專利名稱：分離的譜系陰性造血干細胞及用其治療的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分離的哺乳動物干細胞。更具體地說，本發(fā)明涉及骨髓源的譜系陰性造血干細胞(Lin-HSC)群，以及通過用分離的Lin-HSC群治療哺乳動物眼睛來保持患有眼退化性疾病的哺乳動物視網(wǎng)膜中的視錐細胞的方法。
背景技術(shù)：
年齡相關(guān)性黃斑變性(ARMD)與糖尿病性視網(wǎng)膜病變(DR)在工業(yè)化國家中是視力喪失的主因，由異常的視網(wǎng)膜血管新生所致。因為視網(wǎng)膜由界限清楚的神經(jīng)元層、神經(jīng)膠質(zhì)層和血管元件層組成，所以諸如在血管增生或水腫中可見的相對小的紊亂即可導(dǎo)致視覺功能顯著喪失。遺傳性視網(wǎng)膜變性，例如色素性視網(wǎng)膜炎(RP)，也與諸如微動脈狹窄及血管性萎縮之類的血管異常相關(guān)。大部分遺傳性人視網(wǎng)膜變性明確地侵襲視桿光感受器，但也存在伴隨的視錐喪失，視錐是黃斑的主要細胞元件，黃斑是人視網(wǎng)膜中負責(zé)集中、精細的視敏度的區(qū)域。視錐特異性存活因子近來已有描述(Mohand-Said等，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，958357-8362)，可利于視網(wǎng)膜變性小鼠模型中的視錐存活。
遺傳性視網(wǎng)膜變性影響多1/3500的個體，其特征是進行性夜盲、視野缺損、視神經(jīng)萎縮、小動脈變細、血管透性改變及通常會發(fā)展為全盲的視野中心缺損(Heckenlively，J.R.編，1988；RetinitisPigmentosa，PhiladelphiaJB Lippincott Co.)。這些疾病的分子遺傳學(xué)分析已在110多種不同基因中識別出突變，這些突變解釋了僅相對較小百分率的受侵襲個體(Humphries等，1992，Science 256804-808；Farrar等，2002，EMBO J.21857-864)。這些突變中有很多都與包括視紫紅質(zhì)、cGMP磷酸二酯酶、rds外周蛋白及RPE65在內(nèi)的光轉(zhuǎn)導(dǎo)器中的酶和結(jié)構(gòu)組分相關(guān)。盡管有這些觀察結(jié)果，但仍沒有減緩或逆轉(zhuǎn)這些視網(wǎng)膜變性疾病進展的有效療法。在將野生型轉(zhuǎn)基因傳遞到有特定突變的動物的光感受器或視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)時，基因療法的新進展已實現(xiàn)了小鼠中rds(Ali等，2000，Nat.Genet.25306-310)及rd(Takahashi等，1999，J.Virol.737812-7816)表型與狗中RPE65表型(Acland等，2001，Nat.Genet.2892-95)的成功逆轉(zhuǎn)。
多年來已知在正常成人循環(huán)系統(tǒng)與骨髓中存在一個干細胞群。這些細胞的不同亞群可依照造血譜系陽性(Lin+)或譜系陰性(Lin-)譜系分化。此外，近來已表明譜系陰性造血干細胞(HSC)群含有能夠在體外和體內(nèi)形成血管的內(nèi)皮祖細胞(EPC)(參見Asahara等，1997，Science275964-7)。這些細胞可參與正常的和病理性的出生后血管發(fā)生(參見Lyden等，2001 Nat.Med.7，1194-201；Kalka等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci．U.S.A.973422-7；及Kocher等，2001，Nat.Med.7430-6)，以及分化成多種非內(nèi)皮細胞類型，包括肝細胞(參見Lagasse等，2000，Nat.Med.61229-34)、小膠質(zhì)細胞(參見Priller等，2002 Nat.Med.71356-61)、心肌細胞(參見Orlic等，2001，Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.9810344-9)及上皮細胞(參見Lyden等，2001，Nat.Med. 71194-1201)。盡管這些細胞已用于若干血管發(fā)生的實驗?zāi)Ｐ?，但EPC靶向新生血管的機制仍是未知的，而且尚沒有確定將有效增加對特定血管系統(tǒng)有益的細胞數(shù)量的策略。
得自骨髓的造血干細胞是目前唯一普遍用于治療用途的干細胞類型。骨髓HSC應(yīng)用于移植已超過40年。目前，正在研究收獲純化的干細胞的先進方法，以開發(fā)出治療白血病、淋巴瘤及遺傳性血液病的療法。已在少數(shù)人類患者中對干細胞在人中治療糖尿病及晚期腎癌的臨床應(yīng)用進行了研究。
發(fā)明概述本發(fā)明提供一種改善患有眼疾的哺乳動物視網(wǎng)膜中的視錐細胞變性的方法。該方法包括給予哺乳動物視網(wǎng)膜哺乳動物骨髓源的、分離的、譜系陰性的造血干細胞群的步驟，所述造血干細胞群包含造血干細胞和內(nèi)皮祖細胞。所述細胞以足以延遲視網(wǎng)膜中的視錐細胞變性的量給予。
一種優(yōu)選方法包括由患有眼疾的哺乳動物骨髓分離含內(nèi)皮祖細胞的譜系陰性造血干細胞群，隨后將分離的干細胞以足以改善視網(wǎng)膜中的視錐細胞變性的量玻璃體內(nèi)注射入哺乳動物眼內(nèi)。
本發(fā)明方法使用來源于哺乳動物骨髓的、分離的、哺乳動物的、譜系陰性的造血干細胞(Lin-HSC)群(即在其細胞表面上不表達譜系表面抗原(Lin)的造血干細胞(HSC))。優(yōu)選地，所述細胞為自體干細胞(即來源于待治療個體哺乳動物的骨髓)。分離的哺乳動物L(fēng)in-HSC群包含內(nèi)皮祖細胞(EPC)，也稱為內(nèi)皮前體細胞，其在玻璃體內(nèi)注射入眼中時選擇性地靶向活化的視網(wǎng)膜星形膠質(zhì)細胞。優(yōu)選所述哺乳動物為人。
在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的Lin-HSC群如下分離由患有眼疾的哺乳動物抽取骨髓；從骨髓中分離多種單核細胞；用針對一種或多種譜系表面抗原的生物素綴合的譜系群體抗體標(biāo)記單核細胞，除去譜系表面抗原陽性的單核細胞，然后回收含EPC的Lin-HSC群。優(yōu)選地，單核細胞用針對一種或多種譜系表面抗原的生物素綴合的譜系群體抗體來標(biāo)記，所述譜系表面抗原選自CD2、CD3、CD4、CD11、CD11a、Mac-1、CD14、CD16、CD19、CD24、CD33、CD36、CD38、CD45、Ly-6G、TER-119、CD45RA、CD56、CD64、CD68、CD86、CD66b、HLA-DR及CD235a(血型糖蛋白A)。優(yōu)選地，本發(fā)明分離的Lin-HSC群中至少約20％的細胞表達表面抗原CD31。然后將分離的細胞給予哺乳動物患病的眼，優(yōu)選通過眼內(nèi)注射給予。在一個優(yōu)選實施方案中，至少約50％的分離的Lin-HSC表達表面抗原CD31，至少約50％的分離的Lin-HSC表達表面抗原CD117(c-kit)。
本發(fā)明Lin-HSC群中的EPC廣泛地滲入發(fā)育中的視網(wǎng)膜血管中和滲入視網(wǎng)膜的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)中，并且仍穩(wěn)定地滲入眼部新生血管和神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)中。正常小鼠視網(wǎng)膜主要為視桿，但是，在本發(fā)明方法治療的小鼠中，Lin-HSC治療后被拯救的細胞令人驚訝地幾乎全部是視錐。
在一個優(yōu)選實施方案中，用一種治療上有用的基因轉(zhuǎn)染分離的Lin-HSC群的細胞。例如，所述細胞可用有效編碼神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)或抗血管發(fā)生物質(zhì)的多核苷酸轉(zhuǎn)染，所述細胞選擇性靶向新生血管系統(tǒng)，并在不影響既有血管的情況下通過一種基于細胞的基因治療形式抑制新血管形成。在一個實施方案中，用于本發(fā)明方法的分離的Lin-HSC群含有一種編碼血管發(fā)生抑制肽的基因。血管發(fā)生抑制性Lin-HSC可用于在諸如ARMD、DR及與異常血管系統(tǒng)相關(guān)的某些視網(wǎng)膜變性的疾病中調(diào)節(jié)異常血管生長。在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的分離的Lin-HSC含有編碼神經(jīng)營養(yǎng)肽的基因。神經(jīng)營養(yǎng)性Lin-HSC可用于促進眼疾中的神經(jīng)元拯救，所述眼疾包括視網(wǎng)膜神經(jīng)變性，例如青光眼、視網(wǎng)膜色素變性等。
用本發(fā)明的分離的Lin-HSC群治療眼的一個特別優(yōu)勢是，在用Lin-HSC玻璃體內(nèi)處理的眼中觀察到血管營養(yǎng)性和神經(jīng)營養(yǎng)性拯救作用。在用本發(fā)明分離的Lin-HSC治療的眼中，視網(wǎng)膜神經(jīng)元及光感受器(尤其是視錐)得以保持，視覺功能的一些量度可以維持。
優(yōu)選地，本發(fā)明方法要治療的患病視網(wǎng)膜包含活化的星形膠質(zhì)細胞。這可通過在有相關(guān)的神經(jīng)膠質(zhì)增生時早期治療眼實現(xiàn)，或通過使用激光刺激活化的星形膠質(zhì)細胞的局部增殖實現(xiàn)。
附圖簡述在附圖中

圖1圖示了發(fā)育中的小鼠視網(wǎng)膜的示意圖。(a)初級叢的發(fā)育。(b)視網(wǎng)膜血管形成的第二階段。GCL，神經(jīng)節(jié)細胞層；IPL，內(nèi)叢層；INL內(nèi)核層；OPL，外叢層；ONL，外核層；RPE，視網(wǎng)膜色素上皮；ON，視神經(jīng)；P，外周。圖(c)圖示了骨髓源Lin+HSC和Lin-HSC分離細胞的流式細胞術(shù)特征。頂行非抗體標(biāo)記細胞的點陣圖分布，其中R1確定陽性PE-染色的定量門控區(qū)，R2表示GFP-陽性；中間行Lin-HSC(C57B/6)；底行Lin+HSC(C57B/6)細胞，每個細胞系都用Sca-1、c-kit、Flk-1/KDR、CD31的PE-綴合抗體標(biāo)記。Tie-2數(shù)據(jù)得自Tie-2-GFP小鼠。百分數(shù)表示總Lin-HSC或Lin+HSC群中陽性標(biāo)記細胞的百分比。
圖2圖示了Lin-HSC植入發(fā)育中的小鼠視網(wǎng)膜中。(a)在注射后4天(P6)時，玻璃體內(nèi)注射的eGFP+Lin-HSC細胞在視網(wǎng)膜上附著并分化。(b)Lin-HSC(B6.129S7-Gtrosa26小鼠，用β-gal抗體染色)在用膠原蛋白IV抗體染色的血管系統(tǒng)(星號表示血管系統(tǒng)頂端)前建立其自身。(c)在注射后4天(P6)時，大多數(shù)Lin+HSC細胞(eGFP+)不能分化。(d)注射后4天(P6)時的腸系膜eGFP+鼠EC。(e)注射入成體小鼠眼中的Lin-HSC(eGFP+)。(f)在GFAP-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠中依照已存在的星型膠質(zhì)細胞模板歸巢并分化的eGFP+Lin-HSC(箭頭處)的低倍放大。(g)Lin-細胞(eGFP)與其下面的星型膠質(zhì)細胞(箭頭處)之間的締合的高倍放大。(h)未注射的GFAP-GFP轉(zhuǎn)基因?qū)φ铡?i)注射后4天(P6)時，eGFP+Lin-HSC向未來的深叢區(qū)遷移并經(jīng)歷分化。左圖獲取了整裝視網(wǎng)膜中的Lin-HSC活性；右圖指示Lin-細胞(箭頭處)在視網(wǎng)膜(頂部是玻璃體面，底部是鞏膜面)中的位置。(J)用α-CD31-PE及α-GFP-alexa 488抗體進行雙重標(biāo)記。注射后7天，注入的Lin-HSC(eGFP，紅色)滲入血管系統(tǒng)(CD31)中。箭頭指示滲入?yún)^(qū)。(k)注射后14天(P17)eGFP+Lin-HSC細胞形成血管。(l與m)心內(nèi)注射羅丹明-葡聚糖表明在初級叢(l)與深叢(m)中的血管都是完整和有功能的。
圖3表明，eGFP+Lin-HSC細胞靶向神經(jīng)膠質(zhì)增生部位(由表達GFAP的星型膠質(zhì)細胞指示，最左圖)，其由激光(a)與機械(b)二者在成熟視網(wǎng)膜中誘發(fā)的損傷(星號表明損傷部位)誘導(dǎo)。最右圖是一幅高倍放大圖，表明Lin-HSC與星型膠質(zhì)細胞緊密締合。校正條＝20μM。
圖4表明，Lin-HSC細胞拯救視網(wǎng)膜變性小鼠的血管。(a-d)，膠原蛋白IV染色的注射后27天(P33)的視網(wǎng)膜；(a)與(b)，用Lin+HSC細胞(Balb/c)注射的視網(wǎng)膜與正常FVB小鼠在血管系統(tǒng)方面未表現(xiàn)出差異；(c)與(d)，用Lin-HSC(Balb/c)注射的視網(wǎng)膜顯示出與野生型小鼠類似的豐富血管網(wǎng)絡(luò)；(a)與(c)，用DAPI染色的整個視網(wǎng)膜的冰凍切片(頂部是玻璃體面，底部是鞏膜面)；(b)與(d)，視網(wǎng)膜總量的深叢；(e)，條形圖，表明在注射Lin-HSC細胞的視網(wǎng)膜中形成的深血管叢的血管狀態(tài)增加(n＝6)。深視網(wǎng)膜血管化的程度通過計算每幅圖像中血管的總長來定量。比較了Lin-HSC、Lin+HSC或?qū)φ找暰W(wǎng)膜中血管平均總長度/高倍視野(以微米為單位)。(f)用得自rd/rd小鼠的Lin-HSC細胞(R，右眼)或Lin+HSC細胞(L，左眼)注射后進行深血管叢長度的比較。顯示了6只獨立小鼠的結(jié)果(一種顏色代表一只小鼠)。(g)與(h)Lin-HSC細胞(Balb/c)在注入P15眼中時也拯救了rd/rd血管系統(tǒng)。顯示了注入Lin-HSC細胞(G)或Lin+HSC細胞(H)的視網(wǎng)膜(注射后一個月)的中間血管叢及深血管叢。
圖5圖示了小鼠視網(wǎng)膜組織的顯微照片(a)，視網(wǎng)膜整裝片(rd/rd小鼠)的深層，eGFP+Lin-HSC注射后五天(P11)可見(灰色)。(b)與(c)，于P6接受Balb/c Lin-細胞(b)或Lin+HSC細胞(c)注射的Tie-2-GFP(rd/rd)小鼠的P60視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)。在(b)和(c)的左圖中只可見內(nèi)源內(nèi)皮細胞(GFP-染色)。(b)和(c)的中圖用CD31抗體染色；箭頭指示用CD31而不用GFP染色的血管，(b)和(c)的右圖顯示了用GFP與CD31同時染色。(d)注射過Lin-HSC的視網(wǎng)膜(左圖)與對照視網(wǎng)膜(右圖)的α-SMA染色。
