專(zhuān)利名稱(chēng)：血管新生治療方法
血管新生治療方法技術(shù)領(lǐng)域(相關(guān)申請(qǐng)案)本發(fā)明請(qǐng)求美國(guó)優(yōu)先權(quán)，2004年8月20日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)案 60/603,016，名稱(chēng)為藉由血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及乳糖基神經(jīng)酰胺修飾血 管新生之治療方法，其所教示內(nèi)容以參考資料合幷于本文。背景技術(shù)：
血管新生，當(dāng)胚胎發(fā)育及創(chuàng)傷愈合時(shí)需要由存在一個(gè)該毛細(xì)血管 芽生式(sprouting),血管新生關(guān)于一系列的步驟，其中內(nèi)皮細(xì)胞退化 它們的局部基底薄膜(basement membrane)。接著，該內(nèi)皮細(xì)胞遷移進(jìn) 入該結(jié)締組織基質(zhì)、增殖幷最后分化進(jìn)入毛細(xì)管襻(capillary loop)。 當(dāng)在肢體及心肌缺血的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和患者中已知VEGF增大測(cè)肢循環(huán)血流 時(shí)，VEGF是血管新生的媒介物而且是有重要目的的。31再者，VEGF誘導(dǎo) 血管形成已經(jīng)被文件證明在動(dòng)脈粥樣硬化癥、糖尿病視網(wǎng)膜病變和腫 瘤轉(zhuǎn)移。3—5雖然大部分研究已經(jīng)集中在血管新生VEGF的角色上，已知少部分 是關(guān)于基于關(guān)鍵表達(dá)型變化(phenotypic change)的機(jī)制。尤其，中性 鞘糖脂(glycosphingolipid)的角色仍然未知。乳糖基神經(jīng)酰胺是中性 鞘糖脂家族的成員幷且藉由提供作為該神經(jīng)結(jié)苷脂，例如單唾液酸神 經(jīng)節(jié)糖苷脂(monosialoganglioside)GM3、雙唾液酸神經(jīng)節(jié)糖苷脂 (disialoganglioside)GD3 、 禾口 globotriosyl 神經(jīng)酷胺 (globotriosylceramide， Gb3)與硫酸乳糖基神經(jīng)酰胺(LacCer)生物合 成的前體，因此扮演重要的角色。當(dāng)這些中性鞘糖脂被顯示賦予不同 的生物功能，乳糖基神經(jīng)酰胺(LacCer)藉由自身的能力，已關(guān)于細(xì)胞 增殖、細(xì)胞粘附及細(xì)胞遷移；這是血管新生全體地需求事件。最重要 的是，發(fā)現(xiàn)LacCer誘導(dǎo)PECAM-l基因/蛋白質(zhì)表達(dá)22;開(kāi)始血管新生的前 提條件。1(U1由舊有血管(血管新生(angiogenesis)和該內(nèi)皮細(xì)胞(血管發(fā)
生)(vasculogenesis)分化)的該新毛細(xì)血管芽生式是健康與疾病的表 達(dá)型事件1。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)已被認(rèn)為與血官發(fā)生與血關(guān)新生 有關(guān)2。 VEGF異常的表達(dá)已被記載于許多血管病理學(xué)，例如炎癥、糖尿 病幷發(fā)癥、心血管疾病及腫瘤轉(zhuǎn)移3。 VEGF結(jié)合自身受體KDR/Flk-1，在 生理學(xué)條件和人類(lèi)動(dòng)脈粥樣硬化癥去媒介對(duì)于血官新生的影響4—6。血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子(PECAM-1/CD31是本質(zhì)地在內(nèi)皮細(xì)胞中 表達(dá)整合蛋白。此外，PECAM-1表達(dá)于血小板、單核細(xì)胞、中心粒細(xì)胞 和特定T細(xì)胞亞群8。近來(lái)的研究透露PECAM-1在血管新生和體外內(nèi)皮細(xì) 胞遷移可能的角色u。例如，人類(lèi)內(nèi)消旋內(nèi)皮瘤(mesoendothelioma) 細(xì)胞系(REN)的植入(PECAM-1的缺陷)無(wú)法誘導(dǎo)裸鼠血管新生。相對(duì)地， REN細(xì)胞'。過(guò)度表達(dá)的PECAM-1確實(shí)誘導(dǎo)這些裸鼠血管新生11。進(jìn)一步地， 使用單克隆PECAM-1抗體抑制小鼠腫瘤血管新生12。最近，0' Brein等 人于研究揭露PECAM-1在血管新生的重要角色13。他們發(fā)現(xiàn)人類(lèi)全長(zhǎng) PECAM-1 cDNA的轉(zhuǎn)染在REN細(xì)胞中免疫-酪氨酸相關(guān)的抑制基序(ITIM) 帶有突變，抑制這些細(xì)胞遷移對(duì)VEGF的反應(yīng)和無(wú)法在該活體外血管新 生試驗(yàn)形成管子(tube)。乳糖基神經(jīng)酰胺(LacCer)是鞘糖脂(GSL)家族的成員。LacCer普遍 地存在于哺乳動(dòng)物組織幷在作為錯(cuò)合物GSLs合成前體扮演重要角色14。 此外，LacCer已被認(rèn)為與關(guān)鍵表達(dá)型變化有關(guān)，例如哺乳類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞 增殖與粘附15—21。近來(lái)，前單核(pro-monocytic)細(xì)胞系(U-937)我們已 表明藉由吸收PKCa和e及PLA2， LacCer刺激該P(yáng)ECAM-l的轉(zhuǎn)錄表達(dá)和 蛋白質(zhì)表達(dá)22。在帶有家族性高膽固醇血癥23患者血漿中，以及在死于 心肌梗死24，患者動(dòng)脈中的鈣化和無(wú)鈣化血小板已報(bào)導(dǎo)出LacCer的提高 水平。同樣地，在帶有心血管疾病26患者身上以及動(dòng)脈粥樣硬化癥的動(dòng) 物模型，例如apoE基因敲除小鼠27，指出可溶性PECAM-1的血漿水平提 咼°由于PECAM-1表達(dá)可能是VEGF誘導(dǎo)血管發(fā)生以及血管新生的前提 條件，還有由于LacCer可上調(diào)PECAM-l在U937細(xì)胞的表達(dá)，我們?cè)?VEGF誘導(dǎo)PECAM-1表達(dá)和在人類(lèi)內(nèi)皮細(xì)胞血管新生上將LacCer可能成 功扮演第二信號(hào)角色合理化。在本申請(qǐng)案，我們揭露LacCer在媒介 VEGF誘導(dǎo)PECAM-1表達(dá)以及HUVECs細(xì)胞的血管新生是關(guān)鍵的。
因此，所述技術(shù)領(lǐng)域中有一需求，在找尋診斷方法、治療和針對(duì) 血管新生篩選新治療方法。因此， 一般希望有治療癥狀或藉由乳糖基神經(jīng)酰胺調(diào)整疾病的方法，例如抑制GalT-V、 VEGFR、 VEGF、 PECAM-1 或其他途徑成員去治療或預(yù)防血管新生。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明包含治療及預(yù)防關(guān)于乳糖基神經(jīng)酰胺(LacCer)疾病的方 法。尤其，我們發(fā)現(xiàn)的治療，包含改變一個(gè)或多個(gè)LacCer合成酶 (GalT-V)、 PECAM1、 VEGFR或相關(guān)的途徑成員活性，以治療患有或易感 染關(guān)于由乳糖基神經(jīng)酰胺造成且/或貢獻(xiàn)的血管新生疾病或癥狀的對(duì) 象。本發(fā)明也關(guān)于偵測(cè)及分析化合物治療該些癥狀能力的方法。更具體而言，本發(fā)明提供治療關(guān)于血管新生增殖疾病的方法，且 關(guān)于血管新生，例如癌癥、冠狀動(dòng)脈心臟病、腫瘤轉(zhuǎn)移、發(fā)炎血管疾 病、炎性疾病、缺血-再灌注損傷(ischemia-r印erfusion injury)、 高血壓或糖尿病。此外，本發(fā)明提供治療關(guān)于血管新生相關(guān)組織退化 疾病，包括例如，胎兒子宮內(nèi)成長(zhǎng)、系統(tǒng)性硬化癥、創(chuàng)傷愈合、缺血、 再灌注損傷、糖尿病、冠狀動(dòng)脈病、腫瘤生長(zhǎng)。在一態(tài)樣，本文提供治療患有或易感染血管新生對(duì)象的方法，包 括將治療有效量的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)途徑抑制劑投與對(duì)象。在一實(shí)施例，該血管新生是關(guān)于癌癥、冠狀動(dòng)脈心臟病、腫瘤轉(zhuǎn) 移、發(fā)炎血管疾病、或糖尿病。在另一實(shí)施例，該VEGF途徑包括一個(gè)或多個(gè)乳糖基神經(jīng)酰胺合成 酶(LacCer合成酶，例如GalT-V/VI)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、血 管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(VEGFR)、血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子1 (PECAM-1)、 磷脂酶A2 (PLA2)及乳糖基神經(jīng)酰胺(LacCer)的介入或相互作用。根據(jù)一實(shí)施例，方法可能進(jìn)一步包括識(shí)別該對(duì)象所需的血管新生 治療。在一相關(guān)實(shí)施例，該對(duì)象所需治療的識(shí)別，包括癌癥、冠狀動(dòng) 脈心臟病、腫瘤轉(zhuǎn)移、發(fā)炎血管疾病、缺血-再灌注損傷、高血壓、或 糖尿病的診斷。在另一實(shí)施例，VEGF抑制劑及/或活化劑藉由包覆植入型醫(yī)學(xué)裝置 投與，例如生物降解生物高分子支架。在另一實(shí)施例，VEGF抑制劑及/ 或活化劑是經(jīng)由支架或?qū)Ч芡杜c。
根據(jù)另一態(tài)樣，確認(rèn)該VEGF途徑抑制劑或活化劑(例如，調(diào)整劑) 降低對(duì)象血管新生的治療能力的方法，是提供且包括對(duì)對(duì)象實(shí)施侵入性手術(shù)；對(duì)對(duì)象投與VEGF途徑抑制劑；及測(cè)試對(duì)象血管生長(zhǎng)。在一實(shí)施例，使用如腫瘤異體移植的動(dòng)物模型去確認(rèn)該VEGF途徑 抑制劑或活化劑的治療能力。在另一態(tài)樣，呈現(xiàn)了確認(rèn)該候選VEGF途徑抑制劑治療關(guān)于血管新 生疾病或癥狀的治療能力的方法，幷包括提供細(xì)胞群；將該細(xì)胞接觸 候選組合物，并確認(rèn)該候選組合物對(duì)一個(gè)或多個(gè)的PECAM-1表達(dá)、 GalT-V表達(dá)、管子形成(例如，體外血管新生試驗(yàn))、或LacCer水平的 影響。根據(jù)一實(shí)施例，方法進(jìn)一步地包括，在該細(xì)胞接觸該候選化合物 前將該細(xì)胞接觸VEGF。根據(jù)另一態(tài)樣，治療患有或易感染組織退化對(duì)象的方法，包括對(duì) 該對(duì)象投與有效量的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)途徑活化劑。在一實(shí)施例，該組織退化是關(guān)于胎兒子宮內(nèi)生長(zhǎng)、系統(tǒng)系硬化癥、 創(chuàng)傷愈合、缺血、再灌注損傷、糖尿病、冠狀動(dòng)脈病、腫瘤生長(zhǎng)。在一態(tài)樣中，提供確認(rèn)該VEGF途徑活化劑降低對(duì)象組織退化的治 療能力的方法，幷包括在對(duì)象體內(nèi)投與組織退化的預(yù)治療水平；對(duì)該對(duì)象投與治療有效量的VEGF途徑活化劑；幷確認(rèn)對(duì)象組織退 化的后治療水平。根據(jù)一態(tài)樣，組織退化的減少表明該VEGF途徑活化劑是有效的。 根據(jù)相關(guān)的態(tài)樣，該組織退化的預(yù)治療和后治療水平是在有病組織內(nèi) 確認(rèn)。在相關(guān)實(shí)施例，該有病組織是一個(gè)或多個(gè)的胎兒、肺臟、心臟、 肝臟、脈管系統(tǒng)(例如，心室微血管形成增加了側(cè)肢循環(huán)血流至該心臟 或其他組織)或神經(jīng)組織。在一實(shí)施例，該組織退化水平是藉由PECAM-1表達(dá)、GalT-V表達(dá)、 管子形成、或LacCer水平確認(rèn)。在另一態(tài)樣，提供的是供確認(rèn)治療組織退化的該候選VEGF途徑活 化劑的治療能力，包括提供細(xì)胞群；將該細(xì)胞接觸候選組合物，并確 認(rèn)該候選組合物對(duì)一個(gè)或多個(gè)的PECAM-1表達(dá)、GalT-V表達(dá)、管子形
成或LacCer水平的影響，其中一個(gè)或多個(gè)PECAM-1表達(dá)、GalT-V表達(dá)、 管子形成、或LacCer水平的增加表明該候選組合物可能是有效的。。在一態(tài)樣，該VEGF途徑抑制劑和活化劑組合投與的方法去治療血 管新生相關(guān)癥狀。在一實(shí)施例，生物降解生物高分子可能以抑制劑和 活化劑的組合包覆著幷以時(shí)間依賴(lài)方法投與。在另一實(shí)施例，該抑制 劑及/或活化劑可能涂布在奈米顆粒上以供用于單一療法或組合療法。本發(fā)明的治療對(duì)于治療和避免不期望的血管新生是尤其有效的。 參照下列例子中提出的結(jié)果。本發(fā)明的治療方法， 一般包括將治療有效量的化合物投與對(duì)象， 尤其是哺乳動(dòng)物，例如靈長(zhǎng)類(lèi)，特別是人類(lèi)，幷可改變下列的活性， 例如抑制LacCer合成酶(GalT-V/VI)、 PECAM1、 VEGFR、 VEGF、 PLA2或相關(guān)途徑成員，治療患有或易感染由血管新生造成或貢獻(xiàn)癥狀的患者。 較佳地，投與的化合物藉由在標(biāo)準(zhǔn)體外細(xì)胞增殖試驗(yàn)中至少約15%或 25%抑制血管新生。這試驗(yàn)的例子在下面敘述。普遍較佳地是該投與的 化合物在下面敘述的標(biāo)準(zhǔn)體外VEGF途徑試驗(yàn)中使用至少約500li M的 IC5。，更佳地是少于或約100pM的ICs。，在更好地是在下面敘述的標(biāo)準(zhǔn) 體外VEGF途徑試驗(yàn)中使用少于或約l-10ixM的IC5。?？梢种艷alT-V活性 的該化合物通常在本文是指「VEGF途徑抑制劑」或其他相似名稱(chēng)。 適合用于本發(fā)明血管新生抑制治療方法的化合物，包含如通式I : ohr\n-ch2-ch-ch-r3 i Inh oc-r2其中R和R'是獨(dú)立地選自氫或有取代或未取代的直鏈或支鏈CrC6烷基所組成的群組，且進(jìn)一步地其中R和W可能被連接形成5、 6或7-元 環(huán)；R2是選自有或沒(méi)有1至3個(gè)雙鍵的直鏈或支鏈Ce-C3。烷基所組成的 群組；且R3是選自有或沒(méi)有1至3個(gè)雙鍵的直鏈或支鏈C6—C2。烷基或芳基或 取代的芳基所組成的群組；其中該取代基是鹵素、C,-C4垸氧基、亞甲
二氧基、C廠C4巰基、氨基或取代的氨基，該氨基取代基可能是d-C4烷 基、或其醫(yī)藥上可接受的鹽。在特定實(shí)施例，R和R'被連接形成5、 6或7-元環(huán)。相關(guān)實(shí)施例中， R和Ri被連接去形成吡咯烷基、嗎啉基、硫代嗎啉基、哌啶基、或氮雜環(huán)庚基環(huán)。用于本發(fā)明治療方法特別好的抑制劑化合物是一個(gè)或多個(gè)的1-苯基-2-癸酰氨基-3-嗎啉基-l-丙醇；1-苯基-2-十六酰氨基-3-嗎啉基-l-丙醇；1-苯基-2-十六酰氨基-3-哌啶基-l-丙醇； 1-苯基-2-十六酰氨基-3-吡咯烷基-l-丙醇；1-嗎啉基-2-十六酰氨基-3-羥基十八碳-4， 5-烯；1-吡咯烷基-2-十六酰氨基-3-羥基十八碳-4， 5-烯；(1R， 2R)-1-苯基 -2-癸酰氨基-3-嗎啉基-1-丙醇(D-PDMP);或反式-(2R， 3R)-1-吡咯烷 基-2-十六酰氨基-3-羥基十八碳-4，5-烯、氯化白屈菜紅堿 (chelerythrinbe)。用于本發(fā)明方法特別好的抑制劑化合物是(1R， 2R)-卜苯基-2-癸 酰氨基-3-嗎啉基-1-丙醇(D-PDMP)、反式-(2R， 3R) -1-吡咯烷基_2-十 六酰氨基-3-羥基十八碳-4， 5-烯、氯化白屈菜紅堿、G56976、 G56850、 溴代苯甲酰甲基溴(BMB)、甲基-花生四?；?氟磷酸酯(MAFP)、吡咯烷 基二硫代羧酸(pyrrolidine carbodithioicacid)、氯化二亞苯基碘及 N-乙酰基-L-半胱氨酸。其他適合的抑制劑包含PECAM-1、 LacCer、或VEGF途徑抗體。還 包含的是VEGF途徑肽和RNAi分子。適合用于本發(fā)明活化血管新生治療方法的化合物，包含如下通式 I的L異構(gòu)物OHR\N-CH2-CH-CH-R3 I IO-C-R2其中R、 R1 、 R2和R3如上所述。
其他適合的VEGF途徑抑制劑或活化劑化合物可容易地藉由樣品測(cè)試識(shí)別，例如體外候選抑制劑化合物測(cè)試相較于抑制或活化該VEGF途 徑活性能力的控制組，例如抑制或活化至少一個(gè)途徑成員的活性至少 多于控制組10%。本發(fā)明進(jìn)一步關(guān)于偵測(cè)和分析化合物抑制或活化VEGF途徑與表達(dá) 治療或避免上述癥狀的治療能力的方法。較佳的偵測(cè)和分析方法，包 含在體外和體內(nèi)試驗(yàn)二者去確認(rèn)該試劑調(diào)整VEGF反應(yīng)細(xì)胞的治療能 力。根據(jù)本發(fā)明較佳的體外偵測(cè)試驗(yàn)表明一個(gè)或多個(gè)關(guān)于VEGF相關(guān)途 徑步驟。該試驗(yàn)包含下列步驟1)至4):1) 用VEGF培養(yǎng)VEGF反應(yīng)細(xì)胞群；2) 將己知或候選VEGF途徑抑制劑加入該細(xì)胞；3) 測(cè)量VEGF相關(guān)步驟中明確細(xì)胞分子的活性；及4) 確認(rèn)該已知或候選VEGF途徑抑制劑在細(xì)胞上的效果，例如、 細(xì)胞增殖、粘附、 一個(gè)或多個(gè)VEGF途徑成員蛋白質(zhì)的表達(dá)、或管子形 成。那試驗(yàn)可有效地測(cè)量該VEGF途徑抑制劑或活化劑分別地減少或增 加VEGF途徑活性的能力。參照本文「標(biāo)準(zhǔn)體外VEGF途徑試驗(yàn)」或其 他相似用語(yǔ)是關(guān)于上述步驟1)至4)，當(dāng)在上述步驟3)中測(cè)量的明確 細(xì)胞分子是VEGF途徑。如下更詳細(xì)的敘述，其他本發(fā)明體外試驗(yàn)是在 VEGF相關(guān)步驟或途徑中測(cè)量額外明確細(xì)胞分子。該本發(fā)明體外試驗(yàn)可 實(shí)施于接近任合反應(yīng)LacCer的細(xì)胞群，包括如該細(xì)胞或組織的裂解液、 或本質(zhì)上該裂解液的純化部分?？赡軕?yīng)用在該試驗(yàn)的合適LacCer反應(yīng) 細(xì)胞包括，涉及血管內(nèi)膜細(xì)胞、尤其是初代及/或永生化(immortalized) 內(nèi)皮和平滑肌細(xì)胞，以及特定免疫細(xì)胞如白血球。較佳的LacCer裂解 液或亞細(xì)胞部分是包含VEGF途徑。本發(fā)明體外偵測(cè)試驗(yàn)可應(yīng)用于用途。例如，如上所述，發(fā)現(xiàn)VEGF 表現(xiàn)某基因改變和蛋白表達(dá)水平以及細(xì)胞功能。因此，上述該標(biāo)準(zhǔn)體 外試驗(yàn)可在步驟3)調(diào)整，包含測(cè)量反應(yīng)添加VEGF的細(xì)胞增殖或粘附， 及確認(rèn)該VEGF途徑抑制劑在細(xì)胞功能上的影響。在試驗(yàn)中測(cè)試的該己 知或候選VEGF途徑抑制劑可作為單一活性試劑或與包含測(cè)試的VEGF
途徑抑制劑的其他試劑組合。大部分的例子中，該體外試驗(yàn)與適合的 控制試驗(yàn)實(shí)施，通常包括如上述步驟相同的測(cè)試條件，但不包括添加 該VEGF途徑抑制劑到該媒介物。在這例子，可藉由顯示比控制組有至少約10%較大的活性，將候選VEGF途徑抑制劑是別為顯示出期望的活 性；較佳地比控制組試驗(yàn)有至少約20%較大的活性；且再更佳地比控制 組有至少約30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%、 100%、 150%或200% 較大的活性。活化劑在活化作用上將具有相似的活性。本發(fā)明也提供偵測(cè)VEGF反應(yīng)細(xì)胞試驗(yàn)，該細(xì)胞可能被用于，例如 上述本發(fā)明的試驗(yàn)。例如可能的VEGF反應(yīng)細(xì)胞可藉由LacCer接觸， 且接著測(cè)量之前討論的VEGF相關(guān)蛋白中期望細(xì)胞分子或功能，如添加 LacCer劑量的功能。大部分的例子中，如果該應(yīng)用的試驗(yàn)顯示在本文 提供的試驗(yàn)確認(rèn)中，該分子或細(xì)胞功能的活性改變至少約10%、較佳地 至少20%、更佳地至少50%、且再更佳地至少約75%或100%，那么該細(xì) 胞被認(rèn)為對(duì)LacCer有反應(yīng)。該試驗(yàn)也可被使用去識(shí)別再不同細(xì)胞或組 織中VEGF反應(yīng)，包括培養(yǎng)后細(xì)胞(例如初代細(xì)胞或永生化細(xì)胞)及器官。本發(fā)明也提供體內(nèi)試驗(yàn)去確認(rèn)已知或候選VEGF途徑抑制劑調(diào)整細(xì) 胞功能的治療能力，該細(xì)胞功能是藉由VEGF，例如細(xì)胞增殖和粘附及 VEGF途徑成員的基因和蛋白質(zhì)表達(dá)水平所影響。該監(jiān)控的適合細(xì)胞功 能可能在該測(cè)試動(dòng)物中舊有存在的，或該細(xì)胞功能可能藉由例如像血 管修復(fù)術(shù)的侵入性手術(shù)誘導(dǎo)。可在這些方法中適合地試驗(yàn)的細(xì)胞功能 包括，例如血管細(xì)胞增殖和粘附以及血管重構(gòu)。本發(fā)明的該體內(nèi)試驗(yàn)可以一些方法調(diào)整所需要的試驗(yàn)。例如，在 本發(fā)明特定實(shí)施例，該血管分析是隨著該動(dòng)物在體外試驗(yàn)或或想要在 體內(nèi)試驗(yàn)。在其他實(shí)施例，對(duì)動(dòng)物投與作為單一活性試劑或與其他活 性化合物(例如，普羅布考(probucol))組合的該VEGF途徑抑制劑，包 括測(cè)試其他VEGF途徑抑制劑，大部分實(shí)施例，將在實(shí)施的體內(nèi)試驗(yàn)中 該VEGF途徑抑制劑的活性比較適合的控制組(例如假手術(shù) (sham-operated)動(dòng)物)，該控制組是以如同該測(cè)試試驗(yàn)實(shí)施，但對(duì)該 測(cè)試對(duì)象不投與該VEGF途徑抑制劑。可使用各種的測(cè)試對(duì)象，尤其是 哺乳類(lèi)動(dòng)物，例如兔子、靈長(zhǎng)類(lèi)、各種嚙齒動(dòng)物或該類(lèi)似的對(duì)象。如上所述，該偵測(cè)試驗(yàn)(體外或體內(nèi))可實(shí)施于廣泛不同的VEGF反
應(yīng)細(xì)胞、組織或器官。進(jìn)一步地，該試驗(yàn)可藉由測(cè)試目標(biāo)分子活性以及VEGF相關(guān)途徑功能去偵測(cè)有用的VEGF途徑抑制劑。因此，本發(fā)明試驗(yàn)可在各種細(xì)胞、組織及設(shè)置器官中測(cè)量活性。值得注意的是，多重偵測(cè)試驗(yàn)(例如該體外及/或體內(nèi)試驗(yàn)的組合)與單一 VEGF途徑抑制劑的使用可擴(kuò)大期望偵測(cè)的選擇性與敏感度。這樣寬光譜測(cè)試提供額外的優(yōu)點(diǎn)，因此，例如，在本發(fā)明體外試 驗(yàn)可有效執(zhí)行多種分析，因此增加識(shí)別VEGF途徑抑制劑治療能力的效 率及與機(jī)率。當(dāng)有大量的化合物需要測(cè)試時(shí)這是特別有用的。舉例而 言，可藉由包含組合類(lèi)型化學(xué)操作的標(biāo)準(zhǔn)合成方法設(shè)立VEGF途徑抑制 劑的資料查詢(xún)系統(tǒng)，幷接著測(cè)試本發(fā)明。此外，許多的該VEGF相關(guān)步驟是VEGF途徑的「下游」，而因此該 包含分子和細(xì)胞功能的試驗(yàn)是VEGF途徑的活性下游。于是，適度但顯 著的VEGF途徑活性改變可紀(jì)錄成可容易測(cè)試信號(hào)。在一態(tài)樣中，確認(rèn)VEGF途徑抑制劑降低對(duì)象血管新生的治療能力 的方法，包括確認(rèn)對(duì)象血管新生的預(yù)治療水平；將治療有效量的VEGF 途徑抑制劑投與對(duì)象；幷確認(rèn)對(duì)象血管新生的后治療水平。在一實(shí)施 例，血管新生的減少表明該VEGF途徑抑制較是有效的。相關(guān)實(shí)施例中， 該血管新生的預(yù)治療和后治療水平是在疾病組織中確認(rèn)的。本發(fā)明其他態(tài)樣在下文中討論。
