(guān)。導(dǎo)入ik-Ba的顯性突變體阻斷NF-kB的弄?；罨?，能增敏放射線誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞的凋亡[21]。活化的NF-icB通過(guò)調(diào)節(jié)其下游的耙分子包括調(diào)節(jié)細(xì)胞周期行進(jìn)的基因(如CyclinBl，Cycl函)、抗凋亡基因(如Survivin，HIAP)、以及DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因(如p53,Ku86)等，而參與細(xì)胞的放療抵抗[22'23。申請(qǐng)人的前期研究進(jìn)展表明，EBV-LMP1可能通過(guò)異?；罨疦F-kB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，反式激活關(guān)鍵靶分子p53和Survivin，抑制Cdc2/CyclinBl激酶活性，參與細(xì)胞G2/M期阻滯的調(diào)控，進(jìn)而介導(dǎo)放射拮抗性的產(chǎn)生。這些前期工作提示阻斷LMP1的表達(dá)，則可能抑制LMP1陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞中異?；罨腘F-icB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而調(diào)節(jié)其下游分子p53、Survivin和Cdc2/CyclinBl的活性，促進(jìn)細(xì)胞越過(guò)G2/M期檢查點(diǎn)(checkpoint),促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而增強(qiáng)其對(duì)放療的敏感性[24'25]。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供技術(shù)方案就是靶向EBV-LMP1的脫氧核酶在制備治療EBV相關(guān)實(shí)體腫瘤藥物中的應(yīng)用。本申請(qǐng)發(fā)明人將已經(jīng)獲得的三種靶向LMP1的脫氧核酶DZ1、DZ7、DZ10轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞CNE1-LMP1。結(jié)果顯示脫氧核酶DZ1、DZ7、DZ10仍能顯著抑制鼻咽癌細(xì)胞LMP1的表達(dá)(圖1)。本發(fā)明的實(shí)施例中還說(shuō)明，活性脫氧核酶能夠誘導(dǎo)CNE1-LMP1細(xì)胞凋亡(圖3A)，以及在24h均能顯著抑制細(xì)胞增殖，并具有劑量依賴性(表l)。表1.活性脫氧核酶抑制CNE1-LMP1細(xì)胞增殖<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>在細(xì)胞水平確定活性脫氧核酶的生物學(xué)效應(yīng)與細(xì)胞增殖和凋亡密切相關(guān)的基礎(chǔ)上，發(fā)明人進(jìn)一步從體內(nèi)水平評(píng)價(jià)活性脫氧核酶的生物學(xué)效應(yīng)。發(fā)明人選擇活性脫氧核酶DZ1為手段，應(yīng)用瘤體內(nèi)多點(diǎn)注射技術(shù)來(lái)觀察活性脫氧核酶對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，脫氧核酶處理組明顯抑制腫瘤的生長(zhǎng)，而對(duì)裸鼠的體重影響不大(圖5)。對(duì)于鼻咽癌，由于其部位的特殊性，使得局部給藥的手段容易實(shí)現(xiàn)。例如可以采用噴霧的方法，將藥物直接作用與鼻咽部。從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，靶向LMP1的脫氧核酶，不但具有現(xiàn)有技術(shù)中公開(kāi)的對(duì)非實(shí)體腫瘤，例如B淋巴細(xì)胞瘤，抑制和促進(jìn)其凋亡的作用，而且對(duì)實(shí)體瘤細(xì)胞也具有的抑制和促進(jìn)其凋亡的作用，更重要的是，對(duì)實(shí)體瘤細(xì)胞的作用較對(duì)B淋巴細(xì)胞瘤的作用更強(qiáng)。本發(fā)明人還對(duì)靶向LMP1的脫氧核酶抗腫瘤的機(jī)理進(jìn)行了研究。1、確定活性脫氧核酶抑制CNE1-LMP1細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路前期大量研究表明，在鼻咽癌細(xì)胞中，LMP1能夠活化NF-kB、AP-1和JAK/STAT三條信號(hào)傳導(dǎo)通路及信號(hào)傳導(dǎo)通路之間的信息交流(Cross-talk)，介導(dǎo)下游靶基因的活化，進(jìn)而發(fā)揮其功能。因此，在證實(shí)構(gòu)建的脫氧核酶能夠下調(diào)LMP1的表達(dá)的基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步研究這些脫氧核酶能否下調(diào)被LMP1異常激活的信號(hào)傳導(dǎo)通路。