專利名稱：Irta－4抗體及其用途的制作方法
背景技術(shù)：
免疫受體易位相關(guān)(IRTA)基因/蛋白，也稱作Fc受體同源物(FcRH)基因，由5個(gè)成員的免疫球蛋白樣細(xì)胞表面受體家族組成(Miller等，(2002)Blood.992662；Davis等，(2002)ImmunologicalReviews 190123)。IRTA最早是通過分析含有1q21染色體重排的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系的斷裂點(diǎn)而發(fā)現(xiàn)的(Hatzivassiliou等，(2001)Immunity.14277)。每個(gè)IRTA糖蛋白含有3-9個(gè)胞外Ig樣域(Miller，2002，同上)。IRTA的特征還在于具有在特定基序內(nèi)含有3-5個(gè)酪氨酸殘基的胞質(zhì)域，提示免疫酪氨酸抑制性基序(ITIM)和免疫酪氨酸激活樣(ITAM樣)基序的存在(Miller，2002，同上；Hatzivassiliou，2001，同上)。
IRTA在外周淋巴樣組織中表達(dá)，包括淋巴結(jié)、扁桃體、靜息外周B細(xì)胞和正常生發(fā)中心B細(xì)胞(Davis等，(2001)PNAS.989772)。IRTA2、3、4、5均在脾臟中高水平表達(dá)，而與之相比，在脾臟中檢測(cè)到低水平的IRTA1。已經(jīng)分析了人扁桃體組織B細(xì)胞區(qū)內(nèi)的IRTA表達(dá)。IRTA1在淋巴濾泡外部以邊緣區(qū)模式在上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞中表達(dá)。IRTA2和3在生發(fā)中心內(nèi)表達(dá)，在富含中央細(xì)胞的明區(qū)中表達(dá)水平最高。IRTA4和5在外套層內(nèi)表達(dá)水平最高，表明在幼稚B細(xì)胞中表達(dá)(Miller，2002，同上)。
已經(jīng)證明IRTA基因在B細(xì)胞非何杰金氏淋巴瘤、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、濾泡性淋巴瘤、B系彌漫性大細(xì)胞淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤中高度表達(dá)(Davis，2001，同上)。
發(fā)明概述本發(fā)明提供與IRTA-4結(jié)合并且表現(xiàn)出許多所需特性的分離的單克隆抗體，特別是人單克隆抗體。這些特性包括與人IRTA-4高親和力結(jié)合，但是缺乏與人IRTA-1、IRTA-2、IRTA-3或IRTA-5的實(shí)質(zhì)交叉反應(yīng)性。而且，本發(fā)明的抗體顯示與諸如Daudi B細(xì)胞腫瘤細(xì)胞等的B細(xì)胞腫瘤細(xì)胞結(jié)合。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，人IRTA-4包括具有如SEQ ID NO25[Genbank登錄號(hào)AAL60249]所示氨基酸序列的多肽；人IRTA-1包括具有如SEQ ID NO26[Genbank登錄號(hào)NP_112572]所示氨基酸序列的多肽；人IRTA-2包括具有如SEQ ID NO27[Genbank登錄號(hào)NP_112571]所示氨基酸序列的多肽；人IRTA-3包括具有如SEQID NO28[Genbank登錄號(hào)AAL59390]所示氨基酸序列的多肽；和/或人IRTA-5包括具有如SEQ ID NO29[Genbank登錄號(hào)AAL60250]所示氨基酸序列的多肽。
在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體(a)以1×10-8M或更低的KD與人IRTA-4結(jié)合；(b)基本不與人IRTA-1、IRTA-2、IRTA-3或IRTA-5結(jié)合；且(c)與Daudi B細(xì)胞腫瘤細(xì)胞結(jié)合。
優(yōu)選地，該抗體為人抗體，但是在替代實(shí)施方案中，該抗體可以是鼠抗體、嵌合抗體或人源化抗體。
在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，該抗體以5×10-9M或更低的KD與人IRTA-4結(jié)合，以4×10-9M或更低的KD與人IRTA-4結(jié)合，以3.5×10-9M或更低的KD與人IRTA-4結(jié)合，以3×10-9M或更低的KD與人IRTA-4結(jié)合，或者以2.8×10-9M或更低的KD與人IRTA-4結(jié)合。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體與參比抗體交叉競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合IRTA-4，該參比抗體包括(a)包含選自SEQ ID NO13和14的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含選自SEQ ID NO15和16的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
在各種實(shí)施方案中，參比抗體包括(a)包含SEQ ID NO13的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQ ID NO15的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或者參比抗體包括(a)包含SEQ ID NO14的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQ ID NO16的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
在另一方面，本發(fā)明涉及一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，包含產(chǎn)自或源自人VH1-3基因的重鏈可變區(qū)，其中該抗體特異性結(jié)合IRTA-4。本發(fā)明也提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，包含產(chǎn)自或源自人VH1-8基因的重鏈可變區(qū)，其中該抗體特異性結(jié)合IRTA-4。本發(fā)明還提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，包含產(chǎn)自或源自人VKL6基因的輕鏈可變區(qū)，其中該抗體特異性結(jié)合IRTA-4。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，包含產(chǎn)自或源自人VKL19基因的輕鏈可變區(qū)，其中該抗體特異性結(jié)合IRTA-4。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，包含(a)人VH1-3或1-8基因的重鏈可變區(qū)；和(b)人VKL6或VKL19的輕鏈可變區(qū)；其中該抗體特異性結(jié)合IRTA-4。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述抗體包含人VH1-3基因的重鏈可變區(qū)和人VKL6基因的輕鏈可變區(qū)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述抗體包含人VH1-8基因的重鏈可變區(qū)和人VKL19基因的輕鏈可變區(qū)。
在另一方面，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重鏈可變區(qū)；和包含CDR1、CDR2和CDR3序列的輕鏈可變區(qū)，其中(a)重鏈可變區(qū)CDR3序列包含選自SEQ ID NO5和6的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列，(b)輕鏈可變區(qū)CDR3序列包含選自SEQ ID NO11和12的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列，(c)該抗體以1×10-8M或更低的KD與人IRTA-4結(jié)合；(d)該抗體基本不與人IRTA-1、IRTA-2、IRTA-3或IRTA-5結(jié)合；且(e)該抗體與Daudi B細(xì)胞腫瘤細(xì)胞結(jié)合。
優(yōu)選地，重鏈可變區(qū)CDR2序列包含選自SEQ ID NO3和4的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列；且輕鏈可變區(qū)CDR2序列包含選自SEQ ID NO9和10的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列。優(yōu)選地，重鏈可變區(qū)CDR1序列包含選自SEQ ID NO1和2的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列；且輕鏈可變區(qū)CDR1序列包含選自SEQ ID NO7和8的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列。
在另一方面，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中(a)重鏈可變區(qū)包含與選自SEQ ID NO13和14的氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列；(b)輕鏈可變區(qū)包含與選自SEQ ID NO15和16的氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列；(c)該抗體以1×10-8M或更低的KD與人IRTA-4結(jié)合；(d)該抗體基本不與人IRTA-1、IRTA-2、IRTA-3或IRTA-5結(jié)合；且(e)該抗體與Daudi B細(xì)胞腫瘤細(xì)胞結(jié)合。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括(a)包含選自SEQ ID NO1和2的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)CDR1；(b)包含選自SEQ ID NO3和4的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)CDR2；(c)包含選自SEQ ID NO5和6的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)CDR3；(d)包含選自SEQ ID NO7和8的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)CDR1；(e)包含選自SEQ ID NO9和10的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)CDR2；和(f)包含選自SEQ ID NO11和12的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)CDR3；其中該抗體特異性結(jié)合IRTA-4。
一種優(yōu)選的組合包括(a)包含SEQ ID NO1的重鏈可變區(qū)CDR1；(b)包含SEQ ID NO3的重鏈可變區(qū)CDR2；(c)包含SEQ ID NO5的重鏈可變區(qū)CDR3；(d)包含SEQ ID NO7的輕鏈可變區(qū)CDR1；(e)包含SEQ ID NO9的輕鏈可變區(qū)CDR2；和(f)包含SEQ ID NO11的輕鏈可變區(qū)CDR3。
另一優(yōu)選組合包括(a)包含SEQ ID NO2的重鏈可變區(qū)CDR1；(b)包含SEQ ID NO4的重鏈可變區(qū)CDR2；(c)包含SEQ ID NO6的重鏈可變區(qū)CDR3；(d)包含SEQ ID NO8的輕鏈可變區(qū)CDR1；(e)包含SEQ ID NO10的輕鏈可變區(qū)CDR2；和(f)包含SEQ ID NO12的輕鏈可變區(qū)CDR3。
本發(fā)明的其他優(yōu)選抗體或其抗原結(jié)合部分包括(a)包含選自SEQ ID NO13和14的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含選自SEQ ID NO15和16的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；其中該抗體特異性結(jié)合IRTA-4。
一種優(yōu)選的組合包括(a)包含SEQ ID NO13的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQ ID NO15的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
另一優(yōu)選組合包括(a)包含SEQ ID NO14的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQ ID NO16的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
在本發(fā)明的另一方面，提供了與上述任一抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合IRTA-4的抗體或其抗原結(jié)合部分。
本發(fā)明的抗體可以是，例如，如IgG1或IgG4同種型的全長(zhǎng)抗體?；蛘?，這些抗體可以是抗體片段，如Fab或Fab’2片段，或單鏈抗體。
本發(fā)明也提供一種免疫偶聯(lián)物，其包含與諸如細(xì)胞毒素或放射性同位素等的治療劑連接的本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分。本發(fā)明也提供一種雙特異性分子，其包含與第二功能部分連接的本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分，該第二功能部分具有與該抗體或其抗原結(jié)合部分不同的結(jié)合特異性。
還提供包含本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分或免疫偶聯(lián)物或雙特異性分子和藥學(xué)上可接受的載體的組合物。
本發(fā)明也包括編碼本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分的核酸分子，以及包含這些核酸的表達(dá)載體，和包含這些表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。而且，本發(fā)明提供一種含有人免疫球蛋白重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，其中該小鼠表達(dá)本發(fā)明的抗體，以及由這種小鼠制備的雜交瘤，其中該雜交瘤產(chǎn)生本發(fā)明的抗體。
另一方面，本發(fā)明提供一種為需要治療的受試者治療B細(xì)胞惡性腫瘤的方法，包括向該受試者施用本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分，從而使該受試者的B細(xì)胞惡性腫瘤得到治療。這樣的疾病可以是，例如，非何杰金氏淋巴瘤、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、濾泡性淋巴瘤、B系彌散性大細(xì)胞淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤。
本發(fā)明還提供基于此處提供的抗-IRTA-4抗體序列制備“第二代”抗-IRTA-4抗體的方法。例如，本發(fā)明提供一種制備抗-IRTA-4抗體的方法，包括(a)提供(i)重鏈可變區(qū)抗體序列，其包含選自SEQ ID NO1和2的CDR1序列、選自SEQ ID NO3和4的CDR2序列、和/或選自SEQ ID NO5和6的CDR3序列；和/或(ii)輕鏈可變區(qū)抗體序列，其包含選自SEQ ID NO7和8的CDR1序列、選自SEQ ID NO9和10的CDR2序列、和/或選自SEQ ID NO11和12的CDR3序列；(b)改變重鏈可變區(qū)抗體序列和/或輕鏈可變區(qū)抗體序列內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸殘基，從而產(chǎn)生至少一個(gè)改變的抗體序列；和(c)將該改變的抗體序列表達(dá)為蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)通過下面的詳述和實(shí)施例將是顯而易見的，該詳述和實(shí)施例不應(yīng)理解為限制性的。貫穿本申請(qǐng)中引用的所有參考文獻(xiàn)、Genbank條目、專利和公布的專利申請(qǐng)的內(nèi)容均在此處特別引入作為參考。


圖1A顯示9G11人單克隆抗體重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ IDNO17)和氨基酸序列(SEQ ID NO13)。勾畫出了CDR1(SEQ ID NO1)、CDR2(SEQ ID NO3)和CDR3(SEQ ID NO5)區(qū)，并指出了V、D和J的種系來源。
圖1 B顯示9G11人單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ IDNO19)和氨基酸序列(SEQ ID NO15)。勾畫出了CDR1(SEQ ID NO7)、CDR2(SEQ ID NO9)和CDR3(SEQ ID NO11)區(qū)，并指出了V和J的種系來源。
圖2A顯示13B1人單克隆抗體重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ IDNO18)和氨基酸序列(SEQ ID NO14)。勾畫出了CDR1(SEQ ID NO2)、CDR2(SEQ ID NO4)和CDR3(SEQ ID NO6)區(qū)，并指出了V和J的種系來源。
圖2B顯示13B1人單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ IDNO20)和氨基酸序列(SEQ ID NO16)。勾畫出了CDR1(SEQ ID NO8)、CDR2(SEQ ID NO10)和CDR3(SEQ ID NO12)區(qū)，并指出了V和J的種系來源。
圖3顯示9G11的重鏈可變區(qū)氨基酸序列與人種系VH1-3氨基酸序列(SEQ ID NO21)的比對(duì)。
