專利名稱：一種人XIAP靶基因的siRNA表達(dá)模板的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因藥物，具體涉及一種人凋亡抑制基因XIAP的siRNA表達(dá)模板。
背景技術(shù)：
全世界超過(guò)3億人受到乙肝病毒的感染，患上乙型肝炎，進(jìn)而發(fā)展成肝硬化，甚至肝癌。據(jù)調(diào)查，目前，我國(guó)健康人群中乙肝表面抗原攜帶率高達(dá)9.75％，每年因肝病死亡約30萬(wàn)例。丙型肝炎病毒由于其高變異性，也成為肝癌發(fā)生的重要原因。我國(guó)病毒性肝炎的高感染率，導(dǎo)致了肝癌的高發(fā)。肝癌也是世界上頭號(hào)“腫瘤殺手”之一，僅2000年，全世界肝癌患者人數(shù)就增加了56萬(wàn)，尤以中國(guó)、東南亞國(guó)家及非洲某些區(qū)域發(fā)病人數(shù)最多。深入了解肝癌發(fā)病的分子機(jī)制以尋求新的治療藥物是提高肝癌整體療效的關(guān)鍵。
在腫瘤細(xì)胞凋亡過(guò)程中，IAP(細(xì)胞凋亡蛋白抑制劑)家族有很重要的作用，它通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡的基本調(diào)節(jié)酶Caspase的作用，阻止腫瘤細(xì)胞凋亡的發(fā)生。X染色體相關(guān)聯(lián)的細(xì)胞凋亡蛋白抑制劑xIAP(X-linked Inhibitor of Apoptosis Protein)是IAP家族中的重要成員之一，較同族基因IAP-1，IAP-2(Hiap-2)，Naip(neuronal apoptosis inhibitoryprotein，神經(jīng)元凋亡抑制蛋白)，Livin，ML-IAP、survivin比較，xIAP可同時(shí)下調(diào)細(xì)胞凋亡關(guān)鍵蛋白酶Caspases-3、Caspases-7以及線粒體凋亡傳導(dǎo)途徑Caspases-9的表達(dá)，而ML-IAP、survivin僅對(duì)Caspases-9有抑制作用；xIAP是IAP(細(xì)胞凋亡蛋白抑制劑)家族中最具活力的成員，xIAP可在肝癌細(xì)胞組織中持續(xù)高表達(dá)。
RNA干預(yù)(RNAi)技術(shù)的出現(xiàn)為基因功能研究、抗腫瘤和抗病毒基因治療等方面的研究展開(kāi)了新的一頁(yè)。雙鏈RNA對(duì)基因表達(dá)的阻斷作用被稱為RNA干預(yù)(RNAinterference，RNAi)，具有干預(yù)作用的小片段雙鏈RNA則稱為siRNA，這些小片段一旦與信使RNA(mRNA)中的同源序列互補(bǔ)結(jié)合，會(huì)導(dǎo)致mRNA失去功能，即不能翻譯產(chǎn)生蛋白質(zhì)，也就是使基因“沉默”了。近年來(lái)，RNAi在腫瘤的基因治療上顯示出廣闊的應(yīng)用前景1、RNAi可用于抑制癌基因表達(dá)；2、RNAi技術(shù)是敲除點(diǎn)突變激活的癌基因的理想武器；3、RNAi技術(shù)還可抑制原癌基因擴(kuò)增；4、RNAi技術(shù)可抑制融合基因表達(dá)；5、RNAi可抑制其他與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因的表達(dá)。
運(yùn)用siRNA技術(shù)研制一種基因藥物，抑制肝癌細(xì)胞的增殖，這對(duì)探索肝癌治療的新途徑具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在采用siRNA技術(shù)對(duì)凋亡抑制基因XIAP進(jìn)行封閉，抑制原癌基因的表達(dá)，誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌凋亡。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案如下本發(fā)明設(shè)計(jì)了一段人凋亡抑制基因XIAP的siRNA表達(dá)模板，該表達(dá)模板的核苷酸序列為gatcccgttg atgtctgcag gtacacaatt gatatccgtt gtgtacctgc agacatcaat tttttccaaa，將該表達(dá)模板插入到siRNA表達(dá)載體pRNAT-U6.1/Neo中，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pRNA-XIAP，通過(guò)轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞，產(chǎn)生靶向凋亡抑制基因XIAP的siRNA；經(jīng)序列測(cè)定，它由70個(gè)核苷酸組成，與設(shè)計(jì)相符；經(jīng)MTT法、免疫組化、wester blotting、細(xì)胞流式法等體外實(shí)驗(yàn)，表明pRNA-XIAP可明顯抑制凋亡抑制基因XIAP的表達(dá)，從而抑制肝癌細(xì)胞HepG2的增殖，促進(jìn)其調(diào)亡。