圖1顯示VEGF在PECAM-1 mRNA轉(zhuǎn)錄及在HUVECs的蛋白質(zhì)表達(dá)的 濃度與時(shí)間依賴(lài)作用的影響，(A)細(xì)胞是以不同濃度的VEGF(O至 30ng/ml)治療4小時(shí)。全部的RNA由被VEGF治療的細(xì)胞中萃取，且使 用等量的全部RNA作為內(nèi)部控制的實(shí)時(shí)(rea1-time) RT-PCR b-肌動(dòng)蛋 白(b-actin)去檢查等量的cDNA。 (B)執(zhí)行定量實(shí)時(shí)RT-PCR分析以精確 確認(rèn)在PECAM-1的基因表達(dá)變化，在不同時(shí)間點(diǎn)以VEGF(25ng/ml)治療 HUVECs。 (C)在HUVECs以不同濃度的VEGF治療4小時(shí)的PECAM-1西方 轉(zhuǎn)漬(Western blot)分析。底部區(qū)塊顯示蛋白質(zhì)表達(dá)的密度定量。(D) PECAM-1表達(dá)的西方轉(zhuǎn)漬(Western blot)分析去確定在PECAM-1表達(dá)上 VEGF(25ng/ml)的時(shí)間進(jìn)程。底部區(qū)塊顯示該蛋白質(zhì)表現(xiàn)的密度定量。
所示圖示是三重測(cè)定產(chǎn)生類(lèi)似結(jié)果的實(shí)驗(yàn)典型而且以塊狀圖示呈現(xiàn)的 該數(shù)值是平均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)方差(士 S.D)。圖2顯示VEGF刺激以及D-PDMP抑制了HUVECs中LacCer/GlcCer生物 合成與PECAM-1表達(dá)。(A)在37。C以["C]棕櫚酸鹽代謝性標(biāo)記細(xì)胞24 小時(shí)。接著，清洗該細(xì)胞并培養(yǎng)60分鐘(與dD-PDMP—起或沒(méi)有 (20uM))。接著加入VEGF(25ng/ml)在37。C繼續(xù)培養(yǎng)。在指示的時(shí)間間 隔，以PBS清洗細(xì)胞三次并萃取脂質(zhì)并如在前述材料與以及材料章節(jié)確 定LACCer含量。該控制值(DMSO);(載體治療的細(xì)胞)分別對(duì)于 LacCer (區(qū)塊A)與Gl cCer (區(qū)塊B)的質(zhì)量是21. 76nmo 1 /mg蛋白質(zhì)以及 9. 77nmol/mg蛋白質(zhì)。每個(gè)點(diǎn)代表以二重測(cè)定執(zhí)行的三個(gè)個(gè)別實(shí)驗(yàn)的平 均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)方差(± S.D)。開(kāi)口范圍(口)表明在指示時(shí)間間隔以 VEGF(25ng/ml)治療的細(xì)胞，而實(shí)心范圍(v )表明在VEGF培養(yǎng)之后以 D-PDMP(20 u M)預(yù)治療的細(xì)胞。(B)以各種濃度的D-PDMP治療90分鐘的 HUVECs中，PECAM-1的西方轉(zhuǎn)漬分析，接著以VEGF(25ng/ml)治療4小 時(shí)，n = 3; * P 〈 0. 001對(duì)上PBS or DMS0的載體控制組；** P < 0. 05 對(duì)上VEGF。 (C)以VEGF(25ng/ml)治療4小時(shí)或是以LAcCer (2. 5 P M)與 VEGF (25ng/ml)治療四小時(shí)的HUVECs中，PECAM-1 mRNA表達(dá)的實(shí)時(shí) RT-PCR分析。在一些實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞是以D-PDMP(20uM)預(yù)治療90分鐘， 然后由VEGF/LacCer作4小時(shí)。n=3 ; * P〈 0.001對(duì)上 VEGF/VEGF+LacCer; **P<0.001對(duì)上載體控制組；*** P〈 0.05對(duì)上 D-PDMP+VEGF。圖3顯示LacCeR特定地誘導(dǎo)HUVECs中PECAM-1表達(dá)與管子形成/血 管新生。(A)執(zhí)行PECAM-1表達(dá)以證明LacCer特定地誘導(dǎo)HUVECs中的 PECAM-1。以LacCer以及其同源物，例如DGDG、 GlcCer或C2Cer用2. 5 u M 治療細(xì)胞4小時(shí)。隨后，處理細(xì)胞裂解液供西方免疫轉(zhuǎn)漬分析用藉以 確定PECAM-1表達(dá)。[n = 3; * P < 0. 001對(duì)上VC載體控制組(DMS0)]。 (B) PECAM-1表達(dá)的西方轉(zhuǎn)漬分析證明LacCeR在PECAM-l表達(dá)上特定地 繞道了該D-P畫(huà)P的抑制效果(n = 3， * P < 0. 001對(duì)上載體控制組;林 P 〈 0.05對(duì)上D-P匿P治療的細(xì)胞)。(C)上方區(qū)塊描述HUVECs中該 LacCer/VEGF誘導(dǎo)血管新生的效果以及LacCer特定地反轉(zhuǎn)D-PDMP對(duì)于 VEGF誘導(dǎo)血管新生的該抑制效果。下方區(qū)塊顯示如「實(shí)驗(yàn)程序」章節(jié) 所述的該管子形成的定量測(cè)量(n 二 3; * P 〈 0. 001對(duì)上載體控制組細(xì) 胞；** P 〈 0.05對(duì)上VEGF或LacCer治療的細(xì)胞以及tf P < 0. 05對(duì)上 區(qū)塊D)。圖4證明對(duì)于HUVECs中該LacCer/VEGF誘導(dǎo)的PECAM-1表達(dá)與血 管新生，該P(yáng)PMP的效果。(A)單獨(dú)以VEGF克隆4小時(shí)或以PPMP(90分 鐘)預(yù)治療然后以LacCer或GlcCer培養(yǎng)4小時(shí)的細(xì)胞中，PECAM-1表 達(dá)的西方轉(zhuǎn)漬分析(n = 3; * P< 0. 001對(duì)上控制組細(xì)胞；**P 〈 0. 001 對(duì)上VEGF治療的細(xì)胞；*** P 〈 0. 05對(duì)上PPMP + GlcCer細(xì)胞)。(B) 顯示在HUVECs中該VEGF/LacCer促進(jìn)血管新生的效果以及該P(yáng)PMP對(duì) 于VEGF誘導(dǎo)的血管新生的抑制效果。HUVECs是以VEGF (25 ng/ml)治 療4小時(shí)或以D-PDMP (20 u M)治療90分鐘，接著以VEGF (25 ng/ml)、 GlcCer (2.5 pM)或LacCer (2.5 txM)培養(yǎng)4小時(shí)，并如前述內(nèi)容執(zhí) 行體外血管新生試驗(yàn)。(n二3; *P< 0.001對(duì)上載體控制組PBS或DMSO A;林P〈 0. 001對(duì)上VEGF或LacCer; *** P〈 0. 05對(duì)上PPMP + VEGF; # P < 0. 001對(duì)上PPMP + VEGF)。圖5顯示使用siRNA用于抗人類(lèi)GalT-V的該GalT-V表達(dá)沉默。 (A)描述執(zhí)行免疫轉(zhuǎn)漬分析去證明該兔子多克隆抗人類(lèi)GalT-V的專(zhuān)一 性。通道1至2，是HUVECs的細(xì)胞裂解液，而通道3至4是充滿(mǎn)CHO-Kl (MT) 細(xì)胞過(guò)表達(dá)人類(lèi)GalT-V。 (B)以標(biāo)靶對(duì)抗GalT-V的、零亂序列的(負(fù)控 制siRNA)或單獨(dú)以O(shè)F轉(zhuǎn)染試劑(Oligofectamine)的該雙螺旋siRNA 指示濃度轉(zhuǎn)染HUVECs。如圖所示，接著，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)收取裂解的細(xì) 胞，并藉由帶有GalT-V抗體或b-肌動(dòng)蛋白的免疫轉(zhuǎn)漬探針?lè)治鯣alT-V 蛋白質(zhì)水平。當(dāng)以b-肌動(dòng)蛋白表達(dá)作標(biāo)準(zhǔn)化，GalT-V表達(dá)是以％控制 表示，且該相對(duì)定量值顯示在該免疫轉(zhuǎn)漬下。(C) HUVECs是以零亂的 GalT-V siRNA(100nM)或GalT-V siRNA(100nM)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)， 將細(xì)胞裂解且以「材料與方法」所述去執(zhí)行Cer合成酶的酶活性。所 顯示的該數(shù)據(jù)是產(chǎn)生類(lèi)似結(jié)果的兩個(gè)相同實(shí)驗(yàn)典型。(* P 〈 0. 05對(duì)上 零亂的GalT-V siRNA或單獨(dú)的OF)。圖6證明GalT-V的沉默減弱了 HUVECs中VEGF誘導(dǎo)的PECAM-1表 達(dá)與血管新生。(A)HUVECs中PECAM-1蛋白質(zhì)表達(dá)的免疫轉(zhuǎn)漬分析是以 特定供GalT-V的siRNA轉(zhuǎn)染或以零亂的siRNA(負(fù)控制)作轉(zhuǎn)染，并以
或不以VEGF(25ng/ml)治療4小時(shí)。當(dāng)以b-肌動(dòng)蛋白標(biāo)準(zhǔn)化，括號(hào)內(nèi) 指示的數(shù)值是PECAM-1蛋白質(zhì)水平的定量表達(dá)。(B)描述細(xì)胞中血管新 生試驗(yàn)，該細(xì)胞是以GalT-V siRNA轉(zhuǎn)染或零亂的siRNA轉(zhuǎn)染并接著以 VEGF(25ng/ml)治療4小時(shí)。(C)描述管子形成的定量測(cè)量。將該前述 實(shí)驗(yàn)以二重測(cè)定重復(fù)，而且所顯示的免疫轉(zhuǎn)漬是其產(chǎn)生可再現(xiàn)結(jié)果的 典型。
圖7顯示PECAM-1是LacCer/VEGF誘導(dǎo)的血管新生所需。(A)HUVECs 是以SU1498預(yù)治療1小時(shí)或者以抗人類(lèi)PECAM-1 mAb預(yù)治療1小時(shí)， 并接著施以VEGF(25ng/ml)/LacCer (2. 5 y M)4小時(shí)，并接著如前述「材 料與方法」章節(jié)實(shí)施管子形成試驗(yàn)。(B)描述管子形成的定量分析。((n =3); * P < 0. 001對(duì)上遭受PBS或DMS0的載體控制組；** P 〈 0. 001 對(duì)上VEGF)。
圖8證明缺乏該P(yáng)ECAM-l無(wú)法在體外誘導(dǎo)血管新生。REN(WT) [A] 是以VEGF(25ng/ml) [B] 、 LacCer (2. 5 u M) [C]或REN(rhPECAM-l) [D]刺 激4小時(shí)，并接著如前述執(zhí)行在體外血管新生試驗(yàn)。這里所顯示的結(jié) 果是由三重測(cè)定執(zhí)行的實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)生類(lèi)似的結(jié)果。
具體實(shí)施方式
如上文討論，是本發(fā)明供治療與避免血管新生相關(guān)癥狀治療方法的特 征。本發(fā)明治療方法一般包括將治療有效量的VEGF途徑調(diào)整劑投與對(duì) 象(例如抑制劑或活化劑)，較佳地是患者所需治療。
同樣意外地發(fā)現(xiàn)VEGF是細(xì)胞信號(hào)分子，可調(diào)整各種血管新生相關(guān) 癥狀。即是，VEGF途徑成員的細(xì)胞水平中變化改變那些疾病的嚴(yán)重性 與發(fā)展。尤其意外地發(fā)現(xiàn)在VEGF反應(yīng)細(xì)胞中，VEGF作用為信號(hào)分子影 響特定細(xì)胞步驟(有時(shí)候在本文中表明為「VEGF相關(guān)步驟」或「VEGF 相關(guān)途徑」)的變化。VEGF相關(guān)途徑影響各種相關(guān)于血管新生的功能。
本文中對(duì)LacCer合成酶的命名如下起初，LacCer合成酶是由人 類(lèi)腎臟純化并以其為特征。后來(lái)，Nomura etal.， (7^'o C力e瓜1998; 273: 1357013577.)克隆老鼠大腦的LacCer合成酶并稱(chēng)為 GalT-2/GalT-IV。接著，由Gen Bank分析資料并揭露其他b 1-4半乳 二糖轉(zhuǎn)移的存在(67/co"oA^7. 1998; 8: 517-526)，幷與老鼠大腦
的LacCer合成酶具有 68%的相似度。該LacCer合成酶被稱(chēng)為GalT-V。 根據(jù)生物化學(xué)與功能研究，建議GalT-V是真實(shí)的LacCer合成酶 (Kolmakova A. and Chatterjee S. Glycoconjugate J. 2005 in Press)。 根據(jù)RT-PCR與北方轉(zhuǎn)漬(Northern blot)分析，在HUVECs中GalTt-V 是主要的 LacCer 合成酶(Kolmakova A. and Chatterjee S. Glycocon jugate J. 2005 in Press),因此在原稿中我們使用該術(shù)語(yǔ) GalT-V以明確表明該HUVEC酶。當(dāng)我們還不確定使否該酶是GalT-V 或GalT-VI，我們已表明它是LacCer合成酶。「提供多肽」表明為藉由例如購(gòu)買(mǎi)或制造該多肽取得。該多肽可 能由任何已知或晚近發(fā)展的生物技術(shù)制得。例如，該多肽可由被培養(yǎng) 的細(xì)胞取得。該培養(yǎng)的細(xì)胞，例如可能包括表達(dá)構(gòu)成，該表達(dá)構(gòu)成包 括核酸片段編碼的多肽。細(xì)胞及/或?qū)ο罂赡芤砸粋€(gè)或多個(gè)抗血管新生治療去治療及/或接 觸，包括手術(shù)、化療、放射療法、基因療法、免疫療法或荷爾蒙療法、 或其他由自己或醫(yī)療照顧提供者健抑或禁止的療法。本文中使用的「治療、避免或減輕血管新生」表明本文中所述的 該治療劑預(yù)防疾病或治療的使用，例如VEGF途徑抑制劑。本文某些例子中使用的「血管新生」表明由異常血管新生的例子 造成的或相關(guān)的癥狀。換言之就是異常的增加或減少血管新生。涉及 增加的血管新生癥狀，包含例如，血管新生是關(guān)于癌癥、冠狀動(dòng)脈心 臟病、腫瘤轉(zhuǎn)移、發(fā)炎血管疾病、炎性疾病、缺血-再灌注損傷、高血 壓或糖尿病。涉及增加的血管新生的這些癥狀是表明本文中以VEGF途 徑抑制劑治療。相關(guān)于減少的血管新生癥狀，包含例如組織退化是相 關(guān)于胎兒子宮內(nèi)成長(zhǎng)、系統(tǒng)性硬化癥、創(chuàng)傷愈合、缺血、再灌注損傷、 糖尿病、冠狀動(dòng)脈病、腫瘤生長(zhǎng)。相關(guān)于減少的血管新生的這些癥狀 是表明本文中以VEGF途徑抑制劑治療。本文中使用的「VEGF途徑」和「VEGF途徑成員」描述蛋白質(zhì)與其 他信號(hào)分子是對(duì)細(xì)胞的VEGF刺激有反應(yīng)。例如，VEGFR、PECAM-1、LacCer 合成酶及PLA2。本文中使用多肽、或其片段或變化物的「降低水平」表明特定細(xì) 胞或?qū)?duì)象表現(xiàn)的較低的平均值、期望的或?qū)嶋H較低值。當(dāng)在多肽、或其片段或變化物的上下文中使用「本質(zhì)上純化」是表明至少60%、較佳地75%與更佳地90%沒(méi)有其他彼此相關(guān)的成分。因此，「分離的多肽」是本質(zhì)上純化的多肽。該術(shù)語(yǔ)「對(duì)象」包含可能患有血管新生的有機(jī)體或可在其他方面 受惠于投與本發(fā)明化合物或組合物者，例如人類(lèi)或非人類(lèi)動(dòng)物。較佳 的人類(lèi)動(dòng)物，包含本文所述的患有或有血管新生或關(guān)連狀態(tài)傾向的人 類(lèi)患者。本發(fā)明中該術(shù)語(yǔ)「非人類(lèi)動(dòng)物」包含所有的脊椎動(dòng)物，例如 哺乳類(lèi)動(dòng)物、例如嚙齒目動(dòng)物、例如小鼠、及非哺乳類(lèi)動(dòng)物，例如非 人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物、例如羊、狗、牛、雞、兩棲類(lèi)、爬蟲(chóng)類(lèi)等等。本文中使用「預(yù)測(cè)或診斷」方法表明基于觀察，對(duì)象的癥狀臨床 或其他試驗(yàn)、測(cè)試或其他有關(guān)事項(xiàng)?！复_認(rèn)表達(dá)的水平」可能是藉由任何目前已知或此后發(fā)展的確認(rèn)表達(dá)水平試驗(yàn)或方法，例如免疫技術(shù)、PCR技術(shù)、免疫試驗(yàn)、定量免疫 試驗(yàn)、西方轉(zhuǎn)漬或ELISA、定量RT-PCR、及/或北方轉(zhuǎn)漬法。該水平可 能是RNA或蛋白質(zhì)的。一個(gè)或多個(gè)的樣品可能藉由，例如擦拭、切片、洗濯或刺絡(luò)從對(duì) 象取得。樣品包含組織樣品、血液、唾液、支氣管洗滌物、針吸式活 組織(biopsy aspirate)、或乳管灌洗樣品。本文中使用「治療有效量」表明基于對(duì)于該細(xì)胞或?qū)ο笸杜c單一 或多劑量試劑的劑量是有效的，在患有該疾病的患者的存活能力或延 長(zhǎng)存活能力上超越?jīng)]有該治療的期望。本文中所述的組合物可能是藉由例如全身性地、瘤內(nèi)地、血管內(nèi)、 切除腫瘤基部、口服地或藉由吸入投與。本文中使用該術(shù)語(yǔ)「引物」表明寡核苷酸，不論自然發(fā)生于純化 的限制性酶或合成制造的，當(dāng)置放在引物延伸產(chǎn)物合成物中是可作用 為合成開(kāi)始的點(diǎn)，該產(chǎn)物是互補(bǔ)于誘導(dǎo)的核酸鏈(例如在核苷酸與例如 DNA聚合酶的誘導(dǎo)劑的存在下，與適合的溫度與pH)。該引物較佳地為 在擴(kuò)增最大效率是單鏈但可替代的是雙鏈。如果是雙鏈，該引物在用 于制備延伸產(chǎn)物前是被首次用于分離自身鏈。該引物在誘導(dǎo)劑的存在 下必定是足夠長(zhǎng)度去啟動(dòng)延伸產(chǎn)物的合成。該引物的精確長(zhǎng)度視許多 因素而定，包括溫度、引物的來(lái)源及該方法的使用。
除非另有表明，特定核酸序列同樣暗示包含其謹(jǐn)慎修飾的變化物 (簡(jiǎn)幷密碼子取代物)與互補(bǔ)序列，且該序列是明確地表明。尤其，簡(jiǎn)幷密碼子取代物可能藉由回折(degenerating)序列完成， 一個(gè)或多個(gè) 選擇的(或全部)密碼子的第3位置是被混合堿及/或脫氧肌苷殘基取代 (Batzer et al. ， Nucleic Acid Res. ， 19 : 5081 (1991) ; 0htsuka et al.， J. Boil. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al. ， Mol. Cell Probes, 8:91-98 (1994))。該項(xiàng)核酸是與基因、cDNA、 m陽(yáng)、 寡核苷酸、及多核苷酸互換地使用。在本文中互換地使用該術(shù)語(yǔ)「多肽」、「肽」及「蛋白質(zhì)」，表明氨 基酸殘基的高分子。該術(shù)語(yǔ)應(yīng)用于氨基酸高分子， 一個(gè)或多個(gè)的氨基 酸對(duì)應(yīng)自然存在氨基酸是人工化學(xué)的擬態(tài)，同樣也應(yīng)用于自然存在的 氨基酸雨非自然存在的氨基酸。在本文中使用該術(shù)語(yǔ)「聚合酶鏈反應(yīng)」(PCR)表明美國(guó)專(zhuān)利第 4683195、 4683202及4965188的方法，其全部?jī)?nèi)容幷入本文以茲參考， 該術(shù)語(yǔ)是關(guān)于在沒(méi)有克隆或增殖的基因組(enomic)DNA混合物中增加 標(biāo)靶序列片段的濃度。在本文中使用該術(shù)語(yǔ)「PCR產(chǎn)物」及「擴(kuò)增產(chǎn)物」 表明關(guān)于經(jīng)過(guò)該P(yáng)CR變性、退火與延伸步驟二個(gè)或更多個(gè)的循環(huán)完成 后的化合物結(jié)果混合物。這些術(shù)語(yǔ)包含已有一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)序列的一 個(gè)或多個(gè)片段擴(kuò)增化例子。本文中使用的該術(shù)語(yǔ)「限制性?xún)?nèi)切酶(restriction endonuclease)」及「限制性酶」是表明關(guān)于細(xì)菌酶，在或接近特定核 苷酸序列每個(gè)細(xì)菌酶切斷雙鏈DNA。本文中使用的該術(shù)語(yǔ)「重組DNA分子」是表明關(guān)于藉由分子生物 技術(shù)將DNA片段所組成的DNA分子連接在一起。本文中使用的核酸序列，即使是較大的寡核苷酸內(nèi)部，也可能被 認(rèn)為具有5，和3，終端。在線狀或環(huán)狀DNA分子，分開(kāi)的元素是表明 為「上游」或「下游」的5'端或3'元素。這術(shù)語(yǔ)所表現(xiàn)的事實(shí)是在 順著DNA鏈5'至3'方式進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。指揮連結(jié)基因轉(zhuǎn)錄的該啟動(dòng)子和 增強(qiáng)子元素通常是位于5'端或該編碼區(qū)的上游。然而，增強(qiáng)子元素可 運(yùn)用其影響，即使是當(dāng)位于該編碼區(qū)和該啟動(dòng)子元素的3'端的時(shí)候。 轉(zhuǎn)錄結(jié)束及多聚腺苷酸化信號(hào)是位于3'端或該編碼區(qū)的下游。