圖4顯示13B1的重鏈可變區(qū)氨基酸序列與人種系VH1-8氨基酸序列(SEQ ID NO22)的比對(duì)。
圖5顯示9G11的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列與人種系VKL6氨基酸序列(SEQ ID NO23)的比對(duì)。
圖6顯示13B1的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列與人種系VKL19氨基酸序列(SEQ ID NO24)的比對(duì)。
圖7顯示證明抗人IRTA-4的人單克隆抗體9G11和13B1特異性結(jié)合人IRTA-4的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
圖8A顯示流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果，該結(jié)果證明抗人IRTA-4的人單克隆抗體9G11與B細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系Daudi的細(xì)胞表面結(jié)合。黑線表示9G11的流式細(xì)胞圖，灰線表示對(duì)照抗體的流式細(xì)胞圖。
圖8B顯示流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果，該結(jié)果證明抗人IRTA-4的人單克隆抗體13B1與B細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系Daudi的細(xì)胞表面結(jié)合。黑線表示13B1的流式細(xì)胞圖，灰線表示對(duì)照抗體的流式細(xì)胞圖。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及以高親和力特異性結(jié)合IRTA-4的分離的單克隆抗體，特別是人單克隆抗體。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體源自特定重鏈和輕鏈種系序列，和/或包含特定結(jié)構(gòu)特征，如包含特定氨基酸序列的CDR區(qū)。本發(fā)明提供分離的抗體、制備該抗體的方法、含有該抗體的免疫偶聯(lián)物和雙特異性分子、和含有本發(fā)明的抗體、免疫偶聯(lián)物或雙特異性分子的藥物組合物。本發(fā)明還涉及使用該抗體的方法，例如用于檢測(cè)IRTA-4，以及治療與IRTA-4表達(dá)有關(guān)的疾病，如表達(dá)IRTA-4的B細(xì)胞惡性腫瘤。因此，本發(fā)明也提供使用本發(fā)明的抗-IRTA-4抗體治療B細(xì)胞惡性腫瘤的方法，例如治療非何杰金氏淋巴瘤、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、濾泡性淋巴瘤、B系彌散性大細(xì)胞淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤。
為了使本發(fā)明更容易理解，首先定義了一些術(shù)語(yǔ)。其他的定義在發(fā)明詳述內(nèi)容中說明。
術(shù)語(yǔ)“免疫球蛋白超家族受體易位相關(guān)基因4”和“IRTA-4”可互換使用，包括人IRTA-4的變體、同種型和物種同源物。因此，本發(fā)明的人抗體在某些情況下可與來自人類以外物種的IRTA-4交叉反應(yīng)。在其他情況下，該抗體對(duì)于人IRTA-4可能是完全特異性的，并且可能不表現(xiàn)出物種或其他類型的交叉反應(yīng)性。人IRTA-4的完整氨基酸序列的Genbank登錄號(hào)為AAL60249(SEQ ID NO25)。
術(shù)語(yǔ)“IRTA-1”、“IRTA-2”、“IRTA-3”和“IRTA-5”分別包括人“IRTA-1”、“IRTA-2”、“IRTA-3”和“IRTA-5”的變體、同種型和物種同源物。人IRTA-1的完整氨基酸序列的Genbank登錄號(hào)為NP_112572(SEQ ID NO26)。人IRTA-2的完整氨基酸序列的Genbank登錄號(hào)為NP_112571(SEQ ID NO27)。人IRTA-3的完整氨基酸序列的Genbank登錄號(hào)為AAL59390(SEQ ID NO28)。人IRTA-4的完整氨基酸序列的Genbank登錄號(hào)為AAL60250(SEQ IDNO29)。
術(shù)語(yǔ)“免疫應(yīng)答”是指例如淋巴細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和上述細(xì)胞或肝臟產(chǎn)生的可溶性大分子(包括抗體、細(xì)胞因子和補(bǔ)體)的作用，導(dǎo)致選擇性損傷、破壞或從人體中清除侵入的病原體、被病原體感染的細(xì)胞或組織、癌細(xì)胞，或(在自身免疫或病理性炎癥的情況下)正常人細(xì)胞或組織。
“信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑”是指在信號(hào)從一個(gè)細(xì)胞的一部分向一個(gè)細(xì)胞的另一部分傳送中起作用的多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子之間的生化關(guān)系。如此處所用的，短語(yǔ)“細(xì)胞表面受體”包括，例如，能夠接收信號(hào)和跨過細(xì)胞質(zhì)膜傳播這種信號(hào)的分子和分子復(fù)合物。本發(fā)明的“細(xì)胞表面受體”的一個(gè)例子是IRTA-4受體。
這里提到的術(shù)語(yǔ)“抗體”包括完整抗體及其任何抗原結(jié)合片段(即“抗原結(jié)合部分”)或單鏈?！翱贵w”是指包含通過二硫鍵互相連接在一起的至少兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈的糖蛋白，或其抗原結(jié)合部分。每條重鏈由重鏈可變區(qū)(在此縮寫為VH)和重鏈恒定區(qū)組成。重鏈恒定區(qū)由三個(gè)結(jié)構(gòu)域CH1、CH2和CH3組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(qū)(在此縮寫為VL)和輕鏈恒定區(qū)組成。輕鏈恒定區(qū)由一個(gè)結(jié)構(gòu)域CL組成。VH和VL區(qū)可進(jìn)一步再分為高變區(qū)，稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，CDR散布在被稱為構(gòu)架區(qū)(FR)的更加保守的區(qū)域中。每個(gè)VH和VL由三個(gè)CDR和四個(gè)FR組成，它們從氨基端至羧基端以如下順序排列FR1，CDR1，F(xiàn)R2，CDR2，F(xiàn)R3，CDR3，F(xiàn)R4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有可與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？贵w的恒定區(qū)可以介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或因子的結(jié)合，該宿主組織或因子包括免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞(例如效應(yīng)細(xì)胞)和經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第一成分(C1q)。
如此處所用的，術(shù)語(yǔ)抗體的“抗原結(jié)合部分”(或簡(jiǎn)稱為“抗體部分”)是指保留特異性結(jié)合抗原(例如IRTA-4)的能力的抗體的一個(gè)或多個(gè)片段。已證明抗體的抗原結(jié)合功能可由全長(zhǎng)抗體的片段來行使。術(shù)語(yǔ)抗體的“抗原結(jié)合部分”中所包括的結(jié)合片段的例子包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CHI結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段；(ii)F(ab’)2片段，即包含在鉸鏈區(qū)處通過二硫鍵連接的兩個(gè)Fab片段的雙價(jià)片段；(iii)由VH和CH1結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(iv)由抗體單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；(v)由VH結(jié)構(gòu)域組成的dAb片段(Ward等(1989)Nature 341544-546)；和(vi)分離的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。此外，盡管Fv片段的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域VL和VH由單獨(dú)的基因編碼，但是它們可以利用重組方法通過能夠使它們形成一條蛋白質(zhì)鏈的合成接頭連接在一起，其中VL和VH區(qū)配對(duì)構(gòu)成單價(jià)分子(稱為單鏈Fv(scFv)；參見，例如Bird等(1988)Science 242423-426；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-5883)。這種單鏈抗體也包括在術(shù)語(yǔ)抗體的“抗原結(jié)合部分”內(nèi)。這些抗體片段用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常規(guī)技術(shù)獲得，并用與完整抗體相同的方法對(duì)這些片段的實(shí)用性進(jìn)行篩選。
如此處所用的“分離的抗體”是指基本不含具有不同抗原特異性的其他抗體的抗體(例如，特異性結(jié)合IRTA-4的分離的抗體基本不含特異性結(jié)合除IRTA-4以外的抗原的抗體)。但是，特異性結(jié)合IRTA-4的分離的抗體與諸如來自其他物種的IRTA-4分子等其他抗原可能具有交叉反應(yīng)性。而且，分離的抗體可基本不含其他細(xì)胞材料和/或化學(xué)物質(zhì)。
如此處所用的術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”是指單一分子組成的抗體分子的制劑。單克隆抗體組合物表現(xiàn)出對(duì)特定表位的單一結(jié)合特異性和親和性。
如此處所用的術(shù)語(yǔ)“人抗體”包括具有如下可變區(qū)的抗體，在該可變區(qū)中，構(gòu)架區(qū)和CDR區(qū)都源自人種系免疫球蛋白序列。而且，如果該抗體含有恒定區(qū)，則恒定區(qū)也源自人種系免疫球蛋白序列。本發(fā)明的人抗體可包含并非由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如，通過體外隨機(jī)或位點(diǎn)特異性誘變或通過體內(nèi)體細(xì)胞突變引入的突變)。但是，如此處所用的術(shù)語(yǔ)“人抗體”不包括其中源自另一哺乳動(dòng)物種如小鼠的種系的CDR序列已被移植到人構(gòu)架序列上的抗體。
術(shù)語(yǔ)“人單克隆抗體”是指表現(xiàn)單一結(jié)合特異性的抗體，其具有其中構(gòu)架區(qū)和CDR區(qū)均源自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，人單克隆抗體由雜交瘤產(chǎn)生，該雜交瘤包括與無限增殖化細(xì)胞融合的B細(xì)胞，該B細(xì)胞從具有含人重鏈轉(zhuǎn)基因和輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物例如轉(zhuǎn)基因小鼠中獲得。
如此處所用的術(shù)語(yǔ)“重組人抗體”包括通過重組方法制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的所有人抗體，例如(a)從人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體動(dòng)物(例如小鼠)或由其制備的雜交瘤(下文進(jìn)一步描述)中分離的抗體，(b)從經(jīng)轉(zhuǎn)化表達(dá)人抗體的宿主細(xì)胞如轉(zhuǎn)染瘤中分離的抗體，(c)從重組組合人抗體文庫(kù)中分離的抗體，和(d)通過包括將人免疫球蛋白基因序列剪接為其他DNA序列的任何其他方法制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的抗體。這些重組人抗體具有其中構(gòu)架區(qū)和CDR區(qū)均源自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)。但是在某些實(shí)施方案中，這些重組人抗體可以經(jīng)受體外誘變(或者，當(dāng)使用人Ig序列的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí)，經(jīng)歷體內(nèi)體細(xì)胞誘變)，因此重組抗體的VH和VL區(qū)的氨基酸序列盡管是源自人種系VH和VL序列并與之相關(guān)的序列，但可能并非在體內(nèi)天然存在于人抗體種系的所有組成成分(repertoire)中。
如此處所用的，術(shù)語(yǔ)“同種型”是指由重鏈恒定區(qū)基因編碼的抗體類別(例如IgM或IgG1)。
短語(yǔ)“識(shí)別抗原的抗體”和“抗原特異性抗體”在此與術(shù)語(yǔ)“特異性結(jié)合抗原的抗體”可互換使用。
術(shù)語(yǔ)“人抗體衍生物”是指人抗體的任何修飾形式，例如抗體和其它試劑或抗體的偶聯(lián)物。
術(shù)語(yǔ)“人源化抗體”是指其中來源于另外一種哺乳動(dòng)物種如小鼠的種系的CDR序列已經(jīng)被移植到人構(gòu)架序列上的抗體。在人構(gòu)架序列內(nèi)也可以進(jìn)行其它的構(gòu)架區(qū)修飾。
術(shù)語(yǔ)“嵌合抗體”是指其中可變區(qū)序列來源于一個(gè)物種而恒定區(qū)序列來源于另一個(gè)物種的抗體，例如其中可變區(qū)序列來源于小鼠抗體而恒定區(qū)序列來源于人抗體的抗體。
如此處所用的，術(shù)語(yǔ)“特異性結(jié)合人IRTA-4”的抗體是指以1×10-7M或更低、更優(yōu)選5×10-8M或更低、更優(yōu)選3×10-8M或更低、更優(yōu)選1×10-8M或更低、甚至更優(yōu)選1×10-9M或更低的KD與人IRTA-4結(jié)合的抗體。
如此處所用的術(shù)語(yǔ)“Kassoc”或“Ka”是指特定抗體-抗原相互作用的結(jié)合速率，而如此處所用的術(shù)語(yǔ)“Kdis”或“Kd”是指特定抗體-抗原相互作用的解離速率。如此處所用的術(shù)語(yǔ)“KD”是指解離常數(shù)，它是由Kd與Ka的比值獲得的(即Kd/Ka)，并且表示為摩爾濃度(M)?？贵w的KD值可能用本領(lǐng)域建立的方法測(cè)定。測(cè)定抗體KD的一種優(yōu)選方法是使用表面等離振子共振法，優(yōu)選使用生物傳感器系統(tǒng)，如Biacore系統(tǒng)。
如此處所用的，術(shù)語(yǔ)IgG抗體的“高親和力”是指抗體對(duì)于靶抗原的KD為10-8M或更低、更優(yōu)選10-9M或更低、甚至更優(yōu)選10-10M或更低。但是對(duì)于其他抗體同種型來說，“高親和力”結(jié)合可能不同。例如，對(duì)于IgM同種型來說，“高親和力”結(jié)合是指抗體具有10-7M或更低、更優(yōu)選10-8M或更低、甚至更優(yōu)選10-9M或更低的KD。
如此處所用的，術(shù)語(yǔ)“受試者”包括任何人或非人類動(dòng)物。術(shù)語(yǔ)“非人類動(dòng)物”包括所有脊椎動(dòng)物，例如哺乳動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物，如非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物、綿羊、狗、貓、馬、牛、雞、兩棲類動(dòng)物、爬行類動(dòng)物等。
本發(fā)明的各個(gè)方面在下面的部分中進(jìn)一步詳細(xì)描述。
抗-IRTA-4抗體本發(fā)明的抗體的特征在于抗體的特定功能特征或特性。例如，這些抗體特異性結(jié)合人IRTA-4。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體以高親和力與IRTA-4結(jié)合，例如KD為1×10-8M或更低。本發(fā)明的抗-IRTA-4抗體優(yōu)選地表現(xiàn)出以下一種或多種特性(a)以1×10-8M或更低的KD與人IRTA-4結(jié)合；(b)基本不與人IRTA-1、IRTA-2、IRTA-3和IRTA-5結(jié)合；和/或(c)與Daudi B細(xì)胞腫瘤細(xì)胞結(jié)合。
優(yōu)選地，該抗體以5×10-9M或更低的KD與人IRTA-4結(jié)合，以4×10-9M或更低的KD與人IRTA-4結(jié)合，或以3.5×10-9M或更低的KD與人IRTA-4結(jié)合，或以3×10-9M或更低的KD與人IRTA-4結(jié)合，或以2.8×10-9M的KD與人IRTA-4結(jié)合。
評(píng)價(jià)抗體對(duì)IRTA-4的結(jié)合能力的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)在本領(lǐng)域中是公知的，包括，例如ELISA、Western印跡分析和RIA。合適的試驗(yàn)在實(shí)施例中詳細(xì)描述?？贵w的結(jié)合動(dòng)力學(xué)(例如結(jié)合親和力)也可以通過本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)如Biacore分析來評(píng)價(jià)。為了評(píng)價(jià)Daudi B細(xì)胞腫瘤細(xì)胞的結(jié)合，從公眾可以獲得的來源，如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心獲得Daudi細(xì)胞(ATCC登記號(hào)CCL-213)，并且在諸如流式細(xì)胞分析等的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定中使用。