下面結(jié)合附圖進(jìn)一步詳述本發(fā)明。


圖1ScoI酶切圖；其中Marker為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；圖2pstI酶切鑒定圖；其中Marker為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；圖3siRNA的結(jié)構(gòu)圖；AsiRNA模板設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)示意圖BsiRNA模板表達(dá)序列為發(fā)夾結(jié)構(gòu)圖4熒光顯微鏡下綠色熒光蛋白GFP表達(dá)；圖5RT-PCR結(jié)果marker為DNA分子量；1空白細(xì)胞， 2空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，3pRNA-XIAP轉(zhuǎn)染細(xì)胞，β-actin為陽(yáng)性內(nèi)對(duì)照。
圖6蛋白質(zhì)印跡Western Blotting圖；1空白細(xì)胞，2空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，3pRNA-XIAP轉(zhuǎn)染細(xì)胞，6空白細(xì)胞，7pRNA-XIAP轉(zhuǎn)染穩(wěn)定細(xì)胞。
圖7免疫組化結(jié)果圖；a空白細(xì)胞，b空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，cpRNA-XIAP轉(zhuǎn)染細(xì)胞)。
圖8流式細(xì)胞檢測(cè)pRNA-XIAP對(duì)肝癌細(xì)胞的凋亡率散點(diǎn)圖。
8-a 5mg/mlMTX，處理24小時(shí)，8-b 5mg/mlMTX，處理48小時(shí)，8-c 10mg/mlMTX，處理24小時(shí)，
8-d 10mg/mlMTX，處理48小時(shí)。
1構(gòu)建靶向基因的siRNA表達(dá)質(zhì)粒1.1表達(dá)質(zhì)粒的準(zhǔn)備購(gòu)買GenScript公司的pRNAT-U6.1/Neo質(zhì)粒，它是一個(gè)為轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞設(shè)計(jì)的siRNA表達(dá)質(zhì)粒，質(zhì)粒中攜帶新霉素抗性基因作為篩選標(biāo)志以建立穩(wěn)定細(xì)胞株，位于CMV啟動(dòng)子下的GFP(綠色熒光蛋白)基因能夠用來(lái)跟蹤質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率，U6啟動(dòng)子下設(shè)計(jì)有多克隆位點(diǎn)，本發(fā)明中我們利用其BamHI和HindIII的酶切位點(diǎn)進(jìn)行克隆。
1.2siRNA序列的設(shè)計(jì)GeneScript公司提供了在線siRNA模板序列設(shè)計(jì)的軟件，利用該軟件可設(shè)計(jì)siRNA模板序列，我們針對(duì)凋亡抑制基因XIAP找到一段靶序列5′TTGTGTACCTGCAGACATCAA 3′根據(jù)它再設(shè)計(jì)出一對(duì)siRNA模板序列(其結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖3-A)5’GATCCCGTTGATGTCTGCAGGTACACAATTGATATCCGTTGTGTACCTGCAGACATCAATTTTTTCCAAA3’3’GGCAACTACAGACGTCCATGTGTTAACTATAGGCAACACATGGACGTCTGTAGTTAAAAAAGGTTTTCGA5’1.3將合成的模板與酶切好的質(zhì)粒連接將上述合成的一對(duì)模板DNA鏈在退火緩沖液中等摩爾比混合，于95℃水浴5分鐘變性，再自然冷卻退火成一條雙鏈DNA，由于設(shè)計(jì)好了BamHI和HindHI的酶切位點(diǎn)粘端，可直接與BamHI和HindIII酶切好的質(zhì)粒連接，在T4連接酶作用下，16℃連接反應(yīng)過(guò)夜。
