基于afp抗原的afp納米抗體a83的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及特異性結(jié)合甲胎蛋白（Alpha-Fetal Protein，AFP)的納米抗體（單域重鏈抗體，Variable domain of heavy chain of heavychain antibody, VHH)及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 甲胎蛋白是一種糖蛋白，由胎肝或成人肝臟產(chǎn)生，常見(jiàn)于在孕婦和嬰兒的血液中， 但在健康成人血液中含量很少，目前主要用于原發(fā)性肝癌的早期診斷、療效評(píng)估和預(yù)后評(píng) 價(jià)，是原發(fā)性肝癌（PHC)重要的血清學(xué)標(biāo)志物。甲胎蛋白作為一種標(biāo)志物在多種腫瘤中，尤 其肝細(xì)胞癌（HCC)中有著過(guò)度表現(xiàn)。隨著對(duì)AFP基因結(jié)構(gòu)及功能的進(jìn)一步深入研究，其在 HCC的早期診斷及生物學(xué)治療中越來(lái)越重要的作用。在其他腸胃管腫瘤如胰腺癌或肺癌及 肝硬化等患者也出現(xiàn)不同程度的升高。當(dāng)肝細(xì)胞發(fā)生癌變時(shí)，會(huì)產(chǎn)生這種AFP，而且隨著病 情惡化它在血清中的含量會(huì)急劇增加，甲胎蛋白就成了診斷原發(fā)性肝癌的一個(gè)特異性臨床 指標(biāo)。
[0003] 臨床檢測(cè)患者AFP的常規(guī)方法有放射性免疫法（RIA)，酶免疫法（EIA)和膠體金 法，目前化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)技術(shù)（CLIA)因其具有反應(yīng)快、靈敏度高、準(zhǔn)確度高，標(biāo)記物穩(wěn) 定、對(duì)人體無(wú)放射性或毒性危害且特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，是目前為止公認(rèn)最好的微量定量檢測(cè) 方法。在檢測(cè)研究性實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，需要大量的抗體應(yīng)用于新型的、高效的檢測(cè)方法的研究。納 米抗體具備了特異的抗原結(jié)合能力及高親和力，顯示出了獨(dú)特性質(zhì)及在研究領(lǐng)域的巨大應(yīng) 用潛能。且抗體以及抗原標(biāo)準(zhǔn)品非常昂貴，而且有些毒素具有危險(xiǎn)性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明利用噬菌體展示技術(shù)，從駝源免疫的單域重鏈抗體庫(kù)中篩選能與靶分子 (AFP抗原）特異性結(jié)合的單域重鏈抗體（VHH)噬菌體克隆，以VHH作為AFP抗體應(yīng)用于免 疫學(xué)分析檢測(cè)領(lǐng)域。該方法篩選得到的VHH具有與AFP免疫反應(yīng)特性，且特異性好、高親 和力，可應(yīng)用于AFP的免疫學(xué)檢測(cè)。本發(fā)明以AFP標(biāo)準(zhǔn)品為靶分子，將靶分子固相包被于酶 標(biāo)板上，投入駝源免疫的單域重鏈抗體庫(kù)進(jìn)行親和淘選，獲得了一種抗AFP納米抗體，具有 SEQ ID N0. :1所示的氨基酸序列。其氨基酸序列的頂GT編號(hào)和結(jié)構(gòu)域劃分如圖1所示。
[0005] 本發(fā)明所提及的AFP納米抗體（VHH)包括四個(gè)框架區(qū)（Framework region, FR)和 三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)（Complementarity-determining region, CDR)。其中，框架區(qū)（FR1-FR4) 分別選自 SEQ ID N0. :2, SEQ ID N0. :4, SEQ ID N0. :6 和 SEQ ID N0. :8,互補(bǔ)決定區(qū) (CDR1-CDR3)分別選自 SEQ ID NO. :3，SEQ ID NO. :5 和 SEQ ID NO. :7?？蚣軈^(qū)結(jié)構(gòu)相對(duì)保 守，主要起著維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用；互補(bǔ)決定區(qū)結(jié)構(gòu)相對(duì)多樣化，主要負(fù)責(zé)抗體的識(shí)別。
[0006] 本發(fā)明提供一種蛋白質(zhì)或多肽，包含SEQ ID NO. :2，SEQ ID NO. :4，SEQ ID N0. :6 和SEQ ID NO. :8中的一個(gè)或兩個(gè)及以上的氨基酸序列，且至少與其中一個(gè)的氨基酸序列有 90%同源性。