單克隆抗體9G11和13B1本發(fā)明優(yōu)選的抗體是如實(shí)施例1和2所述分離并進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征的人單克隆抗體9G11和13B1。9G11和13B1的VH氨基酸序列分別顯示在SEQ ID NO13和14中。9G11和13B1的VL氨基酸序列分別顯示在SEQ ID NO15和16中。
假定這些抗體中的每一個(gè)都能夠與IRTA-4結(jié)合，則VH和VL序列可以“混合并匹配”，產(chǎn)生本發(fā)明的其他的抗-IRTA-4結(jié)合分子。IRTA-4與這些“混合并匹配的”抗體的結(jié)合可以用上文及實(shí)施例中所述的結(jié)合試驗(yàn)(例如ELISA)檢測(cè)。優(yōu)選地，當(dāng)VH和VL鏈混合并匹配時(shí)，來自特定VH/VL配對(duì)的VH序列被替換為結(jié)構(gòu)上相似的VH序列。同樣，優(yōu)選地，來自特定VH/VL配對(duì)的VL序列被替換為結(jié)構(gòu)上相似的VL序列。
因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括(a)包含選自SEQ ID NO13和14的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含選自SEQ ID NO15和16的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；其中該抗體特異性結(jié)合IRTA-4，優(yōu)選人IRTA-4。
優(yōu)選的重鏈和輕鏈組合包括(a)包含SEQ ID NO13的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQ ID NO15的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或(a)包含SEQ ID NO14的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQ ID NO16的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
在另一方面，本發(fā)明提供包含9G11和13B1的重鏈和輕鏈CDR1、CDR2和CDR3或其組合的抗體。9G11和13B1的VHCDR1的氨基酸序列示于SEQ ID NO1和2中。9G11和13B1的VHCDR2的氨基酸序列示于SEQ ID NO3和4中。9G11和13B1的VHCDR3的氨基酸序列示于SEQ ID NO5和6中。9G11和13B1的VKCDR1的氨基酸序列示于SEQ ID NO7和8中。9G11和13B1的VKCDR2的氨基酸序列示于SEQ ID NO9和10中。9G11和13B1的VKCDR3的氨基酸序列示于SEQ ID NO11和12中。CDR區(qū)用Kabat系統(tǒng)(Kabat，E.A.等(1991)Sequences of Proteins of ImmunoloGIcal Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Servies，NIH出版號(hào)91-3242)勾畫出。
假如這些抗體均能與IRTA-4結(jié)合，并且抗原結(jié)合特異性主要是由CDR1、2和3區(qū)提供的，則VHCDR1、CDR 2和CDR 3序列與VKCDR1、CDR 2和CDR 3序列可以“混合并匹配”(即來自不同抗體的CDR可以混合并匹配，但是每個(gè)抗體必須含有VHCDR1、CDR2和CDR3和VKCDR1、CDR2和CDR3)，產(chǎn)生本發(fā)明的其他的抗-IRTA-4結(jié)合分子。IRTA-4與這些“混合并匹配的”抗體的結(jié)合可以用上文及實(shí)施例中所述的結(jié)合試驗(yàn)(例如ELISA，Biacore分析)檢測(cè)。優(yōu)選地，當(dāng)VHCDR序列混合并匹配時(shí)，來自特定VH序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列被替換為結(jié)構(gòu)上相似的CDR序列。同樣，當(dāng)VKCDR序列混合并匹配時(shí)，來自特定VK序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列優(yōu)選地被替換為結(jié)構(gòu)上相似的CDR序列。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見的是，通過將一個(gè)或多個(gè)VH和/或VLCDR區(qū)序列替換為來自此處公開的單克隆抗體9G11和13B1的CDR序列的結(jié)構(gòu)上相似的序列，可以產(chǎn)生新的VH和VL序列。
因此，在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括(a)包含選自SEQ ID NO1和2的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)CDR1；(b)包含選自SEQ ID NO3和4的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)CDR2；(c)包含選自SEQ ID NO5和6的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)CDR3；(d)包含選自SEQ ID NO7和8的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)CDR1；(e)包含選自SEQ ID NO9和10的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)CDR2；和(f)包含選自SEQ ID NO11和12的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)CDR3；其中該抗體特異性結(jié)合IRTA-4，優(yōu)選人IRTA-4。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該抗體包括(a)包含SEQ ID NO1的重鏈可變區(qū)CDR1；(b)包含SEQ ID NO3的重鏈可變區(qū)CDR2；(c)包含SEQ ID NO5的重鏈可變區(qū)CDR3；(d)包含SEQ ID NO7的輕鏈可變區(qū)CDR1；(e)包含SEQ ID NO9的輕鏈可變區(qū)CDR2；和(f)包含SEQ ID NO11的輕鏈可變區(qū)CDR3。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該抗體包括(a)包含SEQ ID NO2的重鏈可變區(qū)CDR1；(b)包含SEQ ID NO4的重鏈可變區(qū)CDR2；(c)包含SEQ ID NO6的重鏈可變區(qū)CDR3；(d)包含SEQ ID NO8的輕鏈可變區(qū)CDR1；(e)包含SEQ ID NO10的輕鏈可變區(qū)CDR2；和(f)包含SEQ ID NO12的輕鏈可變區(qū)CDR3。
具有特定種系序列的抗體在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含來自特定種系重鏈免疫球蛋白基因的重鏈可變區(qū)和/或來自特定種系輕鏈免疫球蛋白基因的輕鏈可變區(qū)。
例如，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含產(chǎn)自或源自人VH1-3基因的重鏈可變區(qū)，其中該抗體特異性結(jié)合IRTA-4。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含產(chǎn)自或源自人VH1-8基因的重鏈可變區(qū)，其中該抗體特異性結(jié)合IRTA-4。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含產(chǎn)自或源自人VKL6基因的輕鏈可變區(qū)，其中該抗體特異性結(jié)合IRTA-4。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含產(chǎn)自或源自人VKL19基因的輕鏈可變區(qū)，其中該抗體特異性結(jié)合IRTA-4。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體(a)包含產(chǎn)自或源自人VH1-3或VH1-8基因(該基因分別編碼SEQ ID NO21和22所示的氨基酸序列)的重鏈可變區(qū)；(b)包含產(chǎn)自或源自人VkL6或VKL19基因(該基因分別編碼SEQ ID NO23和24所示的氨基酸序列)的輕鏈可變區(qū)；且(c)特異性結(jié)合IRTA-4，優(yōu)選人IRTA-4。
分別具有VH1-3和VkL6的VH和VK的抗體的一個(gè)例子是9G 11。分別具有VH1-8和VkL19的VH和VK的抗體的一個(gè)例子是7G8。
如此處所用的，如果一種人抗體的可變區(qū)是從使用人種系免疫球蛋白基因的系統(tǒng)中獲得的，則該抗體包含“產(chǎn)自”或“源自”特定種系序列的重鏈或輕鏈可變區(qū)。這樣的系統(tǒng)包括用目標(biāo)抗原免疫攜帶人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，或者用目標(biāo)抗原篩查展示在噬菌體上的人免疫球蛋白基因文庫(kù)?！爱a(chǎn)自”或“源自”人種系免疫球蛋白序列的人抗體可以這樣鑒定將該人抗體的氨基酸序列與人種系免疫球蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比較，選擇在序列上最接近于該人抗體序列(即有最高％同一性)的人種系免疫球蛋白序列?！爱a(chǎn)自”或“源自”特定人種系免疫球蛋白序列的人抗體與該種系序列相比可能包含氨基酸差異，例如由于天然發(fā)生的體細(xì)胞突變或定點(diǎn)突變的有意引入而導(dǎo)致的。但是，選擇的人抗體在氨基酸序列上與人種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列一般至少90％相同，并且含有當(dāng)與其他物種的種系免疫球蛋白氨基酸序列(例如鼠種系序列)相比較時(shí)確認(rèn)該人抗體屬于人類抗體的氨基酸殘基。在某些情況下，人抗體在氨基酸序列上與該種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列可以至少95％、或者甚至至少96％、97％、98％或99％相同。一般來說，源自特定人種系序列的人抗體表現(xiàn)與該人種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列有不超過10個(gè)氨基酸的差異。在某些情況下，該人抗體可能表現(xiàn)與該種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列有不超過5個(gè)、或者甚至不超過4、3、2或1個(gè)氨基酸的差異。
同源抗體在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含的重鏈和輕鏈可變區(qū)含有與此處所述優(yōu)選抗體的氨基酸序列同源的氨基酸序列，并且其中該抗體保留了本發(fā)明抗-IRTA-4抗體的需要的功能特性。
例如，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中(a)重鏈可變區(qū)包含與選自SEQ ID NO13和14的氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列；(b)輕鏈可變區(qū)包含與選自SEQ ID NO15和16的氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列；(c)該抗體以1×10-8M或更低的KD與人IRTA-4結(jié)合；(d)該抗體基本不與人IRTA-1、IRTA-2、IRTA-3或IRTA-5結(jié)合；且(e)該抗體與Daudi B細(xì)胞腫瘤細(xì)胞結(jié)合。
在各種實(shí)施方案中，該抗體可以是，例如人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。
在另外一些實(shí)施方案中，VH和/或VL氨基酸序列可以與上述序列8 5％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源。具有與上述序列的VH和VL區(qū)高度(即80％或更高)同源的VH和VL區(qū)的抗體可以如下獲得誘變(例如定點(diǎn)誘變或PCR介導(dǎo)的誘變)編碼SEQ IDNO17、18、19和20的核酸分子，然后用此處所述的功能試驗(yàn)檢測(cè)編碼的被改變抗體的保留的功能(即以上(c)和(d)所述的功能)。
如此處所用的，兩個(gè)氨基酸序列之間的百分同源性等同于兩個(gè)序列之間的百分同一性。考慮為了兩個(gè)序列之間進(jìn)行最佳比對(duì)所需要引入的空位的數(shù)目和每個(gè)空位的長(zhǎng)度后，兩個(gè)序列之間的百分同一性是這兩個(gè)序列共有的相同位點(diǎn)的數(shù)目的函數(shù)(即％同源性＝相同位點(diǎn)的數(shù)目/位點(diǎn)的總數(shù)×100)。兩個(gè)序列之間的序列比較和百分同一性的確定可以如下面的非限制性實(shí)施例中所述用數(shù)學(xué)算法實(shí)現(xiàn)。
兩個(gè)氨基酸序列之間的百分同一性可以用已經(jīng)整合入ALIGN程序(2.0版本)中的E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.，411-17(1988))的算法來確定，其使用PAM120權(quán)重殘基表，12的空位長(zhǎng)度罰分，4的空位罰分。另外，兩個(gè)氨基酸序列之間的百分同一性也可以用已經(jīng)整合入GCG軟件包(可從http://www.gcg.com獲得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48444-453(1 970))的算法來確定，其使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣，16、14、12、10、8、6或4的空位權(quán)重，和1、2、3、4、5或6的長(zhǎng)度權(quán)重。
另外，或者，本發(fā)明的蛋白質(zhì)序列可以進(jìn)一步用作“查詢序列”來對(duì)公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，例如用來鑒定相關(guān)序列。這種檢索可以用Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215403-10的XBLAST程序(2.0版本)進(jìn)行。BLAST蛋白質(zhì)檢索可以用XBLAST程序進(jìn)行，得分＝50，字長(zhǎng)＝3，以獲得與本發(fā)明的抗體分子同源的氨基酸序列。為了獲得用于比較目的的空位比對(duì)，可以采用如Altschul等(1997)Nucleic AcidsRes.25(17)3389-3402所述的空位BLAST。當(dāng)采用BLAST和空位BLAST程序時(shí)，可以使用各自程序(例如XBLAST和NBLAST)的缺省參數(shù)。參見http://www.ncbi.nlm.nih.gov。
具有保守修飾的抗體在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包括含CDR1、CDR2和CDR3序列的重鏈可變區(qū)和含CDR1、CDR2和CDR3序列的輕鏈可變區(qū)，其中這些CDR序列中的一個(gè)或多個(gè)包含基于本文所述優(yōu)選抗體(例如9G11或13B1)的特定氨基酸序列或其保守修飾，并且其中該抗體保留本發(fā)明抗-IRTA-4抗體的需要的功能特性。因此，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括含CDR1、CDR2和CDR3序列的重鏈可變區(qū)和含CDR1、CDR2和CDR3序列的輕鏈可變區(qū)，其中(a)重鏈可變區(qū)CDR3序列包含選自SEQ ID NO5和6的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列，(b)輕鏈可變區(qū)CDR3序列包含選自SEQ ID NO11和12的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列，(c)該抗體以1×10-8M或更低的KD與人IRTA-4結(jié)合；(d)該抗體基本不與人IRTA-1、IRTA-2、IRTA-3或IRTA-5結(jié)合；且(e)該抗體與Daudi B細(xì)胞腫瘤細(xì)胞結(jié)合。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，重鏈可變區(qū)CDR2序列包含選自SEQ IDNO3和4的氨基酸序列和其保守修飾的氨基酸序列；且輕鏈可變區(qū)CDR2序列包含選自SEQ ID NO9和10的氨基酸序列和其保守修飾的氨基酸序列。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，重鏈可變區(qū)CDR1序列包含選自SEQ ID NO1和2的氨基酸序列和其保守修飾的氨基酸序列；且輕鏈可變區(qū)CDR1序列包含選自SEQ ID NO7和8的氨基酸序列和其保守修飾的氨基酸序列。
在各種實(shí)施方案中，該抗體可以是，例如人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。
如此處所用的，術(shù)語(yǔ)“保守序列修飾”是指不會(huì)顯著影響或改變含該氨基酸序列的抗體的結(jié)合特性的氨基酸修飾。這樣的保守修飾包括氨基酸置換、添加和缺失。可以通過本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，如定點(diǎn)誘變和PCR介導(dǎo)的誘變，向本發(fā)明抗體中引入修飾。保守氨基酸置換是將氨基酸殘基替換為具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族在本領(lǐng)域中已經(jīng)定義。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷極性側(cè)鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支側(cè)鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳族側(cè)鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。因此，本發(fā)明抗體的CDR區(qū)內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基可以被置換為來自相同側(cè)鏈家族的其他氨基酸殘基，并且可以用此處所述的功能試驗(yàn)檢測(cè)改變的抗體保留的功能(即以上(c)至(j)所述的功能)。
