基于綠色熒光蛋白發(fā)光結(jié)構(gòu)域標記的抗乙肝表面抗原抗體的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種基于綠色巧光蛋白發(fā)光結(jié)構(gòu)域標記的抗 乙肝表面抗原抗體的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球有20億人感染過乙肝病毒。每年有近100萬人死于乙肝 病毒慢性感染引起的肝硬化或肝癌等疾病。乙肝表面抗原化BsAg)定量檢測是評價慢乙肝 治療效果的重要手段。中華醫(yī)學(xué)會發(fā)布的2015年版《慢性乙型肝炎防治指南》指出：對血清 中的乙肝表面抗原進行定量監(jiān)測，可用于預(yù)測疾病進展、抗病毒療效和預(yù)后，停藥后獲得持 久的皿SAg消失為慢乙肝治療的理想終點。
[0003] 目前用于乙肝表面抗原定量檢測方法，均W抗原-抗體識別為基礎(chǔ)?？挂腋伪砻婵?原抗體(anti-HBsAg)在酶標板上分散均勻度和抗體的穩(wěn)定性，直接影響乙肝表面抗原的定 量。然而目前市面上尚沒有評估抗乙肝表面抗原抗體的方法，給乙肝表面抗原的定量檢測 帶來不確定性。
[0004] 傳統(tǒng)方法多采用了綠色巧光蛋白融合表達的方法，即在目的蛋白質(zhì)的碳端或者氮 端連接綠色巧光蛋白實現(xiàn)標記。然而，綠色巧光蛋白體積太大，會待標記的目的蛋白質(zhì)的正 確折疊產(chǎn)生影響。
[0005] 因此，設(shè)計一種體積小相對較小的綠色巧光蛋白發(fā)光結(jié)構(gòu)域(GFP-F-Domain)標記 的抗乙肝表面抗原抗體的制備方法，W保證乙肝表面抗原定量檢測的準確性，是本領(lǐng)域亟 待解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種基于綠色巧光蛋白發(fā)光結(jié)構(gòu)域標記的抗乙肝表面抗 原抗體的制備方法，旨在保證乙肝表面抗原定量檢測的準確性。
[0007] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種基于綠色巧光蛋白發(fā)光結(jié)構(gòu)域標記的抗乙肝表 面抗原抗體的制備方法。所述基于綠色巧光蛋白發(fā)光結(jié)構(gòu)域標記的抗乙肝表面抗原抗體的 制備方法包括如下步驟：
[000引 Sl:合成融合基因 GFP-F-Domain-anti-HBsAg的第一DNA序列；
[0009] S2: W所述第一DNA序列為模板，擴增所述第一DNA序列，獲得第二DNA序列；
[0010] S3:將所述第二DNA序列連接至表達載體祀T2化質(zhì)粒，獲得第一目的克隆組；
[0011] S4:將所述第一目的克隆組分別誘導(dǎo)表達，獲得第一細菌群；
[0012] S5:破碎所述經(jīng)過誘導(dǎo)表達的第一細菌群，進行純化，獲得基于綠色巧光蛋白發(fā)光 結(jié)構(gòu)域標記的抗乙肝表面抗原抗體。
[0013] 優(yōu)選地，所述步驟S3包括如下步驟：
[0014] S31:純化第二DNA序列，獲得第；0臟序列；
[001引 S32:利刷良制性內(nèi)切酶處理所述第立0酷序列，獲得第四DNA序列；
[0016] S33:利用限制性內(nèi)切酶處理表達載體pET2化質(zhì)粒，獲得線性化的祀T22b質(zhì)粒，即 第五DNA序列；
[0017] S34:連接所述第四DNA序列和所述第五DNA序列，獲得第一連接產(chǎn)物；
[0018] S35:將第一預(yù)設(shè)量的所述第一連接產(chǎn)物和第二預(yù)設(shè)量的化21菌株感受態(tài)細胞混 合，轉(zhuǎn)化并篩選培養(yǎng)，獲得陽性克隆組；
[0019] S36:篩選所述陽性克隆組，進行測序驗證，獲得第一目的克隆組。
[0020] 優(yōu)選地，所述步驟S5包括如下步驟：
[0021 ] S51:超聲破碎所述第一細菌群，獲得上清液；