[0007] 本發(fā)明提供一種蛋白質(zhì)或多肽，包含SEQ ID NO. :3, SEQ ID NO. :5和SEQ ID NO. :7中的一個(gè)或兩個(gè)及以上的氨基酸序列，且至少與其中一個(gè)的氨基酸序列有80%同源 性。
[0008] 本發(fā)明還涉及編碼AFP抗體氨基酸序列的核苷酸，其序列為SEQ ID N0. :9。
[0009] 本發(fā)明提及的基于AFP結(jié)合的納米抗體可通過(guò)噬菌體擴(kuò)增或基因工程重組表達(dá) 的方式進(jìn)行大量制備。噬菌體擴(kuò)增是指將展示有AFP納米抗體（VHH)的噬菌體，通過(guò)生物擴(kuò) 增的方式，大量繁殖生產(chǎn)展示有AFP的納米抗體（VHH)的噬菌體粒子?；蚬こ讨亟M表達(dá) 的方式是指將編碼納米抗體的基因，通過(guò)克隆至表達(dá)載體，以蛋白表達(dá)的形式進(jìn)行AFP抗 體的大量制備。
[0010] 本發(fā)明還涉及所述AFP納米抗體在非疾病診斷治療目的免疫學(xué)檢測(cè)分析中的應(yīng) 用。免疫學(xué)檢測(cè)的類型包括酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)、膠體金免疫層析、免疫斑點(diǎn)雜交等基于抗 原-抗體特異性反應(yīng)的免疫學(xué)分析檢測(cè)類型。
[0011] 本發(fā)明AFP納米抗體在應(yīng)用時(shí)，可以通過(guò)噬菌體擴(kuò)增獲得的展示有AFP納米抗體 的噬菌體粒子直接用于分析檢測(cè)以及將AFP納米抗體經(jīng)過(guò)原核生物或真核生物表達(dá)后以 蛋白的形式進(jìn)行免疫學(xué)檢測(cè)分析。
[0012] 本發(fā)明還涉及AFP納米抗體在非疾病診斷治療目的免疫學(xué)檢測(cè)分析中的應(yīng)用，具 體為AFP納米抗體在制備吸附AFP的納米抗體試劑中的應(yīng)用。比如，可以將本發(fā)明AFP納 米抗體制成免疫親和柱，吸附抓取AFP，富集，以供進(jìn)一步的研究等。
[0013] 本發(fā)明所述的氨基酸序列可以作為前體，通過(guò)隨機(jī)或定點(diǎn)突變技術(shù)進(jìn)行改造，能 夠獲得性質(zhì)（親和力、特異性和穩(wěn)定性等）更好的突變體。
[0014] 本發(fā)明中所敘述的一些術(shù)語(yǔ)具有如下含義：
[0015] 同源性：描述兩個(gè)或多個(gè)氨基酸序列的相似程度，第一個(gè)氨基酸序列和第二個(gè)氨 基酸序列之間的同源性百分比可以通過(guò)【第一氨基酸序列中與第二氨基酸序列中相應(yīng)位置 處的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的數(shù)量】除以【第一個(gè)氨基酸序列中氨基酸總數(shù)】再乘以 【100%】來(lái)計(jì)算，其中第二氨基酸序列中的某個(gè)氨基酸的缺失、插入、替換或添加（與第一 氨基酸相比）被認(rèn)為是有差別。另外，同源性百分比也可以利用已知的用于序列比對(duì)的計(jì) 算機(jī)運(yùn)算程序（如：NCBI Blast)獲得。
[0016] 結(jié)構(gòu)域：蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的基本結(jié)構(gòu)單位，通常具有一定的功能。
[0017] IMGT編號(hào)：IMGT數(shù)據(jù)庫(kù)（The International ImMunoGeneTics Database)中的一 種已經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的抗體氨基酸序列編號(hào)方法。具體編號(hào)方法可以參考文獻(xiàn)（Ehrenmann，F(xiàn).，Q. Kaas，et al. (2010). "IMGT/3Dstructure-DB and IMGT/DomainGapAlign:a database and a tool for immunoglobulins or antibodies,T cell receptors,MHC, IgSF and MhcSF. ^Nucleic Acids Res 38 (Database issue):D301-307. Lefranc, M. P. , C. Pommie, et al. (2003) ? 〃IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains. ^Dev Comp Immunol 27(1) : 55-77.)中的描述。
[0018] 密碼子（codon):亦稱三聯(lián)體密碼（triplet code)，指對(duì)應(yīng)于某種氨基酸的核苷 酸三聯(lián)體。在轉(zhuǎn)譯過(guò)程中決定該種氨基酸插入生長(zhǎng)中多肽鏈的位置。