本文中使用的具有核苷酸序列編碼基因的核苷酸是指包括基因的該編碼區(qū)的DNA序列或換言之的DNA序列編碼基因產(chǎn)物。該編碼區(qū)可 能出現(xiàn)在cDNA或基因組DNA形式。如果需要允許適當(dāng)轉(zhuǎn)錄開(kāi)始及/或 恰當(dāng)?shù)某跫?jí)RNA轉(zhuǎn)錄進(jìn)行，適合的控制元件(element)例如增強(qiáng)子/啟 動(dòng)子、剪接接口、多聚腺苷酸化信號(hào)等等，可能被置于接近該基因編 碼區(qū)附近。可選擇地，在本發(fā)明載體使用的該編碼區(qū)可能包含內(nèi)源增 強(qiáng)子/啟動(dòng)子、剪接接口、間隔序列、多聚腺苷酸化信號(hào)等等，或內(nèi)源 與外源控制元件二者的組合。在2個(gè)或更多個(gè)核酸或多肽序列的上下文中，該術(shù)語(yǔ)「相同」或 百分比「相同」是指當(dāng)在比對(duì)譜窗(comparison window)比對(duì)和對(duì)齊最 大一致性時(shí)或當(dāng)使用一種下列序列比對(duì)演算或藉由手動(dòng)對(duì)齊和目測(cè)測(cè) 量指定區(qū)，2個(gè)或更多個(gè)序列或子序列(subsequence)是相同的或具有 氨基酸殘基或核苷酸的特定百分比是相同的(例如特定區(qū)域60%相同、 視情況地65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、或95%相同)。那么該序列 可認(rèn)為是「本質(zhì)上相同」。這定義也是指對(duì)測(cè)試序列的認(rèn)可。視情況地， 存在區(qū)域上的相同是至少50個(gè)氨基酸或核苷酸長(zhǎng)度相同，或更佳地區(qū) 域上是75至100個(gè)氨基酸或核苷酸長(zhǎng)度相同。序列比對(duì)，典型地依序列作為參考序列，幷比對(duì)測(cè)試序列。當(dāng)使 用序列比對(duì)演算法，測(cè)試和參考序列都輸入電腦，如果需要的話(huà)，指 定序列調(diào)節(jié)，幷指定序列演算程序參數(shù)。可使用預(yù)設(shè)的程序參數(shù)或者 可指定替代的參數(shù)。該序列比對(duì)演算法根據(jù)程序參數(shù)可由該測(cè)試序列 相對(duì)于參考序列計(jì)算序列相同百分比。本文中使用「比對(duì)譜窗」包含參考任一數(shù)量的連續(xù)位置片段，該 連續(xù)位置是選自20至600，通常約50至約200，更常為約100至約150 個(gè)組成的群組，在兩個(gè)序列以最佳化對(duì)齊后，群組中序列可能與連續(xù) 位置的相同數(shù)量的參考序列比對(duì)。供比對(duì)的序列對(duì)齊方法在所屬領(lǐng)域 中是已知的。供比對(duì)序列的最佳化對(duì)齊可藉由Smith & Waterman的局 部相似(local homology)演算法執(zhí)行，Adv. Appl. Math. ， 2:482 (1981);藉由Needleman & Wunsuh該相似對(duì)齊演算法，J. Mol Biol.， 48:443 (1970);藉由Pearson & Lipman的相似方法檢索，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:2444 (1988);藉由這些演算法的電腦化完成(GAP, BESTFIT， FASTA， and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.);或藉由手動(dòng)對(duì)齊與目觀lj (參考，例如Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 supplement))。本文中使用該術(shù)語(yǔ)「抗體」是指任何具有特定免疫反應(yīng)性的分子， 不論是否與其他化合物偶合，例如目標(biāo)(targeting)試劑、載體、標(biāo)簽、 毒素、或藥物。雖然抗體通常包含2個(gè)輕的和2個(gè)重的鏈聚集在「YJ 結(jié)構(gòu)中，它們之間有或無(wú)共價(jià)鍵連結(jié)，該術(shù)語(yǔ)同樣關(guān)于包含任何平常 化合物的活性片段，例如Fab分子、Fab蛋白質(zhì)或具有結(jié)合抗原親和力 的單鏈多肽。Fab是指抗原結(jié)合片段。本文中使用的該術(shù)語(yǔ)「Fab分子J 是指抗體分子的區(qū)域包含重鏈及/或輕鏈的各種部分，幷表現(xiàn)出結(jié)合活 性。「Fab蛋白質(zhì)」包含一重鏈與一輕鏈(一般認(rèn)為Fab)的聚集，以及相 當(dāng)于該抗體Y(—般認(rèn)為F(ab)2)的兩個(gè)分支的四聚體，不論上述哪一種 是共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵聚集只要該聚集是有能力選擇與特定抗原或抗原 家族反應(yīng)即可。本文中以廣義使用該術(shù)語(yǔ)「抗體」，幷包含多克隆及單克隆抗體二 者，除了完整的免疫球蛋白分子外，該術(shù)語(yǔ)「抗體」還包含是那些免 疫球蛋白分子的片段或高分子，及免疫球蛋白分子的人類(lèi)或人源化形 式或其片段，只要它們是選擇其能力與本文中所述的該蛋白相互作用。 在根據(jù)已知臨床測(cè)試方法該抗體的體外治療及/或預(yù)防疾病的活性被 測(cè)試后，該抗體可藉由使用本文所述的體外試驗(yàn)測(cè)試其期望活性，或 藉由類(lèi)似方法。本發(fā)明的該抗體被提出對(duì)抗VEGF途徑成員，例如VEGF、 VEGFR、 VEGF途徑、PECAM-1。該抗體可為多克隆、單克隆、重組的、例如嵌合或人源化、全人 類(lèi)、非人類(lèi)，例如鼠類(lèi)、單鏈抗體、或全合成的。嵌合的、人源化， 但最佳地完全人類(lèi)抗體是包含重復(fù)投與的應(yīng)用所期望的，例如人類(lèi)患 者的治療，及一些診斷應(yīng)用。相關(guān)實(shí)施例中，該抗體可與毒素偶合。治療方法與組合物 本發(fā)明提供治療患有或具有血管新生風(fēng)險(xiǎn)對(duì)象的預(yù)防疾病和治療 方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供在對(duì)象體內(nèi)治療血管新生的方法，包括將對(duì)向 投與一個(gè)或多個(gè)劑量的本發(fā)明醫(yī)藥組合物，并有效降低對(duì)象血管新生， 因此治療該血管新生。本文中使用該術(shù)語(yǔ)「血管新生相關(guān)疾病」及「異常血管新生」是 表明無(wú)癥狀期和癥狀期二者、及增加的血管新生(癌癥、冠狀動(dòng)脈心臟 病、腫瘤轉(zhuǎn)移、發(fā)炎血管疾病、或糖尿病)及減少的血管新生(組織退 化)。本文中使用的「異常血管新生」表明增加的血管新生(例如癌癥、 冠狀動(dòng)脈心臟病、腫瘤轉(zhuǎn)移、發(fā)炎血管疾病、或糖尿病)及減少的血 管新生(組織退化)。本文中使用該術(shù)語(yǔ)「治療」定義為對(duì)患者應(yīng)用或投與治療劑，或 對(duì)患者的分離組織或細(xì)胞系應(yīng)用或投與治療劑，該患者是患有或具有 異常血管新生風(fēng)險(xiǎn)的，該術(shù)語(yǔ)幷帶有治療、治愈、減輕、緩和、改變、 醫(yī)治、改善、改進(jìn)或影響該染病或染病的癥狀。治療劑包括但不限于， 如本文所述的肽、抗體或其片段、小分子、脂質(zhì)及核酸。該術(shù)語(yǔ)「有效量」表明劑量或數(shù)量是足以減低或增加血管新生的 數(shù)量，幷導(dǎo)致患者癥狀改善或達(dá)成所期望的生物結(jié)果，例如較佳或較 高的血管新生?！羔t(yī)藥上可接受的賦型劑或載劑」包括，例如水、鹽、甘油、乙 醇等等。此外，輔助物質(zhì)，例如濕潤(rùn)劑或乳化劑、pH緩沖物、及其相 似物可能出現(xiàn)在該載劑中。本發(fā)明治療方法普遍地包括對(duì)需要該治療的對(duì)象投與治療有效量 的VEGF途徑抑制劑或活化劑，例如哺乳類(lèi)動(dòng)物，及尤其是靈長(zhǎng)類(lèi)，例 如人類(lèi)。本發(fā)明的治療方法同樣包括將需要本文揭露治療的對(duì)象投與 如本文定義有效量的通式I化合物，該對(duì)象尤其是哺乳類(lèi)動(dòng)物，例如各種的VEGF途徑抑制劑可使用在本治療方法。簡(jiǎn)單的測(cè)試，如上 述定義的標(biāo)準(zhǔn)體外試驗(yàn)可輕易地識(shí)別適合的VEGF途徑抑制劑。較佳的 VEGF途徑抑制劑包含那些含有丙醇主鏈者。 一般供本發(fā)明治療方法使
用的較佳化合物如通式I:<formula>formula see original document page 28</formula>其中R和W是獨(dú)立地選自氫或有取代或未取代(例如氨基、羥基或巰 基)的直鏈或支鏈d-Ce垸基所組成的群組，且進(jìn)一步地其中R和W可能被 連接形成5、 6或7-元環(huán)取代基，例如吡咯烷基、嗎啉基、硫代嗎啉基、 呱啶基、或氮雜環(huán)庚基及其類(lèi)似物；R2是選自有或沒(méi)有1至3個(gè)雙鍵的直鏈或支鏈C6-C3。垸基所組成的 群組；且R3是選自是選自有或沒(méi)有1至3個(gè)雙鍵的直鏈或支鏈Ce—C2。烷基或 芳基，例如碳環(huán)芳基(例如苯基)或取代的芳基，例如碳環(huán)芳基(例如苯 基)所組成的群組；其中該取代基是鹵素、d-C4烷氧基、亞甲二氧基、 d-C4巰基、氨基或取代的氨基，該氨基取代基可能是d-C4烷基。上述通式I適合的化合物及其他VEGF途徑抑制劑可輕易地藉由已 知程序制備或可由市場(chǎng)資源上取得。參照，例如Abe， A. etal.， (1992 ) J. a'oc力e瓜111 : 191—196; Inokuchi， J. et al. (1987) Zj》jV 28:565-571; Shukla， A. et al. (1991) /. "/wV T es. 32:73; Vun腦，R. R. etal., (1980) C力e瓜JW尸力，.cs of "; 油26 : 265; Carson， K. et al. ， (1994) 7etrs力et/ro/ Zets. 35:2659; and Akira， A. et al.， (1995) / Z加V 7fe，rc力36:611。VEGF途徑抑制劑也包含，例如SU-1498、 G56976、 G56850、溴代 苯甲酰甲基溴(BMB)、甲基-花生四?；?氟磷酸酯(MAFP)、吡咯烷基二 硫代羧酸、氯化二亞苯基碘及N-乙?；?L-半胱氨酸。VEGF途徑抑制劑也包含，例如PECAM-1、 LacCer、或LacCer合成 酶抗體或其片段。例示性的抗體，包含特定對(duì)于減輕的VEF-誘導(dǎo)的體 外血管新生/管子形成的LacCer合成酶(GalT-V/VI)抗體。其他供本文 所述使用的例示性抗體是特定GalT-V肽序列，包括 IGAQVYEQVLRSAYAKRNSSVND及IGMHMI-----RLYTNKNSTLNGT 。進(jìn)一步在 本文所述的方法有用的抗體是特定針對(duì)下列LacCer合成酶(GalT-V/VI) 序列-人類(lèi)GalT-V肽(115) PERLP(119)(145) PTIKLGGHWKP(155)(160) P飄VAILIP(169)(169) PFRNRHEHLP(178)(178) PVLFRHLLP(186)(316)PEGDTGKYKSIP(328)人類(lèi)GalT-VI肽(97) PENFTYSP(104) (104) PYLP(107) (107) PCPEKLP(113) (143) PGG臓P(149) (154) PRWK窗LIP(163) (163) PFRNRHEHLP(172) (172) PIFFLHLIP(180) (311) PEGDLGKYKSIP(322) (374) PELAP(378)VEGF途徑抑制劑也包含，例如PECAM-1、 LacCer、或LacCer合成 酶siRNA分子。例如5， -CGG、 AGU GAG UGG CUU AAC A dTdT-3，(正 義)、5、 UGU UAA GCC ACU CAC UCC G dTdT-3，(反義)。VEGF途徑抑制劑也包含例如PECAM-1、 LacCer、或LcaCer合成酶 肽或其片段。例示性的肽包含下列LcaCer合成酶(GalT-V/VI)肽 人類(lèi)GalT-V肽 (115) PERLP(119) (145) PTIKLGGHWKP(155) (160) PRWKVAILIP(169) (196) PFRNRHEHLP(178) (178) PVLF亂LP(186) (316) PEGDTGKYKSIP (328)人類(lèi)GalT-VI肽(97) PENFTYSP(104) (104) PYLP(107) (107) PCPEKLP(113) (143) PGG臓P(149) (154) P醒VAVLIP(163) (163) PF證腦LP(172) (172) PIFFLHLIP(180) (311) PEGDLGKYKSIP(322) (374) PELAP(378)其他有用的肽包括PLA2肽，因?yàn)榱字窤2 (PLA2)活化是需要藉由 LacCer去誘導(dǎo)PECAM-1表達(dá)(Gong， N…Chatter je， S et al Proc Natl Acad Sci USA. 101; 6490-6495 2004)，且在本文中呈現(xiàn)的是PLA2抑 制劑在人類(lèi)內(nèi)皮細(xì)胞中也緩和VEGF/LacCer誘導(dǎo)的血管新生。PLA2肽 的使用在對(duì)象中可緩和PLA2活性且因此PECAM-1表達(dá)與血管新生。例 式性的PLA2肽序列包含具有CC(P)-x-H-(LGY)-x-C序列的肽，其中組 氨酸(H)是該酶的活性位置。
其他si-RNAs及肽是想象的且受惠于本說(shuō)明書(shū)(例如序列及篩選方 法)的所屬領(lǐng)域中人士可知道如何制造及使用其他此類(lèi)VEF途徑的 si-RNA及肽抑制劑。例如，si-RNA可能藉由使用下列序列建構(gòu):AF38663 (GalT-V)、 AF38664 (GalT-VI) 、 NM一008816、麗—000442 (PECAM1)、 NM—077435 、 醒—001025370 、 醒—001025369 、 應(yīng)—001025368 、 麗—001025367、醒—003376、NM—001025366、 (VEGF) 、 X94263、 XM_497921、 AB065372、 AJ319908、 D64016、 NM—002019、 (VEGFR)及NM—000300、 BC005919、 (PLA2)，其全部?jī)?nèi)容幷入本文以茲參考。
本發(fā)明的治療方法，可對(duì)于對(duì)象以各種形式投與治療化合物。例 如VEGF途徑抑制劑或活化劑可以預(yù)防疾病的投與，去避免目標(biāo)癥狀的
開(kāi)始或降低其嚴(yán)重性。另一選擇，可于目標(biāo)癥狀的過(guò)程中投與VEGF途 徑抑制劑。
可將單獨(dú)的或一個(gè)或多個(gè)治療劑組合的治療化合物投與對(duì)象，如 與傳統(tǒng)賦形劑混合物的醫(yī)藥組合物，例如適合經(jīng)由腸外、腸內(nèi)、或鼻 內(nèi)使用且不會(huì)與活性化合物有不利地反應(yīng)，也部會(huì)對(duì)接受者不利的醫(yī) 藥上可接受的有機(jī)或無(wú)機(jī)載體物質(zhì)。適合的醫(yī)藥上可接受載體包含但 不限于水、鹽溶液、酒精、蔬菜油、聚乙二醇、白明膠、乳糖、直鏈 淀粉、硬脂酸鎂、滑石、硅酸、粘石臘、香料油、脂肪酸單酸甘油酯和雙酸甘油酯、petroethral脂肪酸、羥甲織維素、聚乙烯四氫咯酮等 等。該醫(yī)藥制備物可被消毒且若期望與輔助劑混合亦不會(huì)與活性化合 物產(chǎn)生有害反應(yīng)，該助劑例如潤(rùn)滑劑、保護(hù)劑、穩(wěn)定劑、濕潤(rùn)劑、乳 化劑、供影響滲透壓之鹽、緩沖劑、顏料、調(diào)味劑且/或芳香族物質(zhì)和 其相似物。
該組合物可能被制備供腸外投藥使用、尤其是以液體溶液或懸浮 益形式；供口服投藥，尤其是以片劑或膠囊形式；供鼻內(nèi)投藥，尤其 是粉末、滴鼻劑、或噴霧方式；在陰道投藥；局部投藥例如乳液的形 式；在直腸投藥例如栓劑；等等。該VEGF途徑抑制劑或活化劑可能也 經(jīng)由支架投藥。例示性的支架描述于美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)案公開(kāi)號(hào) 20050177246、 20050171599、 20050171597、 20050171598、 20050169969、 20050165474、 20050163821、 20050165352、及20050171593。
該醫(yī)藥試劑可能是傳統(tǒng)地以單位劑量形式投藥并可能藉由任何在 醫(yī)藥領(lǐng)±或已知方法制備，例如在^ e啦'A^o"' s尸力an^cewz^'ca2 5"cj'e; ces (Mack Pub. Co., Easton， Pa， 1980)所描述。腸夕卜纟合藥酉己 方可能包含一般的賦形劑，例如無(wú)菌水或鹽、聚烴基乙二醇例如聚乙 二醇、蔬菜原料油、氫化萘及其類(lèi)似物。尤其，生物相容性、可生物 降解的丙交酯高分子、丙交酯/乙交酯共聚物、或聚氧乙烯醚一聚氧 丙烯醚共聚物可能是有用的賦形劑去控制特定VEGF途徑抑制劑的釋 放。
其他潛在有用的腸外傳遞系統(tǒng)包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物顆粒、 滲透泵、植入性灌注系統(tǒng)、及脂質(zhì)體。吸入投藥配方包含如賦形劑， 例如乳糖、或可能是含水性溶液，例如聚氧乙烯醚-9-十二烷基醚、甘 氨膽酸、脫氧膽酸或在供滴鼻劑形式投藥的油性溶液、或如鼻內(nèi)應(yīng)用 的膠體。腸內(nèi)投藥的配方可能也包含供口頰給藥的甘氨膽酸、供直腸 投藥的甲氧基水楊酸酯、或供陰道投藥的檸檬酸。其他傳遞系統(tǒng)將在 手術(shù)部位直接投與該治療劑，例如在球囊血管修復(fù)后可能藉由使用支 架投與VEGF途徑抑制劑。VEGF途徑調(diào)整劑(例如抑制劑或活化劑)可在本治療方法使用作為單一活性醫(yī)藥試劑或可與其他活性成分組合使用，例如普羅布考(probucol)、已知的抗氧化劑(維他命C或E)或其他化合物。本文中使 用的調(diào)整劑是指該VEGF途徑的抑制劑或活化劑。治療組合物的一個(gè)或多個(gè)治療化合物濃度可能視一些因素變化， 包括該VEGF途徑抑制劑或活化劑投與的劑量、該使用的組合物化學(xué)特 性(例如疏水性)、及預(yù)期模式和投藥路徑。 一般條件下，供腸外投藥， 以含有約0. 1至10%化合物的水性生理緩沖液提供一個(gè)或多于一個(gè) VEGF途徑抑制劑活活化劑。用于給予治療上該實(shí)際較佳的活性化合物量將根據(jù)，例如使用的 特定化合物、該特別的組合物配方、該投藥模式及該對(duì)象的特性而變 化，例如物種、性別、體重、 一般健康狀態(tài)及該對(duì)象年齡。針對(duì)給予 的投藥計(jì)畫(huà)，可由熟悉該項(xiàng)技術(shù)者使用傳統(tǒng)劑量決定測(cè)試實(shí)施前述相 關(guān)方針輕易地確定理想投藥速率。適合的劑量范圍可能包含由每天體 重的1 u g/kg至約100 y g/kg。本發(fā)明治療化合物適合以質(zhì)子化和水溶性形式給藥與患者，例如 醫(yī)藥上可接受的鹽類(lèi)、典型地酸添加鹽例如無(wú)機(jī)酸添加鹽，例如鹽酸 化物、硫酸鹽、磷酸鹽或如有機(jī)酸添加鹽例如醋酸、順丁烯二酸、富 馬酸、或檸檬酸鹽。本發(fā)明治療化合物的醫(yī)藥上可接受鹽同樣可包含 金屬鹽類(lèi)、尤其是如鈉鹽或鉀鹽的堿金屬鹽；例如鎂或鈣鹽的堿土金 屬鹽；例如銨或四甲基銨鹽的銨鹽；或氨基酸添加鹽例如賴(lài)氨酸 (lysine)、乙氨酸、或苯丙氨酸鹽。較佳的VEGF途徑調(diào)整劑(例如抑制劑或活化劑)在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞增值試 驗(yàn)展現(xiàn)顯著的活性。較佳地，該VEGF途徑抑制劑抑制細(xì)胞增殖相對(duì)于 適合的控制試驗(yàn)至少約15或25%，較佳地至少50%。在該試驗(yàn)中，使 用期望的VEGF途徑抑制劑或活化劑約在0. 1至100 u M之間，較佳地
在約1至50UM之間。例示性的細(xì)胞增殖試驗(yàn)包括計(jì)算存活細(xì)胞幷監(jiān) 視特定檸檬酸循環(huán)酶的活性，例如乳酸脫氫酶。測(cè)量一個(gè)或多個(gè)可偵測(cè)標(biāo)記(detectably-labeled)核苷合幷進(jìn)入DNA 的較佳試驗(yàn)，例如藉由a) 在介質(zhì)中培養(yǎng)適合的細(xì)胞幷添加1) 候選VEGF途徑抑制劑或活化劑及2) 典型地量約0. 1至100n Ci之間的放射性標(biāo)記核苷，例如3H-胸苷；b) 培養(yǎng)該細(xì)胞，例如約6至24小時(shí)，并典型地接著清洗；及c) 測(cè)量該放射性核苷的合幷進(jìn)入DNA超過(guò)相較于控制培養(yǎng)的時(shí)間，該 控制培養(yǎng)是如該試驗(yàn)培養(yǎng)一樣以相同條件制備與培養(yǎng)但不包含該可能 的VEGF途徑抑制劑或活化劑。該測(cè)量可藉由多種方法達(dá)成，包括再紙 濾器上標(biāo)記DNA的三氯醋酸(TCA)沉淀接著進(jìn)行閃爍計(jì)數(shù)。參照，例如 相關(guān)于這試驗(yàn)的揭露Chatterjee， S. ， i ioc力e瓜 A.o/ / j51. Was" Co鵬. (1991) 181:554; Chatterjee， S. et al. (1982) f〃_r. /萬(wàn)ioc力e瓜 120:435。參考本文「標(biāo)準(zhǔn)體外細(xì)胞增殖試驗(yàn)」或其他相似詞語(yǔ)是指包含上 述步驟a)至c)的試驗(yàn)。較佳的細(xì)胞增殖試驗(yàn)例子使用主動(dòng)脈平滑肌細(xì) 胞(aortic smooth muscle cells) (ASMCs)，尤其由人類(lèi)、?；蛲米尤?得。適合的計(jì)畫(huà)是關(guān)于根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法制備ASMCs以及在適合的介質(zhì)中 培養(yǎng)一些細(xì)胞，例如Ham' s F-10。期望的VEGF途徑抑制劑或活化劑 是接著在介質(zhì)中稀釋?zhuān)^佳地為每毫升介質(zhì)中約1至lOOu g的最終濃 度，更佳地為約l至50"g或更小，接著伴隨著約1至5天的培養(yǎng)期， 較佳締約1天或更少。該培養(yǎng)之后，可執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞增殖，例如上述 提及的氚化胸苷的合幷或乳酸脫氫酶試驗(yàn)。該試驗(yàn)較佳地以三重測(cè)定 執(zhí)行并帶有5%至10%之間的變動(dòng)。參照，例如Ross， R. / 6W丄扁丄 (1971) 50:172; Chatterjee， S. et al. (1982)臉./.腸c/ 艦 120:435; Bergmeyer， H. V. // 尸rj'/ ci/ 7es of j5>2z，<3tic ylraJj^.s. (1978) Verlag Chemie， NY。此外，較佳的VEGF途徑抑制劑或活化劑在傳統(tǒng)細(xì)胞粘附試驗(yàn)表現(xiàn) 出顯著活性。較佳地，該VEGF途徑抑制劑抑制細(xì)胞粘附相對(duì)于適合的 控制試驗(yàn)至少25%，較佳地至少50%或更多。較佳地，該VEGF途徑活
化劑活化細(xì)胞粘附相對(duì)于適合的控制試驗(yàn)至少25%，較佳地至少50。/?；蚋唷Ｔ谠撛囼?yàn)中，期望的VEGF途徑抑制劑或活化劑是使用約O. l至 100pM之間，較佳地約1至50uM之間。舉例而言，較佳的細(xì)胞粘附試驗(yàn)包含下列步驟a) 將第1群免疫細(xì)胞，較佳地是特定白血球細(xì)胞，標(biāo)記可偵測(cè) 標(biāo)簽，該標(biāo)簽是有能力制造可偵測(cè)標(biāo)簽的染色的、放射性的、 發(fā)光的(例如螢光或磷光)、或酶標(biāo)簽，b) 將該第1群細(xì)胞接觸第2群做可偵測(cè)標(biāo)記的內(nèi)皮細(xì)胞，例如 染色的、放射性的、發(fā)光的(例如螢光或磷光)、或酶標(biāo)簽， 較佳地是和步驟a)使用不同的標(biāo)簽；及c) 偵測(cè)第1和第2群細(xì)胞之間的粘附。參考本文中「標(biāo)準(zhǔn)體外細(xì)胞粘附試驗(yàn)」或其他關(guān)于包含上述a) 至c)步驟試驗(yàn)的類(lèi)似詞語(yǔ)。在步驟c)中該偵測(cè)可藉由不同方法達(dá)成， 例如顯微術(shù)、尤其是關(guān)于FACS的共焦顯微術(shù)及螢光為基礎(chǔ)的顯微照相 術(shù)；自動(dòng)細(xì)胞分類(lèi)技術(shù)、例如ELISA及RIA的免疫學(xué)方法；及閃爍記 數(shù)。參考下列揭露相關(guān)的較佳細(xì)胞粘附試驗(yàn)例子。較佳的體外細(xì)胞粘附試驗(yàn)是在與期望的VEGF途徑抑制劑或活化劑 接觸前、當(dāng)時(shí)或之后測(cè)量多形核白細(xì)胞(polymorphonuclear leukocyte) (P麗s及/或肌細(xì)胞)或血小板及增加的內(nèi)皮細(xì)胞粘附。該 P麗S或肌細(xì)胞可根據(jù)下述詳細(xì)標(biāo)準(zhǔn)方法收集與純化。該P(yáng)麗S或肌細(xì)胞 接著藉由與適合的螢光染料，例如螢光細(xì)胞跟蹤染料(例如綠染料)或 Calcein-AM培養(yǎng)做標(biāo)記。在大約相同的時(shí)間，把在適合的基質(zhì)上，例 如平板或無(wú)菌塑膠培養(yǎng)皿以標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)方法制備的內(nèi)皮細(xì)胞單層藉 由該VEGF途徑抑制劑或活化劑揭觸，幷以另一個(gè)螢光染料例如螢光細(xì) 胞跟蹤染料(例如橙染料)做標(biāo)記。接著在37"C培養(yǎng)該P(yáng)麗S或肌細(xì)胞及 內(nèi)皮細(xì)胞約10分鐘至幾小時(shí)之間，較佳地約30分鐘。接著在該平板 以生理上可接受緩沖液，例如磷酸緩沖鹽(PBS)清洗掉非粘附性細(xì)胞。 接著藉由標(biāo)準(zhǔn)方法，例如使用熒光讀板儀估計(jì)粘附細(xì)胞數(shù)量。平板上 的該粘附細(xì)胞數(shù)量可以數(shù)種方法估計(jì)，包括在內(nèi)皮細(xì)胞單層上表達(dá)該 P麗/腿2數(shù)量。另一選擇，該粘附細(xì)胞可藉由下列顯微照相術(shù)使用顯微 照相及目測(cè)做檢查以估計(jì)數(shù)量。接著藉由顯微照相術(shù)檢查來(lái)評(píng)估細(xì)胞
粘附。參照下列例子。尤其較佳的是如前述方法以及以ASMCs處理的GalT-V試驗(yàn)。參考 例如Chatter jee, S. ， and Castiglione, E. (1987)Biochem. Biophys. Acta, 923:136; 及 Chatterjee, (1991) S. Biochem. Biophys. Res Comm., 181:554.