圖6表明，T2-TrpRS-轉(zhuǎn)染的Lin-HSC抑制小鼠視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)的發(fā)育。(a)人TrpRS、T2-TrpRS和在氨基末端帶有Igk信號序列的T2-TrpRS的示意圖。(b)注射T2-TrpRS轉(zhuǎn)染的Lin-HSC的視網(wǎng)膜在體內(nèi)表達T2-TrpRS蛋白。(1)在大腸桿菌中產(chǎn)生的重組T2-TrpRS；(2)在大腸桿菌中產(chǎn)生的重組T2-TrpRS；(3)在大腸桿菌中產(chǎn)生的重組T2-TrpRS；(4)對照視網(wǎng)膜；(5)注射過Lin-HSC+pSecTag2A(只是載體)的視網(wǎng)膜；(6)注射過Lin-HSC+pKLe135(pSecTag中的Igk-T2-TrpRS)的視網(wǎng)膜。(a)，內(nèi)源TrpRS。(b)，重組T2-TrpRS。(c)，注射過Lin-HSC的T2-TrpRS的視網(wǎng)膜。(c-f)，注射后7天，接受注射的視網(wǎng)膜的代表性初級(表層)叢與次級(深)叢；(c)與(d)，注射過空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Lin-HSC的眼發(fā)育正常；(e)與(f)，T2-TrpRS-轉(zhuǎn)染的Lin-HSC注射過的眼多數(shù)表現(xiàn)出深叢抑制作用；(c)與(e)，初級(表面)叢；(d)與(f)，次級(深)叢。在(f)中觀察到的微弱血管輪廓是(e)中顯示的初級網(wǎng)絡(luò)血管的“滲漏”圖像。
圖7顯示了編碼His6-標(biāo)記的T2-TrpRS的DNA序列SEQ ID NO1。
圖8顯示了His6-標(biāo)記的T2-TrpRS的氨基酸序列SEQ ID NO2。
圖9圖示了小鼠視網(wǎng)膜的顯微照片和視網(wǎng)膜電圖(ERG)，所述小鼠的眼睛注射了本發(fā)明的Lin-HSC和Lin+HSC(對照)。
圖10圖示了統(tǒng)計圖，該圖表明了用Lin-HSC處理的rd/rd小鼠眼睛的中間血管層(Int.)和深血管層的神經(jīng)元拯救(y-軸)和血管拯救(x-軸)之間的相關(guān)性。
圖11圖示了統(tǒng)計圖，該圖表明用Lin+HSC處理的rd/rd小鼠眼睛的神經(jīng)元拯救(y-軸)和血管拯救(x-軸)之間沒有相關(guān)性。
圖12是用Lin-HSC處理的rd/rd小鼠眼睛(暗條)和未處理的rd/rd小鼠眼睛(亮條)在注射后1個月(1M)、2個月(2M)和6個月(6M)的時間點以任意相對單位表示的血管長度(Y-軸)的條形圖。
圖13包含3張條形圖，它們是注射后1個月(1M)、2個月(2M)及6個月(6M)時rd/rd小鼠外部神經(jīng)層(ONR)的核數(shù)量，表明用Lin-HSC處理的眼(暗條)的核數(shù)目相對于用Lin+HSC處理的對照眼(亮條)有顯著增加。
圖14描繪了個體rd/rd小鼠外部神經(jīng)層核數(shù)量的圖，該圖比較了在(注射后)1個月(1M)、2個月(2M)及6個月(6M)的時間點時右眼(R，用Lin-HSC處理)與左眼(L，用Lin+HSC處理的對照眼)；所給出圖中的每條線都比較個體小鼠的左右眼。
圖15描繪了rd1/rd1小鼠(C3H/HeJ，左圖)或野生型小鼠(C57BL/6，右圖)中視網(wǎng)膜血管和神經(jīng)細胞的變化。顯示了整裝視網(wǎng)膜(紅色膠原蛋白IV，綠色CD31)及同一視網(wǎng)膜切片(紅色DAPI，綠色CD31，下圖)中的中間血管叢(上圖)或深層(中圖)血管叢的視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)。(P出生后天數(shù))。(GCL節(jié)細胞層；INL內(nèi)核層；ONL外核層)。
圖16表明，Lin-HSC注射拯救rd1/rd1小鼠中的神經(jīng)細胞變性。(A、B與C)，注射過Lin-HSC的眼(右圖)與對側(cè)的注射過對照細胞(CD31-)的眼(左圖)在P30(A)、P60(B)和P180(C)時的中間叢(int.)或深叢的視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)和切片，(D)，在P30(左圖，n＝10)、P60(中圖，n＝10)及P180(右圖，n＝6)時注射過Lin-HSC或?qū)φ占毎?CD31-)的視網(wǎng)膜的血管系統(tǒng)平均總長度(平均值+或-標(biāo)準偏差)。分別顯示了中間血管叢(Int.)與深血管叢的數(shù)據(jù)(Y軸血管系統(tǒng)的相對長度)。(E)，在P30(左圖，n＝10)、P60(中圖，n＝10)或P180(右圖，n＝6)時注射過對照細胞(CD31-)或Lin-HSC的視網(wǎng)膜的ONL中的細胞核平均數(shù)(Y軸ONL中細胞核的相對數(shù)目)。(F)，在P30(左圖)、P60(中圖)及P180(右圖)時注射過Lin-HSC或?qū)φ占毎?CD31-)的視網(wǎng)膜的血管系統(tǒng)長度(X軸)與ONL中細胞核數(shù)(Y軸)之間的線性相關(guān)性。
圖17表明通過注射Lin-HSC拯救視網(wǎng)膜功能。使用視網(wǎng)膜電圖(ERG)記錄測量注射過Lin-HSC或?qū)φ占毎?CD31-)的視網(wǎng)膜的功能。(A與B)，注射后2個月被拯救與未被拯救的視網(wǎng)膜的典型例子。顯示了同一動物的注射過Lin-HSC的右眼(A)與注射過CD31-對照細胞的左眼(B)的視網(wǎng)膜切片(綠色CD31染色的血管系統(tǒng)，紅色DAPI染色的核)。(C)，(A與B)中所示的同一動物的ERG結(jié)果。
圖18表明，人骨髓細胞群能在rd1小鼠中拯救變性視網(wǎng)膜(A-C)。在另一視網(wǎng)膜變性模型rd10中也觀察到這種拯救(D-K)。A，用綠色染料標(biāo)記的人Lin-HSC(hLin-HSC)可在玻璃體內(nèi)注射入C3SnSmn.CB17-Prkdc SCID小鼠后分化為視網(wǎng)膜血管細胞。(B與C)，注射后1.5個月時，在注射過Lin-HSC的眼(B)或?qū)?cè)的對照眼(C)中的視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)(左圖；上中間叢，下深叢)與神經(jīng)細胞(右圖)。(D-K)，用Lin-HSC拯救rd10小鼠(在P6時注射)。顯示了在P21(DLin-HSC，H對照細胞)、P30(ELin-HSC，I對照細胞)、P60(FLin-HSC，J對照細胞)及P105(GLin-HSC，K對照細胞)時的代表性視網(wǎng)膜(每一時間點的處理眼和對照眼來自同一動物)。視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)(每幅圖的上圖為中間叢；每幅圖的中圖為深叢)用CD31(綠色)與膠原蛋白IV(紅色)染色。每幅圖的下圖顯示了由同一視網(wǎng)膜制備的橫切面(紅色DAPI，綠色CD31)。
圖19表明，在用Lin-HSC處理后，晶體蛋白αA在拯救的外核層細胞中被上調(diào)，而在用對照細胞處理的對側(cè)眼中無此現(xiàn)象。左圖被拯救的視網(wǎng)膜中的IgG對照，中圖被拯救的視網(wǎng)膜中的晶體蛋白αA，右圖在未被拯救的視網(wǎng)膜中的晶體蛋白αA。
圖20包括在已用本發(fā)明的Lin-HSC處理的鼠類視網(wǎng)膜中被上調(diào)基因的表。(A)其表達在用鼠Lin-HSC處理的小鼠視網(wǎng)膜中增加3倍的基因。(B)在用鼠Lin-HSC處理的小鼠視網(wǎng)膜中被上調(diào)的晶體蛋白基因。(C)其表達在用人Lin-HSC處理的小鼠視網(wǎng)膜中增加2倍的基因。(D)其表達在用人Lin-HSC處理的小鼠視網(wǎng)膜中被上調(diào)的神經(jīng)營養(yǎng)因子或者生長因子的基因。
圖21圖示了CD31與整聯(lián)蛋白α6表面抗原在本發(fā)明的CD133陽性(DC133+)和CD133陰性(CD133-)人Lin-HSC群上的分布。左圖顯示了流式細胞術(shù)點陣圖。中央圖和右圖是直方圖，顯示了細胞群上特異性抗體的表達水平。Y軸代表事件數(shù)，X軸顯示信號強度。移至空心(對照)直方圖右側(cè)的實心直方圖代表增加的熒光信號和背景水平以上的抗體表達。
圖22圖解了出生后的P0日至P30日于正常氧水平(含氧量正常)飼養(yǎng)的野生型C57/B16小鼠的出生后視網(wǎng)膜發(fā)育。
圖23圖解了P7至P12期間以高氧水平(含氧量高；75％氧)飼養(yǎng)、隨后由P12至P17于正常含氧量飼養(yǎng)的C57/B16小鼠中的氧誘導(dǎo)型視網(wǎng)膜病變模型。
圖24顯示了在氧誘導(dǎo)型視網(wǎng)膜病變模型中通過用本發(fā)明的Lin-HSC群處理進行的血管拯救。
圖25表明，玻璃體內(nèi)注射Lin-HSC后rd1小鼠外核層(ONL)中的被拯救光感受器主要為視錐細胞。在野生型小鼠視網(wǎng)膜中小比例的光感受器(上圖)是視錐細胞，證據(jù)是表達紅/綠視錐視蛋白(A)，同時ONL的大部分細胞對視桿特異性視紫紅質(zhì)(B)呈陽性。視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)用預(yù)免疫血清自身發(fā)熒光(C)，但核層對用視桿或視錐特異性視蛋白染色完全陰性。Rd/rd小鼠視網(wǎng)膜(下圖)具有減少的內(nèi)核層和接近完全萎縮的ONL，這二者對視錐(D)或視桿(圖G)視蛋白均為陰性。對照CD31-HSC處理的眼與未注射的rd/rd視網(wǎng)膜相同，對視錐(E)或視桿(H)視蛋白無任何染色。Lin-HSC處理的對側(cè)眼表現(xiàn)出明顯降低但明確存在的ONL，其主要由視錐細胞組成，證據(jù)是對視錐紅/綠視蛋白的陽性免疫反應(yīng)性(F)。還觀察到少量視桿(I)。
優(yōu)選實施方案的詳述干細胞通?？捎煽乖诩毎砻嫔系姆植紒碜R別(詳細的討論參見Stem CellsScientific Progress and Future Directions，國立衛(wèi)生研究院科學(xué)政策辦公室于2001年六月制定的報告，附錄E干細胞標(biāo)記，該報告按照相關(guān)程度引入本文作為參考)。
本發(fā)明提供一種改善患有眼疾的哺乳動物視網(wǎng)膜中的視錐細胞變性的方法。優(yōu)選通過玻璃體內(nèi)注射將含造血干細胞和內(nèi)皮祖細胞的哺乳動物骨髓源的、分離的、譜系陰性的造血干細胞群給予哺乳動物視網(wǎng)膜。所述細胞以足以改善視網(wǎng)膜中的視錐細胞變性的量給予。
一種優(yōu)選方法包括由待治療的哺乳動物骨髓分離譜系陰性造血干細胞群，然后將所述細胞以足以改善視網(wǎng)膜中的視錐細胞變性的量給予哺乳動物。
所述細胞可得自患病哺乳動物，優(yōu)選在眼疾早期獲得?；蛘?，所述細胞可在已知對眼疾(例如視網(wǎng)膜色素變性)具有遺傳傾向性的患者中于發(fā)病前獲得。所述細胞可儲存至需要時，然后可在首次觀察到病發(fā)征兆時預(yù)防性地注射。優(yōu)選患病的視網(wǎng)膜包含干細胞靶向其的活化星形膠質(zhì)細胞。因此，當(dāng)存在相關(guān)的神經(jīng)膠質(zhì)增生時對眼進行早期治療是有益的?；蛘?，可用激光治療視網(wǎng)膜，以刺激視網(wǎng)膜中活化星形膠質(zhì)細胞的局部增殖，然后給予自體干細胞。
造血干細胞是能夠發(fā)育成多種血細胞類型(例如B細胞、T細胞、粒細胞、血小板及紅細胞)的干細胞。譜系表面抗原是一組為成熟血細胞譜系標(biāo)記物的細胞表面蛋白，包括CD2、CD3、CD11、CD11a、Mac-1(CD11b:CD18)、CD14、CD16、CD19、CD24、CD33、CD36、CD38、CD45、CD45RA、鼠Ly-6G、鼠TER-119、CD56、CD64、CD68、CD86(B7.2)、CD66b、人白細胞抗原DR(HLA-DR)及CD235a(血型糖蛋白A)。不表達顯著水平的這些抗原的造血干細胞一般稱為譜系陰性(Lin-)。人造血干細胞一般表達諸如CD31、CD34、CD117(c-kit)和/或CD133的其它表面抗原。鼠造血干細胞一般表達諸如CD34、CD117(c-kit)、Thy-1和/或Sca-1的其它表面抗原。
本發(fā)明提供在其細胞表面上不表達顯著水平的“譜系表面抗原”(Lin)的分離的造血干細胞。這種細胞在本文中稱為“譜系陰性”或“Lin-”造血干細胞。具體地說，本發(fā)明提供含內(nèi)皮祖細胞(EPC)的Lin-造血干細胞群(Lin-HSC)，它能夠滲入到發(fā)育中的血管中，然后分化形成血管內(nèi)皮細胞。優(yōu)選地，分離的Lin-HSC群存在于培養(yǎng)基如磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中。
本文以及后附權(quán)利要求中使用的表述“成體的”用于指骨髓，包括出生后分離的骨髓，即與胚胎相反地從幼年及成體個體中分離的骨髓。術(shù)語“成體哺乳動物”指幼年和完全成年的哺乳動物這二者。
本發(fā)明的分離的、哺乳動物的、譜系陰性的造血干細胞(Lin-HSC)群包含內(nèi)皮祖細胞(EPC)。優(yōu)選地，分離的Lin-HSC群包含其中至少約20％的細胞表達表面抗原CD31的哺乳動物細胞，表面抗原CD31通常存在于內(nèi)皮細胞上。在另一個實施方案中，至少約50％、更優(yōu)選至少約65％、最優(yōu)選至少約75％的細胞表達CD31。優(yōu)選地，至少約50％的本發(fā)明Lin-HSC群的細胞優(yōu)選表達整聯(lián)蛋白α6抗原。
在一個優(yōu)選的鼠Lin-HSC群實施方案中，至少約50％的細胞表達CD31抗原，至少約50％的細胞表達CD117(c-kit)抗原。優(yōu)選地，至少約75％、更優(yōu)選約81％的Lin-HSC細胞表達表面抗原CD31。在另一個優(yōu)選的鼠實施方案中，至少約65％、更優(yōu)選約70％的細胞表達表面抗原CD117。本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的實施方案是以下鼠Lin-HSC群，其中約50％至約85％的細胞表達表面抗原CD31，約70％至約75％的細胞表達表面抗原CD117。
另一個優(yōu)選實施方案是其中細胞為CD133陰性的人Lin-HSC群，其中至少約50％的細胞表達CD31表面抗原，至少約50％的細胞表達整聯(lián)蛋白α6抗原。再另一個優(yōu)選實施方案是其中細胞為CD133陽性的人Lin-HSC群，其中少于約30％的細胞表達CD31表面抗原，少于約30％的細胞表達整聯(lián)蛋白α6抗原。
本發(fā)明的分離的Lin-HSC群在玻璃體內(nèi)注入哺乳動物物種眼中時，選擇性靶向星型膠質(zhì)細胞并摻入新生血管系統(tǒng)中，所述哺乳動物物種例如為小鼠或人，所述細胞由所述哺乳動物物種中分離。
本發(fā)明的分離的Lin-HSC群含有內(nèi)皮祖細胞，其分化為內(nèi)皮細胞并在視網(wǎng)膜內(nèi)產(chǎn)生血管結(jié)構(gòu)。具體地說，本發(fā)明的Lin-HSC群用于治療視網(wǎng)膜新生血管與視網(wǎng)膜血管變性疾病，并用于修復(fù)視網(wǎng)膜血管損傷。本發(fā)明的Lin-HSC細胞還促進視網(wǎng)膜中的神經(jīng)元拯救，并促使抗凋亡基因上調(diào)。已令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的成體Lin-HSC細胞甚至能在患有視網(wǎng)膜變性的嚴重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠中抑制視網(wǎng)膜變性。正常小鼠視網(wǎng)膜主要為視桿，但用Lin-HSC治療后的被拯救細胞幾乎全部是視錐。此外，Lin-HSC群可用于治療初生哺乳動物眼中的視網(wǎng)膜缺陷，所述初生哺乳動物例如為患有氧誘導(dǎo)型視網(wǎng)膜病變或早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變的哺乳動物。