與本發(fā)明的抗-IRTA-4抗體結(jié)合相同表位的抗體在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供與本發(fā)明的任一IRTA-4單克隆抗體結(jié)合相同表位的抗體(即能夠與本發(fā)明的任一單克隆抗體交叉競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合IRTA-4的抗體)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，用于交叉競(jìng)爭(zhēng)研究的參比抗體可以是單克隆抗體9G11(具有分別如SEQ ID NO13和15所示的VH和VL序列)或單克隆抗體13B1(具有分別如SEQ IDNO14和16所示的VH和VL序列)。這些交叉競(jìng)爭(zhēng)抗體可以根據(jù)它們?cè)跇?biāo)準(zhǔn)IRTA-4結(jié)合測(cè)定中與9G11或13B1交叉競(jìng)爭(zhēng)的能力來鑒定。例如，可以利用BIAcore分析、ELISA測(cè)定或流式細(xì)胞分析來證明與本發(fā)明抗體的交叉競(jìng)爭(zhēng)。測(cè)試抗體抑制例如9G11或13B1與人IRTA-4結(jié)合的能力證明，該測(cè)試抗體可以與9G11或13B1競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合人IRTA-4，因此與9G11或13B1結(jié)合人IRTA-4上相同的表位。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，與9G11或13B1結(jié)合人IRTA-4上相同表位的抗體是人單克隆抗體。這些人單克隆抗體可以如實(shí)施例所述制備和分離。
工程化(engineered)和修飾的抗體本發(fā)明的抗體還可以如下制備用具有此處所公開的一種或多種VH和/或VL序列的抗體作為起始材料，工程化一種修飾的抗體，該修飾的抗體可以具有與起始抗體相比改變的特性?？梢酝ㄟ^修飾一個(gè)或兩個(gè)可變區(qū)(即VH和/或VL)例如一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)內(nèi)和/或一個(gè)或多個(gè)構(gòu)架區(qū)內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)殘基來工程化抗體。另外，或者，可以通過修飾恒定區(qū)內(nèi)的殘基來工程化抗體，例如改變?cè)摽贵w的效應(yīng)功能。
可以進(jìn)行的一種類型的可變區(qū)工程化是CDR移植。抗體主要是通過位于六個(gè)重鏈和輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)中的氨基酸殘基與靶抗原相互作用。由于這個(gè)原因，CDR內(nèi)的氨基酸序列比CDR外的序列在各個(gè)抗體之間更加多樣化。由于CDR序列負(fù)責(zé)大多數(shù)抗體-抗原相互作用，因此通過構(gòu)建如下的表達(dá)載體能夠表達(dá)模擬特定天然存在抗體的特性的重組抗體該表達(dá)載體包含來自特定天然存在抗體的CDR序列，該CDR序列被移植到來自具有不同特性的不同抗體的構(gòu)架序列上(參見，例如，Riechmann，L.等(1998)Nature 332323-327；Jones，P.等(1986)Nature 321522-525；Queen，C.等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8610029-10033；Winter的美國(guó)專利5,225,539，和Queen等人的美國(guó)專利5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
因此，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括含CDR1、CDR2和CDR3序列的重鏈可變區(qū)，該CDR1、CDR2和CDR3序列分別包含選自SEQ ID NO1和2、SEQ ID NO3和4和SEQ ID NO5和6的氨基酸序列，并且包括含CDR1、CDR2和CDR3序列的輕鏈可變區(qū)，該CDR1、CDR2和CDR3序列分別包含選自SEQ ID NO7和8、SEQ ID NO9和10和SEQ ID NO11和12的氨基酸序列。因此，這些抗體含有單克隆抗體9G11或13B1的VH和VLCDR序列，但是可能含有與這些抗體不同的構(gòu)架序列。
這些構(gòu)架序列可以從包括種系抗體基因序列的公共DNA數(shù)據(jù)庫(kù)或發(fā)表的參考文獻(xiàn)中獲得。例如，人重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的種系DNA序列可以在以下資源中發(fā)現(xiàn)“VBase”人種系序列數(shù)據(jù)庫(kù)(可從因特網(wǎng)上www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase獲得)，以及Kabat，E.A.等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH出版號(hào)91-3242；Tomlinson，I.M.等(1 992)“The Repertoire of Human Germline VHSequences Reveals about Fiftu Groups of VH Segments with DifferentHypervariable Loops”J.Mol.Biol.227776-798；和Cox，J.P.L.等(1994)“A Directory of Human Germ-line VHSegments Reveals a Strong Bias intheir Usage”Eur.J.Immunol.24827-836；其內(nèi)容均在此引用作為參考。
用于本發(fā)明抗體的優(yōu)選構(gòu)架序列在結(jié)構(gòu)上類似于所選擇的本發(fā)明抗體使用的構(gòu)架序列，例如，類似于本發(fā)明優(yōu)選的單克隆抗體使用的VH1-3構(gòu)架序列(SEQ ID NO21)和/或VH1-8構(gòu)架序列(SEQ IDNO22)和/或VKL6構(gòu)架序列(SEQ ID NO23)和/或VKL19構(gòu)架序列(SEQ ID NO24)。VHCDR1、CDR 2和CDR3序列和VKCDR1、CDR2和CDR3序列可以被移植到與該構(gòu)架序列的來源種系免疫球蛋白基因具有相同序列的構(gòu)架區(qū)上，或者CDR序列可以被移植到與該種系序列相比含有一個(gè)或多個(gè)突變的構(gòu)架區(qū)上。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在某些情況中，將構(gòu)架區(qū)內(nèi)的殘基進(jìn)行突變對(duì)于保持或增強(qiáng)抗體的抗原結(jié)合能力是有利的(參見，例如，Queen等的美國(guó)專利5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
另一種類型的可變區(qū)修飾是突變VH和/或VKCDR1、CDR2和/或CDR3區(qū)內(nèi)的氨基酸殘基，從而改善目標(biāo)抗體的一種或多種結(jié)合特性(例如親和力)。可以進(jìn)行定點(diǎn)誘變或PCR介導(dǎo)的誘變，以引入突變，對(duì)抗體結(jié)合的影響，或者其他目標(biāo)功能特性，可以用此處所述和實(shí)施例中提供的體外或體內(nèi)試驗(yàn)來評(píng)價(jià)。優(yōu)選地引入(如上文所述的)保守修飾。這些突變可以是氨基酸置換、添加或缺失，但是優(yōu)選置換。而且，一般改變CDR區(qū)內(nèi)的不超過1、2、3、4或5個(gè)殘基。
因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供分離的抗-IRTA-4單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含的重鏈可變區(qū)含有(a)VHCDR1區(qū)，其包含選自SEQ ID NO1和2的氨基酸序列，或與SEQ ID NO1和2相比具有1、2、3、4或5個(gè)氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列；(b)VHCDR2區(qū)，其包含選自SEQ ID NO3和4的氨基酸序列，或與SEQ ID NO3和4相比具有1、2、3、4或5個(gè)氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列；(c)VHCDR3區(qū)，其包含選自SEQID NO5和6的氨基酸序列，或與SEQ ID NO5和6相比具有1、2、3、4或5個(gè)氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列；(d)VKCDR1區(qū)，其包含選自SEQ ID NO7和8的氨基酸序列，或與SEQ ID NO7和8相比具有1、2、3、4或5個(gè)氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列；(e)VKCDR2區(qū)，其包含選自SEQ ID NO9和10的氨基酸序列，或與SEQ ID NO9和10相比具有1、2、3、4或5個(gè)氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列；和(f)VKCDR3區(qū)，其包含選自SEQ ID NO11和12的氨基酸序列，或與SEQ ID NO11和12相比具有1、2、3、4或5個(gè)氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列。
本發(fā)明的工程化抗體包括例如為了改善抗體特性而對(duì)其VH和/或VK內(nèi)的構(gòu)架殘基進(jìn)行了修飾的抗體。進(jìn)行這樣的構(gòu)架修飾一般是為了降低抗體的免疫原性。例如，一種方法是將一個(gè)或多個(gè)構(gòu)架殘基“回復(fù)突變”為相應(yīng)的種系序列。更特別地，經(jīng)歷體細(xì)胞突變的抗體可含有與衍生該抗體的種系序列不同的構(gòu)架殘基。通過比較抗體構(gòu)架序列與衍生該抗體的種系序列，可以鑒定這些殘基。例如，對(duì)于13B1，VH的氨基酸殘基#28(FR1內(nèi))是天冬酰胺，而在相應(yīng)的VH1-8種系序列中該殘基為蘇氨酸。為了使構(gòu)架區(qū)序列恢復(fù)為其種系構(gòu)型，可以通過例如定點(diǎn)誘變或PCR介導(dǎo)的誘變，將該體細(xì)胞突變“回復(fù)突變”為種系序列(例如，13B1的VH的FR1的殘基#28可以從天冬酰胺“回復(fù)突變”為蘇氨酸)。
另一個(gè)例子是，對(duì)于13B1，VH的氨基酸殘基#30(FR1內(nèi))是天冬酰胺，而在相應(yīng)的VH1-8種系序列中該殘基為蘇氨酸。為了使構(gòu)架區(qū)序列恢復(fù)為其種系構(gòu)型，例如，可以將13B1的VH的FR1的殘基#30從天冬酰胺“回復(fù)突變”為蘇氨酸。這種“回復(fù)突變”的抗體也包括在本發(fā)明內(nèi)。
另一個(gè)例子是，對(duì)于13B1，VH的氨基酸殘基#41(FR2內(nèi))是丙氨酸，而在相應(yīng)的VH1-8種系序列中該殘基為蘇氨酸。為了使構(gòu)架區(qū)序列恢復(fù)為其種系構(gòu)型，例如，可以將13B1的VH的殘基#41(FR2的殘基#6)從丙氨酸“回復(fù)突變”為蘇氨酸。這種“回復(fù)突變”的抗體也包括在本發(fā)明內(nèi)。
另一個(gè)例子是，對(duì)于13B1，VH的氨基酸殘基#72(FR3內(nèi))是色氨酸，而在相應(yīng)的VH1-8種系序列中該殘基為精氨酸。為了使構(gòu)架區(qū)序列恢復(fù)為其種系構(gòu)型，例如，可以將13B1的VH的殘基#72(FR3的殘基#6)從色氨酸“回復(fù)突變”為精氨酸。這種“回復(fù)突變”的抗體也包括在本發(fā)明內(nèi)。
另一個(gè)例子是，對(duì)于13B1，VH的氨基酸殘基#91(FR3內(nèi))是絲氨酸，而在相應(yīng)的VH1-8種系序列中該殘基為蘇氨酸。為了使構(gòu)架區(qū)序列恢復(fù)為其種系構(gòu)型，例如，可以將13B1的VH的殘基#91(FR3的殘基#25)從絲氨酸“回復(fù)突變”為蘇氨酸。這種“回復(fù)突變”的抗體也包括在本發(fā)明內(nèi)。
另一種類型的構(gòu)架修飾涉及對(duì)構(gòu)架區(qū)內(nèi)、或者甚至一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)殘基進(jìn)行突變，以除去T細(xì)胞表位，從而降低該抗體的潛在的免疫原性。該方法也被稱為“脫免疫”，在Carr等人的公布號(hào)為20030153043的美國(guó)專利中詳細(xì)記載。
除了在構(gòu)架區(qū)或CDR區(qū)內(nèi)進(jìn)行的修飾以外，或者作為它的替代方案，也可以將本發(fā)明的抗體工程化為在Fc區(qū)內(nèi)包括修飾，一般是為了改變?cè)摽贵w的一種或多種功能特性，如血清半衰期、補(bǔ)體固定、Fc受體結(jié)合和/或抗原依賴性細(xì)胞毒性。此外，也可以將本發(fā)明的抗體化學(xué)修飾(例如一個(gè)或多個(gè)化學(xué)部分可以連接到該抗體上)，或者修飾改變其糖基化，以改變?cè)摽贵w的一種或多種功能特性。這些實(shí)施方案均在下文詳細(xì)描述。Fc區(qū)中殘基的編號(hào)是Kabat的EU指數(shù)的編號(hào)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，修飾CH1的鉸鏈區(qū)，使該鉸鏈區(qū)中半胱氨酸殘基的數(shù)目改變，例如增加或減少。該方法在Bodmer等人的美國(guó)專利No.5,677,425號(hào)中詳細(xì)記載。改變CH1鉸鏈區(qū)中半胱氨酸的數(shù)目是為了，例如，促進(jìn)輕鏈和重鏈的裝配，或提高或降低抗體的穩(wěn)定性。
在另一實(shí)施方案中，對(duì)抗體的Fc鉸鏈區(qū)進(jìn)行突變，以降低該抗體的生物半衰期。更特別地，向Fc-鉸鏈片段的CH2-CH3結(jié)構(gòu)域界面區(qū)引入一個(gè)或多個(gè)氨基酸突變，使得該抗體與葡萄球菌蛋白A(SpA)的結(jié)合比天然Fc-鉸鏈結(jié)構(gòu)域與SpA的結(jié)合減弱。該方法在Ward等人的美國(guó)專利No.6,165,745號(hào)中詳細(xì)記載。
在另一實(shí)施方案中，修飾抗體以提高其生物半衰期?？梢允褂酶鞣N方法。例如，可以引入一個(gè)或多個(gè)如下突變T252L、T254S、T256F，如Ward的美國(guó)專利No.6,277,375所述?；蛘撸瑸榱颂岣呱锇胨テ?，可以在CH1或CL區(qū)內(nèi)改變?cè)摽贵w，使之含有來自IgG Fc區(qū)CH2結(jié)構(gòu)域的兩個(gè)環(huán)的補(bǔ)救受體結(jié)合表位，如Presta等人的美國(guó)專利No.5,869,046和6,121,022所述。
在其他一些實(shí)施方案中，通過將至少一個(gè)氨基酸殘基置換為不同的氨基酸殘基來改變Fc區(qū)，以改變抗體的效應(yīng)功能。例如，可以將選自氨基酸殘基234、235、236、237、297、318、320、322的一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換為不同的氨基酸殘基，使得該抗體對(duì)效應(yīng)配體的親和力改變，但是保留親本抗體的抗原結(jié)合能力。其親和力被改變的效應(yīng)配體可以是，例如，F(xiàn)c受體或補(bǔ)體的C1成分。該方法在Winter等人的美國(guó)專利No.5,624,821和5,648,260中更詳細(xì)地描述。
在另外一個(gè)實(shí)施例中，可以將選自氨基酸殘基329、331和322的一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換為不同的氨基酸殘基，使得該抗體的C1q結(jié)合改變和/或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)降低或消除。該方法在Idusogie等人的美國(guó)專利No.6,194,551中更詳細(xì)地描述。
在另外一個(gè)實(shí)施例中，改變氨基酸位點(diǎn)231和239中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，從而改變?cè)摽贵w固定補(bǔ)體的能力。該方法在Bodmer等人的PCT公布WO 94/29351中進(jìn)一步描述。
在另外一個(gè)實(shí)施例中，為了提高抗體介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)的能力和/或提高抗體對(duì)Fcγ受體的親和力，通過在下列位點(diǎn)處修飾一個(gè)或多個(gè)氨基酸來修飾Fc區(qū)238，239，248，249，252，254，255，256，258，265，267，268，269，270，272，276，278，280，283，285，286，289，290，292，293，294，295，296，298，301，303，305，307，309，312，315，320，322，324，326，327，329，330，331，333，334，335，337，338，340，360，373，376，378，382，388，389，398，414，416，419，430，434，435，437，438或439。該方法在Presta的PCT公布WO 00/42072中進(jìn)一步描述。而且，人IgG1上對(duì)于FcγRI、FcγRII、FcγRIII和FcRn的結(jié)合位點(diǎn)已經(jīng)作圖，并且已經(jīng)描述了具有改善的結(jié)合的變體(參見，Shields，R.L.等(2001)J.Biol.Chem.2766591-6604)。位點(diǎn)256、290、298、333、334和339處的特定突變顯示改善了與FcγRIII的結(jié)合。另外，下列組合突變體顯示改善了與FcγRIII的結(jié)合T256A/S298A，S298A/E333A，S298A/K224A和S298A/E333A/K334A。
