專利名稱：包含瘧原蟲抗原的疫苗的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及瘧疾抗原免疫對抗瘧疾疾病的新用途。具體地說，本發(fā)明涉及子孢子抗原、具體地說為環(huán)子孢子(CS)蛋白或其片段免疫對抗嚴重瘧疾疾病的用途。
瘧疾是世界的主要健康問題之一。在20世紀中，經濟和社會發(fā)展連同抗瘧疾運動已導致在世界的大部分區(qū)域中根除了瘧疾，將世界上受感染區(qū)域由50％降至27％。盡管如此，根據預期的人口增長，預計至2010年世界一半人口(接近35億人)將居住在瘧疾傳播區(qū)域1?，F時的估計表明，每年由于瘧疾死亡的人數遠超過1百萬，僅非洲的龐大經濟成本就相當于每年1000億美元2。
這些數字突顯了全球性的瘧疾危機和向國際衛(wèi)生機構提出的挑戰(zhàn)。此危機的原因是多方面的，范圍從可獲得的、可承受的和先前高效的藥物的廣泛抗性的出現，到衛(wèi)生系統(tǒng)的衰弱和不足、資源缺乏。除非發(fā)現了控制該病的方法，否則改善健康和幼兒生存、減少貧困、增加安全性和增強最易受攻擊社群的全球性努力將失敗。
該疾病的一種最急性形式是由原生動物寄生蟲惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)引起的，該寄生蟲是由于瘧疾引起的大部分死亡的原因。
惡性瘧原蟲(P.falciparum)的生活周期復雜，需要人和蚊兩個寄主來完成。人的感染是由被感染蚊子唾液中的子孢子接種啟動的。子孢子遷移到肝臟并在那里感染肝細胞(肝期)，它們在肝細胞中分化，經紅細胞外胞內期(exoerythrocytic intracellular stage)進入裂殖子期，裂殖子感染紅細胞(RBC)，以啟動無性血液期中的周期性復制。該周期以RBC中的許多裂殖子分化成蚊子攝取的有性期配子體完成，在蚊子中有性期配子體在中央管中經過一系列時期的發(fā)育產生子孢子，子孢子遷移到唾液腺。
子孢子期的惡性瘧原蟲已被鑒定為瘧疾疫苗的一個潛在靶。子孢子的主要表面蛋白質稱為環(huán)子孢子蛋白質(CS蛋白質)。已對各種品系該蛋白質進行了克隆、表達和測序，例如NF54品系克隆3D7(Caspers等，Mol.Biochem.Parasitol.35，185-190，1989)。品系3D7的該蛋白質的特征是具有中央免疫顯性重復區(qū)，該區(qū)含有重復40次的四肽Asn-Ala-Asn-Pro，但其中散布了四個次要重復序列Asn-Val-Asp-Pro。在其它品系中，主要和次要重復序列的數目以及它們相對的位置有變化。這一中央部分與N和C末端部分側接，N和C末端部分由非重復的氨基酸序列組成，命名為CS蛋白質的無重復部分。
GlaxoSmithKline Biologicals的基于CS蛋白的RTS，S瘧疾疫苗自1987年以來就處于研發(fā)中，目前是最先進的在研侯選瘧疾疫苗4。該疫苗特異性靶向紅細胞前期的惡性瘧原蟲，在未感染瘧疾的成年志愿者中賦予對實驗室培育的被感染蚊子傳遞的惡性瘧原蟲子孢子感染的保護，以及賦予半免疫成人抗天然暴露的保護5，6。
RTS，S/AS02A(RTS，S加佐劑)用于在岡比亞進行的連續(xù)I期研究，包含6-11歲和1-5歲的兒童，該研究證實所述疫苗是安全的、良好耐受的和免疫原性的7。隨后，選擇兒科疫苗劑量并在包含1-4歲莫桑比克兒童的I期研究中進行研究，在該研究中發(fā)現所述疫苗是安全的、良好耐受的和免疫原性的8。
但是，長期以來人們一直堅持這樣的觀點為在天然暴露的條件下獲得免于患惡性瘧原蟲引起的臨床疾病的保護作用，應需要一種以上的抗原，并應需要代表所述寄生蟲生命周期的多個時期的多種抗原(第3頁，Webster，Daniel and Hill，Adrian V.S.Progress with newmalaria vaccines.Bull World Health Organ，Dec.2003，81卷，第12章，902-909頁，ISSN 0042-9686；Hoffman S.Save the children.Nature.2004年8月19日；430(7002)940-1)。人們一般還持有這樣的觀點對提供抗嚴重疾病的保護作用來說，例如來自紅細胞前期寄生蟲的CS的抗原應不是優(yōu)選抗原，因為嚴重疾病由無性期寄生蟲引起，而紅細胞前期抗原如CS不在無性期寄生蟲上表達。
現在已在幼年非洲兒童的實驗中用紅細胞前期瘧疾抗原獲得了令人驚訝的結果。業(yè)已發(fā)現，基于CS蛋白的RTS，S疫苗不僅可賦予抗在天然暴露下感染的保護作用，而且賦予抗惡性瘧原蟲引起的廣譜臨床疾病的保護作用。接受RTS，S疫苗的兒童經歷的嚴重不良事件、住院治療和嚴重的瘧疾并發(fā)癥(包括死亡)比對照組少。
具體地說，此基于CS的疫苗可降低嚴重瘧疾疾病發(fā)病率的研究結果是出乎意料和令人驚訝的。嚴重瘧疾疾病描述于WHO臨床實驗規(guī)范指南(第3頁World Health Organization.Management of severemalaria，實用手冊，第2版，2000.http://mosquito.who.int/docs/hbsm.pdf)。遵照基于WHO的嚴重瘧疾定義的兒童分類法鑒別患病非常嚴重的兒童和高危垂死的兒童。高危可用于指約30％或以上的死亡風險。
而且，抗新感染或臨床發(fā)作這二者的RTS，S疫苗效力似乎不衰減，也不緩慢衰減。在實驗中的6個月隨訪結束時，所述疫苗仍有效，盡管在感染發(fā)病率方面有顯著差異。這與先前在未感染瘧疾的志愿者或岡比亞成人中進行的實驗形成強烈反差，所述實驗提示疫苗效力是短期的6，23。
因此，本發(fā)明提供瘧原蟲(Plasmodium)抗原在藥物生產中的用途，所述瘧原蟲抗原在紅細胞前期表達，優(yōu)選為子孢子抗原，所述藥物用于抗嚴重瘧疾疾病的接種，所述瘧原蟲抗原與藥物可接受的佐劑或載體組合。
本發(fā)明尤其涉及降低嚴重惡性瘧原蟲疾病的發(fā)病率。
此疫苗的優(yōu)選目標群是兒童，具體地說是5歲以下的兒童，尤其是1-4歲的兒童。
優(yōu)選地，所述瘧原蟲抗原為惡性瘧原蟲抗原。
所述抗原可選自在子孢子或其它紅細胞前期(例如肝期)寄生蟲上表達的任意抗原。優(yōu)選地，所述抗原選自環(huán)子孢子(CS)蛋白、肝期抗原-1(LSA-1)、肝期抗原-3(LSA-3)、血小板反應蛋白相關性未名蛋白(TRAP)以及最近已表明在肝期(以及紅細胞期)存在的頂端裂殖子抗原-1(AMA-1)。所有這些抗原在本領域都是周知的。所述抗原可為完整蛋白或其免疫原性片段。瘧疾抗原的免疫原性片段是眾所周知的，例如AMA-1的胞外結構域。
優(yōu)選地，所述瘧原蟲抗原融合至乙肝表面抗原(HBsAg)。
用于本發(fā)明的優(yōu)選抗原衍生自環(huán)子孢子(CS)蛋白，優(yōu)選為與HbsAg的雜合蛋白形式。所述抗原可為完整的CS蛋白或其部分，包括CS蛋白的一個或多個片段，所述多個片段可融合在一起。
優(yōu)選地，基于CS蛋白的抗原為雜合蛋白形式，其含有基本上全部的瘧原蟲CS蛋白的C端部分、4個或更多個串聯重復的CS蛋白免疫顯性區(qū)以及乙肝表面抗原(HBsAg)。優(yōu)選地，所述雜合蛋白包含含有與CS蛋白C端部分基本同源的至少160個氨基酸的序列。具體地說，“基本全部的”CS蛋白的C末端部分包括沒有疏水錨區(qū)序列的C末端。CS蛋白可沒有C末端的最后12個氨基酸。