特別佳地體外細(xì)胞粘附試驗(yàn)包含在P麗s粘附分子的免疫學(xué)偵測(cè)使 用特定有特別能力結(jié)合該粘附分子的抗體，尤其是單克隆的。特別佳 地試驗(yàn)是包含流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry)。
上述該體外粘附試驗(yàn)是相容于各種特定粘附分子分析，例如 ICAM-l(細(xì)胞內(nèi)粘附分子1)、 Mac-l(CDllb/CD18) 、 LFA-1及選擇素 (selectin)。
另一種本發(fā)明試驗(yàn)，包括下列步驟a)至d):
a) 培養(yǎng)VEGF-反應(yīng)細(xì)胞群較佳地融合在不足脂蛋白 (lipoprotein-deficient)低血清培養(yǎng)基，例如約培養(yǎng)基的 lmg不足脂蛋白低血清/蛋白/毫升或更少；
b) 較佳地在適合的分散緩沖液中，例如二甲胂酸鹽緩沖液，收 取該細(xì)胞；
c) 較佳地以可偵測(cè)標(biāo)記分子，例如可偵測(cè)標(biāo)記核苷腺苷二磷酸 供體，例如典型地量約0. 1至lOOyCi之間的「"C」-UDP-半乳糖與該收取細(xì)胞做培養(yǎng)；及
d) 測(cè)量LacCer形成并作為該VEGF途徑酶的活性指示。 大部分的例子中上述該試驗(yàn)普遍地將使用已知VEGF反應(yīng)細(xì)胞且將
在適合于試驗(yàn)中維持那些細(xì)胞的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。例如Eagles'最小基 礎(chǔ)培養(yǎng)基(HMEM)或Ham， s F-10培養(yǎng)基。
較佳的VEGF途徑抑制劑與活化劑，包含那些存在VEGF途徑成員的至 少2-迭至5-迭較大的抑制或活化，它是藉由VEGF途徑酶或該途徑成 員的基因或蛋白的表達(dá)來(lái)測(cè)量。更較佳的是那些VEGF途徑抑制劑與活 化劑存在至少5迭-至10-迭較大的抑制或活化，且甚至更佳的是至少 約10-迭至50-迭較大的抑制或活化。測(cè)量表達(dá)的方法在實(shí)例中敘述。 特別較佳的VEGF途徑抑制劑，包含那些有能力特定抑制一個(gè)或多 個(gè)VEGF途徑酶者。換言之，該識(shí)別的VEGF途徑抑制劑是其些酶相對(duì) 差的抑制劑。顯然地，該VEGF途徑抑制劑應(yīng)該避免不期望的藥物影響，該影響是可由其他VEGF相關(guān)酶的非選擇性抑制引起。本發(fā)明的該體內(nèi)試驗(yàn)對(duì)于隨后的VEGF途徑抑制劑與活化劑在體外 試驗(yàn)表現(xiàn)適當(dāng)活性的評(píng)估是有用的。伴隨著侵入性手術(shù)，例如球囊血 管修復(fù)的再狹窄(restenosis)的兔子模型是較佳的。適合的計(jì)畫(huà)包含 對(duì)該兔子投與適合的載劑或與一個(gè)或多個(gè)目的VEGF途徑抑制劑組合的 載劑。該VEGF途徑抑制劑的投與量將視各種參數(shù)而變化，包括該相關(guān) 于目的手術(shù)的破壞程度。在例子中當(dāng)運(yùn)用球囊血管修復(fù)，兔子典型地 將接受候選劑量在(例如i. m.或i. p.) 0. 5至100之間的VEGF途徑抑制 劑，較佳地約1至20之間，且更佳地約該兔子體重的10mg/kg。提供 較佳的VEGF途徑抑制劑投藥劑量安排在開(kāi)始實(shí)施侵入性手術(shù)前24小 時(shí)，并接著在該手術(shù)后連續(xù)投與該VEGF途徑抑制劑15天。在其他的 計(jì)畫(huà)，可能在該手術(shù)后執(zhí)行每天該VEGF途徑抑制劑注射約2至12周。 該VEGF途徑抑制劑的每天注射，例如i. m.或i. p.普遍地是較佳的。 之后，將該兔子安樂(lè)死幷摘除血管供測(cè)驗(yàn)，較佳地是主動(dòng)脈。接著以 福馬林(formalin)固定該血管幷使用標(biāo)準(zhǔn)組織學(xué)程序分析血管內(nèi)皮細(xì)胞、媒介質(zhì)及動(dòng)脈外膜的增殖。該術(shù)語(yǔ)「侵入性手術(shù)」意思為涉及對(duì)該血管內(nèi)皮細(xì)胞有重大破壞 影響的醫(yī)學(xué)或獸醫(yī)技術(shù)，例如，如心臟、肝臟、腎臟或肢體的器官。 該血管包括該主動(dòng)脈、冠狀動(dòng)脈、大腿及腸骨動(dòng)脈與靜脈。該侵入性 手術(shù)可涉及關(guān)于例如，心臟手術(shù)、腹胸手術(shù)、動(dòng)脈手術(shù)、器具部署(例 如血管支架或?qū)Ч?、或動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù)。(例示性支架與導(dǎo)管，以及 其使用方法敘述于美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)案公幵號(hào)第20050177246 、 20050171599、 20050171597、 20050171598、 20050169969、 20050165474、 20050163821、 20050165352、及20050171593)。較佳的侵入性手術(shù)是 血管修復(fù)術(shù)、尤其是球囊血管修復(fù)術(shù)。較佳地該侵入性手術(shù)是對(duì)哺乳 類(lèi)動(dòng)物執(zhí)行，例如靈長(zhǎng)類(lèi)、尤其是人類(lèi)、嚙齒動(dòng)物或兔子、或飼養(yǎng)的 動(dòng)物例如豬、狗或貓。其他VEGF途徑抑制劑及活化劑的篩選方法包含 1) 培養(yǎng)人類(lèi)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)及/或缺乏內(nèi)皮PECAM-1 表達(dá)的人類(lèi)內(nèi)消旋內(nèi)皮瘤細(xì)胞系[REN-野生型(WT)]及/或
REN (mt-rhPECAM-1)表達(dá)人類(lèi)PECAM-1;2) 將該細(xì)胞接觸候選VEGF途徑抑制劑或活化劑；3) 分析該細(xì)胞的LacCer水平及/或該LacCer合成酶、 PECAM-1、 PLA2、 VEGF或VEGFR的一個(gè)或多個(gè)的表達(dá)。該LacCer、 LacCer合成酶、PECAM-1、 PLA2、 VEGF或VEGFR的基 因或蛋白表達(dá)可能藉由實(shí)時(shí)(real-time)PCR、 PCR、反轉(zhuǎn)錄酶PCR、西 方轉(zhuǎn)漬(Western blot)、以及其他所屬領(lǐng)域中熟悉該項(xiàng)技術(shù)者已知的 方法。PECAM-1例示性引物序列如下分別為(正)5， TGACCTTCTGCTCTGTT 3，及(逆)5， TGAGAGGTGGTGCTGACATC 3 ， 。 e -肌 動(dòng)蛋白引物可能包含，例如，分別為(正)5， AGGTCATCACTATTGGCAACGA 3， 及(逆)5， CACTTCATGATGGAATTGAATGTAGTT 3，。在對(duì)象中該VEGF途徑抑制劑降低血管新生的治療能力的確認(rèn)方 法，包括確認(rèn)對(duì)象血管新生的預(yù)治療水平；將該對(duì)象投與治療有效量 的VEGF途徑抑制劑；幷確認(rèn)該對(duì)象血管新生的后治療水平。在一實(shí)施 例，血管新生的減少表明該VEGF途徑抑制劑是有效的。該相關(guān)實(shí)施例 該血管新生的預(yù)治療水平與后治療水平是在有病組織內(nèi)確認(rèn)。評(píng)估該治療能力或在對(duì)象的治療效果的方法，包括藉由該領(lǐng)域已 知方法確認(rèn)血管新生的預(yù)治療水平(例如VEGF途徑成員的表現(xiàn)水平、 身體診斷、組織的目視檢查、在治療前、當(dāng)時(shí)或之后的不同時(shí)間測(cè)量 腫瘤縮小或成長(zhǎng)，該測(cè)量是以例如雙角規(guī)形夾(caliper)測(cè)量)并且接 著將該對(duì)象投與有效量的VEGF途徑抑制劑或活化劑。在投與該化合物 的適當(dāng)一段時(shí)間后(例如在治療初期之后)例如2小時(shí)、4小時(shí)、8小時(shí)、 12小時(shí)或72小時(shí)再次確認(rèn)血管新生水平。該血管新生的調(diào)整表明該治 療的有效。該血管新生的水平可能在整個(gè)治療中周期性地確認(rèn)。例如， 該血管新生可能每幾小時(shí)、天、或周就檢查以評(píng)估該治療的有效性。 血管新生的減少表明以該抑制劑治療是有效的。該所述方法可用于篩 選或選擇對(duì)象，該對(duì)像是可能受惠于VEGF途徑抑制劑治療的。根據(jù)本文所述方法，該疾病組織是肺臟、心臟、肝臟、腫瘤、或 脈管系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)。該血管新生水平可能藉由PECAM-1表達(dá)、 GalT-V表達(dá)、管子形成或LacCer水平確認(rèn)。
如上所述，本發(fā)明包含偵測(cè)及分析VEGF途徑抑制劑及活化劑在治療或避免血管新生相關(guān)癥狀治療能力的方法。該VEGF途徑活性可藉由 參考本文之方法測(cè)量。一般而言，該本文揭露的新穎VEGF相關(guān)步驟發(fā)現(xiàn)VEGF途徑活性 對(duì)血管新生相關(guān)癥狀的變化。本發(fā)明偵測(cè)方法是格式化包含一種或多 種的VEGF途徑成員。更特別地，該偵測(cè)方法包含測(cè)量該去調(diào)整細(xì)胞血 管新生的分子活性的特定步驟。該VEGF相關(guān)步驟是設(shè)法得到VEGF細(xì)胞反應(yīng)。VEGF反應(yīng)細(xì)胞可為 永生化細(xì)胞系或初代培養(yǎng)細(xì)胞(例如由組織或器官所取得)幷表明在一 個(gè)或多個(gè)特定細(xì)胞分子或功能，例如接觸適合劑量的VEGF后的血管新 生，的變化。更具體地， 一個(gè)策略或或策略的組合可識(shí)別VEGF反應(yīng)的哺乳類(lèi)細(xì) 胞。例如一方法，在適當(dāng)生長(zhǎng)培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿種入約1x105個(gè)細(xì)胞。 對(duì)初代培養(yǎng)細(xì)胞，由動(dòng)物取得期望的器官或組織并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法擴(kuò)散 (例如聲裂法、機(jī)械攪動(dòng)、及/或暴露于該領(lǐng)域已知的分散劑，例如去 垢劑及蛋白酶)。 一天或幾天后，從該培養(yǎng)皿移除該生長(zhǎng)培養(yǎng)基幷以磷 酸鹽緩沖鹽清洗該細(xì)胞。接著將該細(xì)胞引入適合的培養(yǎng)基約1至5小 時(shí)，且當(dāng)下加入VEGF去培養(yǎng)。添加該VEGF的劑量將取決于各種參數(shù)， 例如被測(cè)試的該特定細(xì)胞或組織。然而在大部分狀況，在每毫升培養(yǎng) 基中約1 u g至lmg之間的濃度添加該VEGF去培養(yǎng)，較佳地約1 u g至 5001ig之間，更佳地約lng至50ug之間。暴露該細(xì)胞于該VEGF后 約1至60分鐘之間，較佳地約1至10分鐘之間或少于這時(shí)間，移除 該培養(yǎng)基，并將該細(xì)胞溶解于適當(dāng)?shù)牧呀饩彌_液，例如下列詳細(xì)敘述。 接著根據(jù)本文所述任何方法試驗(yàn)該細(xì)胞對(duì)添加該VEGF的反應(yīng)。尤其較佳的VEGF反應(yīng)的哺乳類(lèi)細(xì)胞，包含與血管內(nèi)皮細(xì)胞有關(guān)的 細(xì)胞，例如關(guān)于器官或肢體的血管，尤其是心臟或腎臟細(xì)胞。更特別 地，人類(lèi)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)與內(nèi)皮細(xì)胞。較佳的VEGF途徑抑制劑也包含那些在暴露于VEGF后的VEGF相關(guān) 途徑中表現(xiàn)出良好的調(diào)整一個(gè)或多個(gè)特定分子的能力。尤其于體外偵 測(cè)試驗(yàn)中約0. 1至lOOu g/ml之間的濃度，較佳地約1至10u g/ml之 間，較佳的化合物在該分子的活性(相對(duì)于適合的控制試驗(yàn))表現(xiàn)出減
少或增加至少20%、較佳地至少50%，且更佳地至少90%或更高。該分子的活性在任何各種簡(jiǎn)易可偵測(cè)方法中可減少或增加，該方法包括改變的合成、降解或貯存；蛋白質(zhì)修飾，例如磷酸化作用、或藉由帶有 特定酶的變構(gòu)效應(yīng)(allosteric effect)。尤其，若該目的分子是酶，較佳地VEGF途徑抑制劑包含那些在下 述酶試驗(yàn)中表現(xiàn)出良好活性者。較佳地，在該試驗(yàn)中ICs。是約20uM或 較低，更佳地ICs。是約luM或較低。一般用于特定試驗(yàn)的控制實(shí)驗(yàn)是量身訂制的。例如，大部分的控 制實(shí)驗(yàn)，是關(guān)于使測(cè)試樣品(例如VEGF反應(yīng)的細(xì)胞或其裂解液)遭受 培養(yǎng)基、鹽類(lèi)、緩沖液或水而非可能的VEGF途經(jīng)抑制劑，且該細(xì)胞同 樣接受測(cè)試化合物的劑量。接著將期望的試驗(yàn)根據(jù)本方法執(zhí)行。適合 的控制實(shí)驗(yàn)的特定例子在下文中敘述。該呈現(xiàn)的偵測(cè)方法也可被用于識(shí)別由生物資源取得的VEGF途徑抑 制劑或活化劑，包括調(diào)整VEGF途徑活性的特定生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子 (cytokines)及脂蛋白。該呈現(xiàn)的偵測(cè)方法進(jìn)一步包含測(cè)量在VEGF相關(guān)生化步驟的特定分 子活性的試驗(yàn)。該測(cè)量可藉由標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室操作例如化學(xué)發(fā)光測(cè)試、薄 層層析(TLC)分離、核酸分離與純化、SDS-PAGE膠電泳、自動(dòng)射線照相 術(shù)、閃爍記數(shù)、密度法、北方及西方轉(zhuǎn)漬雜交技術(shù)、及免疫試驗(yàn)(例如 RIA及ELISA測(cè)試)實(shí)施。普遍地，參照Sambrooket al. in #。2ec〃^r 67。/ y吸.'J LsZ 。rat。z7 ife加sJ (2d ed. 1989); 及Ausubel et al. (1989) ， CwrreM尸rotocoJs j./ #o/ect;Jar萬(wàn)icJc^， John Wiley & Sons, New York討論相關(guān)許多該標(biāo)準(zhǔn)方法，該揭露幷入本文以茲參考。在一態(tài)樣，該呈現(xiàn)的體外試驗(yàn)測(cè)量VEGF反應(yīng)的細(xì)胞中該特定酶的 活性。發(fā)現(xiàn)隨著細(xì)胞暴露于VEGF及/或特定VEGF途徑抑制劑，例如PDMP 或其他以下所述者，該酶的活性被調(diào)整。提供額外的體外試驗(yàn)，該試驗(yàn)是測(cè)量一個(gè)或多個(gè)酶，該酶是已發(fā) 現(xiàn)藉由本文所述的VEGF途徑抑制劑所調(diào)整。例如，核苷限苷三磷酸、尤其是環(huán)狀核苷限苷三磷酸，例如胍核 苷限苷三磷酸(GTP)藉由該ras-GTP-結(jié)合蛋白與致癌基因蛋白合幷，例 如ras蛋白(例如負(fù)載ras-GTP)，幷藉由一些確定的方法包括核苷限苷
三磷酸(例如GTP)合幷Ras的直接偵測(cè)。例如，在一方法中，VEGF反應(yīng) 的細(xì)胞是以放射性正磷酸鹽(例如32p-標(biāo)記)對(duì)細(xì)胞內(nèi)該可偵測(cè)標(biāo)記 (detectably-label)的GTP做代謝性標(biāo)記。該標(biāo)記的細(xì)胞藉由VEGF途徑 抑制劑以LacCer培養(yǎng)，且接著清洗并溶解于適合的裂解緩沖液，例如 RIPA(參照下述)。之后，該細(xì)胞裂解液在適合的TLC片上分離。該TLC 片是暴露于X射線薄膜并接著實(shí)施密度法，若需要的話(huà)，去估計(jì)該GTP 與該Ras蛋白的合幷。偵測(cè)負(fù)載ras-GTP的較佳方法揭露于Chatterjee， S. et al.， (1997) 67y一W柳，7:703。同樣地也提供測(cè)量該VEGF途徑酶的方法。例如，在一方法，該VEGF 反應(yīng)的細(xì)胞是以VEGF及可能的VEGF途徑抑制劑培養(yǎng)，清洗幷接著， 暴露于該VEGF后的1至60分鐘后收取、較佳地1至10分鐘或少于。 制備整個(gè)細(xì)胞裂解液并接著實(shí)施SDS-PAGE膠電泳。該膠被轉(zhuǎn)移至適合 的薄膜支撐物幷接著用西方轉(zhuǎn)漬(Western blot)雜交程序以抗體直接 探測(cè)該VEGF途徑成員。額外的在體外適合測(cè)量藉由VEGF及VEGF途徑抑制劑調(diào)整，包括 監(jiān)視細(xì)胞增殖因子的表達(dá)。對(duì)該分析較佳的細(xì)胞增殖因子是增殖細(xì)胞 核抗原(PCNA)。在一適合的方法，該培養(yǎng)的細(xì)胞是在伴隨VEGF途徑抑 制劑之后以VEGF培養(yǎng)，接著以適合的緩沖液清洗。可藉由使用有能力 明確地結(jié)合該P(yáng)CNA的單克隆抗體(例如PC10抗體)偵測(cè)(若想要的話(huà)還 可估計(jì))在培養(yǎng)的細(xì)胞中的PCNA。參考Sasaki, K. ， et al. (1993) Cytometry 14:876-882。該P(yáng)CNA接著在細(xì)胞中可藉由各種免疫學(xué)方法， 包含流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry)或固定的細(xì)胞部位免疫組織化學(xué)顯 像法(immunohistochemical visualization)。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)已被暗示血管新生涉及冠狀動(dòng)脈心臟 病、糖尿病血管并發(fā)癥、發(fā)炎血管疾病與腫瘤轉(zhuǎn)移。雖然，VEGF驅(qū)使 關(guān)于鞘糖脂，例如乳糖基神經(jīng)酰胺的血管新生的機(jī)制是未知的。為證 明在VEGF關(guān)于LacCer誘導(dǎo)血管新生，我們使用在HUVECs中合成LacCer 表達(dá)(GalT-V/VI)的siRNA媒介沉默。這基因沉默顯著地抑制VEGF誘導(dǎo) 的PEC認(rèn)-l表達(dá)與血管新生。再來(lái)，我們使用D-蘇-l-苯基-2-癸酰氨基 -3-嗎啉基-l-丙醇(D-PDMP) ， LacCer合成酶的抑制劑與葡糖神經(jīng)酰胺 (glucosylceramide)合成酶，并顯著地緩和VEGF誘導(dǎo)的PECAM-1表達(dá)與
血管新生。有趣地，這些表現(xiàn)型變化是藉由LacCer反轉(zhuǎn)，但不是藉由 結(jié)構(gòu)相關(guān)化合物例如葡糖神經(jīng)酰胺、雙半乳二糖苷神經(jīng)酰胺及神經(jīng)酰 胺。在缺乏PEC細(xì)-1的該內(nèi)生表達(dá)的人類(lèi)內(nèi)皮細(xì)胞系(REN)， VEGF/LacCer無(wú)法刺激PECAM-1表達(dá)及管子形成/血管新生。雖然在 siRNA細(xì)胞表達(dá)人類(lèi)PECAM-l基因/蛋白，VEGF與LacCer二者誘導(dǎo) PECAM-1表達(dá)及管子形成/血管新生。實(shí)際上，是藉由SU-1498， VEGF 受體酪氨酸激酶抑制劑緩和VEGF誘導(dǎo)的血管新生而非LacCer誘導(dǎo)的血 管新生。同樣地，藉由蛋白激酶C(PKC)與磷脂酶A2(PLA2)抑制劑緩和 VEGF/LacCer誘導(dǎo)的PECAM-l表達(dá)與血管新生。此外，藉由1-吡咯烷二 硫代羧酸(PDTC)、 NF-kB抑制劑、二亞苯基碘(DPI) NADPH氧化酶抑制 劑與N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)抗氧化劑緩和VEGF/LacCer誘導(dǎo)的 PECAM-1表達(dá)與血管新生。這些結(jié)果表明在VEGF治療的內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的 LacCer可能對(duì)于PECAM-1表達(dá)與在血管新生是作為重要的信號(hào)分子。這 發(fā)現(xiàn)以及在我們的報(bào)告中發(fā)展的試劑，可能在體外及體內(nèi)進(jìn)一步研究 中對(duì)于抗血管新生藥物是有效的。
抗體
在本文所述方法中有效的抗體是明確針對(duì)VEGF途徑成員的抗體， 包括VEGF、 VEGFR、 LacCer合成酶、LacCer、 PECAM-1、及PLA2。特別 佳的抗體是那些抑制VEGF途徑成員活性的抗體。以下更完整的敘述產(chǎn) 生在本文所述方法中有效抗體的方法。
例示性的抗體包含LacCer合成酶(GalT-V/VI)抗體，特定地緩和 VEGF誘導(dǎo)的體外血管新生/管子形成。其他用于本文所述方法的例示性 抗體是特定針對(duì)GalT-V肽序列的抗體，包括IGAQVYEQVLRSAYAKRNSSVND及IGMHMI-----RLYTNKNSTLNGT。更多本文所述方法中有效的抗體是特定針對(duì)下列LacCer合成梅(GalT-V/VI)序 列
人類(lèi)合成GalT-V肽
(115) PERLP(119) (145) PTIKLGGHWKP(155) (160) PRWKVAILIP(169)(196) PFRNRHEHLP(178) (178) PVLFRHLLP(186) (316) PEGDTG區(qū)SIP (328)人類(lèi)GalT-VI肽(97) PENFTYSP(104) (104) PYLP(107) (107) PCPEKLP(113) (143) PGGHWRP(149) (154) PRW跳VLIP(163) (163) PFRNRHEHLP(172) (172) PIFFLHLIP(180) (311) PEGDLGKYKSIP(322) (374) PELAP(378)嵌合與人源化單克隆抗體，包含人類(lèi)與非人類(lèi)部分二者的抗體是 可藉由標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)制造。該嵌合與人源化單克隆抗體可藉由該 領(lǐng)域習(xí)知重組DNA技術(shù)制備，例如使用Robinson et al.等人在國(guó)際申 請(qǐng)案PCT/US86/02269所述的方法；Akira， et al.歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)案第 184187號(hào);Taniguchi， M.,歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)案第171496號(hào)；Morrison et al.歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)案第173494號(hào);Neubergeret et al. PCT國(guó)際公開(kāi) 號(hào)W086/01533; Cabilly et al.美國(guó)專(zhuān)利第4816567號(hào)；Cabilly et al. 歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)案第125023號(hào)；Better et al. (1988) Science 240:1041—1043; Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443; Liu et al. (1987) J. Immuno. 139:3521-3526; Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214—218; Nishimura et al. (1987) Cane. Res. 47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314: 446-449 ; 及 Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553—1559); Morrison, S. L. (1985) Science 229:1202—1207; 0i et al. (1986) Bio Techniques 4:214; Winter美國(guó)專(zhuān)利第5225539 號(hào)；Jones etal. (1986)Nature 321:552—525; Verhoeyan et al. (1988)