1.4轉(zhuǎn)染DH5α感受態(tài)細(xì)胞將連接過(guò)夜的連接體系轉(zhuǎn)染DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含Amp抗性的LB平皿上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，可見(jiàn)有十幾個(gè)菌落生長(zhǎng)。
1.5挑陽(yáng)性克隆進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序鑒定，以確定siRNA模板已正確插入質(zhì)粒挑取生長(zhǎng)良好的單個(gè)菌落接種于含Amp抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，270r/min搖床培養(yǎng)過(guò)夜，用質(zhì)粒純化試劑盒(Promega公司產(chǎn)品)提取質(zhì)粒。并做PstI和SalI酶切鑒定，構(gòu)建好的重組質(zhì)粒能夠被酶切，從酶切圖(圖1、圖2)初步證實(shí)質(zhì)粒構(gòu)建成功，把質(zhì)粒送大連寶生物公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果確定siRNA模板已正確插入質(zhì)粒，模板序列經(jīng)Primer5分析為發(fā)夾結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖3-B)。
2 體外實(shí)驗(yàn)2.1大量擴(kuò)增重組質(zhì)粒，脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，建立siRNA表達(dá)質(zhì)粒pRNA-XIAP穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，用熒光顯微鏡監(jiān)測(cè)其轉(zhuǎn)染效率。
轉(zhuǎn)染前一天用胰酶消化培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞，用無(wú)雙抗含10％小牛血清的DMEM稀釋細(xì)胞，濃度約為7×104/ml，35mm直徑的6孔板每孔加入2ml細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24h左右細(xì)胞豐度約為60％。采用LipofectamineTM 2000(Invitrogen公司)脂質(zhì)體以無(wú)血清和無(wú)雙抗DMEM轉(zhuǎn)染2μg重組質(zhì)粒，同時(shí)轉(zhuǎn)染2μg空白質(zhì)粒pRNAT-U6.1作為對(duì)照。熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，可見(jiàn)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞有綠色熒光蛋白GFP表達(dá)(見(jiàn)圖4)。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24h后，將6孔板中的細(xì)胞消化至培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，加入G418(Geneticin，氨基糖苷類抗生素，是新霉素抗性基因neo編碼的磷酸轉(zhuǎn)移酶的底物)，濃度為600ug/ml，繼續(xù)培養(yǎng)72h將絕大部分未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞殺死，在培養(yǎng)液中維持G418終濃度為300ug/ml進(jìn)行抗生素壓力篩選至細(xì)胞生長(zhǎng)密度為70％～80％(約需四周時(shí)間)，完成細(xì)胞篩選及富集。
2.2通過(guò)RT-PCR和Western blot檢測(cè)siRNA封閉基因表達(dá)的效果，用免疫組化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行定位。