最優(yōu)選地，用于本發(fā)明的雜合蛋白是含惡性瘧原蟲CS蛋白部分的蛋白，該CS蛋白基本對應于品系NF54來源的惡性瘧原蟲3D7克隆(Caspers等，出處同上)的氨基酸207-395，由線性接頭按照讀框融合至HbsAg的N末端。所述接頭可包含HbsAg的preS2的一部分。
用于本發(fā)明的優(yōu)選CS構建物概述于WO 93/10152。最優(yōu)選的是稱為RTS的雜合蛋白，其描述于WO 93/10152(其中將其稱為RTS*)和WO 98/05355，這兩個專利的公開內容通過引用結合到本文中。
特別優(yōu)選的雜合蛋白是稱為RTS的雜合蛋白，其由以下組成●甲硫氨酸殘基，由核苷酸1059-1061編碼，來源于釀酒酵母TDH3基因序列。(Musti A.m.等，Gene 198325133-143)。
●3個氨基酸Met Ala Pro，來源于通過用于構建雜合基因的克隆方法建立的核苷酸序列(1062-1070)。
●一段189個氨基酸的序列，由代表惡性瘧原蟲品系3D7(Caspers等，出處同上)的環(huán)子孢子蛋白(CSP)的氨基酸207-395的核苷酸1071-1637編碼。
●由核苷酸1638-1640編碼的氨基酸(Gly)，通過用于構建雜合基因的克隆方法建立。
●4個氨基酸Pro Val Thr Asn，由核苷酸1641-1652編碼，代表乙肝病毒(adw血清型)preS2蛋白(Nature 280815-819，1979)的4個羧基末端殘基。
●一段226個氨基酸的序列，由核苷酸1653-2330編碼，表示乙肝病毒(adw血清型)的S蛋白。
優(yōu)選地，所述RTS為混合顆粒RTS，S形式。
優(yōu)選的RTS，S構建物包含兩種多肽RTS和S，其同時被合成，并在純化過程中自發(fā)形成復合顆粒結構(RTS，S)。
RTS蛋白優(yōu)選在酵母中表達，最優(yōu)選在釀酒酵母(S.cerevisiae)中表達。在該宿主中，RTS將作為脂蛋白顆粒表達。優(yōu)選的受者酵母菌株優(yōu)選地已在其基因組中攜帶若干乙肝病毒S表達盒的整合拷貝。獲得的菌株由此合成兩種多肽S和RTS，其自發(fā)地共組裝成混合的(RTS，S)脂蛋白顆粒。這些顆粒有利地在其表面存在所述雜合體的CSP序列。有利地，這些混合顆粒中的RTS∶S比率為1∶4。
本發(fā)明允許在疫苗中使用單一瘧疾抗原，與先前認為產生保護作用(特別是抗嚴重疾病的保護作用)應需要的相反。因此，按照本發(fā)明，RTS或其它抗原優(yōu)選為疫苗中的唯一瘧疾抗原。
另一方面，本發(fā)明提供來自單一瘧疾蛋白的抗原在制備用于接種對抗嚴重瘧疾的藥物中的用途。所述瘧疾蛋白可為本文描述的任何蛋白，包括CS蛋白、AMA-1、TRAP、LSA-1和LSA-3。最優(yōu)選地其為本文所述雜合形式的CS蛋白。
本發(fā)明還提供預防或減少嚴重瘧疾的方法，該方法包括給予對象含在紅細胞前期表達的瘧疾抗原和佐劑的組合物。所述抗原和佐劑如本文所述。優(yōu)選的對象是兒童，優(yōu)選在本文所述年齡范圍內。
適用于本發(fā)明的接種流程包括以1個月的間隔給予3劑疫苗。
嚴重瘧疾可按照WHO臨床實驗規(guī)范指南(出處同上)定義。在本文所述研究中，用于定義嚴重瘧疾的標準源自WHO臨床實驗規(guī)范指南，并在下表中給出。
作為主要終點，在所述研究中定義的瘧疾臨床發(fā)作要求存在在Giemsa染色的厚血涂片上＞15000/μl的惡性瘧原蟲無性寄生蟲血癥，并出現≥37.5℃的發(fā)熱(腋下體溫≥37.5℃)。
嚴重瘧疾的定義是另外存在以下一種或多種嚴重瘧疾貧血(PCV＜15％)、腦型瘧(Blantyre昏迷記分＜2)或其它人體系統(tǒng)的嚴重疾病，所述疾病可包括多次癲癇發(fā)作(在之前的24小時中有兩次或多次全身性抽搐)、虛脫(定義為不能獨立地坐)、低血糖(＜2.2mmol/dL或＜40mg/dL)、臨床可疑的酸中毒或循環(huán)衰竭。這些在下表1中給出。
嚴重瘧疾病例定義
按照本發(fā)明，純化雜合蛋白的水溶液可直接使用，或與合適的佐劑或載體組合使用。或者，所述蛋白可凍干，然后與合適的佐劑或載體混合。
本發(fā)明的優(yōu)選疫苗劑量是1-100μg RTS，S/劑，更優(yōu)選5-75μgRTS，S/劑，最優(yōu)選25μg RTS，S蛋白/劑，優(yōu)選在250μl(最終液體制劑)中。這是在兒童中使用的優(yōu)選劑量，具體地說是5歲以下的兒童，更具體地說是1-4歲的兒童，代表優(yōu)選成人劑量的一半。優(yōu)選的成人劑量是1-100μg RTS，S/劑，更優(yōu)選5-75μg RTS，S/劑，最優(yōu)選50μgRTS，S/劑，在500μl(最終液體制劑)中。
按照本發(fā)明，所述抗原與佐劑或載體組合。優(yōu)選存在佐劑，具體地說是為Th1型應答的優(yōu)選刺激劑的佐劑。
合適的佐劑包括但不限于任何來源的脫毒脂質A和脂質A的無毒衍生物、皂苷和為Th1細胞應答(本文也稱為Th1型應答)的優(yōu)選刺激劑的其它免疫刺激劑。
廣義上可將免疫應答分為兩個極端類別，即體液或細胞介導的免疫應答(傳統(tǒng)上分別以保護作用的抗體機制和細胞效應子機制為特征)。這些類別的應答已被命名為Th1型應答(細胞介導的應答)和Th2型免疫應答(體液應答)。
極端的Th1型免疫應答可以以抗原特異性的、單倍體限制的細胞毒性T淋巴細胞和天然殺傷細胞應答的產生為特征。在小鼠中，Th1型應答常常以IgG2a亞型抗體的產生為特征，而在人中，這些抗體對應于IgG1型抗體。Th2型免疫應答的特征在于產生一系列的免疫球蛋白同種型，在小鼠中包括IgG1。
可以認為位于這兩種類型的免疫應答發(fā)展背后的驅動力是細胞因子。高水平的Th1型細胞因子傾向于支持誘導針對給定抗原的細胞介導的免疫應答，而高水平的Th2型細胞因子傾向于支持誘導針對抗原的體液免疫應答。
Th1和Th2型免疫應答的區(qū)別不是絕對的，可采取這兩個極端類別之間的連續(xù)體形式。實際上，個體將支持被描述為主要是Th1或主要是Th2的免疫應答。然而，常常方便地按照Mosmann和Coffman(Mosmann，T.R.and Coffman，R.L.(1989)TH1 and TH2 cellsdifferentpatterns of lymphokine secretion lead to different functional properties.Annual Review of Immunology，7，145-173頁)在鼠CD4+ve T細胞克隆中所描述的來考慮細胞因子家族。傳統(tǒng)上，Th1型應答與T淋巴細胞產生INF-γ有關。其它通常與Th1型免疫應答的誘導直接相關的細胞因子不由T細胞產生，如IL-12。相反，Th2型應答與IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和腫瘤壞死因子-β(TNF-β)的分泌有關。