我們選擇在細(xì)胞內(nèi)有效的脫氧核酶，應(yīng)用TMP為轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)入LMP1陽(yáng)性的鼻咽癌細(xì)胞CNE1-LMP1中；以未轉(zhuǎn)染脫氧核酶的細(xì)胞為對(duì)照，轉(zhuǎn)染不同時(shí)間后，提取總蛋白，應(yīng)用WesternWot檢測(cè)NF-KBp65、Ik-Bcuc-jun、磷酸化JNK、Stat3、STAT3-Tyr(705)-p等的表達(dá)。結(jié)果表明，活性脫氧核酶抑制LMP1的表達(dá)后，lK-Ba的表達(dá)升高，而NF-kBp65的表達(dá)減少；表明LMP1的表達(dá)減少后，lK-Bot的磷酸化降解減少，從而使得lK-Ba聚集，抑制了NF-kB的活性，下調(diào)NF-kb信號(hào)通路(圖2，A)。并且，活性脫氧核酶抑制LMP1的表達(dá)后，JNK磷酸化水平下調(diào)，c-Jun的表達(dá)亦下降，表明活性脫氧核酶能夠抑制被LMP1異?；罨腁P-1信號(hào)通路(圖2,B)。同時(shí)，活性脫氧核酶抑制LMP1的表達(dá)后，磷酸化的Stat3水平亦顯著下調(diào)，而總Stat3的表達(dá)沒(méi)有明顯的改變；表明活性脫氧核酶阻斷LMP1的表達(dá)后，抑制Stat3的磷酸化，從而抑制JAK7STAT信號(hào)通路(圖2，C)。2、活性脫氧核酶誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞中Caspase的活化為了進(jìn)一步明確脫氧核酶對(duì)細(xì)胞凋亡的影響的分子機(jī)制，我們應(yīng)用比色法檢測(cè)脫氧核酶處理后CNE1-LMP1細(xì)胞中的Caspase-3，-9,-8的活性。我們將活性脫氧核酶瞬時(shí)轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞，以lOOpg/L的TNF-a誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡為陽(yáng)性對(duì)照；按Caspase-3,-9，-8ColorimetricAssayKit試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，405nrn比色檢測(cè)Caspase-3，-9，-8的活性。結(jié)果顯示脫氧核酶處理12h后，Caspase-3，-9，-8的活性均升高，但Caspase-3，-9的活性升高比Caspase-8更顯著，表明脫氧核酶誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可能通過(guò)線粒體通路和死亡受體通路兩條凋亡通路，但主要通過(guò)線粒體通路(圖4)。3、活性脫氧核酶誘導(dǎo)CNE1-LMP1細(xì)胞凋亡在證實(shí)活性脫氧核酶能夠抑制LMP1的表達(dá)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的基礎(chǔ)上，本發(fā)明人進(jìn)一步研究了活性脫氧核酶誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制是否與Bcl-2的表達(dá)相關(guān)。結(jié)果顯示3條有效的脫氧核酶均能顯著抑制Bcl-2的表達(dá)(圖3B)。除了所述的靶向LMP1脫氧核酶能夠誘導(dǎo)EBV相關(guān)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制其生長(zhǎng)夕卜，更令人驚奇的是，靶向LMP1脫氧核酶能夠作為放射治療的增敏劑。因此，本發(fā)明還提供靶向EBV-LMP1的脫氧核酶在制備與EBV相關(guān)腫瘤放射治療增敏劑中的應(yīng)用。放射治療增敏劑在醫(yī)藥領(lǐng)域中被認(rèn)為是一種藥物。因此，靶向EBV-LMP1的脫氧核酶的這一用途是其在制備治療EBV相關(guān)實(shí)體腫瘤藥物中應(yīng)用的一種具體方式。本申請(qǐng)實(shí)施例中，本發(fā)明人以鼻咽癌為對(duì)象研究發(fā)現(xiàn)，在EBV相關(guān)實(shí)體腫瘤進(jìn)行放射治療的同時(shí)，施以耙向LMP1脫氧核酶能夠增強(qiáng)放射治療的效果。實(shí)施例中的結(jié)果表明，與單獨(dú)放療或單獨(dú)脫氧核酶處理相比，脫氧核酶與放療聯(lián)合應(yīng)用能夠顯著增強(qiáng)放射線誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并且具有劑量依賴性。在5Gy時(shí)，80%的細(xì)胞發(fā)生凋亡(圖6)。選擇2Gy的放療劑量與活性脫氧核酶聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，觀察上述3條活性脫氧核酶與放療聯(lián)合應(yīng)用對(duì)鼻咽癌細(xì)胞CNE1-LMP1的影響。結(jié)果表明，與單獨(dú)脫氧核酶或放療相比，3條活性脫氧核酶均能顯著增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)放療的敏感性(圖7)。