本發(fā)明還提供一種治療哺乳動物眼疾的方法，其包括由哺乳動物骨髓中分離含內(nèi)皮祖細胞的譜系陰性造血干細胞群，并將分離的干細胞以足以抑制疾病的量玻璃體內(nèi)注射入哺乳動物眼中。本發(fā)明方法可用于在初生的、幼年的或者完全成年的哺乳動物中治療眼疾，例如視網(wǎng)膜變性疾病、視網(wǎng)膜血管變性疾病、局部缺血性視網(wǎng)膜病變、血管出血、血管滲漏和脈絡(luò)膜病變。這些疾病的實例包括年齡相關(guān)性黃斑變性(ARMD)、糖尿病性視網(wǎng)膜病變(DR)、擬眼組織胞漿菌病(POHS)、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(ROP)、鐮狀細胞貧血與色素性視網(wǎng)膜炎以及視網(wǎng)膜損傷。
注射到眼中的干細胞數(shù)足以抑制眼睛的疾病狀態(tài)。例如，細胞數(shù)可有效修復(fù)眼視網(wǎng)膜損傷、穩(wěn)定視網(wǎng)膜新生血管系統(tǒng)、成熟視網(wǎng)膜新生血管系統(tǒng)并防止或修復(fù)血管滲漏與血管出血。
可用治療上有用的基因，例如編碼抗血管發(fā)生蛋白(用于眼部的基于細胞的基因療法)的基因和編碼神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)(用于增強神經(jīng)元拯救作用)的基因，轉(zhuǎn)染本發(fā)明的Lin-HSC群細胞。
轉(zhuǎn)染的細胞可包含任何在治療上對視網(wǎng)膜障礙治療有用的基因。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)染的Lin-HSC包含有效編碼抗血管發(fā)生肽的基因，該抗血管發(fā)生肽包括蛋白或其片段，例如TrpRS或其抗血管發(fā)生的片段，例如在共同所有的、共同待審的美國專利申請序號10/080,839中所詳述的TrpRS的T1與T2片段，該專利申請的公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。本發(fā)明的編碼抗血管發(fā)生肽的轉(zhuǎn)染Lin-HSC用于治療與異常血管發(fā)育相關(guān)的視網(wǎng)膜病，例如糖尿病性視網(wǎng)膜病變及類似疾病。Lin-HSC優(yōu)選為人細胞。
在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)染Lin-HSC含有效編碼神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)的基因，所述神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)例如為神經(jīng)生長因子、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-4、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-5、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子、視網(wǎng)膜色素上皮衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子、胰島素樣生長因子、神經(jīng)膠質(zhì)細胞系衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子、腦衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子等。這類神經(jīng)營養(yǎng)性Lin-HSC可用于在視網(wǎng)膜神經(jīng)變性疾病(例如青光眼與色素性視網(wǎng)膜炎)中促進神經(jīng)元拯救、治療視網(wǎng)膜神經(jīng)損傷等。業(yè)已報道了睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子植入體用于治療色素性視網(wǎng)膜炎(參見Kirby等，2001，Mol Ther.3(2)241-8；Farrar等，2002，EMBO Journal 21857-864)。據(jù)報道，腦衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子在受損的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)中調(diào)節(jié)生長相關(guān)基因(參見Fournier等，1997，J.Neurosci.Res.47561-572)。據(jù)報道，神經(jīng)膠質(zhì)細胞系衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子在色素性視網(wǎng)膜炎中延緩光感受器變性(參見McGee等，2001，Mol Ther.4(6)622-9)。
本發(fā)明還提供一種從哺乳動物骨髓中分離含內(nèi)皮祖細胞的譜系陰性造血干細胞的方法。該方法需要以下步驟(a)從成體哺乳動物抽取骨髓；(b)從骨髓中分離多種單核細胞；(c)使用針對一種或多種譜系表面抗原的生物素綴合的譜系群體抗體來標(biāo)記單核細胞，優(yōu)選譜系表面抗原選自CD2、CD3、CD4、CD11、CD11a、Mac-1、CD14、CD16、CD19、CD24、CD33、CD36、CD38、CD45、Ly-6G(鼠)、TER-119(鼠)、CD45RA、CD56、CD64、CD68、CD86(B7.2)、CD66b、人白細胞抗原DR(HLA-DR)及CD235a(血型糖蛋白A)；(d)從多種單核細胞中除去對所述一種或多種譜系表面抗原為陽性的單核細胞，并回收含有內(nèi)皮祖細胞的譜系陰性造血干細胞群，優(yōu)選其中至少約20％的細胞表達CD31。
當(dāng)從成人骨髓中分離Lin-HSC時，優(yōu)選地，用針對譜系表面抗原CD2、CD3、CD4、CD11a、Mac-1、CD14、CD16、CD19、CD33、CD38、CD45RA、CD64、CD68、CD86(B7.2)和CD235a的生物素綴合的譜系群體抗體標(biāo)記單核細胞。當(dāng)從成體小鼠骨髓中分離Lin-HSC時，優(yōu)選地，用針對譜系表面抗原CD3、CD11、CD45、Ly-6G和TER-119的生物素綴合的譜系群體抗體標(biāo)記單核細胞。
在一種優(yōu)選方法中，所述細胞分離自成人骨髓，并通過CD133譜系進一步分離。分離人Lin-HSC的一種優(yōu)選方法包括以下額外步驟用生物素綴合的CD133抗體標(biāo)記單核細胞，并回收CD133陽性的Lin-HSC群。通常，不到約30％的此類細胞表達CD31，不到約30％的此類細胞表達整聯(lián)蛋白α6。本發(fā)明的CD133陽性的人Lin-HSC群在注射入未經(jīng)歷血管發(fā)生的眼中時可靶向外周局部缺血誘生的血管新生部位。
分離人Lin-HSC的另一種優(yōu)選方法包括以下額外步驟用生物素綴合的CD133抗體標(biāo)記單核細胞、除去CD133陽性細胞并回收CD133陰性的Lin-HSC群。通常，至少約50％的此類細胞表達CD31，至少約50％的此類細胞表達整聯(lián)蛋白α6。本發(fā)明的CD133陰性的人Lin-HSC群在注射入未經(jīng)歷血管發(fā)生的眼中時可滲入發(fā)育中的血管系統(tǒng)中。
本發(fā)明還提供治療眼部血管發(fā)生疾病的方法，該方法通過將所述細胞玻璃體內(nèi)注射入眼中給予本發(fā)明的轉(zhuǎn)染的Lin-HSC細胞。這種轉(zhuǎn)染的Lin-HSC細胞包括用治療上有用的基因(例如編碼抗血管發(fā)生或神經(jīng)營養(yǎng)性基因產(chǎn)物的基因)轉(zhuǎn)染的Lin-HSC。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)染的Lin-HSC細胞是人細胞。
優(yōu)選地，至少約1×105個Lin-HSC細胞或轉(zhuǎn)染的Lin-HSC細胞通過玻璃體內(nèi)注射給予患有視網(wǎng)膜變性疾病的哺乳動物眼。要注射的細胞數(shù)可取決于視網(wǎng)膜變性的嚴重性、哺乳動物年齡以及視網(wǎng)膜疾病治療領(lǐng)域的普通技術(shù)人員容易知曉的其它因素。Lin-HSC可在一段時間內(nèi)以單劑量或多劑量給予，這由負責(zé)治療的臨床醫(yī)生決定。
本發(fā)明的Lin-HSC用于治療涉及視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)中斷或變性或視網(wǎng)膜神經(jīng)變性的視網(wǎng)膜損傷和視網(wǎng)膜缺陷。人Lin-HSC還可用于產(chǎn)生遺傳上相同的細胞系，即無性繁殖系，用于再生性或修復(fù)性治療視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)，以及用于治療或改善視網(wǎng)膜神經(jīng)元變性。
實施例實施例1.細胞分離與富集；鼠Lin-HSC群A和B的制備一般方法。所有體內(nèi)評價均依照NIH實驗動物看護與使用指南執(zhí)行，并且所有評價程序均得到Scripps研究所(TSRI，La Jolla，CA)動物看護與使用委員會的批準。從B6.129S7-Gtrosa26、Tie-2GFP、ACTbEGFP、FVB/NJ(rd/rd小鼠)或Balb/cBYJ成體小鼠(The JacksonLaboratory，ME)中提取骨髓細胞。
然后，通過使用HISTOPAQUE聚蔗糖梯度(Sigma，St.Louis，MO)的密度梯度分離來分離單核細胞，并用在小鼠中用于Lin-選擇的生物素綴合的譜系群體抗體(CD45、CD3、Ly-6G、CD11、TER-119，Pharmingen，San Diego，CA)標(biāo)記。使用磁分離設(shè)備(AUTOMACSTM分選儀，Miltenyi Biotech，Auburn，CA)從Lin-HSC中分離譜系陽性(Lin+)細胞并除去。所獲得的含內(nèi)皮祖細胞的Lin-HSC群使用以下抗體用FACSTMCalidur流式細胞儀(Becton Dickinson，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ)進一步表征PE-綴合的Sca-1、c-kit、KDR和CD31(Pharmingen，SanDiego，CA)。Tie-2-GFP骨髓細胞用于表征Tie-2。
為收獲成體小鼠內(nèi)皮細胞，通過外科手術(shù)從ACTbEGFP小鼠中取出腸系膜組織，并置于膠原酶(Worthington，Lakewood，NJ)中以消化組織，然后使用45μm濾器過濾。收集流通濾液并用內(nèi)皮生長培養(yǎng)基(Clonetics，San Diego，CA)溫育。通過觀察形態(tài)上的鵝卵石狀外觀、用CD31 mAb(Pharmingen)染色以及檢查培養(yǎng)物在MATRIGELTM基質(zhì)(Beckton Dickinson，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ)中形成管樣結(jié)構(gòu)來確認內(nèi)皮性狀。
鼠Lin-HSC群A。通過上述一般方法從ACTbEGFP小鼠中提取骨髓細胞。通過FACS流式細胞儀表征Lin-HSC細胞的CD31、c-kit、Sca-1、Flk-1與Tie-2細胞表面抗原標(biāo)記。結(jié)果如圖1(c)所示。約81％的Lin-HSC顯示出CD31標(biāo)記，約70.5％的Lin-HSC顯示出c-kit標(biāo)記，約4％的Lin-HSC顯示出Sca-1標(biāo)記，約2.2％的Lin-HSC顯示出Flk-1標(biāo)記，約0.91％的Lin-HSC顯示出Tie-2標(biāo)記。相反，從這些骨髓細胞中分離的Lin+HSC具有顯著不同的細胞標(biāo)記譜(即，CD3137.4％；c-kit20％；Sca-12.8％；Flk-0.05％)。
鼠Lin-HSC群B。通過上述一般方法從Balb/C、ACTbEGFP及C3H小鼠中提取骨髓細胞。分析Lin-HSC細胞中細胞表面標(biāo)記(Sca-1、KDR、c-kit、CD34、CD31和多種整聯(lián)蛋白α1、α2、α3、α4、α5、α6、αM、αV、αX、αIIb、β1、β4、β3、β4、β5和β7)的存在情況。結(jié)果如表1所示。
表1.Lin-HSC群B的特征
實施例2.在鼠模型中玻璃體內(nèi)給予細胞用鋒利的刀片在小鼠眼瞼中做一條眼瞼裂縫，暴露P2至P6眼球。使用一個33號(Hamilton，Reno，NV)針頭的注射器，玻璃體內(nèi)注射本發(fā)明的譜系陰性HSC群A(在約0.5μl至約1μl細胞培養(yǎng)基中有約105個細胞)。
實施例3.EPC轉(zhuǎn)染根據(jù)廠商的實驗手冊利用FuGENETM6轉(zhuǎn)染試劑(Roche，Indianapolis，IN)用編碼TrpRS的T2片段、又封入His6標(biāo)記的DNA(SEQ ID NO1，圖7)轉(zhuǎn)染鼠Lin-HSC(群A)。將Lin-HSC細胞(每ml約106細胞)懸浮在含有干細胞因子(PeproTech，Rocky Hill，NJ)的opti-MEM培養(yǎng)基(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。然后加入DNA(約1μg)和FuGENE試劑(約3μl)，將混合物在約37℃溫育約18小時。溫育后，清洗并收集細胞。經(jīng)FACS分析證實該系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染率約為17％。通過蛋白質(zhì)印跡證實T2產(chǎn)生。His6標(biāo)記的T2-TrpRS的氨基酸序列如圖8的SEQ ID NO2所示。
實施例4.免疫組織化學(xué)和共聚焦分析在不同時間點收集小鼠視網(wǎng)膜，為整裝片或者冰凍切片制片做準備。對于整裝片，使用4％多聚甲醛固定視網(wǎng)膜，在50％胎牛血清(FBS)及20％正常山羊血清中于室溫封閉一小時。視網(wǎng)膜經(jīng)一抗處理并用二抗檢測。使用的一抗為抗膠原蛋白IV(Chemicon，Temecula，CA)、抗β-gal(Promega，Madison，WI)、抗GFAP(Dako Cytomation，Carpenteria，CA)、抗-α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA，Dako Cytomation)。使用的二抗綴合Alexa 488或594熒光標(biāo)記(Molecular Probes，Eugene，OR)。利用MRC 1024共聚焦顯微鏡(Bio-Rad，Hercules，CA)獲取圖像。利用LASERSHARP軟件(Bio-Rad)創(chuàng)建三維圖像，以檢查整裝視網(wǎng)膜中三個不同血管層的發(fā)育。利用由共聚焦顯微鏡辨別出的GFP(eGFP)增強小鼠與GFAP/wtGFP小鼠間的GFP像素強度差異創(chuàng)建3D圖像。
實施例5.小鼠中體內(nèi)視網(wǎng)膜血管發(fā)生定量測定對于T2-TrpRS分析，從小鼠視網(wǎng)膜三維圖像重建初級叢與深叢。初級叢分為兩類正常發(fā)育或中斷的血管發(fā)育。深部血管發(fā)育抑制的分類基于血管抑制的百分比進行分析，包括以下標(biāo)準深叢形成的完全抑制標(biāo)記為“完全”，正常血管發(fā)育(含少于25％的抑制)標(biāo)記為“正常”，其余的標(biāo)記為“部分”。對于rd/rd小鼠的拯救數(shù)據(jù)，使用10x透鏡獲取每個整裝視網(wǎng)膜中深叢的四個單獨區(qū)域。計算每幅圖像的血管系統(tǒng)總長、總結(jié)并進行組間比較。為了獲得精確的信息，將Lin-HSC注射入小鼠的一只眼中，而將Lin+HSC注射到同一小鼠的另一只眼中。未注射的對照視網(wǎng)膜取自同一窩動物。