已知某些疫苗佐劑尤其適于刺激Th1或Th2型細胞因子應答。傳統(tǒng)上，接種或感染后免疫應答的Th1∶Th2平衡的指示包括直接測量用抗原再刺激后由T淋巴細胞在體外產生的Th1或Th2細胞因子，和/或檢測(至少在小鼠中)抗原特異性抗體應答的IgG1∶IgG2a比率。
因此，Th1型佐劑是這樣一種佐劑，其在用抗原體外再刺激時刺激分離的T細胞群產生高水平的Th1型細胞因子，并誘導與Th1型同種型相關的抗原特異性免疫球蛋白應答。
能夠優(yōu)先刺激TH1細胞應答的佐劑描述于WO 94/00153和WO95/17209。
可被配制以生產適用于本發(fā)明的佐劑的優(yōu)選Th1-型免疫刺激劑包括但不限于以下佐劑。
長久以來就已知腸細菌脂多糖(LPS)是一種有效的免疫系統(tǒng)刺激劑，但由于其毒性作用而被剝奪了其佐劑用途。Ribi等(1986，Immunology and Immunopharmacology of bacterial endotoxins，PlenumPubl.Corp.，NY，407-419頁)已描述了LPS的一種無毒衍生物—單磷酰脂質A(MPL)，其通過去除中心的糖基團和由還原末端葡糖胺中去除磷酸酯而產生，具有以下結構
其它脫毒形式的MPL由去除二糖骨架3-位的?；湲a生，稱為3-O-脫?；瘑瘟柞Ｖ|A(3D-MPL)。其可按照GB 2122204B中教導的方法純化和制備，所述參考文獻還公開了二磷酰脂質A及其3-O-脫酰化變體的制備。
優(yōu)選形式的3D-MPL為具有直徑小于0.2μm的小粒度的乳劑，其生產方法公開于WO 94/21292。含單磷酰脂質A和表面活性劑的水性制劑已描述于WO 9843670。
用于本發(fā)明的細菌脂多糖衍生的佐劑可由細菌來源純化和加工，或替代性地其可為合成的。例如，純化的單磷酰脂質A描述于Ribi等1986(出處同上)，來自沙門氏菌(Salmonella sp.)的3-O-脫酰單磷酰脂質A或二磷酰脂質A描述于GB 2220211和US 4912094。其它純化的和合成的脂多糖也有描述(Hilgers等，1986，Int.Arch.Allergy.Immunol.，79(4)392-6；Hilgers等，1987，Immunology，60(1)141-6；和EP 0 549 074 B1)。特別優(yōu)選的細菌脂多糖佐劑是3D-MPL。
因此，可用于本發(fā)明的LPS衍生物是在結構上類似于LPS或MPL或3D-MPL的免疫刺激劑。在另一個備選中，所述LPS衍生物可為?；瘑翁?，其是以上結構的MPL的一部分。
皂苷也是符合本發(fā)明的優(yōu)選Th1免疫刺激劑。皂苷是眾所周知的佐劑，教導于Lacaille-Dubois，M和Wagner H.(1996.A review of thebiological and pharmacological activities of saponins.Phytomedicine第2卷，363-386頁)。例如，Quil A(來自南美Quillaja Saponaria Molina樹的樹皮)及其分離級分描述于US 5,057,540和“Saponins as vaccineadjuvants”，Kensil，C.R.，Crit Rev Ther Drug Carrier Syst，1996，12(1-2)1-55以及EP 0 362 279 B1。溶血皂苷QS21和QS17(HPLC純化的Quil A分離級分)已被描述為有效的系統(tǒng)性佐劑，其生產方法公開于美國專利第5,057,540號和EP 0 362 279 B1。在這些參考文獻中還描述了用作系統(tǒng)性疫苗的有效佐劑的QS7(Quil A的非溶血性級分)的用途。QS21的用途進一步描述于Kensil等(1991.J.Immunology 146卷，431-437)。QS21與聚山梨醇酯或環(huán)糊精的組合也為人所知(WO99/10008)。包含Quil A的分離級分如QS21和QS7的顆粒佐劑系統(tǒng)描述于WO 96/33739和WO 96/11711。
另一種優(yōu)選的免疫刺激劑是含有未甲基化的CpG二核苷酸(“CpG”)的免疫刺激性寡核苷酸。CpG是存在于DNA中的胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸基序的縮寫。本領域已知CpG是通過全身和粘膜途徑給予的佐劑(WO 96/02555、EP 468520，Davis等，J.Immunol，1998，160(2)870-876；McCluskie和Davis，J.Immunol.，1998，161(9)4463-6)。歷史上觀察到BCG的DNA部分能夠發(fā)揮抗腫瘤作用。在進一步的研究中，來自BCG基因序列的合成寡核苷酸表現出能夠誘導免疫刺激作用(體內和體外都如此)。這些研究的作者得出結論包含中心CG基序的某些回文序列具備此活性。之后在Krieg的出版物Nature 374，546頁1995中闡釋了CG基序在免疫刺激中的核心作用。詳細的分析已表明CG基序必須處于一定的序列背景中，并且這些序列在細菌DNA中常見，但很少處于脊椎動物DNA中。免疫刺激性序列常常是嘌呤、嘌呤、C、G、嘧啶、嘧啶；其中CG基序未被甲基化，但已知其它未甲基化的CpG序列是免疫刺激性的，并且可用于本發(fā)明。
在某些6核苷酸組合中存在回文序列。若干這些基序可在同一寡核苷酸中以一種基序的重復或不同基序的組合存在。一種或多種這些含免疫刺激性序列的寡核苷酸的存在可以激活各種免疫亞群，包括天然殺傷細胞(其產生干擾素γ并具有溶細胞活性)和巨噬細胞(Wooldrige等，89卷(第8章)，1977)。其它含未甲基化CpG但不具有這一共有序列的序列現在也已被證實具有免疫調節(jié)性。
當配制成疫苗時，CpG通常在游離溶液中與游離抗原一起給予(WO 96/02555；McCluskie和Davis，出處同上)，或共價綴合至抗原(WO 98/16247)，或與例如氫氧化鋁的載體一起配制((肝炎表面抗原)Davis等，出處同上；Brazolot-Millan等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，1998，95(26)，15553-8)。
上述這種免疫刺激劑可以與載體一起配制，所述載體例如為脂質體、水包油乳劑和/或金屬鹽，包括鋁鹽(如氫氧化鋁)。例如，3D-MPL可與氫氧化鋁(EP 0 689 454)或水包油乳劑(WO 95/17210)一起配制；QS21可有利地與含有膽固醇的脂質體(WO 96/33739)、水包油乳劑(WO 95/17210)或鋁佐劑(WO 98/15287)一起配制；CpG可以與鋁佐劑(Davis等，出處同上；Brazolot-Millan出處同上)或其它陽離子載體一起配制。
還優(yōu)選免疫刺激劑的組合，具體地說是單磷酰脂質A和皂苷衍生物的組合(WO 94/00153、WO 95/17210、WO 96/33739、WO98/56414、WO 99/12565、WO 99/11241)，更具體地說是如WO 94/00153所公開的QS21和3D-MPL的組合?；蛘撸珻pG加皂苷(如QS21)的組合也構成了用于本發(fā)明的有效佐劑。