在證實(shí)活性脫氧核酶能夠增強(qiáng)鼻咽癌細(xì)胞對(duì)放療的敏感性的基礎(chǔ)上，本發(fā)明人進(jìn)一步觀察脫氧核酶與放療聯(lián)合應(yīng)用對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的增殖活性的影響。結(jié)果表明，與對(duì)照組及單獨(dú)脫氧核酶或放療組相比，脫氧核酶與放療聯(lián)合處理組顯著抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖(圖8);克隆形成率亦顯著減少(圖9)。在細(xì)胞水平明確脫氧核酶與放療聯(lián)合處理能夠抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞對(duì)放療的敏感性的基礎(chǔ)上，發(fā)明人進(jìn)一步研究了脫氧核酶與放療聯(lián)合應(yīng)用對(duì)鼻咽癌裸鼠移植瘤的影響。結(jié)果表明，與對(duì)照相比，脫氧核酶與放療聯(lián)合應(yīng)用能夠顯著抑制裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)(圖11)本發(fā)明中，發(fā)明人通過(guò)研究找到了靶向LMP1脫氧核酶非常重要的抗腫瘤用途，尤其令人意想不到的是該類脫氧核酶能作為放射治療的增敏劑，并且有非常好的效果，為治療EBV相關(guān)腫瘤提供了新型工具。圖1耙向LMP1的活性脫氧核酶下調(diào)鼻咽癌細(xì)胞CNE1-LMP1中LMP1的表達(dá).A為應(yīng)用western從蛋白質(zhì)水平檢測(cè)LMP1表達(dá)的結(jié)果，B為應(yīng)用RT-PCR從mRNA水平檢測(cè)LMP1表達(dá)的結(jié)果；圖2活性脫氧核酶抑制CNE1-LMP1細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。A活性脫氧核酶能夠下調(diào)NF-kB信號(hào)通路；B，活性脫氧核酶能夠抑制被LMP1異?；罨腁P-1信號(hào)通路;C，活性脫氧核酶能夠抑制JAK/STAT信號(hào)通路；圖3活性脫氧核酶誘導(dǎo)CNE1-LMP1細(xì)胞凋亡.A,流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)脫氧核酵能夠誘導(dǎo)CNE1-LMP1細(xì)胞凋亡；B，Western證實(shí)脫氧核酶能顯著抑制Bcl-2的表達(dá)；圖4活性脫氧核酶誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞中Caspase的活化；圖5靶向LMP1的活性脫氧核酶抑制鼻咽癌裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)；圖6耙向LMP1的活性脫氧核酶DZ1劑量依賴性導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡率比較圖；圖7耙向LMP1的活性脫氧核酶誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組比較圖；圖8MTT分析證實(shí)脫氧核酶與放療聯(lián)合處理組顯著抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖；圖9克隆形成實(shí)驗(yàn)證實(shí)脫氧核酶與放療聯(lián)合處理組顯著抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖；圖10靶向LMP1的脫氧核酶與放療聯(lián)合應(yīng)用能夠顯著抑制裸鼠腫瘤的生長(zhǎng)。具體實(shí)施方式本實(shí)施例中實(shí)驗(yàn)操作部分來(lái)源于(1)Westernblotting、RT-PCR、MTT、免疫組化技術(shù)和HE染色等操作步驟均按《MolecularCloning》第3版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(ColdSpringHarborLaboratoryPress)所提供的方法進(jìn)行。(2)流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，0.02%EDTA和0.25%胰酶消化，收集細(xì)胞計(jì)數(shù)，接種6孔板，待60%-80%融合后，選擇在細(xì)胞內(nèi)有效的脫氧核酶，應(yīng)用TMP轉(zhuǎn)入脫氧核酶，脫氧核酶終濃度為2umol/L;轉(zhuǎn)染不同時(shí)間后收集細(xì)胞，PBS洗滌后用70%乙醇，4'C固定30min，1XPBS洗1次，800rpm離心5min,收集細(xì)胞，0.2M檸檬酸/擰檬酸鈉高滲處理30min，1XPBS洗2次，0.1%Triton/PBS洗1次，再用500pg/ml碘化丙啶(PI)和0.1%RNaseA于室溫下，避光孵育30min，應(yīng)用FACSort(BectonDickinson)檢測(cè)，CELLQuest軟件分析。(3)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)參考《基因治療的原理和實(shí)踐》，杜寶恒，天津科學(xué)技術(shù)出版社,2001,1,80-83。