實施例6.成體視網(wǎng)膜損傷小鼠模型使用二極管激光器(150mW，1秒，50mm)或用一個27號針頭機械刺破小鼠視網(wǎng)膜，建立激光和瘢痕模型。在傷后5天，利用玻璃體內(nèi)方法注射細胞。5天后采集小鼠眼睛。
實施例7.視網(wǎng)膜變性的神經(jīng)營養(yǎng)性拯救成體鼠骨髓源譜系陰性造血干細胞(Lin-HSC)在視網(wǎng)膜變性小鼠模型中具有血管營養(yǎng)性和神經(jīng)營養(yǎng)性拯救作用。在10天齡小鼠的右眼玻璃體內(nèi)注射約0.5毫升含約105個本發(fā)明Lin-HSC，2個月后評價視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)的存在情況與神經(jīng)元層核的數(shù)目。同一小鼠的左眼注射約相同數(shù)目的Lin+HSC作為對照，并進行類似評價。如圖9所示，在Lin-HSC治療的眼中，視網(wǎng)膜血管表現(xiàn)得接近正常，內(nèi)核層近似正常，外核層(ONL)有約3至4個核層。相反，對側(cè)Lin+HSC處理的眼有一個明顯萎縮的中間視網(wǎng)膜血管層，一個完全萎縮的外視網(wǎng)膜血管層；內(nèi)核層明顯萎縮，外核層完全消失。這在小鼠3與小鼠5中表現(xiàn)得尤為明顯。在小鼠1中未見拯救作用，這種情況存在于約15％的被注射小鼠中。
當(dāng)使用視網(wǎng)膜電流圖(ERG)評定視覺功能時，在觀測到血管與神經(jīng)拯救(小鼠3與5)的同時觀察到陽性ERG恢復(fù)。沒有血管與神經(jīng)元拯救時(小鼠1)觀察不到陽性ERG。圖10所示的回歸分析曲線說明了本發(fā)明的Lin-HSC產(chǎn)生的rd/rd小鼠眼中血管和神經(jīng)營養(yǎng)拯救之間的相關(guān)性。對于中間血管系統(tǒng)類型(r＝0.45)和深血管系統(tǒng)(r＝0.67)，觀測到神經(jīng)元(y-軸)與血管(x-軸)修復(fù)之間的相關(guān)性。
圖11顯示在Lin+HSC產(chǎn)生的血管與神經(jīng)元拯救之間沒有任何統(tǒng)計學(xué)上的顯著相關(guān)性。對血管拯救定量，數(shù)據(jù)列于圖12。圖12顯示的注射后1個月(1M)、2個月(2M)及6個月(6M)時的小鼠數(shù)據(jù)表明，與同一小鼠的未處理眼中的血管長度(白柱)相比，用本發(fā)明的Lin-HSC處理的眼中的血管長度(黑柱)有顯著增加，特別是在注射后1個月與2個月時。在注射Lin-HSC或Lin+HSC后約兩個月，通過計數(shù)內(nèi)核層和外核層中的核定量神經(jīng)營養(yǎng)性拯救作用。結(jié)果列于圖13與14。
實施例8.人Lin-HSC群通過上述一般方法從健康成人志愿者中抽取骨髓細胞。然后通過使用HISTOPAQUE聚蔗糖梯度(Sigma，St.Louis，MO)的密度梯度分離來分離單核細胞。為了從人骨髓單核細胞中分離Lin-HSC群，將下述生物素綴合的譜系群體抗體用于磁分離系統(tǒng)(AUTOMACSTM分選儀，Miltenyi Biotech，Auburn，CA)CD2、CD3、CD4、CD11a、Mac-1、CD14、CD16、CD19、CD33、CD38、CD45RA、CD64、CD68、CD86、CD235a(Pharmingen)。
基于CD133表達將人Lin-HSC群再分為兩個亞群。細胞用生物素綴合的CD133抗體標(biāo)記，并分成CD133陽性和CD133陰性亞群。
實施例9.在視網(wǎng)膜變性鼠模型中玻璃體內(nèi)給予人和鼠細胞C3H/HeJ、C3SnSmn.CB17-Prkdc SCID與rd10小鼠品系用作視網(wǎng)膜變性模型。C3H/HeJ與C3SnSmn.CB17-Prkdc SCID小鼠(TheJackson Laboratory，Maine)是視網(wǎng)膜變性1(rd1)突變的純合子，所述突變是引起早期發(fā)作的嚴重視網(wǎng)膜變性的突變。該突變位于編碼視桿光感受器cGMP磷酸二酯酶β亞基的Pde6b基因的外顯子7中。該基因中的此突變已在有常染色體隱性色素性視網(wǎng)膜炎(RP)的人患者中發(fā)現(xiàn)。C3SnSmn.CB17-Prkdc SCID小鼠還是嚴重聯(lián)合免疫缺陷自發(fā)突變(Prkdc SCID)純合子，用于人細胞轉(zhuǎn)移實驗。rd10小鼠中的視網(wǎng)膜變性由Pde6b基因的外顯子13中的突變引起。這也是一種發(fā)作比rd1/rd1更后、視網(wǎng)膜變性比rd1/rd1更輕微的臨床相關(guān)性RP模型。所有評價均依照NIH實驗動物看護與使用指南實施，所有方法都獲得Scripps研究所(TSRI，La Jolla，CA)動物看護與使用委員會的批準。
用鋒利的刀片在小鼠眼瞼中做一條眼瞼裂縫，暴露P2至P6眼球。使用一個33號(Hamilton，Reno，NV)針頭的注射器，將鼠群A或人群C的譜系陰性HSC細胞(約0.5μl至約1μl細胞培養(yǎng)基的約105個細胞)玻璃體內(nèi)注射入小鼠眼中。為使注射的人細胞可見，在注射前用染料(Cell tracker green CMFDA，Molecular Probes)標(biāo)記細胞。
在不同時間點收集視網(wǎng)膜，并用4％多聚甲醛(PFA)和甲醇固定，接著在50％FBS/20％NGS中于室溫封閉一小時。為染色視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)，將視網(wǎng)膜與抗CD31抗體(Pharmingen)及抗膠原蛋白IV抗體(Chemicon)溫育，接著與Alexa 488或594綴合的二抗(Molecular Probes，Eugene，Oregon)溫育。以四個放射性松弛切口平鋪視網(wǎng)膜，以獲得整裝片制品。視網(wǎng)膜血管中間叢或深叢(參見Dorrell等，2002 InvestOphthalmol.Vis.Sci.433500-3510)中的血管系統(tǒng)圖像利用RadianceMP2100共焦顯微鏡及LASERSHARP軟件(Biorad，Hercules，California)獲得。為定量血管系統(tǒng)，從中間血管層或深血管層的中間部分隨機選擇四個獨立區(qū)域(900μm×900μm)，使用LASERPIX分析軟件(Biorad)測量血管總長。同一叢中的這四個區(qū)域的總長用于進一步分析。
為制作冰凍切片，重新包埋視網(wǎng)膜平片。視網(wǎng)膜置于4％PFA中過夜，然后與20％蔗糖溫育。視網(wǎng)膜包埋在最佳切割溫度復(fù)合物(OCTTissue-Tek；Sakura FineTech，Torrance，CA)中。冰凍切片(10μm)在含核染料DAPI(Sigma-Aldrich，St.Louis，Missouri)的PBS中再水合。通過共焦顯微鏡獲取含視神經(jīng)頭及完整周邊視網(wǎng)膜的單個切片中的三個不同視野(280μm寬，無偏采樣)的DAPI標(biāo)記核圖像。對位于一個切片中三個獨立視野的ONL中的核數(shù)目進行計數(shù)并求和，以進行分析。執(zhí)行簡單的線性回歸分析，以檢測深叢中的血管系統(tǒng)長度與ONL中的細胞核數(shù)之間的關(guān)系。
在整夜暗適應(yīng)后，通過腹膜內(nèi)注射15μg/gm氯胺酮與7μg/gm甲苯噻嗪麻醉小鼠。使用金環(huán)角膜電極連同口參考電極和尾接地電極，在瞳孔擴大后(1％硫酸阿托品)從每只眼的角膜表面記錄視網(wǎng)膜電圖(ERG)。用固定在高反射性Ganzfeld圓頂外側(cè)的Grass光刺激器(PS33 Plus，Grass Instruments，Quincy，MA)產(chǎn)生刺激。在直至光刺激器最大允許值(0.668 cd-s/m2)的亮度范圍內(nèi)，對短波長(Wratten 47A；λmax＝470nm)閃光記錄視桿反應(yīng)。對反應(yīng)信號進行放大(CP511 AC放大器，Grass Instruments)、數(shù)字化(PCI-1200，National Instruments，Austin，TX)和計算機分析。每只小鼠以由治療的眼和未治療的眼記錄的ERG作為其自身的內(nèi)標(biāo)。將多達100次的掃描平均，用作最弱信號。由治療眼的反應(yīng)數(shù)字減去未治療眼的平均反應(yīng)，此信號差值用于指示功能性拯救。
使用微陣列分析評價Lin-HSC靶向的視網(wǎng)膜基因表達。用Lin-HSC或CD31-HSC注射P6 rd/rd小鼠。注射后40天將這些小鼠的視網(wǎng)膜剝離到?jīng)]有RNA酶的培養(yǎng)基中(在注射后的此時間點明顯可見視網(wǎng)膜血管及光感受器層的拯救)。通過整裝片分析每個視網(wǎng)膜的1/4，以確保正常的HSC靶向以及已獲得血管系統(tǒng)與神經(jīng)保護作用。使用TRIzol(Life Technologies，Rockville，MD)、苯酚/氛仿RNA分離方案由成功注射的視網(wǎng)膜純化RNA。RNA雜交至Affymetrix Mu74Av2芯片，使用GENESPRING軟件(SiliconGenetics，Redwood City，CA)分析基因表達。純化的人或小鼠HSC玻璃體內(nèi)注射入P6小鼠中。在P45時剝離視網(wǎng)膜并合并成以下部分1)注射了人HSC的被拯救的小鼠視網(wǎng)膜，2)注射了人HSC的未被拯救的小鼠視網(wǎng)膜，及3)注射了小鼠HSC的被拯救的小鼠視網(wǎng)膜，用于純化RNA，并雜交至人特異性U133A Affymetrix芯片上。使用GENESPRING軟件鑒別在背景值以上表達并在人HSC拯救的視網(wǎng)膜中具有較高表達的基因。然后單獨分析這些基因中每一個的探針對表達譜，并與使用dChip的正常人U133A微芯片實驗?zāi)Ｐ蛯Ρ龋源_認人類物種的特異性雜交，并消除由于種間雜交產(chǎn)生的假陽性。
圖21表顯示了流式細胞儀數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)比較了CD31及整聯(lián)蛋白α6表面抗原在本發(fā)明CD133陽性(DC133+)與CD133陰性(CD133-)的人Lin-HSC群上的表達。左圖顯示了流式細胞術(shù)點陣圖。中央圖和右圖是直方圖，顯示了細胞群上特異性抗體的表達水平。Y軸代表事件數(shù)，X軸顯示信號強度?？招闹狈綀D是表明非特異性背景染色水平的同種型IgG對照抗體。實心直方圖顯示了所述細胞群上特異性抗體的表達水平。移至空心(對照)直方圖右側(cè)的實心直方圖代表增加的熒光信號和背景水平以上的抗體表達。兩個細胞群之間實心直方圖峰位置的對比代表了細胞上的蛋白表達差異。例如，CD31在本發(fā)明的CD133+和CD133-細胞上均在背景以上表達；但是，和CD133-群相比，在CD133+細胞群中表達較低水平的CD31的細胞更多。由此數(shù)據(jù)顯見，CD31表達在兩個群之間有變化，α6整聯(lián)蛋白表達大部分限于Lin-群中的細胞，因此可用作具有血管營養(yǎng)性和神經(jīng)營養(yǎng)性拯救功能的細胞的標(biāo)記物。
當(dāng)CD133陽性與CD133陰性的Lin-HSC亞群玻璃體內(nèi)注射入初生SCID小鼠的眼中時，對于既表達CD31又表達整聯(lián)蛋白α6表面抗原的CD133陰性亞群，觀察到對發(fā)育中血管系統(tǒng)的最大程度滲入(參見圖21，下圖)。不表達CD31或整聯(lián)蛋白α6的CD133陽性亞群(圖21，上圖)似乎靶向外周局部缺血誘生的血管新生部位，但在注射入正經(jīng)歷血管新生的眼中時無此現(xiàn)象。
用對視桿視蛋白或視錐視蛋白有特異性的抗體以免疫組化方法分析被拯救的和未被拯救的視網(wǎng)膜。對用于圖17列出的ERG記錄的相同眼睛進行視桿視蛋白或視錐視蛋白分析。在野生型小鼠視網(wǎng)膜中，存在的光感受器不足5％為視錐(Soucy等，1998，Neuron21481-493)，用紅/綠視錐視蛋白或用視桿視紫紅質(zhì)所觀測到的免疫組化染色圖譜如圖25(A)或圖25(B)所示，符合視錐細胞的該百分率。對視桿視紫紅質(zhì)特異性的抗體(rho4D2)由大不列顛哥倫比亞大學(xué)的Robert Molday博士提供，如先前所述使用(Hicks等，1986，Exp.Eye Res.4255-71)。對視錐紅/綠視蛋白特異性的兔抗體購自Chemicon(AB5405)，按照生產(chǎn)商的說明使用。
實施例10.在氧誘導(dǎo)型視網(wǎng)膜變性的鼠模型中玻璃體內(nèi)給予鼠細胞在氧誘導(dǎo)型視網(wǎng)膜變性(OIR)模型中的出生后P7至P12日之間，使新生野生型C57B16小鼠暴露于高氧環(huán)境(75％氧)。圖22顯示了由P0至P30期間C57B16小鼠中的正常初生后血管發(fā)育。在P0時只能在視神經(jīng)盤周圍觀察到剛開始發(fā)育的表層血管。在接下來的幾天內(nèi)，初級表層網(wǎng)絡(luò)擴展至外周，在P10日時到達外周邊緣。在P7與P12之間，次級(深)叢發(fā)育。至P17時，出現(xiàn)廣泛的表層與深層血管網(wǎng)絡(luò)(圖22，插圖)。在隨后的時間里，同血管的第三(中間)層的發(fā)育一起發(fā)生重塑，直至大約在P21時形成成熟結(jié)構(gòu)。
相反，在OIR模型中，在于P7-P12暴露于75％氧之后，事件的正常次序被嚴重擾亂(圖23)。本發(fā)明的成體鼠Lin-HSC群于P3時玻璃體內(nèi)注射入小鼠的一只眼中，該小鼠隨后進行OIR，另一只眼注射PBS或者CD31陰性細胞作為對照。圖24表明，本發(fā)明的Lin-HSC群可在發(fā)育中的小鼠視網(wǎng)膜中逆轉(zhuǎn)高氧水平的變性作用。在P17時于處理的眼中觀察到完全發(fā)育的表層及深層視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)，而在對照眼中顯示出大量無血管區(qū)域，實際上是沒有深層血管(圖24)。觀察了OIR模型中的約100只小鼠眼睛。在58％的本發(fā)明Lin-HSC處理眼中觀察到正常血管形成，相比之下，用CD31-細胞處理的對照眼為12％，用PBS處理的對照眼為3％。
結(jié)果和討論鼠視網(wǎng)膜血管發(fā)育；眼血管發(fā)生模型。小鼠眼睛提供了一種公認的用于研究哺乳動物視網(wǎng)膜血管發(fā)育(例如人視網(wǎng)膜血管發(fā)育)的模型。在鼠視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)發(fā)育期間，局部缺血誘生的視網(wǎng)膜血管以和星型膠質(zhì)細胞緊密締合的方式發(fā)育。這些神經(jīng)膠質(zhì)元件沿著神經(jīng)節(jié)細胞層從視神經(jīng)盤移至妊娠末三個月的人類胎兒或新生嚙齒動物的視網(wǎng)膜上，并呈放射狀展開。隨著鼠視網(wǎng)膜血管發(fā)育，內(nèi)皮細胞利用此已建立的星型膠質(zhì)細胞模板確定視網(wǎng)膜血管樣式(參見圖1(a與b))。圖1(a與b)圖示了發(fā)育中的小鼠視網(wǎng)膜示意圖。圖(a)圖示了疊加在星型膠質(zhì)細胞模板(亮線)上的初級叢(圖左上方的暗線)的發(fā)育，而(b)描述了視網(wǎng)膜血管形成的第二階段。在圖1中，GCL代表神經(jīng)節(jié)細胞層；IPL代表內(nèi)叢層；INL代表內(nèi)核層；OPL代表外叢層；ONL代表外核層；RPE代表視網(wǎng)膜色素上皮；ON代表視神經(jīng)；而P代表外周。