因此，適宜的佐劑系統(tǒng)包括如單磷酰脂質A(優(yōu)選3D-MPL)連同鋁鹽的組合。增強系統(tǒng)包括單磷酰脂質A與皂苷衍生物的組合，具體地說是如WO 94/00153公開的QS21和3D-MPL的組合，或如WO96/33739公開的較低反應原性組合物，其中QS21在含有膽固醇的脂質體(DQ)中被猝滅。
特別有效的佐劑制劑包含在水包油乳劑中的QS21、3D-MPL和生育酚，其描述于WO 95/17210，是用于本發(fā)明的另一種優(yōu)選制劑。
另一種優(yōu)選制劑包含單獨的CpG寡核苷酸或與QS21、3D-MPL一起的CpG寡核苷酸或與鋁鹽一起的CpG寡核苷酸。
因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，提供脫毒脂質A或無毒脂質A衍生物(更優(yōu)選單磷酰脂質A或其衍生物，如3D-MPL)與本文描述的瘧疾抗原的組合用于生產預防嚴重瘧疾疾病的疫苗的用途。
優(yōu)選地，額外地使用皂苷，優(yōu)選QS21。
優(yōu)選地，本發(fā)明還使用水包油乳劑或脂質體。
用于本發(fā)明的優(yōu)選佐劑組合是1.3D-MPL、QS21和水包油乳劑。
2.在脂質體制劑中的3D-MPL和QS21。
3.在脂質體制劑中的3D-MPL、QS21和CpG。
選擇每劑疫苗中存在的本發(fā)明蛋白的量，其為在典型疫苗中誘導免疫保護應答而無顯著不良副作用的量。這種量將根據使用的具體免疫原和疫苗是否佐劑化而變化。一般來說，預期每劑將含1-1000μg蛋白，優(yōu)選1-200μg，最優(yōu)選10-100μg。具體疫苗的最佳量可通過包括觀測對象中抗體滴度和其它反應的標準研究來確定。在初次接種后約4周對象優(yōu)選接受加強，此后只要存在感染風險，每6個月重復加強。RTS，S蛋白的優(yōu)選量也同上文給出的一樣。
本發(fā)明的疫苗可通過多種途徑中的任一種提供，所述途徑例如為口服、局部、皮下、粘膜(通常為陰道內)、靜脈內、肌內、鼻內、舌下、皮內和通過栓劑。
免疫可為預防性的或治療性的。本文描述的本發(fā)明主要地但非排它性地涉及抗瘧疾的預防性接種，更具體地說是預防或降低嚴重瘧疾疾病可能性的預防性接種。用于本發(fā)明的合適的藥物可接受載體或賦形劑在本領域眾所周知，包括例如水或緩沖液。疫苗制備一般描述于PharmaceuticalBiotechnology，61卷Vaccine Design-the subunit and adjuvant approach，Powell和Newman編輯，Plenum Press New York，1995New Trends andDevelopments in Vaccines，Voller等編輯，University Park Press，Baltimore，Maryland，U.S.A.1978。脂質體中的包囊化描述于例如Fullerton的美國專利4,235,877。蛋白質與大分子的綴合公開于例如Likhite的美國專利4,372,945和Armor等的美國專利4,474,757。
實施例材料和方法研究區(qū)域該實驗于2003年4月至2004年5月間在莫桑比克南部 地區(qū)(Maputo省)的Centro de em Saude da [CISM] 健康研究中心)進行。該區(qū)域的特征已在它處9詳述。氣候是具有兩個明顯不同季節(jié)的亞熱帶氣候由11月至4月的溫暖多雨季節(jié)，以及在一年其余時間中一般來說冷且干燥的季節(jié)。2003年當中的年降雨量是1286mm。具有顯著季節(jié)性的終年瘧疾傳播主要歸因于為主要載體的惡性瘧原蟲不吉按蚊(P.falciparum.Anophelesfunestus)，2002年的估測昆蟲接種率(EIR)為38?；诎⒛剜突前范嘈?乙胺嘧啶(SP)的聯合治療是用于無并發(fā)瘧疾的一線療法，可容易地在衛(wèi)生機構使用。 健康中心鄰近CISM，是一個110個床位的轉診級衛(wèi)生機構。地區(qū)衛(wèi)生網絡由另外8個周邊的衛(wèi)生所和鄉(xiāng)村醫(yī)院組成。
研究設計研究是雙盲的、隨機的和受控的IIb期實驗，以評價GSKBiologicals的RTS，S/AS02A瘧疾疫苗的安全性、免疫原性和效力。首要目標是評價由第3劑后14天開始的6個月監(jiān)視期內初次接種的1-4歲兒童中抗惡性瘧原蟲瘧疾臨床發(fā)作的效力。
該實驗設計用于檢驗疫苗在生命周期和瘧疾發(fā)病中的兩個時間點感染和臨床疾病中的效力。這兩個終點在基于兩個不同地點的兩個同齡組中被同時檢測到(
圖1)。同齡組1由 周圍10Km半徑的區(qū)域征募，有助于評價抗臨床疾病的保護作用的主要終點，該終點通過在 健康中心和Maragra衛(wèi)生所的被動病例檢驗測定。同齡組2在 北部55km的農業(yè)和沼澤低地區(qū)域Ilha Josina征募，之后進行跟蹤，以通過主動和被動監(jiān)視的組合檢測新感染。
對于同齡組1，假定在監(jiān)視期內在對照組中的臨床惡性瘧原蟲發(fā)病率為11％以及疫苗效力為50％，則為了具有80％能力以檢測15％疫苗效力的置信下限，需要每組704個可評價對象。對于同齡組2，假定在監(jiān)視期內新感染率為50％，則為了提供86％能力來以20％置信下限檢測預防新感染的50％疫苗效力，需要每組116個可評價兒童。
方案得到莫桑比克國家倫理審查委員會、巴塞羅那醫(yī)院門診倫理審查委員會和適宜衛(wèi)生科技組織(PATH)人體保護委員會批準。該實驗按照ICH臨床實驗規(guī)范指南進行，由GSK Biologicals監(jiān)控。局部安全性監(jiān)測委員會以及資料和安全性監(jiān)測委員會密切檢查該實驗的進行和結果。
篩選與知情同意CISM在研究區(qū)域運行人口統(tǒng)計學監(jiān)視系統(tǒng)10。由該人口普查產生潛在合格的常駐兒童名單。他們在家接受訪問，給父母或監(jiān)護人念信息表，并核對征募標準。這些標準包括被證實在研究區(qū)域居住，用EPI疫苗完整地免疫。感興趣的父母/監(jiān)護人被邀請至 健康中心或Ilha Josina衛(wèi)生所。在首次訪問時，再讀信息表，并由專門受過培訓的職員向父母/監(jiān)護人群體解釋。只有在他們通過設計用于檢查對該信息的理解的個人口頭理解測試之后才征求個人同意。然后邀請他們簽署(或者不識字的話按拇指印)知情同意文件。委員會成員擔任公證員，會簽同意表。篩選包括簡單的病史和檢查、扎指采血進行血液學和生化檢查。
如果兒童具有變態(tài)反應病史、血細胞容量小于25％、營養(yǎng)不良(身高別體重≤3Z記分)、具有臨床顯著的慢性或急性病或異常血液學或生化參數，則將他們排除在參與者以外。合格的受試者招收入研究中，在接種的第一天開始，給予獨有的研究編號和單獨的照片身份證。
隨機化和免疫征募了1-4歲的2022個兒童并隨機化，以在 健康中心或Ilha Josina衛(wèi)生所接受3劑RTS，S/AS02A侯選瘧疾疫苗或對照接種方案。在GSK Biologicals使用方塊圖(1∶1比率，塊大?。?)進行隨機化。