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，脫氧核酶終濃度為2pmol/L;在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，脫氧核酶的給藥量為5mg/kg體重。實(shí)施例1一、靶向LMP1的活性脫氧核酶下調(diào)鼻咽癌細(xì)胞CNE1-LMP1中LMP1的表達(dá)首先應(yīng)用TMP為轉(zhuǎn)染試劑，將這3條脫氧核酶(DZ1、DZ7、DZ10)及對(duì)照(CON)轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞CNE1-LMP1，終濃度為2pM，24h后，提取總蛋白和總RNA，分別應(yīng)用Westernblotting和RT-PCR從蛋白水平和RNA水平檢測(cè)脫氧核酶的催化活性。圖1結(jié)果顯示，脫氧核酶DZ1、DZ7、DZ10仍能顯著抑制鼻咽癌細(xì)胞LMP1的表達(dá)。二、確定活性脫氧核酶抑制CNE1-LMP1細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路應(yīng)用TMP為轉(zhuǎn)染試劑，將脫氧核酶DZ1，DZ7，DZ10轉(zhuǎn)入LMP1陽(yáng)性的鼻咽癌細(xì)胞CNE1-LMP1中；以未轉(zhuǎn)染脫氧核酶的細(xì)胞為對(duì)照，轉(zhuǎn)染不同時(shí)間后，提取總蛋白，應(yīng)用Westernblot檢測(cè)NF-KBp65、Ik-Bouc如n、磷酸化JNK、Stat3、STAT3-Tyr(705)-p等的表達(dá)。結(jié)果表明，見(jiàn)圖2，A，活性脫氧核酶抑制LMP1的表達(dá)后，lK-Ba的表達(dá)升高，而NF-KBp65的表達(dá)減少；表明LMP1的表達(dá)減少后，Ik-Boc的磷酸化降解減少，從而使得ik-Ba聚集，抑制了NF-kB的活性，下調(diào)nf-kb信號(hào)通路。并且，見(jiàn)圖2,b，活性脫氧核酶抑制LMP1的表達(dá)后，JNK磷酸化水平下調(diào)，c-Jun的表達(dá)亦下降，表明活性脫氧核酶能夠抑制被LMP1異?；罨腁P-1信號(hào)通路。同時(shí)，活性脫氧核酶抑制LMP1的表達(dá)后，磷酸化的Stat3水平亦顯著下調(diào)，而總Stat3的表達(dá)沒(méi)有明顯的改變；表明活性脫氧核酶阻斷LMP1的表達(dá)后，抑制Stat3的磷酸化，從而抑制JAK/STAT信號(hào)通路，見(jiàn)圖2，C。三、活性脫氧核酶抑制CNE1-LMP1細(xì)胞增殖應(yīng)用TMP為轉(zhuǎn)染試劑，將脫氧核酶DZ1，DZ7，DZ10轉(zhuǎn)入LMP1陽(yáng)性的鼻咽癌細(xì)胞CNE1-LMP1中，以未轉(zhuǎn)染脫氧核酶的細(xì)胞為對(duì)照，轉(zhuǎn)染不同時(shí)間后，應(yīng)用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性，結(jié)果表明3條有效的脫氧核酶在24h均能顯著抑制細(xì)胞增殖，并具有劑量依賴性；而對(duì)照對(duì)細(xì)胞增殖活性無(wú)影響。四、活性脫氧核酶抑制CNE1-LMP1細(xì)胞的細(xì)胞周期行進(jìn)應(yīng)用TMP為轉(zhuǎn)染試劑，將脫氧核酶DZl,DZ7，DZ10轉(zhuǎn)入LMP1陽(yáng)性的鼻咽癌細(xì)胞CNE1-LMP1中，以未轉(zhuǎn)染脫氧核酶的細(xì)胞為對(duì)照；轉(zhuǎn)染后分別于不同時(shí)間收獲細(xì)胞，乙醇固定；PI染色，應(yīng)用流式細(xì)胞儀(FACS420)檢測(cè)細(xì)胞周期。結(jié)果表明，在CNE,LMP1細(xì)胞中，靶向LMP1的脫氧核酶主要引起細(xì)胞周期S期增加，G2/M期和Go/G,期細(xì)胞均減少(表2)。表2.活性脫氧核酶抑制CNE1-LMP1細(xì)胞的細(xì)胞周期行進(jìn)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>五、活性脫氧核酶誘導(dǎo)CNE1-LMP1細(xì)胞凋亡應(yīng)用TMP為轉(zhuǎn)染試劑，將脫氧核酶DZ1，DZ7，DZ10轉(zhuǎn)入LMP1陽(yáng)性的鼻咽癌細(xì)胞CNE1-LMP1中，以未轉(zhuǎn)染脫氧核酶的細(xì)胞為對(duì)照；轉(zhuǎn)染后分別于不同時(shí)間收獲細(xì)胞，乙醇固定；PI染色，應(yīng)用流式細(xì)胞儀(FACS420)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果見(jiàn)表3，表明，活性脫氧核酶能夠誘導(dǎo)CNE1-LMP1細(xì)胞凋亡(圖3A)。表3細(xì)胞凋亡％CellTMPDZ1DZ7DZ10CONCNE15.42±0.0283.83±0.284.04±1.534.17±0.344.63±0.964.86±0.304CNE1-LMP10.59±0.0352.4±0.4721.57±2.3119.45±0.9218.74±3.442.87±1.24應(yīng)用Westernblotting檢測(cè)活性脫氧核酶處理的鼻咽癌細(xì)胞CNE1-LMP1細(xì)胞中Bd-2的表達(dá)，結(jié)果顯示3條有效的脫氧核酶均能顯著抑制Bcl-2的表達(dá)(圖3B)。