[0022] S52:利用儀離子親和柱純化所述上清液，獲得洗脫液；
[0023] S53:利用蛋白凍干的方法處理所述洗脫液，獲得綠色巧光蛋白發(fā)光結(jié)構(gòu)域標記的 抗乙肝表面抗原抗體。
[0024] 優(yōu)選地，所述步驟S2中擴增所述第一 DNA序列的引物GFP-F-Domain-anti-HBsAg-F 的DNA序列為atgccaacacttgtcactac，引物GFP-F-Domain-anti-皿sAg-R的DNA序列為 cttgacttcagcacggtco
[00巧]優(yōu)選地，所述融合基因 GFP-F-Domain-anti-皿sAg的第一 DNA序列包括位于所述融 合基因 GFP-F-Domain-anti-HBsAg的5'端的編碼綠色巧光蛋白GFP發(fā)光結(jié)構(gòu)域的DNA序列、 位于3 '端的編碼anti-冊sAg蛋白的DNA序列，W及位于5 '端和3 '端之間的連接膚DNA序列。
[0026] 優(yōu)選地，所述融合基因 GFP-F-Domain-anti-HBsAg的第一 DNA序列為單鏈DNA序列。
[0027] 優(yōu)選地，所述限制性內(nèi)切酶為Nde巧日趾Ol。
[00巧]優(yōu)選地，所述第一預(yù)設(shè)量為20化，所述第二預(yù)設(shè)量為10化L。
[0029] 優(yōu)選地，連接所述第四DNA序列和所述第五DNA序列時的溫度為16°C。
[0030] 本發(fā)明提供的基于綠色巧光蛋白發(fā)光結(jié)構(gòu)域標記的抗乙肝表面抗原抗體的制備 方法，將編碼綠色巧光蛋白GFP發(fā)光結(jié)構(gòu)域的DNA序列與編碼anti-皿sAg蛋白的DNA序列融 合在一起;利用GFP的巧光基團標記anti-皿SAg蛋白，根據(jù)檢測到的巧光強度，即可換算出 anti-皿SAg蛋白的含量。本發(fā)明所采用的綠色巧光蛋白發(fā)光結(jié)構(gòu)域由58個氨基酸組成，與 組成GFP的238氨基酸相比，分子量變?yōu)樵瓉淼乃姆种?。本發(fā)明采用體積小相對較小的綠 色巧光蛋白發(fā)光結(jié)構(gòu)域(GFP-F-Domain)標記抗乙肝表面抗原抗體，提高了乙肝表面抗原定 量檢測的準確性。
【附圖說明】
[0031] 圖1為本發(fā)明基于綠色巧光蛋白發(fā)光結(jié)構(gòu)域標記的抗乙肝表面抗原抗體的制備方 法的流程示意圖；
[0032] 圖2為本發(fā)明較佳實施例中步驟S3的細化流程示意圖；
[0033] 圖3為本發(fā)明較佳實施例中步驟S5的細化流程示意圖。
【具體實施方式】
[0034] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明，W下實施例是對本發(fā)明的解 釋，本發(fā)明并不局限于W下實施例。
[0035] 在本發(fā)明實施例中，乙肝表面抗原的英文縮寫為皿sAg，是乙肝病毒基因編碼的分 泌蛋白；抗乙肝表面抗原抗體的英文縮寫為anti-HBsAg，是特異識別乙肝表面抗原的抗體； GFP即綠色巧光蛋白（Green Fluorescent Protein) ;dNTPs為脫氧核糖核巧S憐酸;pET22b 質(zhì)粒為一種常用于基因工程的質(zhì)粒，為目的基因的表達載體;BL21菌株，是一種常用的具有 蛋白質(zhì)表達功能的大腸桿菌菌株。
[0036] 參照圖1，圖1為本發(fā)明基于綠色巧光蛋白發(fā)光結(jié)構(gòu)域標記的抗乙肝表面抗原抗體 的制備方法的流程示意圖。所述基于綠色巧光蛋白發(fā)光結(jié)構(gòu)域標記的抗乙肝表面抗原抗體 的制備方法包括如下步驟：
[0037] Sl:合成融合基因 GFP-F-Domain-anti-HBsAg的第一DNA序列；