RTS，S由在酵母中重組表達的雜合分子組成，其中CS蛋白10，11中心串聯重復區(qū)和羧基末端區(qū)以N末端融合至顆粒中的乙肝病毒S抗原(HBsAg)，所述顆粒還包含未融合的S抗原。全劑量的RTS，S/AS02A(GlaxoSmithKline Biologicals，Rixensart，Belgium)含50μg凍干RTS，S抗原，其在500μL AS02A佐劑(含各50μg的免疫刺激劑3D-MPL[Corixa Inc.，WA，USA]和QS21的水包油乳劑)中重構。在該實驗中使用一半成人劑量；即250μL劑量體積，在250μLAS02佐劑(含各25μg的3D-MPL和QS21)中含25μg RTS，S抗原。
因為常規(guī)乙肝疫苗接種已于2001年7月引入了莫桑比克的EPI程序，所以12-24個月齡的兒童已經接受了乙肝疫苗免疫。因此，不足24個月的兒童在第1次和第3次接種時接受兩劑7價肺炎球菌綴合物疫苗(PrevnarWyeth Lederle Vaccines，New Jersey，USA)，以及在第2次接種時接受1劑嗜血流感桿菌(Haemophilus influanzae)b型疫苗(HiberixTMGlaxoSmithKline Biologicals，Rixensart，Belgium)作為對照疫苗。對于24個月以上的兒童，對照疫苗是預防性乙肝疫苗(Engerix-BGlaxoSmithKline Biologicals，Rixensart，Belgium)。對照組給予全劑量(0.5ml劑量體積)。
RTS，S/AS02A和對照疫苗按照0、1、2月接種程序交替地在臂的三角肌部位肌內給予。因為所使用疫苗的外觀和體積截然不同，所以采取特別的防范措施以確保實驗的雙盲特性。接種小組準備了疫苗并在接種前用不透明帶遮住了注射器的內容物。該小組不參與任何其它研究程序，包括終點監(jiān)視。
安全性和反應原性的隨訪在每次接種后，觀察研究參與者至少1小時。受過培訓的外勤人員在隨后的3天每天到家里看望兒童，以記錄任何不良事件。記錄此階段內訴求的局部和全身不良事件12。通過醫(yī)院發(fā)病率監(jiān)視系統(tǒng)記錄每劑后30天的未經訴求的不良事件。以相似方式檢測嚴重不良事件(SAE)，并在整個研究中進行記錄。由第3劑后的60天開始，研究兒童每月在家接受一次訪問。在訪問期間，檢查居住狀況，記錄未報告的SAE。監(jiān)測所有參與者的血液學和生化參數；在第3劑后1個月進行全血計數，并在第3劑后的1個月和6個半月監(jiān)測肌酐、丙氨酸氨基轉移酶[ALT]和膽紅素。
免疫原性評價在第1劑前測定所有參與者中的乙肝表面抗原(HBsAg)狀態(tài)。在第1劑前以及第3劑后的30天和6個半月時檢測同齡組1中的抗CS抗體，在這些相同的時間點檢測同齡組2中的抗HBs抗體。在篩選時測定兩個同齡組的間接熒光抗體測試(IFAT)。
效力評價基于衛(wèi)生機構的發(fā)病率監(jiān)視系統(tǒng)從1997年運行至今13，目前已在 健康中心以及Maragra和Ilha Josina的衛(wèi)生所建立。在全部3個機構中，項目醫(yī)務人員一天24小時在崗，以通過個人ID卡識別研究參與者并確保標準化記錄和合適的藥物管理。
所有在前24小時內報告發(fā)熱或具有記錄到的發(fā)熱(腋下體溫≥37.5℃)的兒童都進行采血，以雙份薄或厚血涂片測定瘧疾寄生蟲，以及以微毛細管測定紅細胞壓積(PCV)。患有準許入院的臨床病癥的兒童進入 健康中心。入院時進行更詳細的臨床史和藥物檢查，并由醫(yī)生記錄在標準表格上。出院時記錄實驗室試驗結果和最終診斷結果。臨床管理按照標準國家指引進行。
在同齡組2中進行主動感染檢查(Actived Detection ofInfection)(ADI)。在開始監(jiān)視瘧疾感染前4周，用阿莫地喹(10mg/kg口服3天)和SP(單劑口服25mg/kg磺胺多辛和1.25mg/kg乙胺嘧啶)的組合推測地清除無癥狀寄生蟲血癥。兩周后檢查無寄生蟲血癥的情況，陽性者用二線療法(Co-Artem)治療，并由進一步的ADI評價排除。監(jiān)視在第3劑后14天開始，在之后的兩個半月中每兩周進行1次，然后在再往后的兩個月中每月進行1次(圖1)。在每次訪問時，外勤人員到家里看望兒童，完成一個簡單的病況調查表，并記錄腋下體溫。如果兒童是無熱的，則通過扎指將血液收集到載玻片和濾紙上。如果發(fā)現兒童有發(fā)熱或有發(fā)熱史，則陪伴該兒童到衛(wèi)生所，在那里對他/她進行檢查并收集血片。所有具有ADI陽性血片的兒童不管有無癥狀都進行治療。
在兩個同齡組中于第3劑后6個半月進行橫斷面調查。在該訪問期間測定腋下體溫和脾大小(Hackett度量法)，并制備血片。
實驗室方法為測定寄生蟲的存在情況和惡性瘧原蟲無性期的密度，按照標準質控方法讀取Giemsa染色血片14。在巴塞羅那醫(yī)院門診部進行外部驗證。使用干式生化光度計VITROS DT II(Orto Clinical Diagnostics，Johnson & Johnson Company，USA)檢測生化參數。血液學測試使用Sysmex KX-21N細胞計數儀(Sysmex Corporation Kobe，Japan)進行。紅細胞壓積(PCV)在肝素化微毛細管中用微型血細胞容量離心機離心后使用Hawksley血細胞容量讀數器檢測。
用標準血清作為參比，使用含序列[NVDP(NANP)15]2LR的重組抗原R32LR吸附的平板，通過標準ELISA檢測環(huán)子孢子蛋白串聯重復表位的特異性抗體。用市售試劑盒(ETI-MAK-4 DIASORIN)通過ELISA測定HBsAg的存在情況。用市售試劑盒(Abbott的AUSAB EIA)通過ELISA檢測抗HBsAg抗體水平。對于IFAT測定，將25μl的測試血清(兩倍連續(xù)稀釋一直到1/81920)與固定在載玻片上的血液期惡性瘧原蟲寄生蟲溫育。用FITC標記的二抗伊文氏藍(Evans Blue)顯示陽性反應。記錄在UV光學顯微鏡下發(fā)出陽性熒光的最高稀釋度。
定義和統(tǒng)計學方法在同齡組1中評價的主要終點是有癥狀的惡性瘧原蟲瘧疾首次臨床發(fā)作的時間。臨床發(fā)作被定義為由于液下體溫≥37.5℃而被送至衛(wèi)生機構且存在高于2500/μl的惡性瘧原蟲無性寄生蟲血癥的兒童。已推測出該病例定義為91％特異性和95％靈敏度15。第二個和第三個終點包括對不同定義的臨床瘧疾的疫苗效力估計和檢查多次發(fā)作。
所有的入院病例都由兩組醫(yī)師獨立地檢查，以便確立最終診斷，差異在未盲前的協商會上解決。在其中瘧疾被判斷為患病的唯一原因或顯著致病因素的惡性瘧原蟲無性寄生蟲血癥兒童中，確定需要入院的瘧疾。嚴重瘧疾的病例定義來源于WHO的臨床實驗規(guī)范指南16。嚴重瘧疾的所有病例都需要具有無性惡性瘧原蟲寄生蟲血癥并沒有其它更可能的病因。所述定義是嚴重瘧疾貧血(PCV＜15％)、腦型瘧(Blantyre昏迷記分＜2)和其它人體系統(tǒng)的嚴重疾病的復合，所述嚴重疾病為多次癲癇發(fā)作(在之前的24小時中至少有兩次或多次全身性抽搐)、虛脫(定義為不能獨立地坐)、低血糖(＜2.2mmol/dL)、臨床懷疑的酸中毒或循環(huán)衰竭。
效力的按照方案(ATP)分析包括滿足所有合格標準、完成接種程序并有助于效力監(jiān)視的受試者。除了評價全因入院以外，還根據研究區(qū)域的缺乏情況和抗瘧疾藥物的使用調整時間風險。為分析臨床瘧疾的多次發(fā)作，在先前發(fā)作后28天內受試者被認為是不易感的。