六、活性脫氧核酶誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞中Caspase的活化將活性脫氧核酶瞬時(shí)轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞，以100pg/L的TNF-a誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡為陽(yáng)性對(duì)照；按Caspase-3，-9，-8ColorimetricAssayKit試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，405nrn比色檢測(cè)Caspase-3,-9，-8的活性。結(jié)果顯示脫氧核酶處理12h后，Caspase-3,-9,-8的活性均升高，但Caspase-3，-9的活性升高比Caspase-8更顯著，表明脫氧核酶誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可能通過(guò)線粒體通路和死亡受體通路兩條凋亡通路，但主要通過(guò)線粒體通路，結(jié)果見(jiàn)表4。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>七、靶向LMP1的活性脫氧核酶抑制鼻咽癌裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)選擇活性脫氧核酶DZ1為手段，應(yīng)用已知的瘤體內(nèi)多點(diǎn)注射技術(shù)來(lái)觀察活性脫氧核酶對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響。鼻咽癌細(xì)胞CNE1-LMP1接種Balb/c雌性裸鼠成瘤，在接種第8天可見(jiàn)腫瘤生長(zhǎng)，第16天平均腫瘤體積達(dá)到80-100mm3時(shí)，開(kāi)始進(jìn)行瘤體內(nèi)多點(diǎn)注射，每周兩次；共給藥6次。每周測(cè)兩次腫瘤的大小和體積。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，脫氧核酶處理組明顯抑制腫瘤的生長(zhǎng)，而對(duì)裸鼠的體重影響不大(圖5)。實(shí)施例2靶向LMP1的活性脫氧核酶增強(qiáng)彝咽癌對(duì)放療的敏感性一、靶向LMP1的活性脫氧核酶增強(qiáng)鼻咽癌細(xì)胞對(duì)放療的敏感性脫氧核酶DZ1轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞CNE1-LMP1,轉(zhuǎn)染24h后，分別給予不同劑量(OGy，0.5Gy，lGy，2Gy，5Gy)的放射處理，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果見(jiàn)表5，表明與單獨(dú)放療或單獨(dú)脫氧核酶處理相比，脫氧核酶與放療聯(lián)合應(yīng)用能夠顯著增強(qiáng)放射線誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并且具有劑量依賴性，在5Gy時(shí)，80%的細(xì)胞發(fā)生凋亡(圖6)。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>隨后，選擇2Gy的放療劑量與活性脫氧核酶聯(lián)合應(yīng)用，觀察3條活性脫氧核酶與放療聯(lián)合應(yīng)用對(duì)鼻咽癌細(xì)胞CNE1-LMP1的影響。結(jié)果見(jiàn)表6，該數(shù)據(jù)表明，與單獨(dú)脫氧核酶或放療相比，3條活性脫氧核酶均能顯著增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)放療的敏感性(圖7)。表6細(xì)胞凋亡％CellTMPDZ1DZ7DZ10CONIR-6.59±1.028.31±1.6926,25±4.0820.64±5.2122.23±4.658.46±2.11IR+(2Gy)6.93±1.358.74土2.0242.01±4.7430.29±5.7232.6±6.529.02±2.16二、靶向LMP1的活性脫氧核酶DZ1抑制彝咽癌細(xì)胞的增殖應(yīng)用活性脫氧核酶DZ1及其對(duì)照CON瞬時(shí)轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞CNE1-LMP1，24h后給予2Gy放射線照射，繼續(xù)培養(yǎng)24h,隨后應(yīng)用MTT實(shí)驗(yàn)和平板集落形成實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)脫氧核酶與放療聯(lián)合處理后鼻咽癌細(xì)胞的增殖活性。結(jié)果表明，與對(duì)照組及單獨(dú)脫氧核酶或放療組相比，脫氧核酶與放療聯(lián)合處理組顯著抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖(圖8);克隆形成率亦顯著減少(圖9)。