在另一實(shí)施方案中，改變抗體的糖基化。例如，可以制備無糖基化的抗體(即該抗體缺乏糖基化)。例如，為了提高抗體對(duì)抗原的親和力，可以改變糖基化。這樣的碳水化合物修飾可以通過例如改變抗體序列內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)來實(shí)現(xiàn)。例如，可以進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換，使一個(gè)或多個(gè)可變區(qū)構(gòu)架糖基化位點(diǎn)消失，從而消除該位點(diǎn)處的糖基化。這種無糖基化可以提高抗體對(duì)抗原的親和力。這種方法在Co等人的美國(guó)專利No.5,714,350和6,350,861中更詳細(xì)地描述。
另外，或者，可以制備糖基化類型改變的抗體，如巖藻糖基殘基數(shù)目減少的低巖藻糖基化抗體，或等分GlcNac結(jié)構(gòu)增多的抗體。已經(jīng)證明這種改變的糖基化模式提高了抗體的ADCC能力。這種碳水化合物修飾可以通過例如在糖基化機(jī)制改變的宿主細(xì)胞中表達(dá)抗體來實(shí)現(xiàn)。糖基化機(jī)制改變的細(xì)胞在本領(lǐng)域中已有描述，能夠用作宿主細(xì)胞在其中表達(dá)本發(fā)明的重組抗體，從而產(chǎn)生糖基化改變的抗體。例如，Hanai等的EP1,176,195描述了具有功能破壞的FUT8基因的細(xì)胞系，該基因編碼巖藻糖轉(zhuǎn)移酶，因此這種細(xì)胞系中表達(dá)的抗體表現(xiàn)為低巖藻糖基化。Presta的PCT公布WO 03/035835記載了一種變異CHO細(xì)胞系，Lec13細(xì)胞，其將巖藻糖連接到Asn(297)-連接的碳水化合物上的能力降低，也導(dǎo)致在該宿主細(xì)胞中表達(dá)的抗體為低巖藻糖基化(參見，Shields，R.L.等(2001)J.Biol.Chem.27726733-26740)。Umana等人的PCT公布WO 99/54342記載了表達(dá)糖蛋白修飾的糖基轉(zhuǎn)移酶(例如β(1，4)-N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶III(GnTIII))的工程化細(xì)胞系，因此該工程化細(xì)胞系中表達(dá)的抗體表現(xiàn)為等分GlcNac結(jié)構(gòu)增加，導(dǎo)致抗體的ADCC活性提高(參見，Umana等(1999)Nat.Biotech.17176-180)。
本發(fā)明涉及的對(duì)此處所述抗體的另一種修飾是PEG化。例如，為了提高抗體的生物(例如血清)半衰期，可以將該抗體PEG化。為了PEG化一種抗體，一般在一個(gè)或多個(gè)PEG基團(tuán)與抗體或抗體片段連接的條件下，將該抗體或其片段與聚乙二醇(PEG)如PEG的反應(yīng)性酯或醛衍生物反應(yīng)。優(yōu)選地，通過與反應(yīng)性PEG分子(或類似的反應(yīng)性水溶性聚合物、)的?；磻?yīng)或烷基化反應(yīng)進(jìn)行PEG化。如此處所用的術(shù)語(yǔ)“聚乙二醇”意在包括用來衍生化其他蛋白質(zhì)的任何PEG形式，如單(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-馬來酰亞胺。在某些實(shí)施方案中，將要PEG化的抗體是一種無糖基化的抗體。將蛋白質(zhì)PEG化的方法在本領(lǐng)域中公知，并且可以用于本發(fā)明的抗體。參見，例如，Nishimura等人的EP 0 154 316和Ishikawa等人的EP 0 401 384。
將抗體進(jìn)行工程化的方法如上所述，能夠利用具有此處公開的VH和VK序列的抗-IRTA-4抗體，通過修飾VH和/或VK序列或與之連接的恒定區(qū)，產(chǎn)生新的抗-IRTA-4抗體。因此，在本發(fā)明的另一方面，利用本發(fā)明的抗-IRTA-4抗體例如9G11或13B1的結(jié)構(gòu)特征，產(chǎn)生結(jié)構(gòu)上相關(guān)的抗-IRTA-4抗體，該結(jié)構(gòu)上相關(guān)的抗體保留本發(fā)明抗體的至少一種功能特性，如與人IRTA-4結(jié)合。如上所述，例如，9G11或13B1的一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)或其突變可以與已知的構(gòu)架區(qū)和/或其他CDR重組組合，從而產(chǎn)生另外的重組工程化的本發(fā)明的抗-IRTA-4抗體。其他類型的修飾包括以上部分所述的修飾。用于工程化方法的起始材料是此處提供的一種或多種VH和/或VK序列，或其一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)。為了產(chǎn)生工程化抗體，不一定必須實(shí)際制備(即表達(dá)為蛋白質(zhì))具有此處提供的一種或多種VH和/或VK序列，或其一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)的抗體。而是用該序列中所含的信息作為起始材料，產(chǎn)生由原始序列衍生的“第二代”序列，然后制備該“第二代”序列，并將其表達(dá)為蛋白質(zhì)。
因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種制備抗-IRTA-4抗體的方法，包括(a)提供(i)重鏈可變區(qū)抗體序列，其包含選自SEQ ID NO1和2的CDR1序列、選自SEQ ID NO3和4的CDR2序列、和/或選自SEQ ID NO5和6的CDR3序列；和/或(ii)輕鏈可變區(qū)抗體序列，其包含選自SEQ ID NO7和8的CDR1序列、選自SEQ ID NO9和10的CDR2序列、和/或選自SEQ ID NO11和12的CDR3序列；(b)改變重鏈可變區(qū)抗體序列和/或輕鏈可變區(qū)抗體序列內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸殘基，從而產(chǎn)生至少一個(gè)改變的抗體序列；和(c)將該改變的抗體序列表達(dá)為蛋白質(zhì)。
可以利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)制備和表達(dá)所述改變的抗體序列。
優(yōu)選地，由改變的抗體序列編碼的抗體保留此處所述抗-IRTA-4抗體的一種、一些或全部功能特性，該功能特性包括但不限于(i)以1×10-8M或更低的KD與人IRTA-4結(jié)合；(ii)基本不與人IRTA-1、IRTA-2、IRTA-3或IRTA-5結(jié)合；和/或(iii)與Daudi B細(xì)胞腫瘤細(xì)胞結(jié)合。
改變的抗體的功能特性可以用本領(lǐng)域中使用的和/或此處所述的，如實(shí)施例中所述的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)(例如流式細(xì)胞術(shù)、結(jié)合測(cè)定)來評(píng)價(jià)。
在工程化本發(fā)明抗體的方法的某些實(shí)施方案中，可以沿全部或部分抗-IRTA-4抗體編碼序列隨機(jī)或選擇性引入突變，并可以針對(duì)結(jié)合活性和/或如此處所述的其他功能特性，篩選獲得的修飾的抗-IRTA-4抗體。突變方法在本領(lǐng)域中已經(jīng)描述。例如，Short的PCT公布WO 02/092780記載了利用飽和誘變、合成連接裝配或它們的組合產(chǎn)生和篩選抗體突變的方法。另外，Lazar等人的PCT公布WO 03/074679也記載了利用計(jì)算篩選方法優(yōu)化抗體的生理化學(xué)性質(zhì)的方法。
編碼本發(fā)明的抗體的核酸分子本發(fā)明的另一方面涉及編碼本發(fā)明的抗體的核酸分子。該核酸可以存在于完整細(xì)胞、細(xì)胞裂解物中，或以部分純化或基本上純的形式存在。當(dāng)通過包括堿/SDS處理、CsCl顯帶、柱層析、瓊脂糖凝膠電泳在內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)和本領(lǐng)域公知的其他方法從其他細(xì)胞成分或其他污染物例如其他細(xì)胞核酸或蛋白質(zhì)中分離純化時(shí)，核酸是“分離的”或“基本上純的”。參見，F(xiàn).Ausubel等ed.(1987)Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing and Wiley Interscience，New York。本發(fā)明的核酸可以是例如DNA或RNA，并且可以含有或者可以不含內(nèi)含子序列。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該核酸是cDNA分子。
本發(fā)明的核酸可以利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)獲得。對(duì)于雜交瘤(例如，由如下文進(jìn)一步描述的攜帶人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠制備的雜交瘤)表達(dá)的抗體，編碼由雜交瘤制備的抗體輕鏈和重鏈的cDNA可以用標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增或cDNA克隆技術(shù)獲得。對(duì)于從免疫球蛋白基因文庫(kù)中獲得的抗體(例如使用噬菌體展示技術(shù))，可以從文庫(kù)中回收編碼該抗體的核酸。
本發(fā)明優(yōu)選的核酸分子是編碼9G11或13B1單克隆抗體的VH和VL序列的核酸分子。編碼9G11或13B1的VH序列的DNA序列分別顯示在SEQ ID NO17和18中。編碼9G11或13B1的VL序列的DNA序列分別顯示在SEQ ID NO19和20中。
一旦獲得編碼VH和VL片段的DNA片段，即可通過標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)進(jìn)一步操作這些DNA片段，例如將可變區(qū)基因轉(zhuǎn)化為全長(zhǎng)抗體鏈基因、Fab片段基因或scFv基因。在這些操作中，編碼VL或VH的DNA片段與編碼另外一種蛋白質(zhì)如抗體恒定區(qū)或柔性接頭的另一個(gè)DNA片段可操作地連接。如在本文中使用的術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”意思是兩個(gè)DNA片段連接在一起，使得這兩個(gè)DNA片段編碼的氨基酸序列保持在閱讀框內(nèi)。
通過將編碼VH的DNA與編碼重鏈恒定區(qū)(CH1、CH2和CH3)的另外一種DNA分子可操作地連接，可以將分離的編碼VH區(qū)的DNA轉(zhuǎn)化為全長(zhǎng)重鏈基因。人重鏈恒定區(qū)基因的序列在本領(lǐng)域中公知(參見，例如，Kabat，E.A.等(1991)Sequences of Proteins of Immunologicl Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH出版號(hào)91-3242)，包括這些區(qū)域的DNA片段可以通過標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增獲得。重鏈恒定區(qū)可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定區(qū)，但是最優(yōu)選的是IgG1或IgG4恒定區(qū)。對(duì)于Fab片段重鏈基因，編碼VH的DNA可以與只編碼重鏈CH1恒定區(qū)的另外一種DNA分子可操作地連接。
通過將編碼VL的DNA與編碼輕鏈恒定區(qū)CL的另外一種DNA分子可操作地連接，可以將分離的編碼VL區(qū)的DNA轉(zhuǎn)化為全長(zhǎng)輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。人輕鏈恒定區(qū)基因的序列在本領(lǐng)域中公知(參見，例如，Kabat，E.A.等(1991)Sequences of Proteins of ImmunologiclInterest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH出版號(hào)91-3242)，包括這些區(qū)域的DNA片段可以通過標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增獲得。輕鏈恒定區(qū)可以是κ或λ恒定區(qū)，但是最優(yōu)選的是κ恒定區(qū)。
為了產(chǎn)生scFv基因，將編碼VH和VL的DNA片段與編碼柔性接頭例如編碼氨基酸序列(Gly4-Ser)3的另外一個(gè)片段可操作地連接，使得VH和VL序列可以表達(dá)為連續(xù)的單鏈蛋白質(zhì)，其VL和VH區(qū)通過該柔性接頭連接(參見，例如Bird等(1988)Science 242423-426；Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-5883；McCafferty等(1990)Nature 348552-554)。
本發(fā)明的單克隆抗體的生產(chǎn)通過多種技術(shù)能制備本發(fā)明的單克隆抗體(mAb)，包括常規(guī)的單克隆抗體方法，例如，Kohler和Milstein(1975)Nature 256495所述的標(biāo)準(zhǔn)體細(xì)胞雜交技術(shù)。雖然優(yōu)選體細(xì)胞雜交技術(shù)，但是原則上，能使用制備單克隆抗體的其他技術(shù)，例如B淋巴細(xì)胞的病毒或致癌轉(zhuǎn)化。
用于制備雜交瘤的優(yōu)選的動(dòng)物系統(tǒng)是鼠系統(tǒng)。用小鼠產(chǎn)生雜交瘤是一種完善建立的程序。免疫程序和分離用于融合的被免疫脾細(xì)胞的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。融合配偶體(例如鼠骨髓瘤細(xì)胞)和融合程序也是公知的。
本發(fā)明的嵌合或人源化抗體可以基于如上所述制備的鼠單克隆抗體的序列制備。編碼重鏈和輕鏈免疫球蛋白的DNA可以從目標(biāo)鼠雜交瘤中獲得，并且使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)將其工程化為含有非鼠(例如人類)免疫球蛋白序列。例如，為了產(chǎn)生嵌合抗體，可以利用本領(lǐng)域公知的方法將鼠可變區(qū)連接到人恒定區(qū)上(參見，例如，Cabilly等人的美國(guó)專利No.4,816,567)。為了產(chǎn)生人源化抗體，可以利用本領(lǐng)域公知的方法將鼠CDR區(qū)插入人構(gòu)架內(nèi)(參見，例如，Winter的美國(guó)專利No.5,225,539，和Queen等人的美國(guó)專利No.5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是人單克隆抗體。這種抗IRTA-4人單克隆抗體能用攜帶部分人免疫系統(tǒng)而不是小鼠系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體小鼠產(chǎn)生。這些轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體小鼠包括在此分別稱作HuMab小鼠和KM小鼠的小鼠，并且在此通稱為“人Ig小鼠”。
HuMab小鼠(Medarex，Inc.)包含編碼未重排的人重鏈(μ和γ)和κ輕鏈免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小基因座，和使內(nèi)源μ和κ鏈基因座失活的定向突變(參見，例如，Lonberg等(1994)Nature 368(6474)856-859)。因此，該小鼠表現(xiàn)為小鼠IgM或κ表達(dá)降低，并且響應(yīng)于免疫，導(dǎo)入的人重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基因經(jīng)歷類別轉(zhuǎn)換和體細(xì)胞突變，從而產(chǎn)生高親和性人IgGκ單克隆抗體(Lonberg，N.等(1994)，同上；綜述Lonberg，N.(1994)Handbook of Experimental Pharmacology 11349-101；Lonberg，N.和Huszar，D.(1995)Intern.Rev.Immunol.Vol.1365-93，和Harding，F(xiàn).和Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci 764536-546)。HuMab小鼠的制備和使用，以及該小鼠攜帶的基因組修飾，于下面的文獻(xiàn)中詳細(xì)描述Taylor，L.等(1992)Nucleic Acids Research 206287-6295；Chen，J.等(1993)International Immunology 5647-656；Tuaillon等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA 903720-3724；Choi等(1993)Nature Genetics 4117-123；Chen，J.等(1993)EMBO J.12821-830；Tuaillon等(1994)J.Immunol.1522912-2920；Taylor，L.等(1994)International Immunology6579-591；和Fishwild，D.等(1996)Nature Biotechnology 14845-851，這些文獻(xiàn)的內(nèi)容全文在此引入作為參考。進(jìn)一步參見，美國(guó)專利No.5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；和5,770,429；都屬于Lonberg和Kay；和Surani等人的美國(guó)專利No.5,545,807；PCT公布號(hào)WO 92/03918，WO93/12227，WO 94/25585，WO 97/13852，WO 98/24884和WO 99/45962，都屬于Lonberg和Kay；和Korman等人的PCT公布號(hào)WO 01/14424。