關于首次臨床瘧疾發(fā)作或瘧疾感染的時間，疫苗效力使用Cox回歸模型評價，被定義為1減去危害比。疫苗效力根據預先確定的年齡共變、蚊帳應用情況、地理區(qū)域和距健康中心的距離而調整。使用基于Schoenfeld殘差17的測試和時間依賴性Cox模型18用圖表研究比例危害假設。對于多次發(fā)作的臨床瘧疾和入院，使用具有正交隨機截矩的Poisson回歸模型評價群體效應，包括作為偏置變量的時間風險。疫苗效力定義為1減去率比。全文報告調整過的疫苗效力。
其它探察分析包括對嚴重瘧疾和入院瘧疾的分析，為此使用Fishers確切檢驗對比具有至少一次發(fā)作的兒童比例差。在確切的95％置信區(qū)間下以1減去風險比計算VE19。使用Fishers確切檢驗評價8個半月時的貧血發(fā)病率(PCV＜25％)差異和陽性寄生蟲密度比例。使用非參數Wilcoxon檢驗評價治療對血細胞容量值和陽性密度幾何平均值的作用。
相似的方法學用于治療意圖(ITT)分析。由第1劑開始的時間風險未針對研究缺乏或藥物使用情況而調整，效力評價未針對共變而調整。
抗CS和抗HBsAg抗體數據通過具有95％CI的幾何平均滴度(GMT)總結。計算抗CS滴度的血清反應陽性率(定義為＞0.5EU/mL)。計算抗HBs滴度的血清保護率(定義為≥10mIU/mL)。使用SAS20和STATA21進行分析。
結果同齡組1和2的實驗概圖示于圖2a和2b。在每個同齡組中，隨機化產生相仿的兒童組(表1)。所有的指標都表明，同齡組2的研究區(qū)域中的瘧疾傳播強度高于同齡組1。
疫苗安全性RTS，S/AS02A和對照疫苗是安全的和良好耐受的；兩個組中92％以上的受試者接受全部3劑。局部和全身性的訴求不良事件是短時期的，在強度上大部分是溫和的或適中的。3級局部或全身不良事件是不常見的和短時期的。在RTS，S/AS02A和對照組中，分別有7例(0.2％)和1例(0.03％)在給藥后出現臂部活動受限的局部注射部位疼痛，分別有224例(7.7％)和14例(0.5％)在給藥后出現＞20mm的注射部位腫脹。在RTS，S/AS02A和對照組中分別有55例(1.9％)和23例(0.8％)在給藥后出現阻礙正?；顒拥娜硇栽V求不良事件(發(fā)熱、過敏、瞌睡、厭食)。在RTS，S/AS02A和對照組中分別有653名(64.5％)受試者和597名(59.1％)受試者報告了至少一個未訴求不良事件。在實驗過程中，安全性實驗室值基本由基線保持不變。
有429例報告的SAERTS，S/AS02A組有180例[17.8％]，相比之下對照組有249例[24.7％]。在研究中有15例死亡RTS，S/AS02A組5例
，對照組10例[1.2％]。4例死亡以瘧疾為顯著致病因素，全部4例都在對照組。沒有嚴重不良事件或死亡被判定為與接種相關。
免疫原性研究兒童中的接種前抗CS抗體滴度低。疫苗是免疫原性的，在第3劑后誘導高抗體水平，在6個月內衰減至初始水平的約，但仍大大高于基線值。對照組中的抗體水平在整個隨訪期都保持很低。所述疫苗還誘導高水平的抗HbsAg抗體(超過97％血清保護率)(表2)。對于CS和HbsAg這二者，所述疫苗的免疫原性在24個月齡以下的兒童中較高。
疫苗效力在于同齡組1中進行的ATP分析中，有282名具有首次或唯一一次臨床發(fā)作的兒童滿足原發(fā)性病例定義(在RTS，S/AS02A組中為123名，在對照組中為159名)，獲得的原制疫苗效力評價為26.9％(95％CI7.4％-42.2％；p＝0.009)，調整后的評價為29.9％(95％CI11％-44.8％；p＝0.004)(圖3a和表3)。臨床瘧疾首次發(fā)作的兒童中的無性期寄生蟲密度不受接種影響，因為病發(fā)時RTS，S/AS02A組和對照組的幾何平均密度分別為43522/μL和41867/μL(p＝0.915)。
當使用不同方法分析時(使用Schoenfeld殘差檢驗危害比[p＝0.139])，按照在主要終點中的定義，在6個月的觀察期內沒有效力衰減的證據。與這些數據相一致，在第3劑后6個半月的橫斷面調查中，RTS，S/AS02A接受者中的寄生蟲血癥發(fā)病率不到37％(在RTS，S/AS02A中為11.9％，相比之下在對照組中為18.9％，p＜0.001)。這些兒童中的寄生蟲密度在RTS，S接受者和對照之間是相似的(幾何平均密度2271對2513；p＝0.699)。
幾乎沒有兒童經歷一次以上的發(fā)作，該終點的疫苗效力是VE＝27.4％[95％CI6.2％-43.8％；p＝0.014])。對于基于寄生蟲密度截止值的不同病例定義，VE推定值未顯著改變(表3)。由第1劑開始的臨床疾病時間的ITT分析獲得30.2％的VE(95％CI14.4％-43.0％；p＜0.001)。在ATP分析中，伴隨發(fā)作的貧血(PCV＜25％)在RTS，S/AS02A組有26例，在對照組有36例(VE＝28.2％[95％CI-19.6％-56.9％；p＝0.203])。在8個半月時的貧血發(fā)病率對照組為0.29％，相比之下疫苗組為0.44％，p＝0.686。
在RTS，S/AS02A組中，有11名兒童具有至少一次嚴重瘧疾發(fā)作，而在對照組中有26名兒童(VE＝57.7％[95％CI16.2％-80.6％；p＝0.019])。在RTS，S/AS02A組中，有42名患瘧疾兒童需要入院，相比之下對照組為62名(VE＝32.3％[95％CI1.3％-53.9％；p＝0.053])。在兩組之間有相似數量的全因入院(79對90；VE＝14.4％[95％CI-19.7％-38.8％；p＝0.362])。
在同齡組2中測定減少首次感染時間的疫苗效力評價值。有323名首次或唯一一次無性惡性瘧原蟲寄生蟲血癥發(fā)作的兒童(RTS，S/AS02A組157名，對照組166名)，獲得VE評價為45％(95％CI31.4％-55.9％；p＜0.001)(圖3b和表3)。對照組和RTS，S/AS02A組首次感染時的無性期寄生蟲平均密度是相似的(3950/μL對3016/μL，p＝0.354)。使用和用于評價同齡組1的效力持久性的方法相同的方法，具有最佳擬合的模型提示疫苗效力隨時間衰減，穩(wěn)定在約40％。RTS，S/AS02A組中的無性惡性瘧原蟲寄生蟲血癥的發(fā)病率在隨訪結束時顯著低于對照組(分別是52.3％對65.8％；p＝0.019)。在8個半月時的貧血發(fā)病率對照組為2.7％，RTS，S/AS02A組為0.0％(p＝0.056)。
沒有證據表明年齡和疫苗效力之間有相互影響，提示效力未隨著年齡增加而顯著改變。但是，我們未進行進一步的探索性亞組分析來評價承受瘧疾疾病攻擊的較年幼組中的疫苗效力。在不足24個月齡的兒童中，在第1劑時在RTS，S/AS02A接受者(N＝173)中有3例嚴重瘧疾，而在對照組接受者(N＝173)中有13例(VE＝76.9％[95％CI27.0％-96.9％；p＝0.018])。對首次或唯一一次臨床瘧疾發(fā)作的發(fā)病率進行相似的分析。在RTS，S/AS02A組和對照組中，在較年幼兒童中分別有31例和47例瘧疾發(fā)作，產生的發(fā)病率為0.41和0.70發(fā)作PYAR(VE＝46.7％[95％CI14.8％-66.7％；p＝0.009])?？剐赂腥镜腣E在較年長和較年幼組中是相似的(44.0％對46.5％)。