RT-PCR采用Trizal Reagents(Gibico/BRL)提取細(xì)胞總RNA，設(shè)計(jì)PCR引物為P15’ATGACTTTTAACAGTTTTGAAGGAT 3’P23’GTCAGTAATGAAAGTTCGTTTTTTA 5’β-actin作為陽(yáng)性內(nèi)對(duì)照；PCR條件為94℃預(yù)變性3分鐘，然后進(jìn)入循環(huán)94℃ 60秒，58℃ 60秒，72℃ 90秒，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘，緩慢降到4℃，凝膠電泳結(jié)果如下轉(zhuǎn)染pRNA-XIAP的細(xì)胞mRNA表達(dá)明顯低于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞及空白質(zhì)粒對(duì)照細(xì)胞，表明pRNA-XIAP可明顯抑制xIAP mRNA表達(dá)。未轉(zhuǎn)染細(xì)胞及空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞xIAPmRNA表達(dá)無(wú)明顯影響。β-actin作為陽(yáng)性內(nèi)對(duì)照，可見(jiàn)清晰表達(dá)，表明實(shí)驗(yàn)方法可靠(圖5)。
Western blot加入裂解液500μl，0℃30min后1200g，4℃離心2min，取上清，測(cè)蛋白含量，用10％PAGE電泳分離蛋白，具體操作步驟見(jiàn)Amersham公司的ECL Westernbloting操作說(shuō)明書。加入羊抗兔酶標(biāo)抗體(1∶100，1∶200及1∶400稀釋)，每槽加1ml，置37℃溫育1h后取出，反復(fù)洗滌3次，每次3min；加入DAB底物液和終止液，觀察反應(yīng)結(jié)果pRNA-XIAP轉(zhuǎn)染細(xì)胞及穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株xIAP蛋白表達(dá)明顯下降，而未轉(zhuǎn)染細(xì)胞及空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞xIAP蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響(圖6)。
免疫組化取出載玻片，6％甲醛固定，分別滴加小鼠抗xIAP單抗、生物素化二抗、ABC、0.05％DAB顯色10min。結(jié)果pRNA-XIAP轉(zhuǎn)染細(xì)胞及穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株核內(nèi)xIAP蛋白表達(dá)明顯下降，而空白對(duì)照細(xì)胞及空質(zhì)粒對(duì)照細(xì)胞xIAP蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響(圖7)。
2.3觀察SiRNA表達(dá)質(zhì)粒pRNA-XIAP在體外對(duì)HepG2生長(zhǎng)的影響。
細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)(MTT法)將濃度為2.5×108/L的細(xì)胞(分三組，一組為空白細(xì)胞，一組為已經(jīng)轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的穩(wěn)定細(xì)胞株，一組為已經(jīng)轉(zhuǎn)染pRNA-XIAP的穩(wěn)定細(xì)胞株，每組設(shè)三個(gè)平行孔)以每孔200ul接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。37℃、5％的CO2孵育箱中預(yù)培養(yǎng)72h后，每孔加入5mg/ml的四唑鹽(MTT)溶液20ul。繼續(xù)孵育4h，每孔加入二甲基亞楓(DMSO)150ul，稍振蕩后，用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)570nm測(cè)其吸光度值，計(jì)算每組平均值和方差。結(jié)果由下表可見(jiàn)pRNA-XIAP組吸光度值較其它兩組低，經(jīng)統(tǒng)計(jì)有差異，表明其對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖具有一定抑制作用。

*經(jīng)統(tǒng)計(jì)，與其它兩組對(duì)照比較，P＜0.05，有差異。
2.4觀察SiRNA對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞衰老的影響。
流式細(xì)胞儀檢測(cè)采用Annexin V/PI雙染色法，收集細(xì)胞，用100μl的標(biāo)記溶液(FITC-Annexin V和PI)重懸細(xì)胞，室溫下避光孵育10～15min，500～1000r/min離心5min沉淀細(xì)胞，孵育緩沖液洗1次，加入熒光(SA-FLOUS)溶液4℃下孵育20min，避光并不時(shí)振動(dòng)后，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