Science 239:1534 ; 及Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141:4053-4060。全人類(lèi)抗體尤其是供人類(lèi)患者期望的治療。該抗體可使用轉(zhuǎn)基因 鼠制造，該鼠是有能力表達(dá)內(nèi)源免疫球蛋白重和輕鏈基因，但該抗體 是可表達(dá)人類(lèi)重和輕鏈基因。參照，例如Lonberg and Huszar (1995) Int. Rev. Immuno. 13:65-93);及美國(guó)專(zhuān)利第5625126、 5633425、 5569825、 5661016、及5545806號(hào)。此外，例如Abgenix， Inc.公司 (Fremont, Calif.)與Medarex， Inc. (Princeton, N. J.)從事于提供 使用類(lèi)似于上述技術(shù)直接對(duì)抗選擇抗原的人類(lèi)抗體?？墒褂藐P(guān)于「指導(dǎo)選擇」的技術(shù)產(chǎn)生識(shí)別選擇的抗原決定區(qū)的全 人類(lèi)抗體。在這方法中，選擇的非人類(lèi)單克隆抗體，例如鼠類(lèi)抗體， 被用作指導(dǎo)識(shí)別相同抗原決定區(qū)的全人類(lèi)抗體的選擇。這技術(shù)描述于 Jespers et al. (1994) Bio/Technology 12:899-903)。本文中使用的該術(shù)語(yǔ)「單克隆抗體」表明由本質(zhì)上同源的抗體群 取得的抗體，例如除了可能存在于該抗體細(xì)胞的小亞群中的可能自然 發(fā)生突變，該群中的個(gè)別抗體是相同的。本文中該單克隆抗體明確地 包含「嵌合」抗體，其中該重及/或輕鏈的部分是與衍生自特定種類(lèi)或 屬于特定抗體型或亞型的抗體中對(duì)應(yīng)序列是相同的或同源的，而該鏈 其余部分是與衍生自其他種類(lèi)或?qū)儆谄渌贵w型或亞型的抗體中對(duì)應(yīng) 序列是相同的或同源的，該抗體的片段也是一樣，只要他們表現(xiàn)出期 望的拮抗(antagonistic)活性。(參考美國(guó)專(zhuān)利第4816567;及Morrison et al. ， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855(1984))。該呈現(xiàn)的單克隆抗體可使用任何制造單克隆抗體的程序制造，例 如，本發(fā)明的單克隆抗體可使用雜交瘤方法制備，例如Kohler與 Mildtein在Nature, 256:495 (1975)敘述的方法。在雜交瘤方法中， 小鼠或其他適合的宿主動(dòng)物典型地被免疫試劑免疫化以引起制造抗體 的淋巴球?qū)⑻囟ǖ亟Y(jié)合該免疫試劑。該單克隆抗體同樣地可藉由重組DNA方法制造，例如美國(guó)專(zhuān)利第 4816567 (Cabilly et al.) 。 DNA編碼所示單克隆抗體可輕易的分離幷使用傳統(tǒng)程序序列化(例如藉由使用可特定結(jié)合該編碼抗體的重與輕 鏈基因的寡核苷酸探針)?？贵w或活性抗體片段庫(kù)也可使用噬菌體呈現(xiàn) 技術(shù)基因技術(shù)(phage display techniques)產(chǎn)生，例如描述于Burton et al.的美國(guó)專(zhuān)利第5804440號(hào)與Barbas et al.的美國(guó)專(zhuān)利第6096551 號(hào)。體外方法也適合于制備單價(jià)抗體?？贵w的消化去制造其片段，尤 其，F(xiàn)ab片段，可使用該領(lǐng)域慣用的技術(shù)達(dá)成。例如，可使用木瓜蛋白 酶實(shí)施消化。木瓜蛋白酶消化的例子描述在國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)第 W094/29348,公開(kāi)于1994年12月22日，以及美國(guó)專(zhuān)利第4342566號(hào)。 抗體的木瓜蛋白酶消化典型地制造兩個(gè)相同抗原結(jié)合片段，稱(chēng)為Fab 片段，每個(gè)帶有單一抗原結(jié)合部位以及Fc片段殘基。胃液素治療產(chǎn)生 具有兩個(gè)組合部位且仍有能力交互內(nèi)襯(cross-lining)抗原。本文中使用該術(shù)語(yǔ)「抗體或其片段」包含帶有雙或多個(gè)抗原或抗 原決定區(qū)特性的嵌合抗體與雜交抗體、單鏈抗體與片段，例如 F(ab， )2、 Fab， 、 Fab、 scFv及其類(lèi)似物，包括雜交片段。因此，提 供了保持結(jié)合它們特定抗原的能力的該抗體片段。例如，維持HIV gpl20結(jié)合活性的抗體片段被包含在該術(shù)語(yǔ)「抗體或其片段」的意義里。 該抗體及片段可藉由習(xí)知技術(shù)制造，并可根據(jù)在實(shí)例以及在供專(zhuān)一性 與活性抗體篩選與制造的一般方法做專(zhuān)一性與活性篩選。(參考 Harlow and Lane. Antibodies, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Publications, New York (1988))。也包含于該「抗體或其片 段」的意思，是所述的抗體片段與抗原結(jié)合蛋白(單鏈抗體)的共軛物， 例如在美國(guó)專(zhuān)利第4704692號(hào)，其內(nèi)容幷入本文以資參考。該片段，不論是否粘附其他序列與否，可同樣地包含特定區(qū)或特 定氨基酸殘機(jī)的插入、刪除、取代或其他選擇的修飾，其提供該抗體 或該抗體片段的活性相較于未修飾的抗體或抗體片段不會(huì)有顯著的變 化或受損。這些修飾可提供額外的性質(zhì)，例如移除/添加氨基酸二硫結(jié) 合能力，增加生物壽命、改變分泌特征；等等。在任一例子中，該抗 體或抗體片段必定占有生物活性性質(zhì)，例如特定結(jié)合關(guān)聯(lián)(cognate)抗 原。該抗體或抗體片段的功能或活性區(qū)可藉由該蛋白特定區(qū)的突變形 成識(shí)別，接著藉由該表達(dá)的多肽表達(dá)與測(cè)試。該方法對(duì)該領(lǐng)域從事該 技術(shù)者是輕易地顯而易見(jiàn)且該方法可包含該核酸編碼的該抗體或抗體 片段的部位特定(site-specific)突變形成(Zoller， M. J. Curr. Opin.
Biotechnol. 3:348-354 (1992))。本文中使用的該術(shù)語(yǔ)「抗體」或「抗體們」也可表明人類(lèi)抗體及/ 或人源化抗體。許多非人類(lèi)抗體(例如那些衍生自小鼠、大鼠或兔子者) 在人體內(nèi)是自然抗原性的，且因此當(dāng)投與人類(lèi)時(shí)可引起不期望的免疫 反應(yīng)。于是，本發(fā)明中人類(lèi)或人源化抗體的使用提供教示抗體投與人 類(lèi)將引起不期望的免疫反應(yīng)的變化。人類(lèi)抗體也可使用其他技術(shù)制備。人類(lèi)單克隆抗體制造技術(shù)的例 子包含那些Cole et al.所述的(Monoclonal Antibodies and Therapy, Alan R. Liss, p. 77(1985))以及Boerner et al. (J. Immunol. 147(1) :86-95(1991))。人類(lèi)抗體(及其片段)也可使用噬菌體呈現(xiàn)技術(shù) 基因庫(kù)制造(Hoogenboom et al. ， K. Mol. Biol. 227:381 (1991); Marks et al.，丄Mol. Biol. 222:581 (1991))。人類(lèi)抗體也可由轉(zhuǎn)基因動(dòng)物取得。例如，轉(zhuǎn)基因，突變的小鼠可 制造人類(lèi)抗體全譜以反應(yīng)免疫化，已描述于(參考例如，Jakobovitset al.， Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:2551-255(1993); Jakobovitset al.， Nature 362:255-258 (1993);及Bruggermann et al. ， Year in Immunol. 7:33(1993))。明確地，在這些嵌合與種系(germ-line)突變 小鼠中的該抗體重鏈連接區(qū)(J(H)基因的純合子(homozygous)偵測(cè)導(dǎo) 致內(nèi)源抗體制造的完全抑制，而且該人類(lèi)種系抗體基因陣列的成功轉(zhuǎn) 移進(jìn)入該種系突變小鼠導(dǎo)致根據(jù)抗原攻擊的人類(lèi)抗體制造。抗體人源化技術(shù)一般是關(guān)于使用重組DNA技術(shù)處理該DNA序列編 碼抗體分子的一個(gè)或多個(gè)多肽鏈，因此，非人類(lèi)抗體(或其片段)的人 源化形式是嵌合抗體或抗體鏈(或其片段，例如Fv、 Fab、 Fab，、或其 他抗體的抗原結(jié)合部分)，其是包含由非人類(lèi)(供體)抗體的抗原結(jié)合部 位的部分整合進(jìn)入人類(lèi)(受體)抗體的骨架。為產(chǎn)生人源化抗體，已知藉由一個(gè)或多個(gè)供體(非人類(lèi))抗體分子 的CDRs取代一個(gè)或多個(gè)受體(人類(lèi))抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)的殘基， 是去獲得期望的抗原結(jié)合特征(例如該標(biāo)靶抗原特異性與親合力的特 定水平)。在一些例子中，人類(lèi)抗體的Fv骨架(FR)殘基是藉由對(duì)應(yīng)的 非人類(lèi)殘基取代。人源化抗體可能包含既不是發(fā)現(xiàn)于受體抗體也不是 在輸入性CDR或骨架序列的殘基。概括而言，人源化抗體具有一個(gè)或
多個(gè)由非人類(lèi)來(lái)源誘導(dǎo)進(jìn)入的氨基酸殘基。實(shí)際上，人源化抗體是典 型地人類(lèi)抗體，其中一些CDR殘基與可能的一些FR殘基被來(lái)自嚙齒動(dòng)物抗體類(lèi)似部位所取代。人源化抗體普遍地包含至少抗體恒定區(qū)(Fc) 的部分，典型地是人類(lèi)抗體的那部分(Jones et al. ， Nature 321:522-525 (1986)) ; Reichmann et al.， Nature 332:323-327 (1988);及Presta， Curr. Opin. Struct. Biol. 2:593—596 (1992))。 非人類(lèi)抗體的人源化方法是該領(lǐng)域已知的。例如，人源化抗體可 根據(jù)Winter與其同事的方法產(chǎn)生(Jones et al. ， Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al. ， Nature 332:323-327 (1988);及Verhoeyen et al.， Science 239:1534536 (1988))，藉由嚙齒動(dòng)物CDRs或CDR 序列取代該人類(lèi)抗體的對(duì)應(yīng)序列?？捎糜谥圃烊嗽椿贵w的方法也描 述于美國(guó)專(zhuān)利第4816567號(hào)(Cabilly et al.)、美國(guó)專(zhuān)利第5565332 號(hào)(Hoogenboom et al.)、美國(guó)專(zhuān)利第5721367號(hào)(Kay et al.)、美國(guó) 專(zhuān)利第5837243號(hào)(Deo et al.)、美國(guó)專(zhuān)利第5939598號(hào)(Kucherlapati et al.)、美國(guó)專(zhuān)利第6130364號(hào)(Jakobovits et al.)、及美國(guó)專(zhuān)利 第6180377號(hào)(Morgan et al.)。醫(yī)藥組合物與套組本文描述的該小分子、肽、核酸、及抗體療法可能配成醫(yī)藥組合 物幷以套組提供。該醫(yī)藥配方可能也涂布醫(yī)學(xué)裝置或奈米顆粒以作為 傳遞之用。該詞語(yǔ)「醫(yī)藥上可接受載體」是領(lǐng)域中認(rèn)可幷包含適合對(duì)哺乳動(dòng) 物投與本發(fā)明化合物的醫(yī)藥上可接受材料、成分或載劑。該載體包括 液體或固體填料、稀釋液、賦形劑、溶劑或封入膠囊的材料，其是關(guān) 于攜帶或傳送對(duì)象試劑由一器官、或身體的部分到其他器官或身體的 部分。每一載體必須是與其他配方成分相容的意思上是「可接受的」 并且對(duì)患者無(wú)害。 一些作為醫(yī)藥上可接受載體的例子，包括糖、例如 乳糖、葡萄糖及蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉與馬鈴薯淀粉；纖維素、 及其衍生物，例如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素、纖維素乙酸鹽、粉 末狀黃耆膠、麥芽、明膠、滑石；賦形劑，例如可可粉奶油與栓劑蠟; 油，例如花生油、棉籽油、葵花油、芝麻油、橄欖油、玉米油與大豆
油；乙二醇，例如丙二醇；多元醇，例如丙三醇、山梨醇；甘露糖醇、 聚乙二醇；酯，例如油酸乙酯、月桂酸乙酯、瓊脂；緩沖劑，例如氫 氧化鎂與氫氧化鋁；海藻酸；無(wú)熱源(pyrogen-free)水；等滲壓鹽； Ringer' s溶液；乙醇、磷酸鹽緩沖液；及其他用于醫(yī)藥配方的無(wú)毒相 容性物質(zhì)。濕潤(rùn)劑、乳化劑與潤(rùn)滑劑，例如硫酸月桂酯鈉與硬脂酸鎂，還也 著色劑、釋放劑、涂布劑、甜味劑、調(diào)味劑、香料、防腐劑與抗氧化 劑也可用于該組合物。醫(yī)藥上可接受抗氧化劑的例子，包括水溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸、半胱胺酸氯化氫、二硫酸鈉、偏重亞硫酸鈉、亞硫酸鈉及其類(lèi)似物；油可溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸棕櫚酸酯、丁基化羥基茴 香醚(BHA)、 丁基化羥基甲苯(BHT)、卵磷脂、五倍子酸丙酯、ci-生育 酚、及其類(lèi)似物；金屬螯合劑、例如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、 山梨醇、酒石酸、磷酸及其類(lèi)似物。本發(fā)明的配方，包括那些適合口服、鼻、局部、皮膚、口頰、舌 下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、直腸、陰道及/或非口服的投與。該配方可能方便 以單位劑量形式呈現(xiàn)并以任何藥物領(lǐng)域已知方法制備?？膳c載體材料 組合以制造單一劑量的該活性成分劑量形式將普遍地是產(chǎn)生療效的化 合物劑量。概括而言，在一百分比里，這劑量將由活性成份的約1百 分比至約99百分比范圍，較佳地約5百分比至約70百分比，最佳地 約10百分比至約30百分比。制備這些配方或組合物的方法，包括使本發(fā)明的抗體或錯(cuò)合劑與 該載體及，視情況地， 一個(gè)或多個(gè)附加成分結(jié)合的步驟。 一般而言， 該配方是藉由均勻地、詳盡地使本發(fā)明化合物與液體載體或細(xì)微地分 開(kāi)的固體載體結(jié)合、或一起、及接著若需要的話(huà)成形該產(chǎn)物。適合口服投藥的本發(fā)明配方可能的形式為扁囊劑、膠囊、錠劑、 片劑、菱形錠劑(使用調(diào)味成份、通常是蔗糖與阿拉伯膠或黃耆膠)、 粉劑、粒劑、或溶液或水溶液中或非水溶液中懸浮液、或水包油或油 包水液態(tài)乳液、或酏劑或糖漿或喉糖(使用惰性堿、例如明膠與丙三醇 或蔗糖與阿拉伯膠)及/或嘴洗劑及該類(lèi)似物，每一種作為活性成份包 含預(yù)先確定的本發(fā)明化合物劑量。本發(fā)明的化合物可能也以大丸藥、
糖劑或糊劑投與。本發(fā)明供口服投藥的固體劑量形式(膠囊劑、錠劑、片劑、糖衣藥 丸、粉劑、粒劑、及其類(lèi)似物)，該活性成分是與一個(gè)或多個(gè)醫(yī)藥上可 接受載體混合，例如擰檬酸鈉或二鈣磷酸鹽、及/或下列任一種填料 或補(bǔ)充劑，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇、硅酸；粘合 劑，例如羧甲基纖維素、海藻膠、明膠、聚乙烯基吡咯啶酮、蔗糖及/ 或阿拉伯膠；濕潤(rùn)劑列如甘油；崩解劑，例如瓊脂-瓊脂、碳酸鈣、馬 鈴薯或樹(shù)薯淀粉、海藻酸、特定硅酸鹽、碳酸鈉；溶液延遲劑，例如 石蠟；吸收加速劑，例如四及銨鹽化合物；濕潤(rùn)劑，例如十六醇與甘 油單硬脂酸酯；吸收劑，例如高嶺土及膨潤(rùn)土；潤(rùn)滑劑，例如滑石、 硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、月桂硫酸納、及其混合物；及 著色劑。在膠囊、錠劑、片劑及糖衣藥丸的例子中，該醫(yī)藥組合物可 能也包括緩沖劑。類(lèi)似形式的固體組合物可能被用作軟及硬填充明膠 膠囊的填料，及使用該賦形劑如乳糖或牛奶糖以及高分子量聚乙二醇 及其類(lèi)似物。片劑可能藉由壓縮或壓模性制造，幷視情況地帶有一個(gè)或多個(gè)添 加成分。壓縮的片劑可能使用粘合劑(例如明膠或羥丙基甲基纖維素)、 潤(rùn)滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、崩解劑(例如羧基乙酸淀粉鈉或交聯(lián)的 羧甲基纖維素鈉)、表面活性或分散劑制備。壓模成形片劑可能藉由適 合的機(jī)器將與惰性液體稀釋劑濕潤(rùn)的該粉末化合物壓模成形。該片劑、及其他本發(fā)明醫(yī)藥組合物的固體劑量形式，例如糖衣藥 丸、膠囊、錠劑與粒劑可能視情況地與涂布劑與殼體制備或制成，例 如腸內(nèi)涂布劑與其他在醫(yī)藥配方領(lǐng)域中已知的涂布劑。它們也可能被 配方成提供該活性成分的緩慢或控制釋放，例如其中使用各種比例的 羥丙基甲基纖維素鈉以提供期望的釋放方式、其他高分子基質(zhì)、脂質(zhì) 體及/或微球。它們可能藉由例如，經(jīng)由細(xì)菌自留(bacteria-retaining) 濾器過(guò)濾消毒、或藉由合幷可溶于無(wú)菌水的無(wú)菌固體組合物形式的殺 菌劑消毒，或緊接著使用前一些其他無(wú)菌可注射媒介物。這些組合物 可能也視情況地包含乳濁(opacifying)劑及可能是它們僅僅或優(yōu)先地 在該胃腸道的特定部位釋放該活性成分組合物的，視情況地，以延遲 方式?？墒褂玫那度?embedding)組合物的例子包括高分子物質(zhì)及蠟。
該活性成分也可是微封入膠囊形式，若適合的話(huà)還帶有一個(gè)或多個(gè)上 述的賦形劑。供口服投與本發(fā)明化合物的液體劑量型，包括醫(yī)藥上可接受乳化 劑乳劑、微乳劑、溶液、懸浮液糖漿與酏劑。該活性成分外，該液體 劑量型可能包含該領(lǐng)域中普遍使用的惰性稀釋劑，例如水或其他溶劑、 增溶劑與乳化劑，例如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙基醋酸鹽、苯甲 醇、苯甲酸芐酯、丙二醇、1，3-丁二醇、油(尤其棉籽、花生、玉米、 胚芽、橄欖、蓖麻及芝麻油)、甘油、四氫呋喃甲醇、聚乙二醇、與山 梨醇脂肪酸酯、及其混合物。除了惰性稀釋劑外，該口服組合物也可包含佐劑、例如濕潤(rùn)劑、 乳化劑及懸浮劑、甜味劑、調(diào)味劑、著色劑、香料劑與防腐劑。懸浮液，除了該活性化合物，可能包含懸浮劑，例如氧乙基異十 八醇、聚氧乙烯山梨醇、與山梨糖醇酯、微晶纖維素、偏氫氧化鋁、 膨潤(rùn)土、瓊脂-瓊脂與黃蓍膠、及其混合物。供直腸或陰道投藥的本發(fā)明該醫(yī)藥組合物的配方可能以栓劑呈 現(xiàn)，其可劑藉由混合一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明化合物以及一個(gè)或多個(gè)適合的 不刺激賦形劑或載體制備，該賦形劑或載體包括可可粉奶油、聚乙二 醇、栓蠟、或水楊酸鹽，其在室溫下為固體，但在體溫時(shí)則為液體， 并且因此會(huì)融化于直腸或陰道內(nèi)并釋放該活性化合物。本發(fā)明適合陰道投藥的配方，也包括陰道藥栓、棉栓、乳霜、膠 體、糊劑、泡沫或噴霧劑配方，其包含該領(lǐng)域已知適當(dāng)?shù)妮d體。供局部或透皮投與本發(fā)明化合物的劑量型，包括粉劑、噴霧劑、 軟膏、糊劑、乳霜、洗劑、膠體、溶液、貼片、與吸入劑。該活性化 合物可能在無(wú)菌條件下與醫(yī)藥上可接受載體混合，以及與任何可能需 要的防腐劑、緩沖液或推進(jìn)劑。該軟膏、糊劑、乳霜及膠體可能包含，除了本發(fā)明活性化合物外，還有賦形劑，例如動(dòng)物與植物脂肪、油、蠟、石蠟、淀粉、黃蓍膠、纖維素衍生物、聚乙二醇、聚硅氧烷、膨潤(rùn)土、硅酸、滑石及氧化鋅、 或其混合物。除了本發(fā)明活性化合物外，粉劑與噴霧劑可包含賦形劑，例如乳 糖、滑石、硅酸、氫氧化鋁、硅酸鈣及聚酰胺粉末、或這些物質(zhì)的混
合物。噴霧劑可額外地包含慣用的推進(jìn)劑，例如氯氟碳?xì)浠锱c揮發(fā) 性未取代碳?xì)浠?，例如丁垸與丙烷。皮膚貼片具有提供本發(fā)明化合物控制傳遞至身體的額外優(yōu)點(diǎn)。該 劑量型可藉由將該化合物溶解或分散于適當(dāng)媒介物中制造。提升吸收 劑亦可用于增加該化合物進(jìn)入皮膚的量?？山逵商峁┧俾士刂票∧せ?在高分子基質(zhì)或膠體中分散該活性化合物控制該流量速率。眼藥配方，眼用軟膏、粉劑、溶液及其類(lèi)似物亦可考慮包含于本 發(fā)明范圍。適合于非經(jīng)腸胃投藥的本發(fā)明醫(yī)藥組合物，包括一種或多種的本 發(fā)明化合物與一種或多種的醫(yī)藥上可接受無(wú)菌等滲壓水性或非水性溶 液、分散液、懸浮液或乳化液、或無(wú)菌粉末的組合，其可能在使用前 再組成無(wú)菌的可注射溶液或分散液，并可能包含抗氧化劑、緩沖液、 抑菌劑、使配方與受體的血液或懸浮或稠化劑等滲壓的溶解物?？赡苡糜诒景l(fā)明醫(yī)藥組合物的適合的水溶性與非水溶性載體的例 子，包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇、及其類(lèi)似 物)、及其適合的混合物、蔬菜油、例如橄欖油、及可注射的有機(jī)酯， 例如油酸乙酯?？山逵桑缡褂猛坎疾牧?，例如卵磷脂、藉由分散 液中維持該所需顆粒尺寸，及藉由使用界面活性劑維持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。這些組合物可能也包含佐劑，例如防腐劑、濕潤(rùn)劑、乳化劑及分 散劑。微生物作用的避免可能藉由包含抗菌劑及殺真菌劑作確保，例 如對(duì)羥苯甲酸酯、氯丁醇、酚山梨酸、及其類(lèi)似物。也可能期望包含 等滲壓劑，例如糖、氯化鈉、及其類(lèi)似物在該組合物中。此外，該可 注射醫(yī)藥形式的吸收延長(zhǎng)可能藉由包含延遲吸收劑達(dá)成，例如單硬脂 酸鋁與明膠。在一些例子中，為了延長(zhǎng)藥物的效果，則期望去緩慢由皮下或肌 肉內(nèi)注射的藥物吸收。這可藉由使用不良水溶性的晶形或非結(jié)晶形材 料液體懸浮液達(dá)成。那么該藥物的吸收速率就取決于溶解速率，依次， 可能取決于晶體尺寸與結(jié)晶形式。另一選擇，非經(jīng)腸胃投與藥物的延 遲吸收可藉由在油載劑中溶解或懸浮該藥物而達(dá)成。注射儲(chǔ)庫(kù)形式是由生物可降解高分子形成該主題化合物的微膠囊 基質(zhì)制造，例如聚乳酸-聚甘醇酸。視藥物對(duì)高分子的比率，以及所用