在同齡組1中評價CS滴度和瘧疾保護作用之間的關系。CS滴度每增加10倍的危害比是0.94(95％CI0.66-1.33；p＝0.708)；CS反應較高的1/4受試者對CS反應較低的1/4受試者的危害比為1.38(95％CICI 0.89-2.12；p＝0.150)。
討論RTS，S/AS02A是首個在年幼非洲兒童中同時賦予抗惡性瘧原蟲引起的感染和臨床疾病譜的保護作用的亞單位疫苗。結果表明，基于誘導部分抗感染保護的單一紅細胞前期抗原的疫苗可降低發(fā)病率，即便沒有血液期組分。
在年幼非洲兒童中，RTS，S/AS02A被良好耐受，其反應原性譜類似于在先前的該疫苗的兒科實驗中所觀察到的。局部和全身性癥狀比在對照疫苗組中更常見，但沒有導致受試者退出。所述疫苗是安全的；接受RTS，S/AS02A的兒童體驗到的全因嚴重不良事件、入院和嚴重瘧疾并發(fā)癥比對照組少。正如已由其它干涉實驗所觀察到的，我們的研究參與者中的發(fā)病率低于該群體中的歷史背景發(fā)病率9。
盡管高水平地暴露于惡性瘧原蟲子孢子，但在該群體中天然存在的抗CS抗體水平很低。所述疫苗是高度免疫免疫原性的，尤其是在不足24個月的兒童中。抗體水平在6個月內衰減達約75％，但在隨訪期結束時其仍遠遠高于免疫前水平。在RTS，S/AS02A參與者中，我們未檢測到抗CS抗體水平和瘧疾風險之間的聯系。但是，幾乎所有疫苗接受者都達到的高滴度和可能存在免疫性的相對低閾值保護水平的可能性潛在地限制了該分析。另外，已知疫苗誘導一般被認為參與保護作用的細胞介導應答，該應答在本研究中未檢測到22。
所述疫苗抗感染的效力與該紅細胞前期疫苗中和子孢子并限制感染的肝細胞數或進入血流的肝期裂殖子數的已知能力相一致5。所述結果還表明，抗感染的保護作用與抗溫和性無并發(fā)疾病、瘧疾入院和嚴重瘧疾的保護作用之間有顯著一致性。盡管似乎有趨勢提示較年幼兒童中的效力和對更嚴重終點的效力較高，但不同終點的置信區(qū)間重疊，觀察到的差異可能源于偶然性。觀察到的抗不同終點的保護作用提示，更容易檢測的感染終點可用作抗臨床疾病的疫苗效力的替代。
我們意外地沒有觀察到貧血病例中的顯著差異。盡管所述趨勢針對在RTS，S/AS02A疫苗接受者中出現的少量病例，但研究當中的瘧疾貧血率遠低于預期，這限制了檢測針對該終點的統(tǒng)計學顯著疫苗效力的能力。強烈提醒母親或監(jiān)護人在病程早期帶其子女到衛(wèi)生機構可能確保了對瘧疾病例的迅速治療，降低了貧血發(fā)病率。另外，莫桑比克最近轉換成一種更有效的瘧疾一線療法，接受了這些藥物的實驗中的兒童更快速地清除了寄生蟲，復發(fā)較少，因此感染時程較短。這些干涉的每一個都對所觀察到的貧血發(fā)病率有影響。
使用統(tǒng)計學方法檢測衰減效力，提示在整個觀察期內都有持續(xù)的抗新感染和臨床疾病這二者的疫苗效力，在最后的橫斷面調查中，感染發(fā)病率有顯著差異。這與在未感染過瘧疾的志愿者或岡比亞成人中進行的實驗形成強烈反差，所述實驗提示疫苗效力是短期的6，23。對這些明顯矛盾的結果有幾個可能的解釋。首先，所述疫苗在本研究群體中的免疫原性遠比其在成人中的免疫原性強，持續(xù)的免疫應答可能產生持久的保護效力。其次，在本實驗中存在的較高水平的子孢子暴露可能產生天然加強的保護性免疫應答，其不能通過抗體檢測來揭示。對研究群體保持監(jiān)視，以監(jiān)測長期安全性和疫苗效力時程。
本實驗一個最值得注意的發(fā)現是記錄到58％的抗嚴重瘧疾的效力，以及其在較年幼兒童中可能更高的提示。盡管嚴重瘧疾的定義是一個持續(xù)爭論的問題，但按照基于WHO的定義鑒別患病非常嚴重的兒童和高危垂死兒童的兒童分類法幾乎沒有疑問。
參考文獻1.Hay SI，Guerra CA，Tatem AJ，Noor AM，Snow RW.The globaldistribution and population at risk of malariapast，present，and future.(瘧疾風險的全球分布和人口過去、現在和進來)The Lancet InfectiousDiseases 2004；4(6)327-336.
2.Breman JG，Alilio MS，Mills A.The intolerable burden of malariawhat′s new，what′s needed.(無法忍受的瘧疾負擔什么是新的，什么是需要的)Am J Trop Med Hyg 2004；71(2_suppl)0-i-.
3.Klausner R，Alonso P.An attack on all fronts.(對所有前線的攻擊)Nature 2004；430(7002)930-14.Ballou WR，Arevalo-Herrera M，Carucci D，Richie TL，CorradinG，Diggs C，et al.Update on the clinical development of candidate malariavaccines.(候選瘧疾疫苗的臨床開發(fā)的更新)Am J Trop Med Hyg 2004；71(2_suppl)239-247.
5.Stoute J，Slaoui M，Heppner D，Momin P，Kester K，Desmons P，et al.A preliminary evaluation of a recombinant circumsporozoite proteinvaccine against Plasmodium falciparum malaria.(重組環(huán)子孢子蛋白疫苗抗惡性瘧原蟲瘧疾的初步評估)RTS，S Malaria Vaccine EvaluationGroup.N Engl J Med 1997；336(2)86-91.
6.Bojang KA，Milligan PJM，Pinder M，Vigneron L，Alloueche A，Kester KE，et al.Efficacy of RTS，S/AS02 malaria vaccine againstPlasmodium falciparum infection in semi-immune adult men in TheGambiaa randomised trial.(RTS，S/AS02A瘧疾疫苗在岡比亞半免疫成人中抗惡性瘧原蟲感染的效力隨機性試驗)The Lancet 2001；358(9297)1927-1934.
7.Bojang KA，，Olodude F，Pinder M，Ofori-Anyinam O，Vigneron L，Fitzpatrick S，Njie F，Kassanga A，Leach A，Milman J，Rabinovich R，McAdam KPWJ，Kester KE，Heppner DG，Cohen JD，Tornieporth N，andMilligan PJM.Safety and immunogenicity of RTS，S/AS02A candidatemalaria vaccine in Gambian children.(RTS，S/AS02A候選瘧疾疫苗在岡比亞兒童中的安全性免疫原性)Vaccine submitted.