在出生時，視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)實際上是不存在的。至出生后14天(P14)，視網(wǎng)膜已發(fā)育成復(fù)雜的初級(表)與次級(深)層視網(wǎng)膜血管，同視覺形成相符。開始時，輻射狀視乳頭周圍血管在已存在的星型膠質(zhì)細胞網(wǎng)絡(luò)上向外周呈放射狀生長，通過毛細血管叢形成變?yōu)檫M行性地互連。這些血管至P10(圖1(a))時在神經(jīng)纖維內(nèi)作為單細胞層生長。在P7-P8之間，側(cè)副枝從此初級叢開始生長，穿透視網(wǎng)膜至外部叢狀層，在那里它們形成次級或深層視網(wǎng)膜叢。至P21時，整個網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)經(jīng)歷了廣泛重建，在內(nèi)核層內(nèi)表面形成第三級叢或中間叢(圖1(b))。
由于若干理由，新生小鼠視網(wǎng)膜血管發(fā)生模型可用于研究眼血管發(fā)生期間的HSC作用。在此生理學(xué)相關(guān)模型中，在內(nèi)源性血管出現(xiàn)之前存在大量的星型膠質(zhì)細胞模板，這使得可在血管新生過程中評價細胞-細胞靶向作用。此外，已知此連貫且可重現(xiàn)的新生視網(wǎng)膜血管化過程是低氧驅(qū)動的，就此而言與許多其中已知局部缺血起作用的視網(wǎng)膜疾病具有相似性。
由骨髓富集內(nèi)皮祖細胞(EPC)。雖然已在存在于HSC制備物中的EPC群上廣泛評價了細胞表面標(biāo)記表達，但專一識別EPC的標(biāo)記仍很難確定。為了富集EPC，將造血譜系標(biāo)記陽性細胞(Lin+)，即B淋巴細胞(CD45)、T淋巴細胞(CD3)、粒細胞(Ly-6G)、單核細胞(CD11)和紅細胞(TER-119)從小鼠骨髓單核細胞中去除。用Sca-1抗原進一步富集EPC。對比玻璃體內(nèi)注射等量的Lin-Sca-1+細胞或者Lin-細胞后獲得的結(jié)果，兩組之間未檢測到差異。實際上，當(dāng)僅注射Lin-Sca-1-細胞時，觀察到遠大得多的對發(fā)育中血管的滲入。
基于功能測定富集具有EPC的本發(fā)明Lin-HSC群。此外，Lin+HSC群與Lin-HSC群在功能上表現(xiàn)得相當(dāng)不同。還評價了常用于鑒別各部分的EPC的表位(基于先前報道的體外特征研究)。盡管這些標(biāo)記中沒有一個與Lin-部分專一關(guān)聯(lián)，但同Lin+HSC部分相比，Lin-HSC中的所有標(biāo)記都增加約70％至約1800％(圖1(c))。圖1的圖c說明了骨髓源Lin+HSC與Lin-HSC分離細胞的流式細胞術(shù)特征。圖1(c)的頂行顯示了非抗體標(biāo)記細胞的造血干細胞點陣圖分布。R1確定了陽性PE-染色的定量門控區(qū)；R2指示GFP-陽性。中間行顯示了Lin-HSC的點陣圖，底行顯示了Lin+HSC的點陣圖。C57B/6細胞用針對Sca-1、c-kit、Flk-1/KDR、CD31的PE-綴合抗體標(biāo)記。Tie-2數(shù)據(jù)得自Tie-2-GFP小鼠。點陣圖角中的百分比表示總Lin-HSC或Lin+HSC群中陽性標(biāo)記細胞的百分數(shù)。有趣的是，公認的EPC標(biāo)記如Flk-1/KDR、Tie-2及Sca-1的表達都很差，因此沒有用于進一步的分級分離。
玻璃體內(nèi)注射的HSC Lin-細胞含有靶向星型膠質(zhì)細胞并滲入發(fā)育中的視網(wǎng)膜血管的EPC。為了測定玻璃體內(nèi)注射的Lin-HSC是否能夠靶向視網(wǎng)膜的特定細胞類型、利用星型膠質(zhì)細胞模板并參與視網(wǎng)膜血管發(fā)生，將來自本發(fā)明的Lin-HSC組合物的約105個細胞或分離自成體(GFP或LacZ轉(zhuǎn)基因)小鼠骨髓的Lin+HSC細胞(對照，約105個細胞)注射入出生后2天(P2)的小鼠眼中。注射后四天(P6)，得自GFP或者LacZ轉(zhuǎn)基因小鼠的本發(fā)明Lin-HSC組合物的許多細胞附著在視網(wǎng)膜上，并具有內(nèi)皮細胞的特征性伸長外觀(圖2(a))。圖2說明了Lin-細胞移入發(fā)育中的小鼠視網(wǎng)膜中。如圖2(a)所示，注射后四天(P6)玻璃體內(nèi)注射的eGFP+Lin-HSC在視網(wǎng)膜上附著并分化。
在視網(wǎng)膜的很多區(qū)域中，GFP表達細胞以符合下面的星型膠質(zhì)細胞的樣式排列，并與血管類似。這些熒光細胞在內(nèi)源性的、發(fā)育中的血管網(wǎng)絡(luò)之前被觀察到(圖2(b))。相反，只有少數(shù)Lin+HSC(圖2(c))或成體小鼠腸系膜內(nèi)皮細胞(圖2(d))附著在視網(wǎng)膜表面。為了確認來自注射的Lin-HSC群的細胞是否也能夠附著在已經(jīng)建立血管的視網(wǎng)膜上，我們將Lin-HSC組合物注射入成體眼中。有趣的是，沒有觀察到細胞附著在視網(wǎng)膜上或滲入既有的正常視網(wǎng)膜血管中(圖2(e))。這表明本發(fā)明的Lin-HSC組合物不破壞已正常發(fā)育完成的血管，不會在正常發(fā)育的視網(wǎng)膜中引發(fā)異常血管化。
為了確定本發(fā)明的注射的Lin-HSC組合物與視網(wǎng)膜星型膠質(zhì)細胞之間的關(guān)系，使用轉(zhuǎn)基因小鼠，其表達膠質(zhì)細胞原纖維酸性蛋白(GFAP，星型膠質(zhì)細胞的標(biāo)記物)和啟動子驅(qū)動的綠色熒光蛋白(GFP)。對注射了來自eGFP轉(zhuǎn)基因小鼠的Lin-HSC的這些GFAP-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠的視網(wǎng)膜進行檢查，表明所注射的eGFP EPC與現(xiàn)存的星型膠質(zhì)細胞共定位(圖2(f-h)，箭頭處)。觀察到eGFP+Lin-HSC的進程與下面的星型膠質(zhì)細胞網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)一致(箭頭處，圖2(g))。對這些眼的檢查表明，所注射的標(biāo)記細胞僅附著于星型膠質(zhì)細胞上；在視網(wǎng)膜外周仍沒有內(nèi)源血管的P6小鼠視網(wǎng)膜中，觀察到所注射的細胞附著在這些尚未血管化區(qū)域中的星型膠質(zhì)細胞上。令人驚訝的是，在視網(wǎng)膜深層中正常視網(wǎng)膜血管隨后將發(fā)育的確切位置上，觀察到所注射的標(biāo)記細胞(圖2(i)，箭頭處)。
為了確定本發(fā)明的注射的Lin-HSC是否穩(wěn)定地滲入到發(fā)育中的視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)中，在幾個稍后的時間點檢查視網(wǎng)膜血管。早在P9(注射后7天)時，Lin-HSC已滲入到CD31+結(jié)構(gòu)中(圖2(j))。到P16(注射后14天)時，細胞已經(jīng)廣泛滲入視網(wǎng)膜的血管樣結(jié)構(gòu)中(圖2(k))。在處死動物前血管內(nèi)注射羅丹明-葡聚糖(以鑒別功能性視網(wǎng)膜血管)時，多數(shù)Lin-HSC與伸展的血管排成一線(圖2(l))。觀察到兩種模式的標(biāo)記細胞分布(1)在一個模式中，細胞沿著未標(biāo)記的內(nèi)皮細胞之間的血管散布；和(2)另一個模式顯示血管完全由標(biāo)記細胞組成。所注射的細胞也滲入到深血管叢的血管中(圖2(m))。雖然以前曾報道過Lin-HSC衍生的EPC零星滲入到新生血管系統(tǒng)中，但這是首次報道血管網(wǎng)絡(luò)全部由這些細胞組成。這表明玻璃體內(nèi)注射的本發(fā)明骨髓源Lin-HSC群中的細胞能夠有效滲入形成中的視網(wǎng)膜血管叢的任何層中。
當(dāng)在玻璃體內(nèi)注射后達5或10天檢查時，非視網(wǎng)膜組織(例如腦、肝臟、心臟、肺、骨髓)的組織學(xué)檢查表明不存在任何GFP陽性細胞。這表明Lin-HSC部分中的細胞亞群選擇性地靶向視網(wǎng)膜星型膠質(zhì)細胞，并穩(wěn)定滲入發(fā)育中的視網(wǎng)膜血管中。由于這些細胞具有內(nèi)皮細胞的許多特征(同視網(wǎng)膜星型膠質(zhì)細胞締合、伸長形態(tài)、穩(wěn)定滲入伸展的血管中并且不出現(xiàn)在血管外位置)，所以這些細胞表明EPC存在于Lin-HSC群中。被靶向的星型膠質(zhì)細胞與在許多低氧性視網(wǎng)膜病變中觀察到的是同一類型。眾所周知，神經(jīng)膠質(zhì)細胞是DR和其它類型的視網(wǎng)膜損傷中所觀察到的新生血管葉的主要組分。在活性神經(jīng)膠質(zhì)增生及局部缺血引發(fā)的新生血管化的情況下，活性星型膠質(zhì)細胞增生、產(chǎn)生細胞因子并上調(diào)GFAP，與在包括人的許多哺乳動物物種的新生視網(wǎng)膜血管模板形成過程中觀察到的情況相仿。
本發(fā)明的Lin-HSC群會象在新生眼中那樣靶向成體小鼠眼中的活性星型膠質(zhì)細胞，將Lin-HSC細胞注射入視網(wǎng)膜被光凝固(圖3(a))或針尖(圖3(b))損傷的成體眼中。在兩個模型中，只是在損傷部位周圍觀察到具有明顯GFAP染色的細胞群(圖3(a與b))。來自所注射的Lin-HSC組合物的細胞位于受損傷部位，并特異性地與GFAP陽性星型膠質(zhì)細胞保持締合(圖3(a和b))。在這些部位，還觀察到Lin-HSC細胞移至視網(wǎng)膜的更深層，其所處層面與在深層視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)新生形成期間觀察到的層面類似。視網(wǎng)膜的未損傷部位不含Lin-HSC細胞，這與Lin-HSC注射入正常未受損成體視網(wǎng)膜中時所觀察到的相一致(圖2(e))。這些數(shù)據(jù)表明，在具有神經(jīng)膠質(zhì)增生的受損成體視網(wǎng)膜以及經(jīng)歷血管化的新生視網(wǎng)膜中，Lin-HSC組合物可選擇性地靶向活性神經(jīng)膠質(zhì)細胞。
玻璃體內(nèi)注射的Lin-HSC可拯救并穩(wěn)定變性血管系統(tǒng)。因為玻璃體內(nèi)注射的Lin-HSC組合物靶向星型膠質(zhì)細胞并滲入正常的視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)中，所以在與神經(jīng)膠質(zhì)增生和血管變性相關(guān)的局部缺血或變性視網(wǎng)膜疾病中這些細胞還穩(wěn)定變性血管。rd/rd小鼠是視網(wǎng)膜變性模型，其至出生后一個月時表現(xiàn)出光感受器及視網(wǎng)膜血管層的深度變性。這些小鼠中的視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)正常發(fā)育至P16，此時較深的血管叢退化；到P30時大多數(shù)小鼠的深叢和中間叢幾乎完全變性。
為了確定HSC是否能夠拯救退化的血管，P6時將Lin+HSC或Lin-HSC(來自Balb/c小鼠)玻璃體內(nèi)注射入rd/rd小鼠中。至P33時，注射Lin+HSC后，最深視網(wǎng)膜層的血管幾乎完全消失(圖4(a和b))。相反，至P33時大多數(shù)注射了Lin-HSC的視網(wǎng)膜具有幾乎正常的視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)，其具有3個平行的、良好成型的血管層(圖4(a和d)。該作用的量化表明，注射了Lin-的rd/rd眼的深血管叢中血管平均長度幾乎是未處理或Lin+細胞處理的眼的3倍(圖4(e))。令人驚訝的是，注射來源于rd/rd成體小鼠(FVB/N)骨髓的Lin-HSC組合物也拯救了變性的rd/rd新生小鼠視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)(圖4(f))。早在出生后2-3周便觀察到rd/rd小鼠眼中血管系統(tǒng)的變性。遲至P15時注射Lin-HSC也能部分穩(wěn)定rd/rd小鼠的變性血管系統(tǒng)達至少一個月(圖4(g和h))。
注射至幼齡(例如P2)rd/rd小鼠中的Lin-HSC組合物也滲入到發(fā)育中的表層血管中。至P11時，觀察到這些細胞移至深血管叢層面，并形成與在野生型外部視網(wǎng)膜血管層中所觀察到的相同樣式(圖5(a))。為了更清晰描述所注射的Lin-HSC組合物中的細胞滲入并穩(wěn)定rd/rd小鼠中的變性視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)的方式，將來源于Balb/c小鼠的Lin-HSC組合物注射入Tie-2-GFP FVB小鼠眼中。FVB小鼠具有rd/rd基因型，并且由于它們表達融合蛋白Tie-2-GFP，所以所有的內(nèi)源血管都發(fā)熒光。
當(dāng)將Lin-HSC組合物中的未標(biāo)記細胞注射入新生Tie-2-GFP FVB眼中并隨后滲入發(fā)育中的血管系統(tǒng)中時，Tie-2-GFP標(biāo)記的內(nèi)源性血管中應(yīng)有未被標(biāo)記的裂縫，這些裂縫對應(yīng)于注射的、滲入的、未被標(biāo)記的LinHSC。隨后用另一種血管標(biāo)記物(例如CD-31)染色，那么就描繪出整個血管，允許確定非內(nèi)源性內(nèi)皮細胞是否是血管系統(tǒng)的一部分。注射后兩個月，在注射Lin-HSC組合物的眼視網(wǎng)膜中觀察到CD-31陽性的、Tie-2-GFP陰性的血管(圖5(b))。有趣的是，多數(shù)被拯救的血管含有Tie-2-GFP陽性細胞(圖5(c))。如同平滑肌肌動蛋白染色所測定的那樣，不管是否存在血管拯救，周細胞分布都不因注射Lin-HSC而改變(圖5(d))。這些數(shù)據(jù)清楚表明，玻璃體內(nèi)注射的本發(fā)明的Lin-HSC組合物在遺傳缺陷小鼠中移至視網(wǎng)膜中、參與正常視網(wǎng)膜血管形成并穩(wěn)定變性中的內(nèi)源性血管。
由來自Lin-HSC的轉(zhuǎn)染細胞抑制視網(wǎng)膜血管發(fā)生。多數(shù)視網(wǎng)膜血管疾病涉及異常的血管增生而不是變性。靶向星型膠質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)基因細胞可用于傳遞抗血管發(fā)生蛋白并抑制血管發(fā)生。用T2-色氨酰-tRNA合成酶(T2-TrpRS)轉(zhuǎn)染來自Lin-HSC組合物的細胞。T2-TrpRS是有效抑制視網(wǎng)膜血管發(fā)生的TrpRS的43kD片段(圖6(a))。P2時注射對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Lin-HSC組合物(無T2-TrpRS基因)的眼視網(wǎng)膜在P12時具有正常的初級(圖6(c))與次級(圖6(d))視網(wǎng)膜血管叢。當(dāng)將T2-TrpRS轉(zhuǎn)染的本發(fā)明Lin-HSC組合物注射入P2眼中并在10天后評價時，初級網(wǎng)絡(luò)明顯異常(圖6(e))，深視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)的形成幾乎完全被抑制(圖6(f))。這些眼中觀察到的極少量血管變細，血管間具有大間隙。分泌T2-TrpRS的Lin-HSC的抑制程度詳述于表2。