的該特定高分子性質(zhì)，可控制該藥物釋放的速率。其他生物可降解高分子的例子包括聚原酸酯(poly(orthoesters))與聚酸酐 (poly(anhydride))。儲(chǔ)庫(kù)注射配方也藉由將藥物置入相容于身體組織 的脂質(zhì)體或微乳液中制備。本發(fā)明可能藉由口服、非經(jīng)腸胃、局部、或直腸地給予制備。當(dāng) 然是藉由適合投藥路徑形式給予。例如，藉由注射、吸入、眼洗液、 軟膏、栓劑等等以片劑或膠囊形式投與；藉由注射、灌入或吸入投與； 局部的藉由洗液或軟膏；及藉由栓劑直腸投與。較佳的是口服投藥。本文中使用的該詞語(yǔ)「非經(jīng)腸胃投藥」及「非經(jīng)腸胃地投與」意 思為除了腸道與局部投藥模式外，通常藉由注射、還包括但不限于， 靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眶內(nèi)、心臟內(nèi)、皮膚內(nèi)、腹 膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、囊下、蛛網(wǎng)膜下、脊髓內(nèi)及 胸骨內(nèi)注射與灌入。本文中使用的該詞語(yǔ)「系統(tǒng)性投藥」、「系統(tǒng)地投與」、「周?chē)耐?藥」意思是化合物、藥物或其他材料的投與，除了以直接進(jìn)入中樞神 經(jīng)系統(tǒng)外，該進(jìn)入患者體系統(tǒng)也因此進(jìn)行新陳代謝及其他類(lèi)似過(guò)程， 例如，皮下投藥。藉由任何適合的投藥路徑，可能投與人類(lèi)及其他動(dòng)物供治療的該化 合物，包括口、鼻、如藉由，例如噴霧、直腸、陰道內(nèi)、腸胃外、腦 池內(nèi)、與局部地，如藉由粉劑、軟膏、或滴液，包括口頰地與舌下地。不論該選擇投藥的路徑，可能以水合物形式使用的本發(fā)明的化合物 及/或本發(fā)明的醫(yī)藥組合物，是藉由熟悉該項(xiàng)技術(shù)者習(xí)知的傳統(tǒng)方法配 方成醫(yī)藥上可接受劑量形式。本發(fā)明醫(yī)藥組合物的該活性成份的實(shí)際劑量水平可能有變化，以便 于得到對(duì)特定患者有效達(dá)到該期望治療反應(yīng)的該活性成分劑量、組合 物及投藥模式，而且是對(duì)患者沒(méi)有毒性的。該選擇的劑量水平將取決于各種因素，包括所使用的本發(fā)明特定化 合物的活性，或該酯類(lèi)、鹽類(lèi)或其氨類(lèi)、該投藥路徑、該投藥時(shí)間、 被使用的特定化合物的該排泄速率、該治療的期間、與該使用特定化 合物組合的其他藥物、化合物及/或材料、該年齡、性別、體重、狀況、 一般健康狀態(tài)與該被治療患者以往病歷、及醫(yī)療領(lǐng)域已知的類(lèi)似因素。
該領(lǐng)域具有熟悉技術(shù)的醫(yī)師或獸醫(yī)可輕易地確認(rèn)與預(yù)測(cè)所需醫(yī)藥 組合物的有效量。例如，該醫(yī)師或獸醫(yī)可一開(kāi)始使用低于所需達(dá)成該 期望治療效果的本發(fā)明醫(yī)藥組合物的化合物劑量水平，并逐漸增加該 劑量直到達(dá)成該期望效果。一般而言，適合的本發(fā)明化合物每天劑量，將是有效產(chǎn)生治療效果 的化合物最低劑量。該有效劑量普遍地將取決于上述因素。概括而言， 當(dāng)使用于該指示的止痛效果，給予患者本發(fā)明化合物的靜脈內(nèi)與皮下 劑量，將由每天體重的每公斤約0. 0001至約100毫克，較佳地由每天每公斤約0. 01至約50毫克，且更佳地約由每天每公斤約1. 0至約100 毫克。有效量是指治療血管新生或相關(guān)疾病的量。如果期望的話(huà)，該活性化合物的有效每日劑量可能投與以一劑量或 二、三、四、五、六或更多次劑量，在一整天適當(dāng)間隔分次地投藥， 視情況地，以單位劑量形式。當(dāng)可能以單獨(dú)投與本發(fā)明化合物時(shí)，較佳地是以醫(yī)藥組合物投與該 化合物。此外，本文所述的該醫(yī)藥組合物可能與一種或多種活性成分 投與，其有助于治療具有HIV感染的對(duì)象。相關(guān)實(shí)施例中，本發(fā)明該 醫(yī)藥組合物可能被配成包含一種或多種額外的活性成分，其有助于治 療具有HIV感染或相關(guān)疾病或癥狀的對(duì)象。如上述制造的該抗體與錯(cuò)合物，可以套組與適當(dāng)?shù)恼f(shuō)明以及其他需 要的試劑提供，以執(zhí)行上述免疫試驗(yàn)。取決于特定使用的免疫試驗(yàn)， 該套組也可包含適合的標(biāo)記與其他包裝的試劑及材料(例如清洗緩沖 液及其類(lèi)似物)。標(biāo)準(zhǔn)的免疫試驗(yàn)，例如上述的試驗(yàn)，可使用這些套組 執(zhí)行。該醫(yī)藥組合物可被包含于容器、包裝物、套組或分配器連同說(shuō) 明一起，例如投藥的文字說(shuō)明，尤其是使用該抗體或錯(cuò)合物去治療或 避免血管新生或相關(guān)疾病的說(shuō)明。該容器、包裝物、套組或分配器也 可能包含，例如有助于治療具有異常血管新生的對(duì)象的一種或多種的 活性成分。供標(biāo)耙LacCer合成酶mRNA的RNAi組合物VEGF途徑抑制劑也包括，例如PECAM-1、 LacCer、 LacCer合成酶、 或PLA2 s iRNA分子。例如，5 ， -CGG AGU GAG UGG CUU AAC A dTdT-3 ，(正
義)、5， UGU UAA GCC ACU CAC UCC G dTdT-3，(反義)。RNAi分子可能 干擾任一個(gè)VEGF途徑成員的mRNA部分。本文中使用的該術(shù)語(yǔ)「RNA干擾」(RNAi)表明RNA的選擇性細(xì)胞內(nèi) 降解。RNAi在細(xì)胞中自然地發(fā)生以移除外來(lái)的RNAs (例如病毒RNAs)。 自然的RNAi于經(jīng)由從無(wú)daRNA分離的片段開(kāi)始，命令其他相似RNA序 列該降解機(jī)制?？蛇x擇地，RNAi可藉由人類(lèi)技術(shù)起始，例如，沉默該 標(biāo)靶基因表達(dá)。有用于RNAi的RNAi分子有時(shí)在本文是表明微小干擾 的隱s(si腿)。藉由「降低或抑制」是表明相較于沒(méi)有使用反義核苷酸寡聚物或用 于RNA干擾的dsRNA治療的樣品，在蛋白或核酸水平造成整體降地較 佳地20%或更高，更佳地50%或更高，及最佳地75%或更高，這是藉由 前述試驗(yàn)所偵測(cè)的(參照「表達(dá)」)。具有「足以互補(bǔ)標(biāo)靶mRNA序列的序列以命令專(zhuān)一標(biāo)耙 (target-specif ic)的RNA干擾(RNAi)」的siRNA意思是該ss-siRNA 具有序列，是足以藉由該RNAi裝置或程序觸發(fā)該標(biāo)耙mRNA的消滅。本發(fā)明各種的方法，包括的步驟，關(guān)于比較「適合的控制」(在本 文可替換地表明為「適當(dāng)?shù)目刂啤?的數(shù)值、水平、特性、特征、性質(zhì) 等等?！高m合的控制」或「適當(dāng)?shù)目刂啤故侨魏晤?lèi)似于有用于比較目的 的一種習(xí)知技術(shù)的控制或標(biāo)準(zhǔn)。在一實(shí)施例，「適合的控制」或「適當(dāng) 的控制」是決定于實(shí)施本文所述的RNAi方法前數(shù)值、水平、特性、特 征、性質(zhì)等等。例如，轉(zhuǎn)錄速率、mRNA水平、轉(zhuǎn)譯速率、蛋白質(zhì)水平、 生物活性、細(xì)胞特征或性質(zhì)、基因型、表現(xiàn)型等等可于執(zhí)行本發(fā)明的 siRNA進(jìn)入細(xì)胞或有機(jī)體前決定。在另一實(shí)施例，「適合的控制」或「適 當(dāng)?shù)目刂啤故菦Q定于細(xì)胞或有機(jī)體內(nèi)的數(shù)值、水平、特性、特征、性 質(zhì)等等，例如展現(xiàn)如正常特征的控制或正常細(xì)胞或有機(jī)體。再于另一 實(shí)施例，「適合的控制」或「適當(dāng)?shù)目刂啤故侵割A(yù)設(shè)的數(shù)值、水平、特 性、特征、性質(zhì)等等。具有「足以互補(bǔ)標(biāo)靶mRNA序列的序列以命令專(zhuān)一標(biāo)耙 (target-specific)的RNA干擾(RNAi)」的RNA鏈意思是該鏈具有序列， 是足以藉由該RNAi裝置或程序觸發(fā)該標(biāo)耙mRNA的消滅。藉由「微小干擾RNAs(siRNAs)」(在該技術(shù)領(lǐng)域中也表明為「短干
擾RNAs」)的意思是具有約10至50個(gè)核苷酸(或核苷酸類(lèi)似物)的分離 的RNA分子，其有能力命令或媒介RNA干擾。該siRNA較佳地是大于 10個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，更佳地是大于15個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，且最佳地是大于 19個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，以用于去識(shí)別被降解的標(biāo)靶基因或mRNA。 19至25 個(gè)核苷酸的范圍是siRNA最佳的尺寸。siRNA也可包括短發(fā)夾RNA，其 中siRNA雙螺旋鏈二者是包含在單一 RNA分子中。siRNA包括dsRNA 的任何形式(特別地是較大dsRNA的分離產(chǎn)物、部分純化的RNA、實(shí)質(zhì) 上純的RNA、合成的RNA、重組制造的RNA)以及藉由添加、消除、取代、 及/或一個(gè)或多個(gè)核苷酸的改變且不同于自然發(fā)生RNA的改變RNA。該 改變可包括非核苷酸材料的添加到，例如該21至23個(gè)nt RNA終端或 內(nèi)部(在該RNA的一個(gè)或多個(gè)核苷酸)。在較佳實(shí)施例，該RNA分子包 含3'羥基。本發(fā)明RNA分子中的核苷酸也可包括非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸，包括 非自然發(fā)生核苷酸或脫氧核糖核苷酸?？傮w而言，所有該改變的RNA 是指RNA的類(lèi)似物。本發(fā)明的siRNA僅需要足以類(lèi)似自然的RNA去具 有調(diào)控RNA干擾(RNAi)的能力。本發(fā)明的RNAi試劑也可包括小發(fā)夾 RNAs (shRNAs)，且表達(dá)建構(gòu)去操控表達(dá)shRNAs。 ShRNAs的轉(zhuǎn)錄是在聚 合酶III(pol III)啟動(dòng)子啟始的，而且被認(rèn)為是在4-5-胸苷轉(zhuǎn)錄終端部 位的2號(hào)位置結(jié)束?；诒磉_(dá)，shRNAs被認(rèn)為折疊成帶有3' UU-懸端 的莖環(huán)(stem-loop)結(jié)構(gòu)；接著，這些shRNAs該終端被處理，轉(zhuǎn)變?cè)?shRNAs成為約21至23個(gè)核苷酸的類(lèi)似siRNA分子。(Brummelkamp et al., Science 296:550-553 (2002); Lee et al， (2002). supra; Miyagishi and Taira， Nature Biotechnol. 20:497-500 (2002); Paddison et al. (2002)， supra; Paul (2002)， supra; Sui (2002) supra; Yu et al. (2002)， supra)。SiRNAs也包括「單鏈微小干擾RNA分子」?！竼捂溛⑿「蓴_RNA分子」 (「ss-siRNA分子」或「ss-siRNA」)。ss-siRNA是活性單鏈siRNA分 子，它以基因特定方式沉默該對(duì)應(yīng)基因標(biāo)靶。較佳地，該ss-siRNA分 子具有約10至50個(gè)或更多核苷酸的長(zhǎng)度。更佳地，該ss-siRNA分子 具有約19至23個(gè)或更多核苷酸的長(zhǎng)度。除了組合物包括ss-siRNA分 子，本發(fā)明其他實(shí)施例包括制造該ss-siRNA分子的方法以及供使用該 ss-siRNA分子的方法(例如研究及/或治療方法)。
本文中使用該術(shù)語(yǔ)「特定地雜交」或「特定地偵測(cè)」表明核酸分子 去雜交樣品核酸的至少約6個(gè)連續(xù)核苷酸的能力?！笜?biāo)靶基因」是被選擇性抑制或「沉默」表達(dá)的基因，例如VEGF 途徑。這沉默是藉由siRNA及藉由分離該標(biāo)耙基因的mRNA，它是藉由 細(xì)胞的RNAi系統(tǒng)從RNA工程前體產(chǎn)生。該RNA前體的雙螺旋莖部分或 片段是互補(bǔ)(例如全互補(bǔ)的)于該標(biāo)耙基因mRNA的約18至40個(gè)或更多 核苷酸反義鏈。本發(fā)明普遍的是關(guān)于藉由使用該VEGF途徑成員的基因及其產(chǎn)物抑 制它們的表達(dá)來(lái)治療或處理血管新生。本發(fā)明的實(shí)施例是關(guān)于包括將 該細(xì)胞接觸化合物的方法，該化合物抑制一個(gè)或多個(gè)VEGF、 VEGFR、 LacCer合成酶、PECAM-1基因的合成或表達(dá)，并使用足以造成該抑制 作用的劑量。不拘泥于理論，該抑制作用是藉由選擇性標(biāo)耙VEGF途徑 成員的DNA或mRNA(例如妨礙該基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、剪接或轉(zhuǎn)譯)達(dá)成。 該VEGF、 VEGFR、 LacCer合成酶、PECAM-1的序列揭露于GenBank Accession Nos. AF38663 (GalT-V) 、 AF38664 (GalT-VI)、NM—008816、 NM—000442 (PECAM1)、 NM_077435、 NM—001025370、 NM—001025369 、 NM_001025368、NM—001025367、NM—003376、NM—001025366、 (VEGF)、 X94263、 XM—497921、 AB065372、 AJ319908、 D64016、NM_002019、 (VEGFR) 及NM_000300、 BC005919、 (PLA2)，其全部?jī)?nèi)容幷入本文以茲參考。RNAi是非常有效的程序，它是藉由雙鏈RNA(dsRNA)在動(dòng)物及植物 細(xì)胞中誘導(dǎo)該同源性mRNA的序列特異性降解(Hutvagner and Zamore (2002)， Curr. Opin. Genet. Dev., 12， 225-232; Sharp (2001)， Genes Dev. ， 15， 485-490)。在哺乳類(lèi)細(xì)胞中，RNAi可藉由微小干擾RNA(siRNA) 的21-核苷酸(nt)雙螺旋觸發(fā)(Chiu et al. (2002), Mol. Cell., 10， 549-561; Elbashir et al. (2001), Nature, 411， 494-498)，或藉 由微RNAs(muRNA)、功能小發(fā)夾RNA(shRNA)、或其他藉由使用帶有RNA 聚合酶III啟動(dòng)子的DNA模板在體內(nèi)表達(dá)dsRNA(Zeng et al. (2002)， Mol. Cell, 9， 1327-1333; Paddison et al. (2002)， Genes Dev. , 16， 948-958; Lee et al. (2002)， Nature Biotechnol. ， 20， 500-505; Paul et al. (2002)， Nature Biotechnol.， 20， 505-508; Tuschl， T. (2002)， Nature Biotechnol. ， 20， 440-448; Yu et al. (2002)， Proc.Natl. Acad. Sci. USA， 99(9)， 6047-6052; McManus et al. (2002)， RNA， 8， 842—850; Sui et al. (2002)， Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 99(6)， 5515-5520)。本發(fā)明特別介紹「微小干擾RNA分子(「siRNA分子」或「siRNA」)」， 制造該siRNA分子的方法及供使用該siRNA分子的方法(例如研究及/ 或治療方法)。本發(fā)明的siRNA分子是由正義鏈與互補(bǔ)反義鏈所組成的 雙鏈分子，該反義鏈具有足以互補(bǔ)于標(biāo)靶mRNA去操控RNAi。較佳地， 該鏈?zhǔn)菍?duì)齊的，所以有至少該沒(méi)有對(duì)齊的鏈終端的1、 2或3堿基(例 如在相對(duì)鏈中發(fā)生的不互補(bǔ)堿基)，所以1、 2或3殘基的懸端發(fā)生在 當(dāng)鏈被退火時(shí)該雙螺旋的一或二終端。較佳地，該siRNA分子具有約 10至50或更多個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度，例如每一鏈包括10至50個(gè)核苷酸(或 核苷酸類(lèi)似物)。更佳地，該siRNA分子在每一鏈中具有約16至30個(gè) (例如16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29 或30)的核苷酸長(zhǎng)度，其中該鏈的一個(gè)是本質(zhì)上互補(bǔ)于，例如至少 80%(或更高，例如85%、 90%、 95%、或100%)互補(bǔ)于，例如具有3、 2、 l或O個(gè)不匹配的核苷酸，標(biāo)靶區(qū)，該標(biāo)靶區(qū)藉由該野型與突變等位基 因(allele)之間的至少一堿基對(duì)區(qū)隔，例如標(biāo)耙區(qū)包括該獲得性 (gain-of-function)突變體，而其他鏈對(duì)于該第一鏈微小干擾RNA分 子是相同或本質(zhì)上相同。在一實(shí)施例中，是藉由使用關(guān)于如RNAi的RNA干擾技術(shù)去抑制該 VEGF、 VEGFR、 LacCer合成酶、PECAM-1 —個(gè)或多個(gè)的表達(dá)。RNAi以高 效及特定方式允許該標(biāo)耙基因表達(dá)的選擇敲低(knockdown)。這關(guān)于將 雙鏈RNA(dsRNA)導(dǎo)入細(xì)胞的技術(shù)，具有序列是對(duì)應(yīng)于該標(biāo)耙基因的外 顯子部分。該dsRNA造成該標(biāo)靶基因的mRNA消滅。參考，例如Hammond et al.， Nature Rev Gen 2:110-119 (2001); Sharp, Genes Dev 15:485-490 (2001)， 二者全部?jī)?nèi)容并入本文以茲參考。RNAi技術(shù)成功使用的方法與程序是本領(lǐng)域已知的，并已描述于，例 如，Waterhouse et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(23): 13959-13964 (1998)。本發(fā)明的該RNAi包括任何可調(diào)整該VEGF、VEGFR、 LacCer合成酶、PECAM-1 mRNA—個(gè)或多個(gè)的選擇性降解的siRNAs。本發(fā)明的siRNAs包含「雙鏈微小干擾RNA分子」(「ds-siRNAj ) 與「單鏈微小干擾RNA分子」(「ss-siRNA」)、制造該siRNA分子的 方法與使用該siRNA分子的方法(例如研究及/或治療方法)。類(lèi)似于該ds-siRNA分子，該ss-siRNA分子具有約10至50個(gè)或更 多核苷酸的長(zhǎng)度。更佳地，該ss-siRNA分子具有約15至45個(gè)核苷酸 的長(zhǎng)度。甚至更佳地，該ss-siRNA分子具有約19至40個(gè)核苷酸的長(zhǎng) 度。本發(fā)明的該ss-siRNA分子進(jìn)一步具有序列，其是「足夠地互補(bǔ)于」 標(biāo)靶mRNA序列以命令專(zhuān)一標(biāo)耙RNA干擾(RNAi)，例如，本文所定義的， ss-siRNA具有序列，是足以藉由該RNAi裝置或程序觸發(fā)該標(biāo)耙mRNA 的消滅。該ss-siRNA分子可被設(shè)計(jì)，所以每個(gè)殘基是互補(bǔ)于該標(biāo)耙分 子內(nèi)的殘基?？商娲兀稍诜肿觾?nèi)制造取代基以增加穩(wěn)定性及/或增 強(qiáng)該分子處理活性(processing activity)。可在鏈中制造取代基或可 制成位于該鏈終端的殘基。該5'終端最佳地是磷酸化的(例如包括磷 酸鹽、二磷酸鹽、會(huì)三磷酸鹽基團(tuán))。該siRNA的3，終端可能是羥基 以促進(jìn)RNAi，由于當(dāng)該活性試劑是ss-siRNA分子時(shí)就不需要3'羥基。 特征是ss-siRNA分子，其中該3'終端(例如該3'糖的C3)缺乏羥基 (例如ss-siRNA分子在3'糖(例如核糖或脫氧核糖)缺乏3'羥基或C3 羥基)。本發(fā)明的該siRNAs包括修飾它們的磷酸鹽糖主鏈或核苷。這些修 飾可被量身訂制以提升選擇性基因抑制，而避免在一些細(xì)胞中藉由 siRNA產(chǎn)生報(bào)告中普遍驚恐的反應(yīng)。此外，修飾可導(dǎo)入該堿基以保護(hù) siRNAs避免該一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源性酶的作用。本發(fā)明的該siRNA以酶制造或全部或部分地合成。此外，本發(fā)明的 該siRNAs可在體內(nèi)或體外合成。針對(duì)生物合成的siRNAs，內(nèi)源性或克 隆的外源性RNA聚合酶可用于體內(nèi)轉(zhuǎn)錄，而克隆的RNA聚合酶可用于 體外?；瘜W(xué)地或酶合成的siRNAs較佳的是在導(dǎo)入該細(xì)胞前純化。雖然該siRNA與該標(biāo)靶區(qū)之間的100百分比的序列相同是較佳的。 但不需要去實(shí)施這發(fā)明。包含一些在該序列中修飾程度的siRNA分子 也可適當(dāng)?shù)毓┍景l(fā)明目的使用。該修飾包括，不論是自然發(fā)生或刻意 地導(dǎo)入，亦不限于突變、刪除或插入?？捎糜谝种芕EGF、 VEGFR、 LacCer 合成酶、PECAM-1 —個(gè)或多個(gè)表達(dá)的特定siRNA例子描述于例子7。藉由siRNAs引導(dǎo)的該標(biāo)靶RNA分離反應(yīng)是高度序列特定性的。大 體而言，包含與該標(biāo)靶基因部分相同的核苷酸序列的si脂A供抑制作用是較佳的。然而，該siRNA與該標(biāo)靶區(qū)之間的100%的序列相同是不需要去實(shí)施本發(fā)明。因此，本發(fā)明具有能夠容忍序列變化的優(yōu)點(diǎn)，該 序列變化可能預(yù)期是因?yàn)榛蛲蛔?、鏈多態(tài)、或進(jìn)化分化。例如，相對(duì)于該標(biāo)靶序列，帶有插入刪除及單點(diǎn)突變的siRNA序列已發(fā)現(xiàn)對(duì)于 抑制作用是有效的。可選擇地，帶有核苷酸類(lèi)似物取代基或插入的 siRNA序列可對(duì)抑制作用是有效的。此外，并非所有siRNA的位置都同樣對(duì)標(biāo)靶識(shí)別有貢獻(xiàn)。該siRNA 中心的失配是最嚴(yán)重的且本質(zhì)上破壞標(biāo)耙RNA分離。相對(duì)地，該siRNA 的3'核苷酸對(duì)于該標(biāo)靶識(shí)別的特定性沒(méi)有顯物的貢獻(xiàn)。尤其，互補(bǔ)于 該標(biāo)靶RNA(例如該引導(dǎo)序列)的該siRNA的3'殘基對(duì)于標(biāo)耙RNA分離 是不嚴(yán)重的。序列相同度可藉由該領(lǐng)域已知的序列比對(duì)與對(duì)齊算法確定。為確定 兩個(gè)核酸序列(或兩個(gè)氨基酸序列)的相同度百分比，該序列是以最理 想比較目的對(duì)齊(例如間隙可導(dǎo)入該地依序列或第二序列作最理想對(duì) 齊)。接著比對(duì)在對(duì)應(yīng)的核苷酸(或氨基酸)位置的該核苷酸(或氨基酸 殘基)。當(dāng)?shù)谝恍蛄兄械奈恢帽辉撓嗤瑲埢紦?jù)作為該第二序列對(duì)應(yīng)的 位置，那么該分子在那位置是相同的。該兩序列之間的相同度百分比 是該序列共享相同位置數(shù)的函數(shù)(例如相似度%=相同位置數(shù)目/全部位 置數(shù)目X100)，視情況地對(duì)該導(dǎo)入間隙的數(shù)目及/或?qū)腴g隙的長(zhǎng)度扣 分。該序列的比對(duì)以及兩序列之間相同度百分比的確定可使用數(shù)學(xué)演 算法達(dá)成。在一實(shí)施例中，該對(duì)齊是產(chǎn)生在經(jīng)過(guò)比對(duì)后具有足夠相同 度的序列特定部分，而不在于具有低程度相同的特定部分(例如局部的 對(duì)齊)。較佳的且不限于局部對(duì)齊演算法的例子，而且是供該序列比對(duì) 使用的例子是Karlin與Altschul的該演算法(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68; Karlin and Altschul修飾于(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77。該演算法并入Altschul， et al.的i亥 BLAST程序(2.0版本)(1990) J. Mol. Biol. 215:403-10。在另一實(shí)施例，該對(duì)齊是藉由導(dǎo)入適當(dāng)?shù)拈g隙作最佳化而且相同度 百分比是確認(rèn)在該對(duì)齊的序列長(zhǎng)度(例如間隙化對(duì)齊)。為得到比對(duì)目