[0019] 本發(fā)明的有益效果是：納米抗體分子結(jié)構(gòu)獨(dú)特，分子量小，穩(wěn)定易表達(dá)，且特異性 好，可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)的單克隆抗體，避免了繁瑣的制備過(guò)程，而且節(jié)約成本。本發(fā)明制備的AFP 抗體可以廣泛用于AFP基礎(chǔ)研究，醫(yī)學(xué)診斷和檢測(cè)，抗體藥物開(kāi)發(fā)等。本發(fā)明的納米抗體方 法具有普遍適用性，可用于其他小分子物質(zhì)模擬抗原的篩選和制備，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1為AFP納米抗體（VHH)的氨基酸編號(hào)及結(jié)構(gòu)域示意圖。
[0021] 圖2為圖1 AFP雙抗夾心ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線及CAE、NSE、CA-125交叉反應(yīng)曲線。噬 菌體克隆檢測(cè)AFP的最低檢測(cè)限分別為1. 21ng/mL，線性關(guān)系分別為0. 9831，線性范圍均為 l_200ng/mL〇
【具體實(shí)施方式】
[0022] 實(shí)施例1.駝源免疫單域重鏈抗體庫(kù)的構(gòu)建
[0023] 1)羊駝的免疫：
[0024] 選取一只健康成年羊駝，采取背部皮內(nèi)、皮下多點(diǎn)注射的方式進(jìn)行免疫，初次免 疫，弗式完全佐劑，免疫原劑量lmg ;第28天二次免疫，弗式不完全佐劑，免疫原劑量0. 5mg， 第49天三免，弗式不完全佐劑，免疫原劑量0. 25mg ;第70天四免，弗式不完全佐劑，免疫原 劑量0. 25mg。第三次加強(qiáng)免疫后第七天，采集羊駝外周血，用于構(gòu)建噬菌體展示文庫(kù)。
[0025] 2)駝源白細(xì)胞的分離：在離心管中加入淋巴細(xì)胞分離液，再加入血液樣品，700g 離心20min ;小心吸取中間層懸浮的白細(xì)胞至一新的離心管中，加入1/2體積的PBS，800g 離心15min ;棄上清，用PBS洗下離心管壁上的白細(xì)胞，850g離心10min ;棄上清，300 yL PBS重懸白細(xì)胞并計(jì)數(shù)；以體積比1 :10加入裂解液（RNAiso)保存?zhèn)溆谩?br>[0026] 3)總RNA提?。合蛏鲜隽呀庖褐屑尤?/5體積的氯仿，劇烈震蕩15s使其充分乳 化，室溫靜置5min ;4°C 12000g離心15min，取上清轉(zhuǎn)移至另一新鮮離心管中；加入等體積 的異丙醇，充分混勻后室溫靜置l〇min ;4°C 12000g離心10min，棄上清，緩慢加入75%乙醇 lmL，小心洗滌離心管管壁；4°C，12000g離心5min后棄去乙醇；室溫干燥沉淀5min，加入適 量的RNase-free水溶解沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于-80°C保存。
[0027] 4)cDNA的合成：將反轉(zhuǎn)錄用的引物、dNTP Mixture和模板RNA混合，65°C 5min，迅 速冰浴。具體配制如下：
[0028]
[0029] 然后在上述Microtube中配置下列反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液：
[0030]
[0031] PCR儀上按下列條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：42°C 30min，50°C 30min，70°C lOmin。PCR產(chǎn) 物于-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0032] 5)抗體可變區(qū)基因擴(kuò)增：將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。
[0033] 第一輪 PCR :
[0034]
[0035] PCR 反應(yīng)條件：94°C 4min ;98。(： 10s，55。(： 15s，72°C 45s，30cycles ;72°C 7min。
[0036] 采用試劑盒回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，適當(dāng)稀釋后作為第二輪PCR的模板。
[0037] 第二輪 PCR :
[0038]
[0039]
[0040] PCR反應(yīng)條件：94 °C 4min ;98 °C 10s，50 °C 15s，72 °C 45s，5cycles ;98 °C 10s， 68°C 40s，30cycles ;72°C 7min。
[0041] 6)文庫(kù)構(gòu)建：
[0042] A. VHH編碼基因及載體的雙酶切
[0043] 分別采用Sfi I和Not I酶對(duì)VHH編碼基因和pHENl載體進(jìn)行雙酶切。
[0044] B?酶切后產(chǎn)物的連接
[0045] 將載體pHENl和VHH片段混勻（摩爾比1 : 5)，于16°C連接12h。先后加入 5iiL(l/10量）