T2-TrpRS由Lin-HSC組合物中的細胞在體外產(chǎn)生和分泌，將這些轉(zhuǎn)染細胞注射入玻璃體之后，在視網(wǎng)膜中觀察到30kD的T2-TrpRS片段(圖6(b))。此30kD片段僅在注射本發(fā)明的轉(zhuǎn)染的Lin-HSC的視網(wǎng)膜中才能明確地觀察到，與重組或體外合成的蛋白相比，這種表觀分子量的降低可能歸因于T2-TrpRS在體內(nèi)的加工或降解。這些數(shù)據(jù)表明，Lin-HSC組合物可通過靶向活性星型膠質(zhì)細胞而用于將有功能活性的基因(例如表達血管生成抑制分子的基因)傳遞至視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)。雖然觀察到的血管生成抑制作用可能是由于細胞介導(dǎo)的活性所致，但這是極不可能的，因為用相同的、但非T2轉(zhuǎn)染的Lin-HSC組合物治療的眼具有正常的視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)。
表2.T2-TrpRS分泌型Lin-HSC的血管抑制作用
玻璃體內(nèi)注射的Lin-HSC群定位至視網(wǎng)膜星型膠質(zhì)細胞、滲入血管中并可用于治療多種視網(wǎng)膜疾病。雖然注射的HSC組合物中的大多數(shù)細胞附著于星型膠質(zhì)細胞模板，但少量細胞深入地移入視網(wǎng)膜中，歸巢至深血管網(wǎng)絡(luò)隨后將在此發(fā)育的區(qū)域。即便在出生后42天之前在此區(qū)域沒有觀察到GFAP陽性星型膠質(zhì)細胞，也不能排除GFAP陰性神經(jīng)膠質(zhì)細胞已存在而為Lin-HSC定位提供信號的可能性。以前的研究已表明許多疾病同活性神經(jīng)膠質(zhì)增生相關(guān)。尤其是在DR中，神經(jīng)膠質(zhì)細胞及其胞外基質(zhì)同病理性血管發(fā)生有關(guān)。
由于注射的Lin-HSC組合物中的細胞特異性地附著于表達GFAP的神經(jīng)膠質(zhì)細胞，因此不管什么類型的損傷，均可使用本發(fā)明的Lin-HSC組合物靶向視網(wǎng)膜中的血管發(fā)生前的損傷部位。例如，在諸如糖尿病的局部缺血性視網(wǎng)膜病變中，新生血管形成是對缺氧的反應(yīng)。通過將Lin-HSC組合物靶向病理性新生血管化部位，可以穩(wěn)定發(fā)育中的新生血管系統(tǒng)，從而防止諸如出血或水腫的新生血管系統(tǒng)異常(同DR相關(guān)的視覺喪失的病因)，并能潛在地緩解原本刺激新生血管形成的缺氧。異常血管可被恢復(fù)成正常狀態(tài)。此外，可使用轉(zhuǎn)染的Lin-HSC組合物和激光誘導(dǎo)的星型膠質(zhì)細胞活化作用，將血管生成抑制蛋白如T2-TrpRS傳遞到病理性血管發(fā)生部位。由于激光光凝術(shù)普遍應(yīng)用在臨床眼科學(xué)上，所以該方法具有針對多種視網(wǎng)膜疾病的應(yīng)用。盡管已在癌癥治療中研究了這些基于細胞的方法，但由于眼內(nèi)注射使得有可能將大量細胞直接傳遞至患病部位，故這些方法對眼疾的用途更有優(yōu)勢。
Lin-HSC的神經(jīng)營養(yǎng)性和血管營養(yǎng)性拯救。如上所述用MACS由增強綠色熒光蛋白(eGFP)、CM(rd/rd)、FVB(rd/rd)小鼠骨髓中分離Lin-HSC。將來自這些小鼠的含EPC的Lin-HSC玻璃體內(nèi)注射入P6 C3H或FVB小鼠眼中。在注射后的不同時間點(1個月、2個月及6個月)收集視網(wǎng)膜。通過CD31抗體染色后的掃描激光共焦顯微鏡和DAPI核染色后的視網(wǎng)膜組織學(xué)分析血管系統(tǒng)。還使用不同時間點的視網(wǎng)膜mRNA的微陣列基因表達分析鑒別潛在地涉及該作用的基因。
至P21時rd/rd小鼠的眼睛具有視網(wǎng)膜神經(jīng)感覺層和視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)的嚴重變性。于P6時用Lin-HSC處理的rd/rd小鼠眼睛維持正常的視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)長達6個月；在所有時間點上(1M、2M和6M)與對照相比，深層與中間層都有顯著改善(參見圖12)。此外，我們觀察到相對于作為對照的用Lin+HSC處理的眼，用Lin-HSC處理的視網(wǎng)膜還更厚(1M；1.2倍，2M；1.3倍，6M；1.4倍)，在外核層具有更多數(shù)目的細胞(1M；2.2倍，2M；3.7倍，6M；5.7倍)。同對照(未處理或非Lin-處理的)rd/rd視網(wǎng)膜相比，對“被拯救的”視網(wǎng)膜(例如，Lin-HSC)的大規(guī)模基因組分析表明，編碼sHSP(小熱休克蛋白)以及與血管和神經(jīng)拯救相關(guān)的特異性生長因子的基因(包括編碼列于圖20的圖A與B中的蛋白的基因)明顯上調(diào)。
本發(fā)明的骨髓源Lin-HSC群顯著且可重復(fù)地誘導(dǎo)正常血管系統(tǒng)的維持，并極大增加了rd/rd小鼠中的光感受器及其它神經(jīng)元細胞層。這種神經(jīng)營養(yǎng)性拯救作用與小熱休克蛋白和生長因子的顯著上調(diào)相關(guān)，對目前尚無法治愈的視網(wǎng)膜變性疾病提供了治療方法的思路。
rd1/rd1小鼠視網(wǎng)膜表現(xiàn)出深度血管和神經(jīng)元變性。小鼠中正常的出生后視網(wǎng)膜血管與神經(jīng)元發(fā)育已有詳細描述，與在妊娠末三個月的人類胎兒中所觀察到的變化類似(Dorrell等，2002，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.433500-3510)。rd1基因的小鼠純合子共有人視網(wǎng)膜變性的多種特征(Frasson等，1999，Nat.Med.51183-1187)，表現(xiàn)出快速的光感受器(PR)喪失，并伴有由PR cGMP磷酸二酯酶編碼基因中的突變導(dǎo)致的嚴重血管萎縮(Bowes等，1990，Nature347677-680)。為檢查視網(wǎng)膜發(fā)育中的血管系統(tǒng)及其隨后的變性，使用抗膠原蛋白IV(CIV)的抗體和抗CD31(PECAM-1)的抗體(圖15)，抗膠原蛋白IV為成熟血管系統(tǒng)的胞外基質(zhì)(ECM)蛋白，CD31為內(nèi)皮細胞標(biāo)記物。rd1/rd1(C3H/HeJ)的視網(wǎng)膜正常發(fā)育，直至約出生后(P)8天，此時含光感受器的外核層(ONL)開始變性。ONL快速變性，細胞經(jīng)凋亡死亡，使得至P20時僅余下單層核。用CIV和CD31這二者的抗體雙重染色整裝視網(wǎng)膜揭示，rd1/rd1小鼠中的血管變性細節(jié)同其他人所描述的相似(Blanks等，1986，J.Comp.Neurol.254543-553)。視網(wǎng)膜血管初級層和深層看起來發(fā)育正常，直至P12，之后內(nèi)皮細胞快速損失，依據(jù)是CD31染色消失。CD31陽性內(nèi)皮細胞以正常分布存在，直至P12，但此后快速消失。有趣的是，CIV陽性染色在所檢查的全部時間點都保持存在，提示血管及相連的ECM正常形成，但在P13之后僅保留基質(zhì)，至P13時未觀察到CD31陽性細胞。(圖15，中圖)。中間血管叢在P21之后也變性，但進度要慢于在深叢中所觀察到的(圖15，上圖)。為與rd1/rd1小鼠對比，給出了正常小鼠的視網(wǎng)膜血管和神經(jīng)細胞層(右圖，圖15)。
骨髓源Lin-HSC在rd1/rd1小鼠中的神經(jīng)保護作用。玻璃體內(nèi)注射的Lin-HSC滲入到全部三個血管叢中的內(nèi)源性視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)中，并防止血管變性。有趣的是，實際上從未在外核層觀察到注射的細胞。這些細胞或滲入到形成中的視網(wǎng)膜血管中，或在這些血管附近被觀察到。鼠Lin-HSC(來自C3H/HeJ)于變性就要開始前的P6時玻璃體內(nèi)注射入C3H/HeJ(rd1/rd1)小鼠眼中。至P30時，注射對照細胞(CD31-)的眼表現(xiàn)出典型的rd1/rd1表型，即在每一個檢查的視網(wǎng)膜中均觀察到幾乎完全變性的深層血管叢及ONL。注射Lin-HSC的眼保持了正常表觀的中間血管叢及深血管叢。令人驚訝的是，在注射Lin-HSC的眼的內(nèi)核層(INL)和ONL中觀察到的細胞明顯多于注射了對照細胞的眼(圖16(A))。Lin-HSC的這種拯救作用可以在注射后2個月觀察到(圖16(B))，并持續(xù)長達6個月(圖16(C))。當(dāng)比較被拯救的與未被拯救的眼時，注射了Lin-HSC的眼的中間叢和深叢血管系統(tǒng)以及含神經(jīng)元細胞的INL與ONL中的差異在所有測量時間點都很明顯(圖16(B和C))。通過測量血管系統(tǒng)總長度(圖16(D))并計數(shù)ONL中所觀察到的DAPI陽性細胞核數(shù)(圖16(E))量化這種作用。對所有時間點的數(shù)據(jù)應(yīng)用簡單的線性回歸分析。
在注射Lin-HSC的眼中于P30(p＜0.024)及P60(p＜0.034)時觀察到血管拯救與神經(jīng)元(例如ONL厚度)拯救之間的統(tǒng)計學(xué)顯著相關(guān)性(圖16(F))。當(dāng)P180時比較注射過Lin-HSC的視網(wǎng)膜和注射過對照細胞的視網(wǎng)膜時，盡管無統(tǒng)計學(xué)顯著性(p＜0.14)，但相關(guān)性仍很高(圖16(F))。相反，注射過對照細胞的視網(wǎng)膜在任何時間點都未顯示出血管系統(tǒng)保持與ONL之間的顯著相關(guān)性(圖16(F))。這些數(shù)據(jù)表明，玻璃體內(nèi)注射Lin-HSC在rd1/rd1小鼠視網(wǎng)膜中導(dǎo)致伴發(fā)的視網(wǎng)膜血管及神經(jīng)元拯救。在ONL中或者視網(wǎng)膜血管內(nèi)或臨近視網(wǎng)膜血管以外的任何位置都未觀察到注射的細胞。
注射過Lin-HSC的rd/rd視網(wǎng)膜的功能性拯救。對注射對照細胞或鼠Lin-HSC后兩個月的小鼠做視網(wǎng)膜電圖(ERG)(圖17)。ERG記錄后對每只眼進行免疫組化與顯微分析，以確認已發(fā)生血管及神經(jīng)元拯救。來自被拯救的治療眼和未被拯救的對照眼的代表性ERG記錄顯示，在被拯救的眼中，數(shù)字上扣減的信號(治療的眼減去未治療的眼)產(chǎn)生約8-10微伏振幅的清晰可檢測信號(圖17)。顯然，來自兩只眼睛的信號嚴重異常。然而，由Lin-HSC治療的眼可記錄到一致且可檢測的ERG。在所有例子中，來自對照眼的ERG都是不可檢測的。雖然被拯救的眼中的信號振幅遠低于正常眼，但只要有組織學(xué)拯救就始終可以觀察到信號，而且信號振幅與基于基因的其它拯救研究報道的信號近似。所有這些結(jié)果都表明在用本發(fā)明的Lin-HSC處理的眼中存在某種程度的功能性拯救。
被拯救的rd/rd視網(wǎng)膜細胞類型主要為視錐。用對視桿視蛋白或視錐視蛋白特異性的抗體以免疫組化方法分析被拯救的和未被拯救的視網(wǎng)膜。對用于圖17列出的ERG記錄的相同眼睛進行視桿視蛋白或視錐視蛋白分析。在野生型小鼠視網(wǎng)膜中，存在的光感受器不足5％為視錐(Soucy等，1998，Neuron 21481-493)，用紅/綠視錐視蛋白或用視桿視紫紅質(zhì)所觀測到的免疫組化染色圖譜如圖25(A)或圖25(B)所示，該圖譜符合視錐細胞的該百分率。當(dāng)野生型視網(wǎng)膜用預(yù)免疫IgG染色時，在血管自身熒光以外的視網(wǎng)膜神經(jīng)感覺層中的任意位置都未觀察到染色(圖25(C))。出生后2個月，未注射的rd/rd小鼠的視網(wǎng)膜具有基本萎縮的外核層，其用紅綠視錐視蛋白抗體(圖25(D))或視紫紅質(zhì)抗體(圖25(G))未顯示出任何染色。注射對照CD31-HSC的眼也未對存在的視錐視蛋白(圖25(E))或視桿視蛋白(圖25(H))呈陽性染色。相反，注射Lin-HSC的對側(cè)眼在被保持的外核層中具有約3至約8排核；這些細胞的大部分對視錐視蛋白陽性(圖25(F))，約1-3％對視桿視蛋白陽性(圖25(I))。引人注目地是，這與最初由正常小鼠視網(wǎng)膜觀察到的幾乎相反，正常小鼠視網(wǎng)膜以視桿為主。這些數(shù)據(jù)表明，注射Lin-HSC可在視錐一般應(yīng)變性的延長時期內(nèi)保持視錐。
人骨髓(hBM)源Lin-HSC也拯救變性視網(wǎng)膜。分離自人骨髓的Lin-HSC表現(xiàn)得類似于鼠Lin-HSC。從人供體收集骨髓，除去Lin+HSC，產(chǎn)生人Lin-HSC(hLin-HSC)群。這些細胞用熒光染料活體外標(biāo)記，并注射入C3SnSmn.CB17-Prkdc SCID小鼠眼中。注射的Lin-HSC遷移至和靶向視網(wǎng)膜血管發(fā)生部位，方式與注射鼠Lin-HSC時觀察到的方式相同(圖18(A))。除了血管靶向以外，人Lin-HSC還對rd1/rd1小鼠的血管和神經(jīng)細胞層這二者提供了有力的拯救作用(圖18(B和C))。此觀察結(jié)果證實在人骨髓中存在靶向視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)并可防止視網(wǎng)膜變性的細胞。
Lin-HSC在rd10/rd10小鼠中具有血管營養(yǎng)性和神經(jīng)營養(yǎng)性作用。盡管rd1/rd1小鼠是應(yīng)用最廣泛、表征最詳盡的視網(wǎng)膜變性模型(Chang等，2002，Vision Res.42517-525)，但變性非常迅速，在這點上與在人類疾病中觀察到的通常更慢的時程不同。在這個品系中，光感受器細胞變性在P8左右開始，P8是視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)仍在快速伸展的時刻(圖15)。深層視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)隨后發(fā)生變性，即便中間叢仍在形成時，因此，rd1/rd1小鼠的視網(wǎng)膜從未完全發(fā)育，這與在大多數(shù)患有該病的人中所觀察到的不同。rd10小鼠模型具有更慢的變性時程，更緊密類似于人視網(wǎng)膜變性狀態(tài)，使用該模型研究Lin-HSC介導(dǎo)的血管拯救。在rd10小鼠中，光感受器細胞變性于P21左右開始，其后不久便開始血管變性。
因為正常的視網(wǎng)膜神經(jīng)感覺層發(fā)育至P21時大體完成，所以在視網(wǎng)膜已徹底分化后開始觀察變性，因此，該變性比rd1/rd1小鼠模型更類似于人視網(wǎng)膜變性。將來自rd10小鼠的Lin-HSC或?qū)φ占毎⑸淙隤6眼中，以變化的時間點上評價視網(wǎng)膜。在P21時，注射了Lin-HSC和對照細胞的眼的視網(wǎng)膜看起來都正常，所有的血管層都完全發(fā)育，INL與ONL正常發(fā)育(圖18(D和H))。在約P21時視網(wǎng)膜變性開始發(fā)生并隨時間加劇。至P30時，注射對照細胞的視網(wǎng)膜表現(xiàn)出嚴重的血管及神經(jīng)元變性(圖18(I))，而注射Lin-HSC的視網(wǎng)膜保持幾乎正常的血管層和光感受器細胞(圖18(E))。被拯救的和未被拯救的眼之間的差異在后面的時間點上更加顯著(對比圖18(F和G)與圖18(J和K))。在對照處理的眼中，通過對CD31和膠原蛋白IV的免疫組織化學(xué)染色非常清楚地觀察到血管變性的發(fā)展(圖18((I-K))。對照處理的眼對CD31幾乎完全陰性，而膠原蛋白IV陽性血管“痕跡”仍然明顯，表明發(fā)生的是血管退化，而不是未完成的血管形成。相反，Lin-HSC治療的眼同時具有CD31陽性和膠原蛋白IV陽性的血管，看起來非常類似于正常的野生型眼(對比圖18(F和I))。