的的間隙化對(duì)齊，間隙化BLAST可使用Altschul et al.,所敘述的內(nèi) 容(1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402。在另一實(shí)施例， 該對(duì)齊是藉由導(dǎo)入適當(dāng)?shù)拈g隙作最佳化而且相同度百分比是確認(rèn)在該 對(duì)齊序列的整體長(zhǎng)度(例如總體對(duì)齊)。較佳的且不限于供使用于序列 總體比對(duì)的數(shù)學(xué)演算法例子是Myers與Miller的該演算法CABIOS (1989)。該演算法并入ALIGN程序(2. 0版本)，其是GCG序列對(duì)齊軟件 包的部分。當(dāng)使用ALIGN程序作氨基酸序列比對(duì)時(shí)，使用PAM120重量 殘基表、12分的間隙長(zhǎng)度扣分、及4分的間隙扣分。在該siRNA與該標(biāo)靶基因的部分之間，高于90%的序列相同度，例 如91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或甚至100%的序 列相同度是較佳的?？蛇x擇地，該ss-siRNA可能功能地定義為核苷酸 序列(或寡核苷酸序列)，其是有能力與該標(biāo)靶基因轉(zhuǎn)錄部分雜交 (400mM的NaCl、 40mM的PIPES pH值6. 4、 lmM的EDTA、 50。C或70°C 雜交12至16小時(shí)，接著清洗)。更較佳的雜交條件包括，在7(TC的 1XSSC中或5(TC的1XSSC中，50%的甲酰胺雜交，接著在70。C的0. 3XSSC 中清洗；或在7(TC的4XSSC中或5(TC的4XSSC中，50%的甲酰胺雜交， 接著在67'C的1XSSC中清洗。預(yù)料是小于50個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)度的雜交體， 該雜交溫度應(yīng)該在5至l(TC，低于該雜交體的熔點(diǎn)(Tm)，其中該Tm 是根據(jù)該下列方程式確定。小于18個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)度的雜交體， Tm(°C)=2(A+T堿基數(shù)量)+4(G+C堿基數(shù)量)。18至49個(gè)堿基對(duì)之間長(zhǎng) 度的雜交體，Tm(。C)二81. 5+16. 6(loglO[Na+])+0. 41 (% G+C)-(600/N)， 其中N是雜交體中的堿基數(shù)量，而[Na+]是雜交緩沖液中該鈉離子的濃 度(1XSSC的[Na+]濃度為0. 165M)。多核苷酸雜交嚴(yán)謹(jǐn)條件的更多例子 提供在Sambrook， J. ， E. F. Fritsch、及T. Maniatis， 1989， Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. ， chapters 9 and 11、 及Current Protocols in Molecular Biology, 1995， F. M. Ausubel et al. ， eds. ， John Wiley & Sons, Inc. ， sections 2. 10 and 6. 3—6. 4， 其內(nèi)容并入本文以茲參考。該相同的核苷酸序列長(zhǎng)度可能至少約10、 12、 15、 17、 20、 22、 25、 27、 30、 32、 35、 37、 40、 42、 45、 47或 50個(gè)堿基。 在較佳的態(tài)樣中，本發(fā)明的該RNA分子是被修飾以提供細(xì)胞培養(yǎng) 的血清或生長(zhǎng)媒介質(zhì)穩(wěn)定。為了提升該穩(wěn)定性，該3，殘基可能被穩(wěn)定 去對(duì)抗降解，例如它們可能經(jīng)過(guò)選擇，因此是由嘌呤核苷酸組成，尤 其是腺苷或鳥(niǎo)苷核竿酸?？蛇x擇地，藉由修飾類(lèi)似物的嘧啶部位取代基，例如藉由2'-脫氧胸苷的尿苷取代基是可容忍的，而且并不影響 該RNA干擾的效率。例如，不存在2'羥基可能會(huì)顯著提升組織培養(yǎng)媒 介質(zhì)中該siRNAs的耐核酸酶性。本發(fā)明的實(shí)施例中，該RNA分子可能包含至少一種修飾過(guò)的核苷 酸類(lèi)似物。該核苷酸類(lèi)似物位置可能在該標(biāo)耙專(zhuān)一活性位，例如該RNAi 媒介活性無(wú)本質(zhì)上被影響，例如在該RNA分子的5'終端及/或3'終 端的區(qū)域。尤其，可能藉由并入修飾過(guò)的核肝酸類(lèi)似物穩(wěn)定該終端。較佳的核苷酸類(lèi)似物包括糖修飾及/或主鏈修飾的核糖核苷酸(例 如包括對(duì)該磷酸鹽糖主鏈的修飾)。例如，可能修飾該中性RNA的磷酸 二酯鍵以包括至少氮或硫雜原子中的一個(gè)。較佳的主鏈修飾核糖核苷 酸，連接至相鄰的核糖核苷酸的該磷酸酯基是藉由修飾基置換，例如 硫代磷酸酯(phosphothioate)基。較佳的糖修飾核糖核苷酸，該2， 0H 基是藉由選自H、 0R、 R、鹵素、SH、 SR、 NH2、 NHR、 NR2或0N基取代， 其中R是C1至C6垸基、烯基或炔基而鹵素是F、 Cl、 Br或I。同樣較佳的是核堿基(nucleobase)修飾的核糖核苷酸，例如核糖 核苷酸，其包含至少一種非自然發(fā)生核堿基而非自然發(fā)生的核堿基。 堿基可能被修飾去阻礙該腺苷腺嘌呤酶的活性。例示性的修飾核堿基 包括，但不限于在5號(hào)位置修飾的尿苷及/或胞苷，例如5_(2-氨基) 丙基尿苷、5-溴尿苷；在8號(hào)位置修飾的腺苷及/或鳥(niǎo)苷，例如8-溴鳥(niǎo) 苷；脫氮核苷酸，例如7-脫氮-腺苷；0-及N-烷基化核苷酸，例如N6-甲基腺苷是合適的。應(yīng)注意的是可能組合該上述修飾。本發(fā)明的該核酸組合物包括如本文所述的siRNA與siRNA衍生物 二者。例如，可運(yùn)用交聯(lián)以改變?cè)摻M合物的藥物動(dòng)力學(xué)，例如，增加 體內(nèi)半生期。因此，本發(fā)明包括siRNA衍生物，其包括具有核酸的兩 個(gè)互補(bǔ)鏈siRNA，而該兩個(gè)鏈?zhǔn)墙宦?lián)的。本發(fā)明也包括具有結(jié)合至自身 的3'終端(例如肽)、有機(jī)組合物(例如染料)、或該類(lèi)似物的非核酸部 位的siRNA衍生物。以這種方式修飾siRNA衍生物可能改進(jìn)細(xì)胞攝取，
或相較于該對(duì)應(yīng)siRNA提升了該產(chǎn)生siRNA衍生物的細(xì)胞標(biāo)耙活性， 該修飾對(duì)于在該細(xì)胞內(nèi)追蹤該siRNA衍生物是有用的，或者相較于該 對(duì)應(yīng)siRNA改善了該siRNA衍生物的穩(wěn)定性。本文中所提及的資料文件全部?jī)?nèi)容并入本文以茲參考例子以下進(jìn)一步由非限制性例子說(shuō)明本發(fā)明例1試劑-擴(kuò)充的材料與方法可在http:〃circres. ahaiournals. org 取得線上補(bǔ)充資料。細(xì)胞培養(yǎng)-人類(lèi)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)與內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)媒介質(zhì) EGM 是購(gòu)買(mǎi)自Cambrex (Walkersville， MD)，并培養(yǎng)在加有10%的胎 牛血清(FBS)的EGM 培養(yǎng)基。缺乏內(nèi)源性PECAM-1表達(dá)與REN (mt-rhPECAM-l)表達(dá)人類(lèi)PECAM-1的人類(lèi)內(nèi)消旋內(nèi)皮瘤細(xì)胞系[(REN-野生型(WT))]是由Dr. Steven Albelda， University of Pennsylvania Medical Center, USA. REN-WT慷慨提供，該細(xì)胞系生長(zhǎng)于加有10%FBS 的RPMI中。REN (mtrhPECAM-1)是培養(yǎng)于帶有G418(0. 5g/L Gibco)的 相同培養(yǎng)基中。LacCer合成的確定-在指示的時(shí)間間隔，將細(xì)胞以PBS清洗三次并 萃取脂質(zhì)，并且執(zhí)行如前述藉由HPLC確定鞘糖脂。LacCer合成酶活性的確定-是使用如前述UDP- [14C]半乳糖作為核 苷酸糖供體以及葡萄糖神經(jīng)酰胺作為受體測(cè)量以VEGF培養(yǎng)的細(xì)胞中該 LacCer合成酶的活性。LacCer合成酶(GalT-V siRNA)的合成與轉(zhuǎn)染-根據(jù)該(N19) TT規(guī)則， 該人類(lèi)GalT-V cDNA的siRNA序列[基因銀行編號(hào)AF038663]分別是 5' -CGG AGU GAG UGG CUU AAC A dTdT-3，(正義)、5， — UGU UAA GCC ACU CAC UCC G dTdT- 3'(反義)。使用的零亂的(負(fù)控制)siRNA分別是5，-AUG GUG AUU AGA CUG UAC C dTdT - 3，(正義)、5， - AAG CGU ACU AGG AUC AGU A dTdT- 3 v (反義)。HUVECs是使用陽(yáng)離子脂質(zhì)體 (Oligofectamine) (Invitrogen公司)轉(zhuǎn)染siRNA。實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄PCR-實(shí)時(shí)RT-PCR是以Bio-Rad iCycler系統(tǒng)實(shí)施。該引 物對(duì)是由1st BASE (Singapore)被設(shè)計(jì)(引物探求整合(Primer Quest -
Integrated) DNA技術(shù))與合成。PECAM-1該引物序列分別如下(正)5' TGACCCTTCTGCTCTGTT 3，及(逆)5， TGAGAGGTGGTGCTGACATC 3， 。
P -肌 動(dòng)蛋白引物分別是(正)5' AGGTCATCACTATTGGCAACGA 3'及(逆)5， CACTTCATGATGGAATTGAATGTAGTT 3'。熱循環(huán)條件如下在94° C初始變 性10分鐘，接著分別在94° C/30秒、60。 C/40秒及72° C/l分鐘作 40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)。最后在72° C、 IO分鐘完成延伸。西方免疫轉(zhuǎn)漬法分析(Western Immunoblot Analysis)-藉由10% SDS- PAGE分解25克的蛋白并接著轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。藉由山葵過(guò) 氧化酶結(jié)合二次抗體(horseradish peroxidase _ conjugated secondary antibody)使用化學(xué)發(fā)光試劑盒顯現(xiàn)該膜結(jié)合型初代抗體。 接著使用分子動(dòng)力影像掃描器對(duì)該薄膜作密度掃描，并使用Image Quant軟件作分析。體外血管新生/管子形成試驗(yàn)-體外血管新生試驗(yàn)是使用Chemicon 公司(Temecula， CA)販?zhǔn)鄣奶准?shí)施。統(tǒng)計(jì)分析-所有試驗(yàn)是以二重測(cè)定或三重測(cè)定執(zhí)行并以平均數(shù)土 標(biāo)準(zhǔn)方差(土 S.D)表達(dá)。學(xué)者的t測(cè)驗(yàn)是用于評(píng)估該數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)的意義。 P 〈0.05是被認(rèn)為重要的。例2VEGF誘導(dǎo)PECAM-1函A及蛋白質(zhì)表達(dá)藉由不同濃度的VEGF(5至30 ng/ml)與不同時(shí)間間隔培養(yǎng)HUVECs 確定該VEGF對(duì)PECAM-1表達(dá)的效果。在該P(yáng)EC雄-1 mRNA的表達(dá)存有 劑量依賴(lài)性。當(dāng)以VEGF(30ng/ml、 4小時(shí))治療HUVECs時(shí)，藉由實(shí)時(shí) RT-PCR確定，觀察到PECAM-1最大的mRNA表達(dá)(圖1A)。類(lèi)似地，當(dāng) 不同時(shí)間點(diǎn)用25 ng/ml的VEGF治療HUVECs時(shí)，如藉由實(shí)時(shí)RT-PCR 確定，在4至5小時(shí)觀察到最大的PECAM-1 mRNA表達(dá)之后就減少(圖 1B)。進(jìn)一步地，以VEGF(30ng/ml)培養(yǎng)4小時(shí)后，PEC雄-1蛋白質(zhì)表 達(dá)是最大的(圖1C)。當(dāng)HUVECs以VEGF(25ng/ml)培養(yǎng)不同的時(shí)間間隔， 在4小時(shí)時(shí)PECAM-1蛋白質(zhì)表達(dá)是最大的(圖ID)。 例3VEGF刺激LacCer合成并藉由D-PDMP消除
如圖2A所示，以VEGF(25ng/ml)治療HUVECs，在時(shí)間依賴(lài)模式中 顯著地刺激該LacCer的重新合成[(圖2A、區(qū)塊A)開(kāi)口范圍]，其提早 在培養(yǎng)的10分鐘發(fā)生，但之后在VEGF治療的細(xì)胞持續(xù)高水平。明顯 相對(duì)地，以20 u M的D-PDMP預(yù)治療HUVECs [(雙醣脂(glycosylceramide) 合成酶的抑制；其阻擋由神經(jīng)酰胺該葡萄糖神經(jīng)酰胺(GlcCer)的合成) 與合成LacCer]緩和VEGF誘導(dǎo)的LacCer生物合成[(圖2A、區(qū)塊A)實(shí) 心范圍]。VEGF也刺激GlcCer[(圖2A、區(qū)塊B)開(kāi)口范圍]的生物合成 以及D-P畫(huà)P預(yù)治療提早在培養(yǎng)的10分鐘抑制了 VEGF誘導(dǎo)的GlcCer 合成[(圖2A、區(qū)塊B)實(shí)心范圍]。另一方面，Gb0se3Cer的水平、LacCer 的a -半乳糖化產(chǎn)物、在VEGF治療細(xì)胞中的合成、帶有及不帶有D-PDMP 是類(lèi)似的(未顯示數(shù)據(jù))。 例4藉由D-PDMP消除以及藉由LacCer反轉(zhuǎn)VEGF誘導(dǎo)的PECAM-1表達(dá)與D-PDMP(IO至30uM)作HUVECs的預(yù)培養(yǎng)，施加VEGF誘導(dǎo)的 PECAM-1表達(dá)的濃度依賴(lài)性抑制(圖2B)。與D-PDMP (20 u M)作HUVECs 的預(yù)培養(yǎng)90分鐘，接著藉由和VEGF(25ng/ml)培養(yǎng)也消除了 PECAM-1 mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)，而這是藉由LacCer繞道(圖2C、 3B)。 例5LacCer特定地對(duì)PECAM-1表達(dá)及血管新生反轉(zhuǎn)該D-PDMP的抑制效果當(dāng)HUVECs與GlcCer、 DGDG或C2神經(jīng)酰胺(每一個(gè)皆為2. 5 ^M)培 養(yǎng)4小時(shí)，并不會(huì)誘導(dǎo)PECAM-1表達(dá)(圖3A)。此外，以D-PDMP治療 HUVECs，接著與GlcCer、 DGDG或C2神經(jīng)酰胺培養(yǎng)無(wú)法對(duì)于PECAM-1表達(dá) (圖3B)及血管新生(圖3C-區(qū)塊e、 f及圖3D)將該D-P麗P的抑制效果繞 道。相對(duì)地，LacCer顯著地誘導(dǎo)PECAM-l表達(dá)及血管新生且不受D-P畫(huà)P 及VEGF的存在與否影響(圖3B、 C-區(qū)塊b及圖3D)。這些觀察結(jié)果暗示 VEGF誘導(dǎo)的PECAM-1表達(dá)及血管新生是緊密相關(guān)于LacCer并藉由 LacCer調(diào)節(jié)。 例6苯基棕櫚酰胺嗎啡丙醇(PPMP)抑制VEGF誘導(dǎo)的PECAM-1表達(dá)及血管新 生并藉由LacCer繞道發(fā)現(xiàn)與PPMP(20y M)(特定供葡萄糖神經(jīng)酰胺合成酶的抑制劑)作 HUVECs的預(yù)培養(yǎng)，造成VEGF誘導(dǎo)的PECAM-1表達(dá)及血管新生的緩和(圖 4A和B)。對(duì)于VEGF誘導(dǎo)的PECAM-l表達(dá)及血管新生，LacCer反轉(zhuǎn)該 PPMP抑制效果(圖4A和B) 。 GlcCer也反轉(zhuǎn)了關(guān)于PECAM-1表達(dá)與血管 新生的該P(yáng)PMP抑制效果(圖4A和B)，但是不及于LacCer。因此，這 些發(fā)現(xiàn)暗示LacCer合成酶的VEGF標(biāo)靶是在HUVECs中PECAM-1表達(dá)與 血管新生的關(guān)鍵。 例7LacCer合成酶(GalT-V)基因脫落緩和PECAM-1表達(dá)與血管新生為了研究是否LacCer特定地需要去媒介VEGF誘導(dǎo)的PECAM-1表 達(dá)與血管新生，我們直接對(duì)人類(lèi)GalT-V使用siRNA雙螺旋去沉默 GalT-V基因表達(dá)。西方免疫轉(zhuǎn)漬試驗(yàn)是使用由HUVECs和突變CHO細(xì)胞 系的二個(gè)個(gè)別制備物所制備的細(xì)胞裂解液過(guò)表達(dá)GalT-V，顯示該兔子 的多克隆GalT-V抗體(IgG)明確地以明顯的約55kDa的分子重量和 GalT-V反應(yīng)(圖5A)。此外，GalT-V專(zhuān)一的siRNA雙螺旋(100nM)轉(zhuǎn)染 顯著地減小(約70%GalT-V)HUVECs中蛋白質(zhì)表達(dá)(圖5B)。再者，當(dāng)與 零亂的siRNA治療細(xì)胞比較，這些細(xì)胞內(nèi)的該GalT-V酶活性也減小約 62%(圖5C)。進(jìn)一步地，研究對(duì)于PECAM-1表達(dá)與血管新生VEGF在 GalT-V沉默的HUVECs中的效果。在PECAM-1表達(dá)沒(méi)有觀察到改變(圖 6A)，且當(dāng)與零亂的siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞比較(圖6B-區(qū)塊B)，在以LacCer 合成酶(GalT-V)沉默的VEGF治療細(xì)胞中觀察到減弱的血管新生。這些 結(jié)果提供LacCer是在HUVECs中媒介VEGF誘導(dǎo)的PECAM-1表達(dá)與血管 新生的證據(jù)。 例8PECAM-1是VEGF/LacCer誘導(dǎo)血管新生所需為了研究是否PECAM-1是VEGF/LacCer誘導(dǎo)血管新生所絕對(duì)需要， 我們以PECAM-1單克隆抗體預(yù)治療HUVECs，接著以VEGF或LacCer培養(yǎng)。 在PECAM-1 mAb(單克隆抗體)而非小鼠IgG預(yù)治療細(xì)胞中，VEGF/LacCe 后治療不會(huì)顯著地誘導(dǎo)血管新生(圖7A、區(qū)塊e、 f和g)。進(jìn)一步地，為 了解是否PECAM-l對(duì)于VEGF/LacCer血管新生是重要的，我們對(duì)REN (WT) 細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，該細(xì)胞表現(xiàn)型地類(lèi)似內(nèi)皮細(xì)胞，但是缺乏內(nèi)源性 PECAM-1表達(dá)。另一方面，如前述根據(jù)在REN WT以及建立的REN (mt-rhPECAM-l)轉(zhuǎn)染PEC細(xì)的組成型表達(dá)的CMV啟動(dòng)子，2.5 kb全人類(lèi) PECAM-1 cDNA被克隆成哺乳類(lèi)表達(dá)載體pcDNA3(Invitrogen公司)。27當(dāng) 與2% FBS治療的細(xì)胞比較(圖8A)，在REN (WT)細(xì)胞中VEGF/LacCer無(wú) 法在該體外血管新生試驗(yàn)中形成類(lèi)似管子結(jié)構(gòu)(圖8B、 C)。另一方面， 在以人類(lèi)PECAM-1基因轉(zhuǎn)染的REN細(xì)胞中，當(dāng)與控制組比較(圖8D)，在 該體外血管新生試驗(yàn)VEGF/LacCer誘導(dǎo)管子形成(圖8E、 F)。因此，這 些實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PECAM-1表達(dá)是VEGF/LacCer誘導(dǎo)血管新生所需的，此 夕卜，觀察到VEGF受體(KDR/Flk-1)拮抗劑SU1498所做的HUVECs預(yù)治療， 接著以VEGF而非LacCer培養(yǎng)是無(wú)法誘導(dǎo)管子形成/血管新生，這暗示該 KDR/Flk-1對(duì)VEGF的需要去引起血管新生(圖7c、 d及h)。這些觀察暗 示LacCer是VEGF誘導(dǎo)的信號(hào)途徑該KDR/Flk-1的下游，該途徑是導(dǎo)致在 HUVECs中PECAM-1表達(dá)與血管新生。 例9PKC與PLA2抑制劑緩和LacCer誘導(dǎo)的血管新生當(dāng)與載體(DMSO)單獨(dú)治療的細(xì)胞比較，PKC抑制劑CC (5.0 u M)、 GO 6850及6976 (50 nM)與PIA抑制劑BPB (10 wM)及MAFP (3.0 u M) 消除VEGF/LacCer誘導(dǎo)的PECAM-l表達(dá)(參照?qǐng)D1A線上補(bǔ)充資料)與管子 形成(參照?qǐng)D1B線上補(bǔ)充資料)。這暗示藉由招募PKC與PLA2， LacCer誘 導(dǎo)PECAM-1表達(dá)，以及這些是下游信號(hào)事件，也就是LacCer可招募去誘 導(dǎo)PECAM-1表達(dá)與血管新生。 例10經(jīng)由NF- k B活化作用VEGF/LacCer誘導(dǎo)PECAM-1表達(dá)以抗氧化劑(例如NAC、 NAPDH氧化酶抑制劑(DPI)或NF- ic B抑制劑 (PDTC))作HUVECs的預(yù)治療，顯著地減弱VEGF/LacCer誘導(dǎo)的 PEC扁-I (參照?qǐng)D2A線上補(bǔ)充資料)與胞質(zhì)NF- k B表達(dá)(參照?qǐng)D2A線上補(bǔ) 充資料)。