在另一實(shí)施方案中，可以用轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體上攜帶人免疫球蛋白序列的小鼠，例如攜帶人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)染色體的小鼠，產(chǎn)生本發(fā)明的人抗體。這種小鼠在此稱為“KM小鼠TM”，在Ishida等人的PCT公布WO 02/43478中詳細(xì)描述。
再者，表達(dá)人免疫球蛋白基因的替代轉(zhuǎn)基因動(dòng)物系統(tǒng)在本領(lǐng)域中可以獲得，能夠用來產(chǎn)生本發(fā)明的抗-IRTA-4抗體。例如，可以使用一種稱作Xenomouse(Abgenix，Inc.)的替代轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)，這種小鼠在例如Kucherlapati等人的美國(guó)專利No.5,939,598；6,075,181；6,114,598；6,150,584和6,162,963中描述。
而且，表達(dá)人免疫球蛋白基因的替代轉(zhuǎn)染色體動(dòng)物系統(tǒng)在本領(lǐng)域中可以獲得，能夠用來產(chǎn)生本發(fā)明的抗-IRTA-4抗體。例如，可以使用攜帶人重鏈轉(zhuǎn)染色體和人輕鏈轉(zhuǎn)染色體的小鼠，其被稱作“TC小鼠”；這種小鼠在Tomizuka等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97722-727中描述。另外，本領(lǐng)域中已經(jīng)描述了攜帶人重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)染色體的牛(Kuroiwa等(2002)Nature Biotechnology 20889-894)，其能夠用來產(chǎn)生本發(fā)明的抗-IRTA-4抗體。
也可以使用篩查人免疫球蛋白基因文庫(kù)的噬菌體展示方法制備本發(fā)明的人單克隆抗體。這種用于分離人抗體的噬菌體展示方法在本領(lǐng)域中已經(jīng)建立。參見，例如，Ladner等人的美國(guó)專利No.5,223,409；5,403,484；和5,571,698；Dower等人的美國(guó)專利No.5,427,908和5,580,717；McCafferty等人的美國(guó)專利No.5,969,108和6,172,197；和Griffiths等人的美國(guó)專利No.5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915和6,593,081。
也可以用SCID小鼠制備本發(fā)明的人單克隆抗體，該SCID小鼠中重構(gòu)了人免疫細(xì)胞，因此在免疫時(shí)能夠產(chǎn)生人抗體應(yīng)答。這種小鼠在例如Wilson等人的美國(guó)專利No.5,476,996和5,698,767中描述。
人Ig小鼠的免疫當(dāng)使用人Ig小鼠產(chǎn)生本發(fā)明的人抗體時(shí)，根據(jù)Lonberg，N.等(1994)Nature 368(6474)856-859；Fishwild，D.等(1996)Nature Biotechnology14845-851；和PCT公布WO 98/24884和WO 01/14424所述，用純化的或富集的IRTA-4抗原和/或重組IRTA-4或IRTA-4融合蛋白的制劑免疫該小鼠。優(yōu)選地，第一次輸注時(shí)小鼠為6-16周齡。例如，可以使用純化的或重組的IRTA-4抗原的制劑(5-50μg)腹膜內(nèi)免疫人Ig小鼠。
產(chǎn)生抗IRTA-4完全人單克隆抗體的詳細(xì)程序在下面的實(shí)施例1中描述。應(yīng)用各種抗原積累的經(jīng)驗(yàn)證明，當(dāng)最初使用弗氏完全佐劑中的抗原腹膜內(nèi)(IP)免疫，接著隔周用弗氏不完全佐劑中的抗原腹膜內(nèi)免疫(最多共六次)時(shí)，轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生應(yīng)答。但是，發(fā)現(xiàn)弗氏佐劑之外的佐劑也是有效的。另外，發(fā)現(xiàn)在沒有佐劑時(shí)，全細(xì)胞具有高度免疫原性。在免疫方案進(jìn)程中用眼眶后取血獲得的血漿樣品監(jiān)測(cè)免疫應(yīng)答。通過ELISA(如下所述)篩選血漿，用具有足夠抗-IRTA-4人免疫球蛋白效價(jià)的小鼠進(jìn)行融合。用抗原對(duì)小鼠進(jìn)行靜脈內(nèi)加強(qiáng)免疫，3天后處死并且取出脾臟。預(yù)期每次免疫可能需要融合2-3次。每一種抗原一般免疫6-24只小鼠。通常HCo7和HCo12系都使用。另外，HCo7和HCo12轉(zhuǎn)基因可以雜交，產(chǎn)生具有兩種不同人重鏈轉(zhuǎn)基因(HCo7/HCo12)的一種小鼠?；蛘?，如實(shí)施例1所述，可以使用KM小鼠TM系。
產(chǎn)生本發(fā)明的人單克隆抗體的雜交瘤的制備為了制備產(chǎn)生本發(fā)明的人單克隆抗體的雜交瘤，從被免疫的小鼠中分離脾細(xì)胞和/或淋巴結(jié)細(xì)胞，并且與合適的無限增殖化細(xì)胞系例如小鼠骨髓瘤細(xì)胞系融合。針對(duì)抗原特異性抗體的產(chǎn)生篩選得到的雜交瘤。例如，使用50％PEG，將來自免疫小鼠的脾淋巴細(xì)胞的單細(xì)胞懸液與六分之一數(shù)量的P3X63-Ag8.653非分泌小鼠骨髓瘤細(xì)胞(ATCC，CRL 1580)融合。細(xì)胞以大約2×105的密度接種于平底微量滴定板中，接著在含有20％胎克隆血清，18％“653”條件基質(zhì)，5％Origen(IGEN)，4mM L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸鈉，5mM HEPES，0.055mM 2-巰基乙醇，50單位/毫升青霉素，50mg/ml鏈霉素，50mg/ml慶大霉素和1×HAT(Sigma；融合后24小時(shí)加入HAT)的選擇性培養(yǎng)基中溫育兩周。大約兩周之后，在用HT替換了HAT的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。然后通過ELISA針對(duì)人單克隆IgM和IgG抗體篩選各孔。一旦發(fā)生廣泛的雜交瘤生長(zhǎng)，則通常在10-14天之后觀察培養(yǎng)基。將分泌抗體的雜交瘤再次平板接種，再次篩選，如果對(duì)于人IgG仍然是陽(yáng)性，則可以通過有限稀釋將單克隆抗體亞克隆至少兩次。然后體外培養(yǎng)穩(wěn)定的亞克隆，以在組織培養(yǎng)基中產(chǎn)生少量抗體用于表征。
為了純化人單克隆抗體，選擇的雜交瘤可以在用于單克隆抗體純化的兩升旋轉(zhuǎn)搖瓶中生長(zhǎng)。過濾上清液，濃縮，之后用蛋白A-sepharose(Pharmacia，Piscataway，N.J.)進(jìn)行親和層析。洗脫下來的IgG通過凝膠電泳和高效液相色譜法檢查以確保純度。將緩沖溶液換成PBS，用1.43的消光系數(shù)根據(jù)OD280確定濃度。可將單克隆抗體分成等份并且在-80℃下保存。
產(chǎn)生本發(fā)明單克隆抗體的轉(zhuǎn)染瘤的制備例如，利用本領(lǐng)域公知的重組DNA技術(shù)和基因轉(zhuǎn)染方法的組合(例如，Morrison，S.(1985)science 2291202)，也能在宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)染瘤中產(chǎn)生本發(fā)明的抗體。
例如，為了表達(dá)抗體或其抗體片段，可通過標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)(例如，使用表達(dá)目標(biāo)抗體的雜交瘤進(jìn)行PCR擴(kuò)增或cDNA克隆)，獲得編碼部分或全長(zhǎng)輕鏈和重鏈的DNA，并將該DNA插入到表達(dá)載體中，使得基因與轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列可操作地連接。在上下文中，術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”意思是抗體基因連接到載體中，使得載體中的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列發(fā)揮它們調(diào)節(jié)該抗體基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯的預(yù)期功能。選擇與所用的表達(dá)宿主細(xì)胞相匹配的表達(dá)載體和表達(dá)控制序列。抗體輕鏈基因和抗體重鏈基因可被插入到單獨(dú)的載體中，或者，更通常地，將兩個(gè)基因插入到同一表達(dá)載體中。通過標(biāo)準(zhǔn)方法將抗體基因插入到表達(dá)載體中(例如，抗體基因片段上的互補(bǔ)限制性位點(diǎn)與載體連接，或者如果不存在限制性位點(diǎn)，則平端連接)。通過插入到已經(jīng)編碼期望的同種型的重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的表達(dá)載體中，使得VH區(qū)段與載體中的CH區(qū)段可操作地連接，而VK區(qū)段與載體中的CL區(qū)段可操作地連接，能夠利用此處描述的抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)產(chǎn)生任一抗體同種型的全長(zhǎng)抗體基因。另外，或者，重組表達(dá)載體能編碼有利于宿主細(xì)胞分泌抗體鏈的信號(hào)肽?？蓪⒖贵w鏈基因克隆到載體中，使得信號(hào)肽與該抗體鏈基因的氨基末端符合閱讀框地連接。信號(hào)肽可以是免疫球蛋白信號(hào)肽或異源信號(hào)肽(即，來自非免疫球蛋白的蛋白質(zhì)的信號(hào)肽)。
除了抗體鏈基因，本發(fā)明的重組表達(dá)載體還帶有控制該抗體鏈基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)序列”包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和控制抗體鏈基因轉(zhuǎn)錄或翻譯的其他表達(dá)控制元件(例如，多腺苷酸化信號(hào))。這樣的調(diào)節(jié)序列例如在Goeddel(Gene Expression Technology.Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990))中描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，表達(dá)載體的設(shè)計(jì)，包括調(diào)節(jié)序列的選擇，取決于諸如要轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇、期望的蛋白質(zhì)表達(dá)水平等因素。用于哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞表達(dá)的優(yōu)選調(diào)節(jié)序列包括指導(dǎo)蛋白質(zhì)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高水平表達(dá)的病毒元件，例如來源于巨細(xì)胞病毒(CMV)、猿病毒40(SV40)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期啟動(dòng)子(AdMLP))和多瘤病毒的啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子。此外也可以使用非病毒調(diào)節(jié)序列，例如泛蛋白啟動(dòng)子或β-珠蛋白啟動(dòng)子。另外，調(diào)節(jié)元件也可由來自諸如SRα啟動(dòng)子系統(tǒng)的不同來源的序列組成，SRα啟動(dòng)子系統(tǒng)含有來自SV40早期啟動(dòng)子的序列和人1型T細(xì)胞白血病病毒的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(Takebe，Y.等(1988)Mol.Cell.Biol.8466-472)。
除了抗體鏈基因和調(diào)節(jié)序列以外，本發(fā)明的重組表達(dá)載體還可以攜帶另外的序列，例如調(diào)節(jié)載體在宿主細(xì)胞中復(fù)制的序列(例如，復(fù)制起點(diǎn))和選擇性標(biāo)記基因。選擇性標(biāo)記基因有利于篩選載體已經(jīng)導(dǎo)入其中的宿主細(xì)胞(參見，例如，Axel等人的美國(guó)專利No.4,399,216，4,634,665和5,179,017)。例如，選擇性標(biāo)記基因一般給已經(jīng)導(dǎo)入載體的宿主細(xì)胞帶來抗藥性，例如G418、潮霉素或氨甲喋呤抗性。優(yōu)選的選擇性標(biāo)記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(在dhfr-宿主細(xì)胞中用于氨甲喋呤選擇/擴(kuò)增)和neo基因(用于G418選擇)。
對(duì)于輕鏈和重鏈的表達(dá)，通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將編碼重鏈和輕鏈的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)染”的各種形式包括常用于將外源DNA導(dǎo)入原核或真核宿主細(xì)胞中的各種技術(shù)，例如，電穿孔、磷酸鈣沉淀、DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染等等。雖然在理論上可以在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的抗體，但是優(yōu)選在真核細(xì)胞中表達(dá)抗體，最優(yōu)選在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中表達(dá)，因?yàn)檫@樣的真核細(xì)胞，特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，比原核細(xì)胞更可能組裝和分泌正確折疊并且具有免疫活性的抗體。據(jù)報(bào)道，原核表達(dá)抗體基因無法高產(chǎn)率地產(chǎn)生活性抗體(Boss，M.A.和Wood，C.R.(1985)Immunology Today 612-13)。
用于表達(dá)本發(fā)明的重組抗體的優(yōu)選哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO細(xì)胞)(包括dhfr-CHO細(xì)胞，在Urlaub和Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 774216-4220中描述，和DHFR選擇性標(biāo)記一起使用，例如，如R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159601-621所述)、NSO骨髓瘤細(xì)胞、COS細(xì)胞和SP2細(xì)胞。特別地，用于NSO骨髓瘤細(xì)胞的另一種優(yōu)選表達(dá)系統(tǒng)是WO 87/04462、WO 89/01036和EP338,841公開的GS基因表達(dá)系統(tǒng)。當(dāng)將編碼抗體基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中時(shí)，通過在足以使抗體在宿主細(xì)胞中表達(dá)的時(shí)間里培養(yǎng)宿主細(xì)胞，或更優(yōu)選地，在足以使抗體分泌到宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中的時(shí)間里培養(yǎng)宿主細(xì)胞，產(chǎn)生抗體?？蓱?yīng)用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化方法從培養(yǎng)基中回收抗體。
抗體與抗原結(jié)合的表征通過例如標(biāo)準(zhǔn)ELISA，可以檢測(cè)本發(fā)明的抗體與IRTA-4的結(jié)合。簡(jiǎn)要地說，用0.25μg/ml的純化IRTA-4在PBS中的溶液包被微量滴定板，然后用PBS中的5％牛血清白蛋白封閉。向各個(gè)孔中加入抗體的稀釋液(例如，來自IRTA-4免疫小鼠的血漿的稀釋液)，并且在37℃下溫育1-2小時(shí)。用PBS/Tween洗滌培養(yǎng)板，之后和與堿性磷酸酶偶聯(lián)的第二試劑(例如，對(duì)于人抗體，為山羊抗人IgG Fc特異性多克隆試劑)一起在37℃下溫育1小時(shí)。洗滌后，培養(yǎng)板用pNPP底物(1mg/ml)顯色，并且在OD 405-650下分析。優(yōu)選地，用顯示最高效價(jià)的小鼠進(jìn)行融合。
如上所述的ELISA分析也可以用來篩選表現(xiàn)出與IRTA-4免疫原有陽(yáng)性反應(yīng)性的雜交瘤。將高親合力結(jié)合IRTA-4的雜交瘤進(jìn)行亞克隆，并且進(jìn)一步表征。從每個(gè)雜交瘤中選擇保留母細(xì)胞反應(yīng)性的一個(gè)克隆(通過ELISA)，制備5-10小瓶細(xì)胞庫(kù)，保存在-140℃下，用于抗體純化。
為了純化抗-IRTA-4抗體，選擇的雜交瘤在用于單克隆抗體純化的兩升旋轉(zhuǎn)搖瓶中生長(zhǎng)。過濾上清液并且濃縮，然后用蛋白A-sepharose(Pharmacia，Piscataway，NJ)進(jìn)行親和層析。通過凝膠電泳和高效液相色譜檢查洗脫的IgG以確保純度。將緩沖溶液換成PBS，并且使用1.43的消光系數(shù)根據(jù)OD280確定濃度。將單克隆抗體分成等份并且在-80℃下保存。