三、靶向LMP1的脫氧核酶與放療聯(lián)合應(yīng)用能夠顯著抑制裸鼠腫瘤的生長(zhǎng)，增強(qiáng)鼻咽癌對(duì)放療的敏感性首先建立鼻咽癌裸鼠移植瘤模型，選擇腫瘤大小一致的裸鼠進(jìn)行隨機(jī)分組，每組5只，分別給予脫氧核酶和/或放療處理。聯(lián)合處理組分別在第一次和第二次給脫氧核酶24h后給予一次放療，觀察腫瘤生長(zhǎng)，每周記錄兩次。結(jié)果見(jiàn)圖10。與對(duì)照相比，脫氧核酶與放療聯(lián)合應(yīng)用能夠顯著抑制裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)。參考文獻(xiàn)1.HoshikawaY，SatohY，MiffakamiM，etal，EvidenceoflyticinfectionofEpstdn-Barrvirus(:EBV)inEBV-positivegastriccarcinoma.JMedVirol，2002;66(3):351-359.2.TouitouR,Bonnet-DuquenoyM，JoabI.AssociationofEpstein-8arrviruswithhumanmammarycarcinoma.Prosandcons.DisMarkers,2001;17(3):163-165.3.GrinsteinS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aaSEQN0.2:agggagtcaGGCTAGCTACAACGAcgtggtggtSEQN0.3:cgtgttocaGGCTAGCTACAACGAggtcagggt3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的靶向EBV-LMP1的脫氧核酶在制備治療EBV相關(guān)實(shí)體瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于所說(shuō)的脫氧核酶是經(jīng)過(guò)防酶解修飾的。4、根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的靶向EBV-LMP1的脫氧核酶在制備治療EBV相關(guān)實(shí)體瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于所說(shuō)的EBV相關(guān)實(shí)體腫瘤是鼻咽癌。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的靶向EBV-LMP1的脫氧核酶在制備治療EBV相關(guān)實(shí)體瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于給藥的方式為局部給藥。6、根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的靶向EBV-LMP1的脫氧核酶在制備治療EBV相關(guān)實(shí)體瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于所說(shuō)的脫氧核酶是作為放射治療增敏劑。7、根據(jù)權(quán)利要求4所述的靶向EBV-LMP1的脫氧核酶在制備治療EBV相關(guān)實(shí)體瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于所說(shuō)的脫氧核酶是作為放射治療增敏劑。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的靶向EBV-LMP1的脫氧核酶在制備治療EBV相關(guān)實(shí)體瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于在所說(shuō)的脫氧核酶與放射治療聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，放射治療的劑量范圍是0.5—5.Gy。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的靶向EBV-LMP1的脫氧核酶在制備治療EBV相關(guān)實(shí)體瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于所說(shuō)的脫氧核酶的用量為5mg/kg體重。全文摘要本發(fā)明涉及一種脫氧核酶的醫(yī)藥用途，具體地是一種靶向EBV-LMP1的脫氧核酶的醫(yī)藥用途。本發(fā)明提供技術(shù)方案就是靶向EBV-LMP1的脫氧核酶在制備治療EBV相關(guān)實(shí)體腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明找到了靶向LMP1脫氧核酶非常重要的抗腫瘤用途，尤其令人意想不到的是該類脫氧核酶能作為放射治療的增敏劑，并且有非常好的效果，為治療EBV相關(guān)腫瘤提供了新型工具。文檔編號(hào)A61K38/43GK101147801SQ20061003225公開(kāi)日2008年3月26日申請(qǐng)日期2006年9月18日優(yōu)先權(quán)日2006年9月18日發(fā)明者盧忠心,孫侖泉,亞曹申請(qǐng)人:中南大學(xué)