用Lin-HSC治療后rd/rd小鼠視網(wǎng)膜的基因表達分析。使用大規(guī)?；蚪M學(xué)(微陣列分析)分析被拯救的和未被拯救的視網(wǎng)膜，以鑒別神經(jīng)營養(yǎng)性拯救中推定的介導(dǎo)物。將用Lin-HSC治療的rd1/rd1小鼠視網(wǎng)膜中的基因表達與未注射的視網(wǎng)膜以及注射對照細胞(CD31-)的視網(wǎng)膜進行比較。這些比較各以一式三份實施。在所有的三份樣品中，要求基因所具有的表達水平至少為背景水平的2倍高才可認定其存在。和注射了對照細胞及未注射的rd/rd小鼠視網(wǎng)膜相比，在Lin-HSC保護的視網(wǎng)膜中被上調(diào)3倍的基因如圖20中的圖A和B所示。通過將標(biāo)準偏差除以各個cRNA復(fù)制物的平均表達水平，計算表達基因的變異系數(shù)(COV)水平。另外，通過關(guān)聯(lián)平均值和標(biāo)準偏差(SD)計算表達水平和噪聲離散之間的關(guān)聯(lián)。獲得各個基因的基因表達水平和標(biāo)準偏差之間的關(guān)聯(lián)，使得可以測定背景水平和可信表達水平閾值?？傮w來講，數(shù)據(jù)完全落在容許限度內(nèi)(Tu等，2002，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9914031-14036)。以下單獨討論的基因具有的表達水平高于這些臨界表達水平。所討論基因的成對“t檢驗”值也列于表1。在各種情況下，p值是合理的(接近或低于0.05)，表明復(fù)制物之間存在相似性，不同測試組之間存在可能顯著的差異。許多顯著上調(diào)的基因，包括MAD及Ying Yang-1(YY-1)(Austen等，1997，Curr.Top.Microbiol.Immunol.224123-130)，其編碼蛋白所具有的功能與保護細胞免于凋亡相關(guān)。許多晶體蛋白與涉及保護細胞免受應(yīng)力的已知熱休克蛋白具有序列同源性和相似的功能，這些晶體蛋白也被Lin-HSC治療上調(diào)。α-晶體蛋白的表達通過免疫組織化學(xué)分析定位在ONL(圖19)。圖19表明，用Lin-HSC治療后在被拯救的外核層細胞中晶體蛋白αA上調(diào)，但在用對照細胞處理的對側(cè)眼中未上調(diào)。左圖顯示了被拯救的視網(wǎng)膜中的IgG染色(對照)。中圖顯示了被拯救的視網(wǎng)膜中的晶體蛋白αA。右圖顯示了未被拯救的視網(wǎng)膜中的晶體蛋白αA。
將來自用人Lin-HSC拯救的rd1/rd1小鼠視網(wǎng)膜的信使RNA雜交至人特異性Affymetrix U133A微陣列芯片上。經(jīng)嚴格分析后，發(fā)現(xiàn)了許多基因，其mRNA表達是人特異性的、高于背景，與鼠Lin-HSC拯救的視網(wǎng)膜和注射了人對照細胞的、未被拯救的視網(wǎng)膜相比，在人Lin-HSC拯救的視網(wǎng)膜中明顯更高(圖20，圖C)。CD6(一種在原生的和新分化的CD34+造血干細胞表面表達的細胞粘附分子)和干擾素α13(另一個由造血干細胞表達的基因)都是通過微陣列生物信息學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)的，驗證了評價方法的有效性。此外，在人Lin-HSC拯救的小鼠視網(wǎng)膜樣品中，幾種生長因子及神經(jīng)營養(yǎng)因子高于背景表達(圖20，圖D)。
使用譜系定型造血細胞標(biāo)記負選擇含EPC的骨髓源Lin-HSC群。雖然可用作EPC的骨髓源Lin-HSC亞群不是由常用的細胞表面標(biāo)記所表征的，但這些細胞在發(fā)育中或受損的視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)中的行為完全不同于在Lin+或成熟內(nèi)皮細胞群中所觀察到的。這些細胞選擇性地靶向視網(wǎng)膜血管發(fā)生部位，參與伸展血管的形成。
遺傳性視網(wǎng)膜變性疾病通常伴發(fā)視網(wǎng)膜血管損失。對這類疾病的有效治療要求功能恢復(fù)以及維持復(fù)雜組織結(jié)構(gòu)。盡管最近幾項研究已經(jīng)研究了營養(yǎng)因子或干細胞自身的基于細胞傳遞的用途，但這二者的某種組合可能是必需的。例如，使用生長因子療法治療視網(wǎng)膜變性疾病導(dǎo)致血管不可調(diào)節(jié)地過度生長，造成正常視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)的嚴重破壞。使用神經(jīng)或視網(wǎng)膜干細胞治療視網(wǎng)膜變性疾病可重建神經(jīng)元功能，但功能性血管對維持視網(wǎng)膜功能完整性也是必需的。本發(fā)明的Lin-HSC的細胞滲入到rd/rd小鼠視網(wǎng)膜血管，在不破壞視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的情況下穩(wěn)定變性的血管系統(tǒng)。當(dāng)細胞注射入P15 rd/rd小鼠中時也觀察到這種拯救作用。由于rd/rd小鼠中的血管變性在P16時開始，所以這個觀察結(jié)果擴展了有效Lin-HSC治療的治療窗。在注射了本發(fā)明的Lin-HSC的眼中視網(wǎng)膜神經(jīng)元和光感受器得以保持，視覺功能得以維持。
成體骨髓源Lin-HSC在玻璃體內(nèi)注射入患有視網(wǎng)膜變性疾病的小鼠中時，施加深度的血管營養(yǎng)性和神經(jīng)營養(yǎng)性作用。這種拯救作用在治療后持續(xù)達6個月，而且在完全視網(wǎng)膜變性之前(直到小鼠出生后16天，所述小鼠通常至出生后30天表現(xiàn)出完全視網(wǎng)膜變性)注射Lin-HSC時最有效。這種拯救作用在兩種視網(wǎng)膜變性小鼠模型中觀察到，而且引人注目地是，當(dāng)受體是患有視網(wǎng)膜變性的免疫缺陷嚙齒類動物(例如SCID小鼠)時用成人骨髓源HSC，或者當(dāng)供體是患有視網(wǎng)膜變性的小鼠時，能夠?qū)崿F(xiàn)這種拯救。雖然最近幾個報道描述了在利用野生型基因的病毒型基因拯救之后，患有視網(wǎng)膜變性的小鼠或狗中的部分表型拯救(Ali等，2000，Nat Genet 25306-310；Takahashi等，1999，J.Virol.737812-7816；Acland等，2001，Nat.Genet.2892-95)，但本發(fā)明是第一個通過血管拯救獲得的通用細胞型治療作用。因此，此方法對治療具有100個以上已知相關(guān)突變的一組疾病(例如色素性視網(wǎng)膜炎)的潛在用途比創(chuàng)建針對每個已知突變的單個基因療法更實用。
神經(jīng)營養(yǎng)性拯救作用的確切分子基礎(chǔ)還不清楚，但僅在有伴發(fā)的血管穩(wěn)定/拯救的情況下觀察到。注射干細胞本身的存在不足以產(chǎn)生神經(jīng)營養(yǎng)性拯救，在外核層中明顯不存在干細胞源神經(jīng)元排除了所注射細胞轉(zhuǎn)變?yōu)楣飧惺芷鞯目赡苄?。由微陣列基因表達分析獲得的數(shù)據(jù)表明已知具有抗凋亡效應(yīng)的基因明顯上調(diào)。由于在視網(wǎng)膜變性中觀察到的大多數(shù)神經(jīng)元死亡都為凋亡方式，所以這種保護可能對在這些疾病中延長光感受器和其它視覺功能關(guān)鍵性神經(jīng)元的壽命具有重大療效。c-myc是一種通過上調(diào)各種下游凋亡誘導(dǎo)因子而參與凋亡的轉(zhuǎn)錄因子。c-myc表達在rd/rd小鼠中增至高于野生型4.5倍，表明它可能涉及在rd1/rd1小鼠中觀察到的光感受器變性。已知兩個在Lin-HSC保護的視網(wǎng)膜中顯著上調(diào)的基因Mad1和YY-1(圖20，圖A)抑制c-myc活性，從而抑制c-myc誘導(dǎo)的凋亡。還已表明，Mad1過表達抑制Fas誘導(dǎo)的胱天蛋白酶-8活化，胱天蛋白酶-8是凋亡途徑的另一種關(guān)鍵組分。這兩種分子的上調(diào)可通過防止一般在rd/rd小鼠中導(dǎo)致變性的凋亡啟動而在保護視網(wǎng)膜免于血管和神經(jīng)變性方面發(fā)揮作用。
另一組在Lin-HSC保護的視網(wǎng)膜中大幅上調(diào)的基因包括晶體蛋白家族成員(圖20，圖B)。與熱休克蛋白及其它應(yīng)激誘導(dǎo)蛋白相似，晶體蛋白可被視網(wǎng)膜應(yīng)激激活，提供抗凋亡的保護作用。在視網(wǎng)膜營養(yǎng)失調(diào)大鼠模型中，αA-晶體蛋白的異常低表達同光感受器損失相關(guān)，最近一個rd/rd小鼠視網(wǎng)膜的蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明，晶體蛋白上調(diào)的誘導(dǎo)是對視網(wǎng)膜變性的響應(yīng)。根據(jù)我們的EPC拯救的rd/rd小鼠視網(wǎng)膜的微陣列數(shù)據(jù)，晶體蛋白的上調(diào)看起來在EPC介導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)保護中起重要作用。
諸如c-myc、Mad1、Yx-1的基因和晶體蛋白可能是神經(jīng)元拯救的下游介導(dǎo)物。神經(jīng)營養(yǎng)性物質(zhì)可調(diào)節(jié)抗凋亡基因表達，但我們用小鼠干細胞拯救的視網(wǎng)膜的微陣列分析未證實誘導(dǎo)增加水平的已知神經(jīng)營養(yǎng)因子。另一方面，用人特異性芯片分析人骨髓源干細胞介導(dǎo)的拯救的確表明，多個生長因子基因的表達低但顯著地增加。
上調(diào)基因包括成纖維細胞生長因子家族的某些成員與Otoferlin。Otoferlin基因中的突變與遺傳障礙相關(guān)，引起聽覺神經(jīng)疾病所致的耳聾。有可能是由注射的Lin-HSC產(chǎn)生的Otoferlin也有助于預(yù)防視網(wǎng)膜神經(jīng)疾病。在歷史上，一直以來都假設(shè)在視網(wǎng)膜變性的病人及動物中觀察到的血管變化是由于光感受器死亡所引起的代謝需求減少的繼發(fā)結(jié)果。本文數(shù)據(jù)表明，至少對患有遺傳性視網(wǎng)膜變性的小鼠來說，保持正常的血管系統(tǒng)可能也有助于維持外核層的組分。近來文獻中的報道會支持這樣一個觀點組織特異性血管系統(tǒng)具有的營養(yǎng)作用超出了僅提供血管“養(yǎng)分”的預(yù)期作用。例如，在VEGFR1活化后，肝內(nèi)皮細胞當(dāng)遭遇肝損傷時可被誘導(dǎo)產(chǎn)生肝細胞再生與維持的關(guān)鍵性生長因子(LeCouter等，2003，Science 299890-893)。
已報道血管內(nèi)皮細胞和鄰近的肝實質(zhì)細胞之間相似的指示性相互作用與肝器官形成有關(guān)，之后很久才形成功能性血管。在視網(wǎng)膜變性個體中的內(nèi)源性視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)可能不會促成如此有力的拯救，但如果該血管系統(tǒng)用來源于骨髓造血干細胞群的內(nèi)皮祖細胞支撐，則它們會使血管系統(tǒng)對變性更有抗性，同時有利于視網(wǎng)膜神經(jīng)元以及血管存活。在患有視網(wǎng)膜變性的人中，延遲完全視網(wǎng)膜變性發(fā)作可提供數(shù)年的額外視覺能力。用本發(fā)明Lin-HSC治療的動物明顯保持了足可支持其視力的ERG。
在臨床上廣泛認識到，盡管仍能保持視覺功能，但光感受器與其它神經(jīng)元可能已有實質(zhì)損失。在某些情況下，關(guān)鍵閾值相交，視覺喪失。由于幾乎所有的人遺傳性視網(wǎng)膜變性都發(fā)病早但發(fā)病慢，因此可鑒別視網(wǎng)膜變性個體，并用本發(fā)明的自體骨髓干細胞移植物玻璃體內(nèi)治療，以延遲視網(wǎng)膜變性和伴發(fā)的視覺喪失。為增強這些干細胞的靶向與滲入，期望存在活化的星型膠質(zhì)細胞(Otani等，2002，Nat.Med.81004-1010)；這可在存在相關(guān)的神經(jīng)膠質(zhì)增生時通過早期治療實現(xiàn)，或通過使用激光刺激活性星型膠質(zhì)細胞局部增殖實現(xiàn)。任選地，在眼內(nèi)注射前用一種或多種神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)活體外轉(zhuǎn)染干細胞可用于增強拯救作用。該方法可用于治療其它視覺神經(jīng)元變性疾病，例如其中存在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞變性的青光眼。
本發(fā)明的Lin-HSC群含有EPC群，其可在不破壞視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的情況下通過靶向活性星型膠質(zhì)細胞并滲入既有模板中而促進血管發(fā)生。本發(fā)明的Lin-HSC群還在患有視網(wǎng)膜變性的眼中提供了令人驚訝的長期神經(jīng)營養(yǎng)性拯救作用。此外，遺傳修飾的、含EPC的自體Lin-HSC組合物可移植入局部缺血或異常血管化的眼中，并可穩(wěn)定滲入新血管和神經(jīng)元層中，長期持續(xù)地局部傳遞治療分子。這種以生理學(xué)上有意義的劑量局部傳遞表達藥物的基因代表了一種治療目前無法治愈的眼疾的新范例。
例如，正常小鼠視網(wǎng)膜中的光受體主要為視桿，但在用本發(fā)明的Lin-HSC拯救后觀察到的外核層主要含視錐。大部分遺傳性人視網(wǎng)膜變性由原發(fā)性視桿特異性缺陷所致，一般認為視錐喪失是視桿功能失調(diào)的繼發(fā)結(jié)果，視桿功能失調(diào)可能與視桿表達的某些營養(yǎng)因子的缺失有關(guān)。在面對視桿/視網(wǎng)膜變性時由Lin-HSC促進的誘導(dǎo)視錐存活的本發(fā)明方法提供了一個方法，以在例如色素性視網(wǎng)膜炎的疾病中更好地保持視錐為主的人類黃斑。
可實施上述實施方案中的眾多變化和修改而不背離本發(fā)明新特征的精神和范圍。本文闡述的具體實施方案無限制意圖或不應(yīng)被推斷為有限制作用。
序列表<110>The Scripps Research InstituteFriedlander，MartinOtani，AtsushiDaSilva，KarenMoreno，Stacey(Hanekamp)<120>分離的譜系陰性造血干細胞及用其治療的方法<130>TSRI-988.2 PCT<150>10/933,634<151>2004-09-03<150>10/833,743<151>2004-04-28<150>10/628,783<151>2003-07-25<150>60/467,051<151>2003-05-02<150>60/398,522<151>2002-07-25<160>2<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>4742<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>編碼His-標(biāo)記的人T2-TrpRS的DNA<400>1tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg60cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc120ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg180gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc240acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt300ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc360