8.Macete E，Aponte JJ，Guinovart C，Sacarlal J，Mandomando I，Espasa M，et al.Safety，reactogenicity and immunogenicty of theRTS，S/AS02A candidate malaria vaccine in children aged 1 to 4 years inMozambique.(RTS，S/AS02A候選瘧疾疫苗在莫桑比克1-4歲兒童中的安全性、反應原性和免疫原性)Vaccine submitted.
9.Alonso P，Saúte F，Aponte J，Gómez-Olivé F，Nhacolo A，Thomson R，et al. DSS，Mozambique.InINDEPTH，ed.Population and Health in Developing Countries.(發(fā)展中國家的人口和健康)OttawaInternational Development Research Centre，2001189-195.
10.Dame JB，Williams JL，McCutchan TF，Weber JL，Wirtz RA，Hockmeyer WT，Maloy WL，Haynes.JD，Schneider I，Roberts D，et al.Structure of the gene encoding the immunodominant surface antigen onthe sporozoite of the human malaria parasite Plasmodium falciparum.(人瘧疾寄生蟲惡性瘧原蟲子孢子上的免疫顯性表面抗原的編碼基因的結構)Science.1984；225593-9.
11.Young JF，Hockmeyer WT，Gross M，Ballou、WR，Winz RA，Trosper JH，Beaudoin RL，Hollingdale MR，Miller LH，Diggs CL，et al.Expression of Plasmodium falciparum circumsporozoite proteins inEscherichia coli fbr potential use in a human malaria vaccine.(用于人瘧疾疫苗的惡性瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白在大腸桿菌中的表達)Science 1985；228958-62.
12.Doheny J，Pinder M，Tornieporth N，Canon C，Vigneron L，Milligan P，et al.A phase I safety and immunogenicity trial with thecandidate malaria vaccine RTS，S/SBAS2 in semi-immune adults in TheGambia.(岡比亞半免疫成人中用候選瘧疾疫苗RTS，S/SBAS2進行的I期安全性和免疫原性實驗)Am J Trop Med Hyg 1999；61(6)865-868.
13.Loscertales MP，Roca A，Ventura P，Abascassamo F，Dos SantosF，Sitaube M，et al.Epidemiology and clinical presentation of respiratorysyncytial virus infection in a rural aurea of southem Mozambique.(南莫桑比克鄉(xiāng)村地區(qū)中呼吸合胞體病毒感染的流行病學和臨床介紹)PediatrInfect Dis J 2002；21148-155.
14.Alonso P，Smith T，Schellenberg J，Masanja H，Mwankusye S，Urassa H，et al.Randomised trial of efficacy of SPf66 vaccine againstPlasmodium falciparum malaria in children in southern Tallzania.(南坦桑尼亞兒童中SPf66疫苗抗惡性瘧原蟲的效力的隨機性試驗)The Lancet1994；3441175-81.
15.Saúte F，Aponte J，Almeda J，Ascaso C，Abellana R，Vaz N，et al.Malaria in southern Mozambiquemalariometric indicators and malariacase definition in district.(南莫桑比克的瘧疾 區(qū)中的瘧疾統(tǒng)計指標和病例定義)in press.
16.World Health Organization.Management of severe malaria，apractical handbook.(嚴重瘧疾的管理實用手冊)Second edition，2000.http://mosquito.who.int/docs/hbsm.pdf17.Therneau TM，Grambsch PM.Modeling Survival DataExtending the Cox Model.(建模存活數據擴展Cox模型)New YorkSpringer，2000.
18.Hess KR.Graphical methods for assessing violations of theproportional hazards assumption in Cox regression.(Cox回歸中用于估計比例危害假定的圖解方法)Stat Med 1995；14(15)1707-23.
19.Cytel Software Corporation.StatXact PROCs for SAS Users(version 6).Cambridge，MA，USA.
20.SAS Institue Inc.SAS sonware(version 8).Cary，NC，USA.
21.Stata Corporation.Stata Statistical Software(Release 8.0).College Station，TX，USA 2003.
22.Sun P，Schwenk R，White K，Stoute JA，Cohen J，Ballou WR，Voss G，Kester KE，Heppner DG，Krzych U.Protective immunity inducedwith malaria vaccine，RTS，S，is linked to Plasmodium falciparumcircumsporozoite protein-specific CD4(+)and CD8(+)T cells producingIFN-gamma.(用RTS，S瘧疾疫苗誘導的保護性免疫與惡性瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白特異性CD4(+)和CD8(+)T細胞產生的IFN-γ有關)JImmunol.2003 Dec 15；171(12)6961-7.
23.Stoute，JA，Kester KE，Krzych U，Wellde BT，Hall T，White K，Glenn G，Ockenhouse CF， N，Schwenk R，Lanar DE，Momin P，Golenda C，Slaoui M，Wortmann G，Cohen J，Ballou WR.Long TermEfficacy and Immune Responses Following Immunization with the RTS，SMalaria Vaccine.(用RTS，S瘧疾疫苗免疫后的長期效力和免疫應答)JInfect Dis 1781139-44，1998.
權利要求
1.瘧原蟲(Plasmodium)抗原在生產藥物中的用途，所述瘧原蟲抗原在紅細胞前期表達，所述藥物用于抗嚴重瘧疾疾病的接種，所述瘧原蟲抗原與藥物可接受的佐劑或載體組合。
2.權利要求1的用途，其中所述目標群體為5歲以下的兒童。
3.權利要求1或權利要求2的用途，其中所述目標群體為1-4歲的兒童。
4.權利要求1-3中任一項的用途，其中所述抗原選自CS、LSA-1、LSA-3、AMA-1、Exp-1或其免疫原性片段。
5.權利要求1-4中任一項的用途，其中所述抗原為融合至乙肝表面抗原(HBsAg)的子孢子抗原。
6.權利要求4或權利要求5的用途，其中所述子孢子抗原為環(huán)子孢子蛋白(CS)或其免疫原性片段。
7.權利要求6的用途，其中所述CS蛋白或片段為雜合蛋白形式，所述雜合蛋白含基本上全部的瘧原蟲(Plasmodium)CS蛋白的C端部分、4個或更多個串聯重復的CS蛋白免疫顯性區(qū)以及乙肝表面抗原(HBsAg)。
8.權利要求7的用途，其中所述雜合蛋白包含基本上對應于惡性瘧原蟲(P.falciparum)NF54品系3D7克隆CS蛋白的氨基酸207-395的惡性瘧原蟲(P.falciparum)CS蛋白序列，所述CS蛋白序列經線性接頭按照讀框融合至HBsAg的N末端。
9.權利要求8的用途，其中所述雜合蛋白為RTS。
10.權利要求9的用途，其中所述RTS為混合顆粒RTS，S形式。
11.權利要求10的用途，其中RTS，S的量為每劑25μg。
12.權利要求1-11中任一項的用途，其中所述抗原與佐劑組合使用，所述佐劑為Th1細胞應答的優(yōu)選刺激劑。
13.權利要求12的用途，其中所述佐劑包括3D-MPL、QS21或3D-MPL和QS21的組合。
14.權利要求13的用途，其中所述佐劑還包括水包油乳劑。
15.權利要求13的用途，其中所述佐劑還包括脂質體。
全文摘要
本發(fā)明涉及瘧疾抗原免疫對抗瘧疾疾病的新用途。具體地說，本發(fā)明涉及子孢子抗原、具體地說為環(huán)子孢子(CS)蛋白或其片段免疫對抗嚴重瘧疾疾病的用途。
文檔編號A61P33/06GK101056653SQ200580038022
公開日2007年10月17日 申請日期2005年9月14日 優(yōu)先權日2004年9月16日
發(fā)明者J·D·科亨, N·G·托爾尼波特 申請人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司