結(jié)果凋亡細(xì)胞對(duì)所有用于細(xì)胞活性鑒定的染料如PI有抗染性，壞死細(xì)胞則不能。細(xì)胞膜有損傷的細(xì)胞的DNA可被PI著染產(chǎn)生紅色熒光，而細(xì)胞膜保持完好的細(xì)胞則不會(huì)有紅色熒光產(chǎn)生。因此，在細(xì)胞凋亡的早期PI不會(huì)著染而沒(méi)有紅色熒光信號(hào)。正?；罴?xì)胞與此相似。在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上，以圖8-a為例左下象限顯示活細(xì)胞(染色為FITC陰性/PI陽(yáng)性)；右上象限是非活細(xì)胞，即壞死細(xì)胞(為FITC陽(yáng)性/PI陽(yáng)性)；而右下象限為凋亡細(xì)胞(為FITC陽(yáng)性/PI陰性)，apoptotic rate為凋亡率，其余類推。由圖8和以下兩個(gè)表可見(jiàn)pRNA-XIAP轉(zhuǎn)染細(xì)胞的凋亡率明顯比空白對(duì)照和空質(zhì)粒對(duì)照細(xì)胞要高，說(shuō)明pRNA-XIAP促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的凋亡，而表1為pRNA-XIAP單獨(dú)對(duì)肝癌細(xì)胞的凋亡作用，表2為經(jīng)化療藥物(氨甲喋呤)聯(lián)合處理后對(duì)肝癌細(xì)胞的凋亡作用，為pRNA-XIAP與氨甲喋呤聯(lián)合治療的強(qiáng)大功效提供了理論基礎(chǔ)。
本發(fā)明構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒pRNA-XIAP可明顯抑制XIAP的表達(dá)，從而抑制肝癌細(xì)胞HepG2的增殖，促進(jìn)其調(diào)亡，為研制治療腫瘤的基因藥物開(kāi)辟了一條有實(shí)用意義的新途徑。
表1未經(jīng)氨甲喋呤(MTX)處理的細(xì)胞凋亡率

*與其它兩組比較，P＜0.05，有差異。
表2經(jīng)氨甲喋呤(MTX)處理后的細(xì)胞凋亡率

*經(jīng)統(tǒng)計(jì)，與其它兩組比較，P＜0.05，有差異。
<110>蘇先獅<120>一種人XIAP靶基因的siRNA表達(dá)模板<210>1<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<400>1gatcccgttg atgtctgcag gtacacaatt gatatccgtt gtgtacctgc agacatcaat 60tttttccaaa 70
權(quán)利要求
1.一種人XIAP靶基因siRNA表達(dá)模板，其特征在于該表達(dá)模板的核苷酸序列如下gatcccgttg atgtctgcag gtacacaatt gatatccgtt gtgtacctgc agacatcaat60tttttccaaa 70。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種XIAP靶基因siRNA(小干擾RNA)表達(dá)模板。發(fā)明設(shè)計(jì)了一段敲除人凋亡抑制基因XIAP(X－linked Inhibitor of Apoptosis Protein)的siRNA表達(dá)模板，插入到siRNA表達(dá)載體pRNAT－U6.1/Neo中，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pRNA－XIAP，通過(guò)轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞，產(chǎn)生靶向有致癌作用的細(xì)胞凋亡抑制基因XIAP的siRNA；經(jīng)序列測(cè)定，它由70個(gè)核苷酸組成，與設(shè)計(jì)相符；經(jīng)MTT法、RT－PCR、wester blotting、免疫組化、細(xì)胞流式法等體外實(shí)驗(yàn)，表明pRNA－XIAP可明顯抑制XIAP的表達(dá)，從而抑制肝癌細(xì)胞HepG2的增殖，促進(jìn)其調(diào)亡，本發(fā)明為研制治療腫瘤的基因藥物提供了新的途徑。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1884530SQ20061003192
公開(kāi)日2006年12月27日 申請(qǐng)日期2006年7月4日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月4日
發(fā)明者陳軍, 蘇先獅, 李 申請(qǐng)人:蘇先獅