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<223>His-標(biāo)記的人T2-TrpRS<400>2Met Ser Ala Lys Gly Ile Asp Tyr Asp Lys Leu Ile Val Arg Phe Gly1 5 10 15Ser Ser Lys Ile Asp Lys Glu Leu Ile Asn Arg Ile Glu Arg Ala Thr20 25 30Gly Gln Arg Pro His His Phe Leu Arg Arg Gly Ile Phe Phe Ser His35 40 45Arg Asp Met Asn Gln Val Leu Asp Ala Tyr Glu Asn Lys Lys Pro Phe50 55 60Tyr Leu Tyr Thr Gly Arg Gly Pro Ser Ser Glu Ala Met His Val Gly65 70 75 80His Leu Ile Pro Phe Ile Phe Thr Lys Trp Leu Gln Asp Val Phe Asn85 90 95Val Pro Leu Val Ile Gln Met Thr Asp Asp Glu Lys Tyr Leu Trp Lys100 105 110
Asp Leu Thr Leu Asp Gln Ala Tyr Gly Asp Ala Val Glu Asn Ala Lys115 120 125Asp Ile Ile Ala Cys Gly Phe Asp Ile Asn Lys Thr Phe Ile Phe Ser130 135 140Asp Leu Asp Tyr Met Gly Met Ser Ser Gly Phe Tyr Lys Asn Val Val145 150 155 160Lys Ile Gln Lys His Val Thr Phe Asn Gln Val Lys Gly Ile Phe Gly165 170 175Phe Thr Asp Ser Asp Cys Ile Gly Lys Ile Ser Phe Pro Ala Ile Gln180 185 190Ala Ala Pro Ser Phe Ser Asn Ser Phe Pro Gln Ile Phe Arg Asp Arg195 200 205Thr Asp Ile Gln Cys Leu Ile Pro Cys Ala Ile Asp Gln Asp Pro Tyr210 215 220Phe Arg Met Thr Arg Asp Val Ala Pro Arg Ile Gly Tyr Pro Lys Pro225 230 235 240Ala Leu Leu His Ser Thr Phe Phe Pro Ala Leu Gln Gly Ala Gln Thr245 250 255Lys Met Ser Ala Ser Asp Pro Asn Ser Ser Ile Phe Leu Thr Asp Thr260 265 270Ala Lys Gln Ile Lys Thr Lys Val Asn Lys His Ala Phe Ser Gly Gly275 280 285Arg Asp Thr Ile Glu Glu His Arg Gln Phe Gly Gly Asn Cys Asp Val290 295 300Asp Val Ser Phe Met Tyr Leu Thr Phe Phe Leu Glu Asp Asp Asp Lys305 310 315 320Leu Glu Gln Ile Arg Lys Asp Tyr Thr Ser Gly Ala Met Leu Thr Gly325 330 335Glu Leu Lys Lys Ala Leu Ile Glu Val Leu Gln Pro Leu Ile Ala Glu340 345 350His Gln Ala Arg Arg Lys Glu Val Thr Asp Glu Ile Val Lys Glu Phe355 360 365Met Thr Pro Arg Lys Leu Ser Phe Asp Phe Gln Lys Leu Ala Ala Ala370 375 380Leu Glu His His His His His His385 390
權(quán)利要求
1.一種改善哺乳動物視網(wǎng)膜中的視錐細胞變性的方法，所述方法包括給予患有眼疾的哺乳動物的視網(wǎng)膜哺乳動物骨髓源的、分離的、譜系陰性的造血干細胞群，所述造血干細胞群包含造血干細胞和內(nèi)皮祖細胞，其量足以延遲視網(wǎng)膜中的視錐細胞變性。
2.權(quán)利要求1的方法，其中在所述分離的、譜系陰性的造血干細胞群中至少約20％的細胞表達表面抗原CD31。
3.權(quán)利要求1的方法，其中在所述分離的、譜系陰性的造血干細胞群中至少約50％的細胞表達表面抗原CD31。
4.權(quán)利要求1的方法，其中在所述分離的、譜系陰性的造血干細胞群中至少約75％的細胞表達表面抗原CD31。
5.權(quán)利要求1的方法，其中在所述分離的、譜系陰性的造血干細胞群中至少約50％的細胞表達整聯(lián)蛋白α6的表面抗原。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述分離的、譜系陰性的造血干細胞群得自成體骨髓。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述分離的、譜系陰性的造血干細胞群包括鼠細胞。
8.權(quán)利要求7的方法，其中在所述分離的、譜系陰性的造血干細胞群中至少約50％的細胞表達表面抗原CD31，且至少約50％的細胞表達表面抗原CD117。
9.權(quán)利要求7的方法，其中在所述分離的、譜系陰性的造血干細胞群中至少約65％的細胞表達表面抗原CD117。
10.權(quán)利要求7的方法，其中在所述分離的、譜系陰性的造血干細胞群中至少約80％的細胞表達表面抗原CD31，且至少約70％的細胞表達表面抗原CD117。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述分離的、譜系陰性的造血干細胞群包括人細胞。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述分離的、譜系陰性的造血干細胞群中的細胞是CD133陰性的，至少約50％的細胞表達整聯(lián)蛋白α6的表面抗原，且至少約50％的細胞表達表面抗原CD31。
13.權(quán)利要求11的方法，其中所述分離的、譜系陰性的造血干細胞群中的細胞是CD133陽性的，少于約30％的細胞表達整聯(lián)蛋白α6的表面抗原，且少于約30％的細胞表達表面抗原CD31。
14.權(quán)利要求1的方法，所述方法包括以下的額外步驟由患有眼疾的哺乳動物中分離造血干細胞群，之后將所述細胞給予視網(wǎng)膜。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述譜系陰性的造血干細胞群如下分離(a)由待治療的哺乳動物抽取骨髓；(b)從所述骨髓中分離多種單核細胞；(c)用針對一種或多種譜系表面抗原的生物素綴合的譜系群體抗體標(biāo)記所述單核細胞，其中所述譜系表面抗原選自CD2、CD3、CD4、CD11、CD11a、Mac-1、CD14、CD16、CD19、CD24、CD33、CD36、CD38、CD45、Ly-6G、TER-119、CD45RA、CD56、CD64、CD68、CD86、CD66b、HLA-DR和CD235a；和(d)從多種單核細胞中除去對所述一種或多種譜系表面抗原陽性的單核細胞，并回收含內(nèi)皮祖細胞的譜系陰性的造血干細胞群。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述哺乳動物為小鼠。
17.權(quán)利要求15的方法，其中所述哺乳動物為小鼠，所述單核細胞在步驟(c)中用抗CD3、CD11、CD45、Ly-6G和TER-119的生物素綴合的譜系群體抗體標(biāo)記。
18.權(quán)利要求15的方法，其中所述哺乳動物為人。
19.權(quán)利要求15的方法，其中所述哺乳動物為人，所述單核細胞在步驟(c)中用抗CD2、CD3、CD4、CD11a、Mac-1、CD14、CD16、CD19、CD33、CD38、CD45RA、CD64、CD68、CD86和CD235a的生物素綴合的譜系群體抗體標(biāo)記。
20.權(quán)利要求18的方法，其中所述哺乳動物為人，所述方法包括以下的額外步驟用生物素綴合的CD133抗體標(biāo)記單核細胞，并回收CD133陽性的、譜系陰生的造血干細胞群。
21.權(quán)利要求18的方法，其中所述哺乳動物為人，所述方法包括以下的額外步驟用生物素綴合的CD133抗體標(biāo)記單核細胞，去除CD133陽性細胞，并回收CD133陰性的、譜系陰性的造血干細胞群。
22.權(quán)利要求1的方法，其中所述分離的、譜系陰性的造血干細胞群通過眼內(nèi)注射給予。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述疾病為視網(wǎng)膜變性疾病。
24.權(quán)利要求22的方法，其中所述疾病為局部缺血性視網(wǎng)膜病。
25.權(quán)利要求22的方法，其中所述疾病為血管出血。
26.權(quán)利要求22的方法，其中所述疾病為血管滲漏。
27.權(quán)利要求22的方法，其中所述疾病為脈絡(luò)膜病。
28.權(quán)利要求22的方法，其中所述疾病為年齡相關(guān)性黃斑變性。
29.權(quán)利要求22的方法，其中所述疾病為糖尿病性視網(wǎng)膜病。
30.權(quán)利要求22的方法，其中所述疾病為擬眼組織胞漿菌病。
31.權(quán)利要求22的方法，其中所述哺乳動物為新生哺乳動物。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述疾病為早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變。
33.權(quán)利要求22的方法，其中所述疾病為鐮狀細胞貧血。
34.權(quán)利要求22的方法，其中所述疾病為色素性視網(wǎng)膜炎。
35.權(quán)利要求1的方法，其中所述分離的、譜系陰性的造血干細胞群用有效編碼治療有用肽的基因轉(zhuǎn)染，然后將所述干細胞給予哺乳動物視網(wǎng)膜。
36.權(quán)利要求35的方法，其中所述治療有用肽為抗血管發(fā)生肽。
37.權(quán)利要求35的方法，其中所述抗血管發(fā)生肽為蛋白片段。
38.權(quán)利要求37的方法，其中所述蛋白片段為TrpRS的抗血管發(fā)生片段。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述TrpRS的片段為T2-TrpRS。
40.權(quán)利要求35的方法，其中所述治療有用肽為神經(jīng)營養(yǎng)性物質(zhì)。
41.權(quán)利要求40的方法，其中所述神經(jīng)營養(yǎng)性物質(zhì)選自神經(jīng)生長因子、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-4、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-5、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子、視網(wǎng)膜色素上皮衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子、胰島素樣生長因子、神經(jīng)膠質(zhì)細胞系衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子和腦衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子。
42.權(quán)利要求35的方法，其中所述轉(zhuǎn)染的、譜系陰性的造血干細胞群如下制備(a)由成體哺乳動物抽取骨髓；(b)從所述骨髓中分離多種單核細胞；(c)用針對CD2、CD3、CD4、CD11、CD11a、Mac-1、CD14、CD16、CD19、CD24、CD33、CD36、CD38、CD45、Ly-6G、TER-119、CD45RA、CD56、CD64、CD68、CD86、CD66b、HLA-DR和CD235a的生物素綴合的譜系群體抗體標(biāo)記所述多種單核細胞；(d)從所述多種單核細胞中分離對所述一種或多種譜系表面抗原陽性的單核細胞，并回收含內(nèi)皮祖細胞的譜系陰性的造血干細胞群；和(e)用有效編碼治療有用肽的多核苷酸轉(zhuǎn)染步驟(d)中回收的譜系陰性的造血干細胞。
43.一種保持患有眼疾的哺乳動物視網(wǎng)膜中的視錐細胞的方法，所述方法包括由哺乳動物骨髓分離包含內(nèi)皮祖細胞的譜系陰性的造血干細胞群，隨后將分離的干細胞以足以改善視網(wǎng)膜中的視錐細胞變性的數(shù)量玻璃體內(nèi)注射入哺乳動物眼中。
44.權(quán)利要求43的方法，其中所述干細胞數(shù)量對修復(fù)哺乳動物眼的視網(wǎng)膜損傷有效。
45.權(quán)利要求43的方法，其中所述干細胞數(shù)量對穩(wěn)定哺乳動物眼的視網(wǎng)膜新血管系統(tǒng)有效。
46.權(quán)利要求43的方法，其中所述干細胞數(shù)量對成熟哺乳動物眼的視網(wǎng)膜新血管系統(tǒng)有效。
47.權(quán)利要求43的方法，其中所述疾病為視網(wǎng)膜變性疾病。
48.權(quán)利要求43的方法，其中所述分離的、譜系陰性的造血干細胞群用有效編碼治療有用肽的基因轉(zhuǎn)染，然后將所述干細胞給予哺乳動物視網(wǎng)膜。
49.一種保持患有眼疾的哺乳動物視網(wǎng)膜中的視錐細胞的方法，所述方法包括由哺乳動物骨髓分離包含內(nèi)皮祖細胞的譜系陰性的造血干細胞群，用激光治療視網(wǎng)膜以刺激視網(wǎng)膜中的活化星型膠質(zhì)細胞的局部增殖，隨后將分離的干細胞以足以改善視網(wǎng)膜中的視錐細胞變性的數(shù)量玻璃體內(nèi)注射入哺乳動物眼中。
全文摘要
分離的、哺乳動物的、成體骨髓源的、譜系陰性的造血干細胞群(Lin－HSC)包含能夠拯救眼中的視網(wǎng)膜血管與神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的內(nèi)皮祖細胞(EPC)。優(yōu)選地，分離的Lin－HSC中至少約20％的細胞表達細胞表面抗原CD31。分離的Lin－HSC群用于治療眼血管疾病和改善視網(wǎng)膜中的視錐細胞變性。在一個優(yōu)選實施方案中，Lin－HSC群如下分離抽取成體哺乳動物骨髓；從骨髓中分離多種單核細胞；用針對一種或多種譜系表面抗原的生物素綴合的譜系群體抗體標(biāo)記單核細胞；從多種單核細胞中除去譜系表面抗原陽性的單核細胞，并回收含EPC的Lin－HSC群。還可用治療上有用的基因轉(zhuǎn)染分離的Lin－HSC。通過用激光刺激視網(wǎng)膜中活化星型膠質(zhì)細胞的增殖可增強治療。
文檔編號A61K48/00GK101052305SQ200580037982
公開日2007年10月10日 申請日期2005年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月3日
發(fā)明者M·弗里德蘭德, 大谷篤史, K·達西爾瓦, S·(H·)莫爾諾 申請人:斯克里普斯研究學(xué)院