為了確定選擇的抗-IRTA-4單克隆抗體是否與獨(dú)特表位結(jié)合，可以使用商售試劑(Pierce，Rockford，IL)將每種抗體生物素化?？梢允褂萌缟纤龅腎RTA-4包被的ELISA板，應(yīng)用未標(biāo)記的單克隆抗體和生物素化單克隆抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)研究?？梢允褂面溍箍股锼氐鞍?堿性磷酸酶探針檢測(cè)生物素化mAb的結(jié)合。
為了確定被純化的抗體的同種型，可以用對(duì)特定同種型抗體具有特異性的試劑進(jìn)行同種型ELISA。例如，為了確定人單克隆抗體的同種型，在4℃下用1μg/ml抗人免疫球蛋白包被微量滴定板的孔過夜。用1％BSA封閉之后，平板與1μg/ml或更少的測(cè)試單克隆抗體或純化的同種型對(duì)照物在室溫下反應(yīng)1-2小時(shí)。這些孔然后與人IgG1或人IgM特異性堿性磷酸酶偶聯(lián)的探針反應(yīng)。如上所述使平板顯色并且分析。
可以通過Western印跡法進(jìn)一步檢測(cè)抗-IRTA-4人IgG與IRTA-4抗原的反應(yīng)性。簡(jiǎn)要地說，制備IRTA-4并進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后，將分離的抗原轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用10％胎牛血清封閉，并用將要檢測(cè)的單克隆抗體探查。人IgG的結(jié)合可以用抗人IgG堿性磷酸酶檢測(cè)，并用BCIP/NBT底物片(Sigma Chem.Co.，St.Louis，Mo.)顯色。
免疫偶聯(lián)物另一方面，本發(fā)明提供與諸如細(xì)胞毒素、藥物(例如免疫抑制劑)或放射性毒素的治療性部分偶聯(lián)的抗-IRTA-4抗體或其片段。這些偶聯(lián)物在此被稱為“免疫偶聯(lián)物”。包括一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞毒素的免疫偶聯(lián)物被稱作“免疫毒素”。細(xì)胞毒素或細(xì)胞毒劑包括對(duì)細(xì)胞有害(例如殺傷細(xì)胞)的任何試劑。實(shí)例包括紫杉醇、細(xì)胞松弛素B、短桿菌肽D、溴化乙啶、吐根堿、絲裂霉素、表鬼臼毒吡喃葡糖苷、表鬼臼毒噻吩糖苷、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、秋水仙素、阿霉素、柔紅霉素、二羥基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光輝霉素、放線菌素D、1-脫氫睪酮、糖皮質(zhì)激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾和嘌呤霉素和它們的類似物或同系物。治療劑還包括，例如，抗代謝物(例如，氨甲喋呤、6-巰基嘌呤、6-硫代鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、氨烯咪胺(decarbazine))，烷化劑(例如，氮芥、苯丁酸氮芥(thioepa chlorambucil)、苯丙氨酸氮芥、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、環(huán)磷酰胺、白消安、二溴甘露糖醇、鏈唑霉素、絲裂霉素C和順-二氯二胺合鉑(II)(DDP)順鉑)，氨茴霉素類(例如，柔紅菌素(以前稱為道諾霉素)和阿霉素)，抗生素(例如，放線菌素D(以前稱為放線菌素)、博來霉素、光輝霉素和安曲霉素(AMC))，和抗有絲分裂劑(例如，長(zhǎng)春新堿和長(zhǎng)春堿)。
能與本發(fā)明抗體偶聯(lián)的治療性細(xì)胞毒素的其他優(yōu)選例子包括倍癌霉素、刺孢霉素、美坦生、auristatin、和它們的衍生物。刺孢霉素抗體偶聯(lián)物的一個(gè)例子是可作為商品購(gòu)得的MylotargTM；Wyeth。
可以利用本領(lǐng)域使用的接頭技術(shù)將細(xì)胞毒素與本發(fā)明的抗體偶聯(lián)。已經(jīng)用于將細(xì)胞毒素與抗體偶聯(lián)的接頭類型的實(shí)例包括但不限于腙、硫醚、酯、二硫化物和含肽的接頭?？梢赃x擇，例如，在溶酶體區(qū)室內(nèi)易被低pH切割或易被蛋白酶切割的接頭，該蛋白酶例如是在腫瘤組織中優(yōu)先表達(dá)的蛋白酶，如組織蛋白酶(例如組織蛋白酶B、C、D)。
關(guān)于細(xì)胞毒素的類型，用于偶聯(lián)治療劑與抗體的接頭和方法的進(jìn)一步討論，參見Saito，G.等(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55199-215；Trail，P.A.等(2003)Cancer.Immunol.Immunother.52328-337；Payne，G.(2003)Cancer Cell 3207-212；Allen，T.M.(2002)Nat.Rev.Cancer 2750-763；Pastan，I.和Kreitman，R.J.(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs 31089-1091；Senter，P.D.和Springer，C.J.(2001)Adv.Drug Deliv.Rev.53247-264。
本發(fā)明的抗體也可以與放射性同位素偶聯(lián)，產(chǎn)生細(xì)胞毒性放射性藥物，也稱作放射性免疫偶聯(lián)物。能夠與診斷或治療性使用的抗體偶聯(lián)的放射性同位素的例子包括但不限于碘131、銦111、釔90和镥177。制備放射性免疫偶聯(lián)物的方法在本領(lǐng)域中已經(jīng)建立。放射性免疫偶聯(lián)物的例子可以作為商品獲得，包括ZevalinTM(IDEC Pharmaceuticals)和BexxarTM(Corixa Pharmaceuticals)，并且能夠利用類似的方法使用本發(fā)明的抗體制備放射性免疫偶聯(lián)物。
本發(fā)明的抗體偶聯(lián)物可用于修飾特定的生物學(xué)反應(yīng)，且藥物部分不應(yīng)理解為局限于經(jīng)典的化學(xué)治療劑。例如，藥物部分可以是具有需要的生物活性的蛋白質(zhì)或多肽。這樣的蛋白質(zhì)包括，例如，具有酶活性的毒素或其活性片段，如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假單胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白質(zhì)，如腫瘤壞死因子或干擾素-γ；或生物學(xué)反應(yīng)調(diào)節(jié)物，如淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒細(xì)胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其他生長(zhǎng)因子。
將這種治療性部分與抗體偶聯(lián)的技術(shù)是眾所周知的，參見，例如，Arnon等，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs InCancer Therapy”，in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等(ed.)，pp.243-56(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等，“Antibodies ForDrug Delivery”，in Controlled Drug Delivery(2nd Ed.)，Robinson等(ed.)，pp.623-53(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，“Antibody Carriers OfCytotoxic Agents In Cancer TherapyA Review”，in MonoclonalAntibodies’84Biological And Clinical Applications，Pinchera等(ed.)，pp.475-506(1985)；“Analysis，Results，And Future Prospective Of TheTherapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”，inMonoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin等(ed.)，pp.303-16(Academic Press 1985)，和Thorpe等，“The Preparation AndCytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates”，Immunol.Rev.，62119-58(1982)。
雙特異性分子另一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的抗-IRTA-4抗體或其片段的雙特異性分子。本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分可以被衍生化或連接到另一個(gè)功能性分子上，如另一個(gè)肽或蛋白質(zhì)(例如另一個(gè)抗體或受體的配體)上，生成可與至少兩個(gè)不同結(jié)合位點(diǎn)或靶分子結(jié)合的雙特異性分子。本發(fā)明的抗體實(shí)際上可以被衍生化或連接到一個(gè)以上的其他功能性分子上，從而生成可與兩個(gè)以上不同結(jié)合位點(diǎn)和/或靶分子結(jié)合的多特異性分子；這樣的多特異性分子也包括在此處所用的術(shù)語(yǔ)“雙特異性分子”內(nèi)。為了產(chǎn)生本發(fā)明的雙特異性分子，本發(fā)明的抗體可與一個(gè)或多個(gè)其他結(jié)合分子如其他抗體、抗體片段、肽或結(jié)合模擬物功能性連接(如通過化學(xué)偶聯(lián)、基因融合、非共價(jià)結(jié)合等)，從而得到雙特異性分子。
因此，本發(fā)明包括包含至少一種對(duì)IRTA-4的第一結(jié)合特異性和對(duì)第二種目標(biāo)表位的第二結(jié)合特異性的雙特異性分子。在本發(fā)明一個(gè)特定實(shí)施方案中，第二種目標(biāo)表位是Fc受體，如人FcγRI(CD64)或人Fcα受體(CD89)。因此，本發(fā)明包括既能與表達(dá)FcγR或FcαR的效應(yīng)細(xì)胞(如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或多形核細(xì)胞(PMN))結(jié)合，又能與表達(dá)IRTA-4的靶細(xì)胞結(jié)合的雙特異性分子。這些雙特異性分子將表達(dá)IRTA-4的細(xì)胞導(dǎo)向于效應(yīng)細(xì)胞，并且觸發(fā)Fc受體介導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞活性，如表達(dá)IRTA-4的細(xì)胞的吞噬作用、抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)、細(xì)胞因子釋放、或超氧陰離子的產(chǎn)生。
在其中雙特異性分子是多特異性分子的本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，除抗-Fc結(jié)合特異性和抗-IRTA-4結(jié)合特異性之外，該分子可進(jìn)一步包括第三結(jié)合特異性。在一個(gè)實(shí)施方案中，該第三結(jié)合特異性是抗增強(qiáng)因子(EF)部分，例如與參與細(xì)胞毒性活性的表面蛋白質(zhì)結(jié)合因而增強(qiáng)針對(duì)靶細(xì)胞的免疫應(yīng)答的分子?！翱乖鰪?qiáng)因子部分”可以是與諸如抗原或受體的特定分子結(jié)合，從而導(dǎo)致結(jié)合決定簇對(duì)Fc受體或靶細(xì)胞抗原的作用增強(qiáng)的抗體、功能性抗體片段或配體。“抗增強(qiáng)因子部分”可與Fc受體或靶細(xì)胞抗原結(jié)合。或者，抗增強(qiáng)因子部分可以與一種實(shí)體結(jié)合，該實(shí)體不同于第一和第二結(jié)合特異性所結(jié)合的實(shí)體。例如，抗增強(qiáng)因子部分可與細(xì)胞毒性T細(xì)胞結(jié)合(如經(jīng)由CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40、ICAM-1或其他免疫細(xì)胞，該細(xì)胞導(dǎo)致針對(duì)靶細(xì)胞的免疫應(yīng)答增強(qiáng))。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙特異性分子包含至少一個(gè)抗體或其抗體片段作為結(jié)合特異性，包括如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或單鏈Fv。該抗體也可以是輕鏈或重鏈二聚體，或任何其最小片段，如Fv或單鏈構(gòu)建體，如Ladner等人的美國(guó)專利No.4,946,778所述，該專利的內(nèi)容引入本文作為參考。
在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)Fcγ受體的結(jié)合特異性由單克隆抗體提供，該單克隆抗體的結(jié)合不被人免疫球蛋白G(IgG)阻斷。如此處所用的術(shù)語(yǔ)“IgG受體”是指位于染色體1上的8個(gè)γ-鏈基因的任何一個(gè)。這些基因編碼總共12個(gè)跨膜或可溶性受體同種型，這些同種型分組為3個(gè)Fcγ受體類別FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，F(xiàn)cγ受體是人高親和力FcγRI。人FcγRI是72kDa的分子，對(duì)單體IgG表現(xiàn)出高親和力(108-109M-1)。
某些優(yōu)選抗-Fcγ單克隆抗體的制備和表征由Fanger等人在PCT申請(qǐng)WO 88/00052和美國(guó)專利號(hào)4,954,617中描述，在此處將其教導(dǎo)整體引入作為參考。這些抗體在與受體的Fcγ結(jié)合位點(diǎn)不同的位點(diǎn)處與FcγRI、FcγRII或FcγRIII的表位結(jié)合，因而，其結(jié)合基本不被生理學(xué)水平的IgG阻斷。可用于本發(fā)明中的特定抗-FcγRI抗體為mAb 22、mAb 32、mAb 44、mAb 62和mAb 197。產(chǎn)生mAb 32的雜交瘤可從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心獲得，ATCC保藏號(hào)為HB9469。在另外一些實(shí)施方案中，抗-Fcγ受體抗體是單克隆抗體22的人源化形式(H22)。H22抗體的產(chǎn)生和表征在Graziano，R.F.等(1995)J.Immunol 155(10)4996-5002和PCT公布WO 94/10332中描述。產(chǎn)生H22抗體的細(xì)胞系以HA022CL1的名稱保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CRL 11177。
在另外一些優(yōu)選實(shí)施方案中，對(duì)Fc受體的結(jié)合特異性由結(jié)合人IgA受體如Fc-α受體(FcαRI(CD89))的抗體提供，該抗體的結(jié)合優(yōu)選地不被人免疫球蛋白A(IgA)阻斷。術(shù)語(yǔ)“IgA受體”包括位于染色體19上的一個(gè)α-基因的基因產(chǎn)物(FcαRI)。已知該基因編碼幾個(gè)55-110kDa的可變剪接跨膜同種型。FcαRI(CD89)在單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、嗜酸性和嗜中性粒細(xì)胞上組成型表達(dá)，但不在非效應(yīng)細(xì)胞群體上組成型表達(dá)。FcαRI對(duì)IgA1和IgA2兩者均具有中等親和力(約5×107M-1)，在暴露于諸如G-CSF或GM-CSF的細(xì)胞因子后該親和力增加(Morton，H.C.等(1996)CriticalReviews in Immunology 16423-440)。已描述了4種FcαRI-特異性單克隆抗體，它們被確定為A3、A59、A62和A77，它們?cè)贗gA配體結(jié)合域之外與FcαRI結(jié)合(Monteiro，R.C.等(1992)J.Immunol.1481764)。
FcαRI和FcγRI是用于本發(fā)明的雙特異性分子的優(yōu)選觸發(fā)受體，因?yàn)樗鼈?1)主要表達(dá)于諸如單核細(xì)胞、PMN、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞的免疫效應(yīng)細(xì)胞上；(2)高水平表達(dá)(如每個(gè)細(xì)胞表達(dá)5,000-100,000個(gè))；(3)是細(xì)胞毒性(如ADCC、吞噬作用)的介質(zhì)；(4)介導(dǎo)導(dǎo)向于它們的抗原(包括自身抗原)的增強(qiáng)的抗原呈遞。
優(yōu)選人單克隆抗體，可以在本發(fā)明的雙特異性分子中使用的其他抗體包括鼠、嵌合和人源化單克隆抗體。
可通過應(yīng)用本領(lǐng)域中公知的方法偶聯(lián)組成的結(jié)合特異性，如抗-FcR和抗-IRTA-4結(jié)合特異性，制備本發(fā)明的雙特異性分子。例如，雙特異性分子的每一種結(jié)合特異性可單獨(dú)生成，然后彼此偶聯(lián)。當(dāng)結(jié)合特異性是蛋白質(zhì)或肽時(shí)，可以使用多種偶聯(lián)劑或交聯(lián)劑進(jìn)行共價(jià)偶聯(lián)。交聯(lián)劑的例子包括蛋白A、碳二亞胺、N-琥珀酰亞氨基-S-乙酰-硫代乙酸鹽(SATA)、5，5’-二硫代二(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、鄰亞苯基雙馬來酰亞胺(oPDM)、N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸鹽(SPDP)和磺基琥珀酰亞氨基4-(N-馬來酰亞氨基甲基)環(huán)己基-1-羧酸鹽(sulfo-SMCC)(參見，例如，Karpovsky等(1984)J.Exp.Med.1601686；Liu，MA等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 828648)。其他方法包括Paulus(1985)Behring Ins.Mitt.No.78，118-132)；Brennan等(1985)Science 22981-83和Glennie等(1987)J.Immunol.1392367-2375所描述的方法。優(yōu)選的偶聯(lián)劑為SATA和sulfo-SMCC，兩者均可從Pierce Chemical Co.(Rockford，IL)獲得。