[003引具體地，所述融合基因 GFP-F-Domain-anti-皿sAg的第一 DNA序列包括位于所述融 合基因6?？诙?00111曰111-曰11*1-冊3結(jié)的5'端的編碼綠色巧光蛋白6?？诎l(fā)光結(jié)構(gòu)域6?？诙?Domain的DNA序列、位于3 '端的編碼anti-冊sAg蛋白的DNA序列，W及位于5 '端和3 '端之間 的連接膚DNA序列。所述GFP-F-Domain DNA序列如核巧酸序列表所示;所述GFP-F-Domain蛋 白質(zhì)序列如氨基酸序列表所示。
[0039] S2: W所述第一DNA序列為模板，擴增所述第一DNA序列，獲得第二DNA序列；
[0040] 具體地，在步驟Sl中，所述融合基因 GFP-F-Domain-anti-皿sAg的第一 DNA序列為 單鏈DNA序列。W該第一DNA序列為模板，利用聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR)，擴增所述融合基因 GFP-F-Domain-anti-HBsAg。所述PCR的擴增體系為50化，包括:無菌水40化、10倍濃度的緩 沖液化L、質(zhì)粒DNA模板化L，PCR擴增時所需引物的名稱為GFP-F-Domain-anti-皿sAg-F和 GFP-F-Domain-anti-皿sAg-R，所需引物的體積為各化L，IOmM dNTPs化L，高保真酶化L。本 發(fā)明中各步驟PCR反應(yīng)體系均按照該體系進行。所述擴增體系，在PCR擴增儀上進行擴增， PCR反應(yīng)擴增的方法為:94°C，4分鐘，預(yù)變性;94°C，1分鐘，變性;58°C，30秒，退火;72°C，3分 鐘，延伸;重復(fù)變性-退火-延伸步驟26次后，72°C保溫5分鐘，然后降溫到16°C，完成反應(yīng)后， 獲得第二DNA序列。該第二DNA序列為雙鏈DNA。本實施例中，所述PCR擴增所需引物序列如表 1所示。
[0041 ] 表1PCR擴增所需引物序列 「rwvn1
L0043J S3:將所還第二DNA序列連援全表達載體祀T2化妨粒，獲得第一目的克隆組；
[0044] 祀T2化質(zhì)粒購自Novagen公司，是常見的用于基因克隆和蛋白質(zhì)表達的質(zhì)粒。在基 因工程實驗中，pET22b質(zhì)粒是大腸桿菌常用的表達載體，該質(zhì)粒上帶有Ampicillin(氨節(jié)青 霉素)抗性基因，是T7啟動子系列中的一員，該質(zhì)粒的復(fù)制子是化i，該質(zhì)粒大小是5500bp， 標簽是N-pelB信號膚，C-His，可轉(zhuǎn)化進大腸桿菌中大量復(fù)制(37°C，LB)。本步驟采用基因工 程手段完成。
[0045] 具體地，參照圖2,圖2為本發(fā)明較佳實施例中步驟S3的細化流程示意圖。所述步驟 S3包括如下步驟：
[0046] S31:純化第二DNA序列，獲得第SDNA序列；
[0047]具體地，可利用北京天根公司生產(chǎn)的商品化PCR純化試劑盒，純化所述第二DNA序 列，除去其中的鹽分及引物二聚體，獲得第SDNA序列；
[004引S32:利用限制性內(nèi)切酶處理所述第SDNA序列，獲得第四DNA序列；
[0049] 具體地，利用化kara公司生產(chǎn)的限制性內(nèi)切酶Nde巧日趾OI處理第SDNA序列；第S DNA序列酶切的反應(yīng)體系為50化，包括:第SDNA序列39化，Nde巧日趾Ol各化L，10倍濃度緩沖 液化L反應(yīng)條件為37°C水浴解育4小時；再利用北京天根公司生產(chǎn)的商品化PCR純化試劑 盒，純化經(jīng)Nde巧日化OI處理后的第SDNA序列，獲得第四DNA序列。
[0050] S33:利用限制性內(nèi)切酶處理表達載體pET2化質(zhì)粒，獲得線性化的祀T22b質(zhì)粒，即 第五DNA序列；
[0化1 ] 具體地，表達載體pET2化質(zhì)粒酶切的反應(yīng)體系也為50化，包括:pET22b質(zhì)粒39化， Nde巧日化Ol各化L，10倍濃度緩沖液扣レ反應(yīng)條件為:37°C水浴解育4小時;再利用北京天根 公司生產(chǎn)的商品化的膠回收試劑盒進行純化，獲得線性化的第