這些結(jié)果暗示VEGF誘導(dǎo)的LacCer重新合成，可選擇地外源添 加的LacCer可觸發(fā)自由基產(chǎn)生，推測(cè)經(jīng)由可活化NF-k B的NADP (H)氧 化酶去誘導(dǎo)PECAM-1表達(dá)。17—19 例11L-PDMP刺激PECAM-1表達(dá)與血管新生以往表明過(guò)L-PDMP是LacCer合成酶的強(qiáng)效活化劑。17、3°因此，確定 的是對(duì)于PECAM-1表達(dá)與血管新生L-PDMP是有效的。當(dāng)細(xì)胞以L-P薩P 增加的濃度治療時(shí)，其顯著地誘導(dǎo)PECAM-1表達(dá)(參照?qǐng)D3A線上補(bǔ)充資 料)與血管新生(參照?qǐng)D3B線上補(bǔ)充資料)。這些觀察顯示PDMP立體易構(gòu) 物是關(guān)于LacCer合成酶的上調(diào)與下調(diào)、PECAM-1表達(dá)與血管新生。為了確定在誘導(dǎo)血管新生方面VEGF可能招募LacCer的機(jī)制，使用 藥物學(xué)與分子的方法二者而去操作負(fù)責(zé)LacCer生物合成酶。既然VEGF 誘導(dǎo)LacCer合成酶活性，首先我們使用D-PDMP，最初被表示為GlcCer 的抑制劑33而后來(lái)被證明是純化的LacCer合成酶抑制劑。3°' 33' 34我們的 研究提供證明藉由D-PDMP以劑量依賴(lài)性模式抑制了 VEGF誘導(dǎo)的 LacCer/GlcCer合成，PECAM-1基因/蛋白質(zhì)表達(dá)與血管新生。此外，這 抑制效果是藉由LacCer繞道而非GlcCer，這暗示VEGF瞄準(zhǔn)LacCer合成 酶去誘導(dǎo)血管新生。近來(lái)，Pannu"證明IFN(干擾素)或脂多糖 (lipopolysaccharide) (LPS)在神經(jīng)源細(xì)胞中治療也招募LacCer去誘 導(dǎo)可誘導(dǎo)的一氧化氮合成酶(iNOS)并加速小鼠脊髓損傷；TNF誘導(dǎo)的星 形細(xì)胞增生與在大鼠脊髓損傷中星形細(xì)胞增生。這些事件是藉由 D-PDMP以及LacCer合成酶反義媒介的沉默(GalT-2)消除。36過(guò)去，D-PDMP已被表示緩和軸突長(zhǎng)出并改善破骨細(xì)胞(osteoclast) 形成37、 38與大動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增生。"雖然D-PDMP也可藉由提升神該經(jīng) 酰胺的細(xì)胞水平去誘導(dǎo)雕亡，如上述研究。37'38，而且在該研究中 D-PDMP (20 u M)直到4至6小時(shí)還不會(huì)誘導(dǎo)在HUVECs中的凋亡(未顯示 數(shù)據(jù))。整體而言，在體內(nèi)與體外多表現(xiàn)形變化中D-P畫(huà)P已被廣泛地用 以描述該LacCer合成酶/LacCer的角色。相對(duì)地，刺激該LacCer合成酶 活性s。的立體異構(gòu)物L(fēng)-PDMP，在我方研究中刺激了PECAM-1表達(dá)與血管 新生。因此PDMP的立體異構(gòu)物，藉由LacCer合成酶的功效可改變表現(xiàn) 型變化，例如前述研究中的細(xì)胞增生15—22與血管新生/管子形成。為了進(jìn)一步確定該VEGF作用標(biāo)靶是LacCer而不是GlcCer，我們 使用PPMP， 一種GlcCer合成酶的特定抑制劑。再者，類(lèi)似PPMP， D-PDMP 也緩和VEGF誘導(dǎo)PECAM-1表達(dá)與血管新生而且這是藉由LacCer繞道。 一種更直接的方式去確定于我方研究在VEGF誘導(dǎo)PECAM-1表達(dá)與血管 新生中該LacCer合成酶/LacCer的角色，是使用siRNA媒介的基因脫 落。該LacCer合成酶/GalT-V表達(dá)是在HUVEC沉默且接著比較其對(duì)VEGF誘導(dǎo)的PECAM-1表達(dá)與血管新生的效果?？偨Y(jié)在圖6A、 6B的結(jié)果暗示 LacCer合成酶(GalT-V) siRNA在HUVECs中沉默，貢獻(xiàn)了減少約70%在 該GalT-V基因/蛋白質(zhì)脫落并且緩和VEGF誘導(dǎo)的PECAM-1基因表達(dá)與 血管新生。我方的研究中，REN細(xì)胞(沒(méi)有PECAM-1的細(xì)胞)對(duì)于VEGF/LacCer 誘導(dǎo)的血管新生是無(wú)反應(yīng)的。相對(duì)地，在REN細(xì)胞表達(dá)PECAM-1全長(zhǎng)cDNA 的VEGF/LacCer治療，在血管新生體外試驗(yàn)對(duì)關(guān)于PECAM-1與類(lèi)似管子 的形成有強(qiáng)烈地反應(yīng)(圖8)。也觀察到在HUVECs中該P(yáng)ECAM-1抗體的使 用緩和了血管新生1。、"。因此LacCer的藥物學(xué)及/或基因操作逆向地影 響PECAM-1基因/蛋白質(zhì)表達(dá)與血管新生。PKC/PLA2特定抑制劑的使用，在本研究中發(fā)現(xiàn)，VEGF誘導(dǎo)LacCer 重新合成并接續(xù)地招募PKC/PLA2去誘導(dǎo)HUVECs中血管新生/管子形成。 此外，我方也以文件證明在前單核細(xì)胞系(U-937)中，LacCer特定地刺 激該胞質(zhì)PKCa/e的易位至該細(xì)胞薄膜，其被認(rèn)為是因?yàn)檫@些蛋白質(zhì) 的活化作用。22最近，對(duì)于在腫瘤血管新生中該l-磷酸鞘氨醇受體-l的要求是使 用體內(nèi)RNA干擾證明。"本研究點(diǎn)出該方向，既然血管新生是關(guān)鍵的多 方面生理事件，細(xì)胞可能招募各種的鞘脂類(lèi)以符合該器官修復(fù)、生長(zhǎng) 及發(fā)育的要求。我方的研究指出使用抗體對(duì)抗PECAM-1、 LacCer合成酶 抑制劑及/或GalT-V siRNA可緩和VEGF誘導(dǎo)的血管新生并可能在抗血管 新生治療方面良好地作為無(wú)可估價(jià)的藥物試劑。本發(fā)明已詳細(xì)地描述，并參照其較佳的實(shí)施例。然而，將可了解 的是該領(lǐng)域熟悉該項(xiàng)技術(shù)者，根據(jù)本說(shuō)明書(shū)考量的內(nèi)容可能做的修飾 與改良，是不脫離下列該所提出權(quán)利要求的精神與范圍。 參考資料1. 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權(quán)利要求
1. 一種治療患有或易感染涉及血管新生疾病或癥狀的對(duì)象的方法，包括向該對(duì)象投與治療有效量的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)途徑抑 制劑。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中涉及血管新生疾病或癥狀是 癌癥、冠狀動(dòng)脈心臟病、腫瘤轉(zhuǎn)移、發(fā)炎血管疾病或糖尿病。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中該VEGF途徑包括一個(gè)或多個(gè) 乳糖基神經(jīng)酰胺合成酶(LacCer合成酶)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(VEGFR)、血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子 1 (PECAM-1)、乳糖基神經(jīng)酰胺(LacCer)或PLA2的介入或相互作用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中該VEGF途徑抑制劑是如通式 I的化合物<formula>formula see original document page 2</formula>其中R和R'是獨(dú)立地選自氫或有取代或未取代的直鏈或支鏈C「Ce烷基所組成的群組，且進(jìn)一步地其中R和R'可能被連接形成5、 6或7-元 環(huán)；R2是選自有或沒(méi)有1至3個(gè)雙鍵的直鏈或支鏈Ce-U烷基所組成的 群組；且R3是選自有或沒(méi)有1至3個(gè)雙鍵的直鏈或支鏈C6—C2。烷基或芳基或 取代的芳基所組成的群組；其中該取代基是鹵素、d-C4烷氧基、亞甲 二氧基、d-C4巰基、氨基或取代的氨基，該氨基取代基可能是C廠C4烷 基或其醫(yī)藥上可接受的鹽。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中R和W被連接形成5、 6或7-元環(huán)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中R和Rl被連接形成吡咯烷基、 嗎啉基、硫代嗎啉基、哌啶基、或氮雜環(huán)庚基環(huán)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中該VEGF途徑抑制劑是一個(gè)或 多個(gè)的1-苯基-2-癸酰氨基-3-嗎啉基-l-丙醇；1-苯基-2-十六酰氨基-3-嗎啉基-1-丙醇；l-苯基-2-十六酰氨基-3-哌啶基-1-丙醇；1-苯基-2-十六酰氨基-3-吡咯烷基-l-丙醇；1-嗎啉基-2-十六酰氨基-3-羥基十八碳-4， 5-烯； 1-吡咯垸基-2-十六酰氨基-3-羥基十八碳-4， 5-烯；(1R， 2R)-1-苯 基_2-癸酰氨基-3-嗎啉基-l-丙醇(D-PDMP);或反式-(2R， 3R) -1-吡咯 垸基-2-十六酰氨基-3-羥基十八碳-4,5-烯、氯化白屈菜紅堿 (chelerythrinbe)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中該VEGF途徑抑制劑是一個(gè)或 多個(gè)的SU-1489、 G56976、 G56850、溴代苯甲酰甲基溴(BMB)、甲基-花生四?；?氟磷酸酯(MAFP)、吡咯垸基二硫代羧酸、氯化二亞苯基碘 及N-乙?；?L-半胱氨酸；PECAM-1、 PLA2、 LacCer、或LacCer合成酶 抗體或其片段；PECAM-1、 PLA2、 LacCer或LacCer合成酶肽或PECAM-1、 PLA2、 LacCer、或LacCer合成酶RNAi 。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中該RNAi是一個(gè)或多個(gè)的 5， -CGG、 AGU GAG UGG CUU AAC A dTdT-3，(正義)、5、 UGU UAA GCC ACU CAC UCC G dTdT-3，(反義)或其片段或變化物。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中該P(yáng)ECAM-1、 PLA2、 LacCer 或LacCer合成酶抗體是特定的針對(duì)IGAQVYEQVLRSAYAKRNSSV ND (GalT-V) ; IG隨I——RLYT腳STLNGT (GalT-VI) ; VLENSTKNSNDPAV FKDNPTEDVEYQCVADN(PECAM-1); PERLP; PTIKLGGHWKP; PRWKVAILIP; PFRNRHEHLP; PVLFRHLLP; PEGDTGKYKSIP; PENFTYSP; PYLP; PCPEKLP; PGGH服P; PRWKVAVLIP; PFRNRHEHLP; PIFFLHLIP; PEGDLGKYKSIP; PELAP; CC(P)-x-H-(LGY)-x-C，其中組氨酸H是該酶(PLA2)或其片段或變化物 的活性部位。
11. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中該P(yáng)ECAM-1、 PLA2、 LacCer 或LacCer合成酶肽是一個(gè)或多個(gè)的IGAQVYEQVLRSAYAKRNS SVND(GalT-V) ; IGM麗I——RLYTNKNSTLNGT(GalT-VI) ; VLENSTKNSN DPAVFKDNPTEDVEYQCVADN(PECAM-1); PERLP; PTIKLGGHWKP; PRWKVAILIP; PF臓服HLP; PVLFRHLLP; PEGDTGKYKSIP; PENFTYSP; PYLP; PCPEKLP; PGGHWRP; PRWKVAVLIP; PFRNRHEHLP; PIFFLHLIP; PEGDLGKYKSIP; PELAP; CC(P)-x-H-(LGY)-x-C，其中組氨酸H是該酶或其片段或變化物的活性 部位。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括識(shí)別該對(duì)象所需關(guān)于 血管新生疾病或癥狀的治療。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中該識(shí)別包括癌癥、冠狀動(dòng) 脈心臟病、腫瘤轉(zhuǎn)移、發(fā)炎血管疾病、缺血-再灌注損傷、高血壓或糖 尿病的診斷。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中該VEGF途徑抑制劑是經(jīng)口 地、肌肉內(nèi)、腫瘤內(nèi)、支架或腹膜內(nèi)投與該對(duì)象。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中該VEGF抑制劑的有效治療 量緩和VEGF誘導(dǎo)的體外血管新生/管子形成。
16. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中該VEGF途徑抑制劑是涂布 于或包含在醫(yī)學(xué)裝置中的一個(gè)或多個(gè)。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中該醫(yī)學(xué)裝置包括生物可降 解的生物高分子。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中該醫(yī)學(xué)裝置是支架。
19. 一種供確認(rèn)VEGF途徑抑制劑降低對(duì)象血管新生的治療能力的 方法，包括將對(duì)象實(shí)施侵入性手術(shù)； 將VEGF途徑抑制劑投與對(duì)象；及測(cè)試該對(duì)象的血管生長(zhǎng)。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中該侵入性手術(shù)是腫瘤摘除 手術(shù)。
21. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中該對(duì)象是動(dòng)物模型。
22. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中該動(dòng)物模型是腫瘤異種移 植物。
23. —種供確認(rèn)VEGF途徑抑制劑降低對(duì)象血管新生的治療能力的 方法，包括確認(rèn)對(duì)象血管新生的預(yù)治療水平； 將VEGF途徑抑制劑的治療有效量投與該對(duì)象；及 確認(rèn)該對(duì)象血管新生的后治療水平。
24. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中血管新生的減少表明該 VEGF途徑抑制劑是有效的。
25. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中血管新生的該預(yù)治療水平 與后治療水平是在疾病組織中確認(rèn)。
26. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中該疾病組織是肺臟、心臟、 肝臟、腫瘤或脈管系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)。
27. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中該血管新生水平是通過(guò) PECAM-1表達(dá)、GatT-V表達(dá)、管子形成或LacCer水平確認(rèn)。
28. —種供確認(rèn)候選VEGF途徑抑制劑治療血管新生的治療能力的 方法，包括提供細(xì)胞群；將該細(xì)胞接觸候選組合物，及確認(rèn)該候選組合物在PECAM-1表達(dá)、GatT-V表達(dá)、管子形成或 LacCer水平的一個(gè)或多個(gè)的效果。
29. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，進(jìn)一步包括在該細(xì)胞接觸該候 選化合物前，將該細(xì)胞接觸VEGF。
30. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，進(jìn)一步包括在該細(xì)胞接觸該候 選化合物后，將該細(xì)胞接觸VEGF。
31. —種治療患有或易感染組織退化的對(duì)象的方法，包括將血管內(nèi) 皮生長(zhǎng)因子(VEGF)途徑抑制劑的治療有效量的投與該對(duì)象。
32. 根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中該組織退化是關(guān)于胎兒子 宮內(nèi)成長(zhǎng)、系統(tǒng)性硬化癥、創(chuàng)傷愈合、缺血、再灌注損傷、糖尿病、 冠狀動(dòng)脈病、腫瘤生長(zhǎng)。
33. 根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中該VEGF途徑包括一個(gè)或多 個(gè)乳糖基神經(jīng)酰胺合成酶(LacCer合成酶)、VEGF、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(VEGFR)、血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子l(PECAM-l)、乳糖基神經(jīng)酰胺 (LacCer)或PLA2的介入或相互作用。
34. 根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中該VEGF途徑活化劑是如通 式I化合物的L異構(gòu)物<formula>formula see original document page 7</formula>其中R和W是獨(dú)立地選自氫或有取代或未取代的直鏈或支鏈C廠C6烷基所組成的群組，且進(jìn)一步地其中R和R'可能被連接形成5、 6或7-元 環(huán)；R2是選自有或沒(méi)有1至3個(gè)雙鍵的直鏈或支鏈Q(jìng)rQ烷基所組成的 群組；且R3是選自有或沒(méi)有1至3個(gè)雙鍵的直鏈或支鏈C6—U烷基或芳基或 取代的芳基所組成的群組；其中該取代基是鹵素、d-C4垸氧基、亞甲 二氧基、C4巰基、氨基或取代的氨基，該氨基取代基可能是d-C4烷 基或其醫(yī)藥上可接受的鹽。
35. 根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中R和R'被連接形成5、 6或 7-元環(huán)。
36. 根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中R和W被連接形成吡咯烷基、 嗎啉基、硫代嗎啉基、哌啶基、或氮雜環(huán)庚基環(huán)。
37. 根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中該VEGF途徑抑制劑是 l-苯基-2-癸酰氨基-3-嗎啉基-1-丙醇；l-苯基-2-十六酰氨基-3-嗎啉基-1-丙醇； 1-苯基-2-十六酰氨基-3-哌啶基-l-丙醇；1-苯基-2-十六酰氨基-3-吡咯烷基-l-丙醇；l-嗎啉基-2-十六酰氨基-3-羥基十八碳-4， 5-烯； l-吡咯垸基-2-十六酰氨基-3-羥基十八碳-4， 5-烯的一個(gè)或多個(gè)L 異構(gòu)物。
38. 根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，進(jìn)一步包括確認(rèn)該對(duì)象需要進(jìn) 行組織退化治療。
39. 根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中該VEGF途徑活化劑是經(jīng)口 地、肌肉內(nèi)、腫瘤內(nèi)、支架或腹膜內(nèi)投與該對(duì)象。
40. —種供確認(rèn)VEGF途徑活化劑降低對(duì)象組織退化的治療能力的 方法，包括確認(rèn)對(duì)象組織退化的預(yù)治療水平； 將VEGF途徑活化劑的治療有效量投與該對(duì)象；及確認(rèn)該對(duì)象組織退化的后治療水平。
41. 根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中組織退化的減少表明該 VEGF途徑活化劑是有效的。
42. 根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中組織退化的該預(yù)治療水平 與后治療水平是在疾病組織中確認(rèn)。
43. 根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中該疾病組織是胎兒、肺臟、 心臟、肝臟、脈管系統(tǒng)或神經(jīng)組織的一個(gè)或多個(gè)。
44. 根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中脈管系統(tǒng)是一個(gè)或多個(gè)的 心室微血管形成以增加側(cè)肢循環(huán)血流至該心臟或其他組織。
45. 根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中該組織退化水平是通過(guò)PECAM-1表達(dá)、GalT-V表達(dá)、管子形成或LacCer水平確認(rèn)。
46. —種供確認(rèn)候選VEGF途徑活化劑治療組織退化的治療能力的 方法，包括提供細(xì)胞群；將該細(xì)胞接觸候選組合物，及確認(rèn)該候選組合物在PECAM-1表達(dá)、GalT-V表達(dá)、管子形成或 LacCer水平的一個(gè)或多個(gè)的效果，其中在一個(gè)或多個(gè)PECAM-1表達(dá)、 GalT-V表達(dá)、管子形成或LacCer水平的增加，表明該候選組合物可能 是有效的。
47. —種治療患有或易感染關(guān)于血管新生疾病或癥狀的對(duì)象的方 法，包括將治療有效量的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)途徑抑制劑及VEGF 途徑活化劑投與該對(duì)象。
48. 根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中該抑制劑在特定組織緩和 血管新生而該活化劑在其他組織促進(jìn)生長(zhǎng)。
49. 根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中該抑制劑與活化劑是涂布 于或包含在生物可降解的生物高分子中。
50. 根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中該抑制劑與活化劑是涂布 于納米顆粒上。
全文摘要
本發(fā)明包括涉及乳糖基神經(jīng)酰胺疾病、手術(shù)后癥狀與細(xì)菌感染的治療與預(yù)防方法。該方法是普遍地提供將一種或多種化合物投與對(duì)象，已改變?cè)揤EGF途徑成員的活性，該成員包括LcaCer合成酶(GalT-V/VI)、PECAM1、VEGFR、VEGF或相關(guān)的途徑成員，去治療患者患有或易感染由VEGF造成或貢獻(xiàn)的癥狀。本發(fā)明也關(guān)于偵測(cè)與分析化合物治療該癥狀的治療能力的方法。
文檔編號(hào)A61K38/00GK101123879SQ200580035893
公開(kāi)日2008年2月13日 申請(qǐng)日期2005年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月20日
發(fā)明者S·查特吉 申請(qǐng)人:約翰·霍普金斯大學(xué)