當(dāng)結(jié)合特異性是抗體時(shí)，它們可通過兩個(gè)重鏈的C-末端鉸鏈區(qū)的巰基鍵合而偶聯(lián)。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，對(duì)鉸鏈區(qū)進(jìn)行修飾以使其在偶聯(lián)前含有奇數(shù)個(gè)，優(yōu)選1個(gè)巰基殘基。
或者，兩種結(jié)合特異性可在同一載體中編碼，并在相同的宿主細(xì)胞中表達(dá)和裝配。當(dāng)雙特異性分子是mAb×mAb，mAb×Fab，F(xiàn)ab×F(ab’)2或配體×Fab融合蛋白時(shí)，該方法是特別有用的。本發(fā)明的雙特異性分子可以是包含一個(gè)單鏈抗體和一個(gè)結(jié)合決定簇的單鏈分子，或包含兩個(gè)結(jié)合決定簇的單鏈雙特異性分子。雙特異性分子可以包含至少兩個(gè)單鏈分子。制備雙特異性分子的方法例如在美國(guó)專利No.5,260,203、美國(guó)專利No.5,455,030、美國(guó)專利No.4,881,175、美國(guó)專利No.5,132,405，美國(guó)專利No.5,091,513、美國(guó)專利No.5,476,786、美國(guó)專利No.5,013,653、美國(guó)專利No.5,258,498和美國(guó)專利No.5,482,858中描述。
雙特異性分子與其特異性靶標(biāo)的結(jié)合可通過例如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、放射免疫測(cè)定(RIA)、FACS分析、生物測(cè)定(如生長(zhǎng)抑制)或Western印跡分析來證實(shí)。這些試驗(yàn)中的每一個(gè)通常通過應(yīng)用對(duì)目標(biāo)復(fù)合物具有特異性的標(biāo)記試劑(如抗體)來檢測(cè)特定目標(biāo)蛋白質(zhì)-抗體復(fù)合物的存在。例如，可以利用識(shí)別和特異性結(jié)合抗體-FcR復(fù)合物的酶聯(lián)抗體或抗體片段來檢測(cè)FcR-抗體復(fù)合物?；蛘?，這些復(fù)合物可利用多種其他免疫分析中的任一種來檢測(cè)。例如，可對(duì)抗體進(jìn)行放射性標(biāo)記并且在放射免疫測(cè)定(RIA)中使用(參見，例如，Weintraub，B.，Principles ofRadioimmunoassays，Seventh Training Course on Radioligand AssayTechniques，The Endocrine Society，1986年3月，在此引入作為參考)。通過諸如使用γ計(jì)數(shù)器或閃爍計(jì)數(shù)器的手段或者通過放射自顯影方法，能夠檢測(cè)放射性同位素。
藥物組合物另一方面，本發(fā)明提供一種組合物，例如藥物組合物，其含有與藥學(xué)上可接受的載體配制在一起的一種或組合的本發(fā)明的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分。這樣的組合物可以包含一種或組合的(例如兩種或多種不同的)本發(fā)明的抗體或免疫偶聯(lián)物或雙特異性分子。例如，本發(fā)明的藥物組合物可以含有結(jié)合靶抗原上的不同表位或具有互補(bǔ)活性的抗體組合(或免疫偶聯(lián)物或雙特異性分子)。
本發(fā)明的藥物組合物也可以在聯(lián)合治療中施用，即與其他藥劑聯(lián)用。例如，聯(lián)合治療可包括本發(fā)明的抗-IRTA-4抗體聯(lián)合至少一種其他的抗炎劑或免疫抑制劑?？稍诼?lián)合治療中使用的治療劑的例子在下面本發(fā)明抗體的應(yīng)用一節(jié)中更詳細(xì)地描述。
如此處所用的“藥學(xué)上可接受的載體”包括生理學(xué)相容的任何和所有的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。優(yōu)選地，該載體適合于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腸胃外、脊柱或表皮給藥(如通過注射或輸注)。根據(jù)給藥途徑，可將活性化合物即抗體、免疫偶聯(lián)物或雙特異性分子包裹于一種材料中，以保護(hù)該化合物免受可使該化合物失活的酸和其他天然條件的作用。
本發(fā)明的藥物組合物可包含一種或多種藥學(xué)上可接受的鹽?！八帉W(xué)上可接受的鹽”是指保持了親代化合物的所需生物活性而不引起任何不期望的毒理學(xué)作用的鹽(參見如Berge，S.M.等(1977)J.Pharm.Sci.661-19)。這樣的鹽的例子包括酸加成鹽和堿加成鹽。酸加成鹽包括那些由諸如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸、亞磷酸等無毒性無機(jī)酸衍生的鹽，以及由諸如脂族單羧酸和二羧酸、苯基取代的鏈烷酸、羥基鏈烷酸、芳族酸、脂族和芳族磺酸等無毒性有機(jī)酸衍生的鹽。堿加成鹽包括那些由諸如鈉、鉀、鎂、鈣等堿土金屬衍生的鹽，以及由諸如N，N’-二芐基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因等無毒性有機(jī)胺衍生的鹽。
本發(fā)明的藥物組合物也可含有藥學(xué)上可接受的抗氧化劑。藥學(xué)上可接受的抗氧化劑的例子包括(1)水溶性抗氧化劑，如抗壞血酸、鹽酸半胱氨酸、硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉，亞硫酸鈉等；(2)油溶性抗氧化劑，如棕櫚酸抗壞血酸酯、丁羥茴醚(BHA)、丁羥甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金屬螯合劑，如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
可用于本發(fā)明藥物組合物中的適當(dāng)?shù)乃曰蚍撬暂d體的例子包括水，乙醇，多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)，及其適當(dāng)?shù)幕旌衔?，植物油如橄欖油，和注射用有機(jī)酯如油酸乙酯。例如通過應(yīng)用包被材料如卵磷脂，在分散液的情況下通過維持所需的顆粒大小，以及通過應(yīng)用表面活性劑，能夠維持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。
這些組合物也可含有佐劑，如防腐劑、潤(rùn)濕劑、乳化劑和分散劑?？梢酝ㄟ^上述的滅菌程序或通過包含諸如對(duì)羥基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚山梨酸等各種抗細(xì)菌劑和抗真菌劑確保防止存在微生物。也可能需要在組合物中包含等滲劑，例如，糖、氯化鈉等。另外，通過包含延遲吸收劑，例如單硬脂酸鋁和明膠，可實(shí)現(xiàn)注射型藥物延長(zhǎng)的吸收。
藥學(xué)上可接受的載體包括無菌水溶液或分散液和用于臨時(shí)制備無菌注射液或分散液的粉末劑。這些用于藥學(xué)活性物質(zhì)的介質(zhì)和試劑的使用是本領(lǐng)域公知的。除了任何與活性化合物不相容的常規(guī)介質(zhì)或試劑范圍外，包括其在本發(fā)明的藥物組合物中的應(yīng)用。還可以向組合物中摻入補(bǔ)充的活性化合物。
治療性組合物一般必須是無菌的并且在制備和貯存條件下穩(wěn)定的?？梢詫⒔M合物配制成溶液、微乳狀液、脂質(zhì)體或其他適合高藥物濃度的有序結(jié)構(gòu)。載體可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇等)及其合適的混合物的溶劑或分散劑。例如，通過使用包衣，例如卵磷脂，在分散液的情況下通過保持所需的顆粒大小，以及通過使用表面活性劑，可以保持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。在很多情況下，組合物中優(yōu)選包含等滲劑，例如，糖、多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇或氧化鈉。通過在組合物中加入延遲吸收劑，例如單硬脂酸鹽和明膠，可實(shí)現(xiàn)注射型藥物延長(zhǎng)的吸收。
通過將活性化合物以需要的量混入合適的溶劑中，并且根據(jù)需要加入以上列舉的成分中的一種或其組合，接著無菌微過濾，可制備無菌注射液。通常，通過將活性化合物摻入到含有基本分散介質(zhì)和上面所列其他所需成分的無菌載體中制備分散劑。對(duì)于用于制備無菌注射液的無菌粉末劑，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥(凍干)，由其預(yù)先無菌過濾的溶液得到活性成分加任何額外所需成分的粉末。
可以與載體材料組合制備單一劑量形式的活性成分的量根據(jù)所治療的受試者和特定給藥方式而不同?？梢耘c載體材料組合制備單一劑量形式的活性成分的量一般是產(chǎn)生治療效果的組合物的量。通常，以100％計(jì)，這個(gè)量的范圍是大約0.01％至大約99％的活性成分，優(yōu)選大約0.1％至大約70％，最優(yōu)選大約1％至大約30％的活性成分，與藥學(xué)上可接受的載體相組合。
調(diào)節(jié)劑量方案，以提供最佳的期望的反應(yīng)(例如，治療反應(yīng))。例如，可以施用單一大丸劑，可以隨時(shí)間施用幾次分開的劑量，或者根據(jù)治療狀況的緊急情況所需，可以按比例減小或增加劑量。特別有利的是將腸胃外組合物配制成容易給藥并且劑量均勻的劑量單位形式。此處使用的劑量單位形式是指適合作為單位劑量用于所治療的受試者的物理不連續(xù)單位；每個(gè)單位含有預(yù)定量的活性化合物，經(jīng)計(jì)算該預(yù)定量的活性化合物與需要的藥物載體組合產(chǎn)生所需的治療效果。對(duì)本發(fā)明劑量單位形式的具體說明限定于且直接依賴于(a)活性化合物的獨(dú)特特性和要達(dá)到的特定治療效果，和(b)本領(lǐng)域中固有的對(duì)于配制這種用于治療個(gè)體敏感性的活性化合物的限制。
對(duì)于抗體的給藥而言，劑量范圍為約0.0001至100mg/kg，更通常為0.01至5mg/kg受者體重。例如，劑量可以是0.3mg/kg體重、1mg/kg體重、3mg/kg體重、5mg/kg體重或10mg/kg體重，或在1-10mg/kg范圍內(nèi)。一個(gè)治療方案的例子需要每周給藥一次、每?jī)芍芤淮?、每三周一次、每四周一次、每月一次、?月一次、或每3-6月一次。本發(fā)明的抗-IRTA-4抗體的優(yōu)選劑量方案包括經(jīng)靜脈內(nèi)給予1mg/kg體重或3mg/kg體重，該抗體使用如下劑量方案之一給藥(i)每4周一次，共6次，然后每3個(gè)月一次；(ii)每3周一次；(iii)3mg/kg體重一次，然后每3周1mg/kg體重。
在一些方法中，同時(shí)施用具有不同結(jié)合特異性的兩種或多種單克隆抗體，在該情況中，每種抗體的給藥劑量落在所述范圍內(nèi)?？贵w通常在有必要時(shí)多次給藥。單次給藥之間的間隔可以是，例如，每周、每月、每三個(gè)月或每年。間隔也可以是不定期的，例如通過測(cè)定患者中抗靶抗原的抗體的血液水平來確定。在一些方法中，調(diào)節(jié)劑量以達(dá)到約1-1000μg/ml的血漿抗體濃度，在一些方法中為約25-300μg/ml。
另外，抗體也可以作為持續(xù)釋放制劑來給藥，在此情況中需要頻率較低的給藥。劑量和頻率根據(jù)抗體在患者中的半衰期而不同。通常，人抗體表現(xiàn)出最長(zhǎng)的半衰期，之后是人源化抗體、嵌合抗體和非人類抗體。給藥劑量和頻率根據(jù)處理是預(yù)防性的還是治療性的而不同。在預(yù)防性應(yīng)用中，在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)以較不頻繁的間隔給予相對(duì)較低的劑量。有些患者在余生中持續(xù)接受處理。在治療性應(yīng)用中，有時(shí)需要以較短的間隔給予較高的劑量，直到疾病的進(jìn)展減輕或停止，優(yōu)選直到患者表現(xiàn)為疾病癥狀部分或完全改善。之后，可以以預(yù)防性方案給患者給藥。
本發(fā)明藥物組合物中活性成分的實(shí)際劑量水平可能改變，以獲得可有效實(shí)現(xiàn)對(duì)特定患者、組合物和給藥方式的所需治療反應(yīng)，而對(duì)患者無毒性的活性成分的量。選擇的劑量水平取決于多種藥物代謝動(dòng)力學(xué)因素，包括應(yīng)用的本發(fā)明特定組合物或其酯、鹽或酰胺的活性，給藥途徑，給藥時(shí)間，應(yīng)用的特定化合物的排泄速率，治療的持續(xù)時(shí)間，與應(yīng)用的特定組合物聯(lián)合應(yīng)用的其他藥物、化合物和/或材料，接受治療的患者的年齡、性別、體重、狀況、總體健康情況和病史，以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中公知的類似因素。
本發(fā)明的抗-IRTA-4抗體的“治療有效劑量”優(yōu)選地導(dǎo)致疾病癥狀的嚴(yán)重性降低，疾病無癥狀期的頻率和持續(xù)時(shí)間增加，或者防止因疾病痛苦而引起的損傷或失能。例如，對(duì)于IRTA-4+腫瘤的治療，相對(duì)于未接受治療的受試者，“治療有效劑量”優(yōu)選地將細(xì)胞生長(zhǎng)或腫瘤生長(zhǎng)抑制至少約20％，更優(yōu)選至少約40％，更優(yōu)選至少約60％，更優(yōu)選至少約80％。化合物抑制腫瘤生長(zhǎng)的能力可以在預(yù)測(cè)對(duì)人類腫瘤的療效的動(dòng)物模型系統(tǒng)中評(píng)價(jià)。另外，也可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的試驗(yàn)檢查該化合物的體外抑制能力，來評(píng)價(jià)組合物的這種性能。治療有效量的治療性化合物能夠減小腫瘤大小，或者以其他方式緩解受試者的癥狀。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)如下因素確定這種量，如受試者的大小、受試者癥狀的嚴(yán)重性和選擇的特定組合物或給藥途徑。
本發(fā)明的組合物可以利用本領(lǐng)域公知的一種或多種方法通過一種或多種給藥途徑給藥。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，給藥途徑和/或方式根據(jù)期望的結(jié)果而不同。本發(fā)明抗體的優(yōu)選給藥途徑包括靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、脊柱或其他腸胃外給藥途徑，例如注射或輸注。如此處所用的短語(yǔ)“腸胃外給藥”是指腸和局部給藥以外的給藥模式，通常是注射，包括但不限于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眶內(nèi)、心內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、囊下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)、硬膜外和胸骨內(nèi)注射和輸注。
此外，本發(fā)明的抗體也可以通過非腸胃外途徑給藥，如局部、表皮或粘膜途徑給藥，例如，鼻內(nèi)、經(jīng)口、陰道、直腸、舌下或局部。
活性化合物可以與保護(hù)化合物不被快速釋放的載體一起制備，例如控釋制劑，包括植入物、透皮貼劑和微膠囊遞送系統(tǒng)?？梢允褂蒙锟山到獾摹⑸锵嗳莸木酆衔?，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐類、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。制備這樣的制劑的很多方法受專利保護(hù)或者通常為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。參見，例如，Sustainedand controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
治療性組合物可應(yīng)用本領(lǐng)域公知的醫(yī)療裝置給藥。例如，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的治療組合物可用無針皮下注射裝置給藥，如在美國(guó)專利No.5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；或4,596,556中公開的裝置。可用于本發(fā)明的公知的植入物和模塊的例子包括美國(guó)專利No.4,487,603，該專利公開了用于以受控速率分散藥物的可植入微量輸注泵；美國(guó)專利No.4,486,194，該專利公開了用于通過皮膚給藥的治療裝置；美國(guó)專利No.4,447,233，該專利公開了用于以精確的輸注速率遞送藥物的醫(yī)用輸注泵；美國(guó)專利No.4,447,224，該專利公開了用于連續(xù)遞送藥物的變流可植入輸注裝置；美國(guó)專利No.4,439,196，該專利公開了具有多腔區(qū)室的滲透藥物遞送系統(tǒng)和美國(guó)專利No.4,475,196，該專利公開了一種滲透藥物遞送系統(tǒng)。這些專利在此引入作為參考。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知許多其他這樣的植入物、遞送系統(tǒng)和模塊。
在某些實(shí)施方案中，可配制本發(fā)明的人單克隆抗體以確保在體內(nèi)的正確分布。例如，血-腦屏障(BBB)阻止了許多高度親水性的化合物。為了確保本發(fā)明的治療性化合物能夠跨過BBB(如果需要時(shí))，可將它們配制在如脂質(zhì)體中。至于制備脂質(zhì)體的方法，參見，例如，美國(guó)專利4,522,811；5,374,548；和5,399,331。脂質(zhì)體包含可被選擇性地轉(zhuǎn)運(yùn)入特定細(xì)胞或器官內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)部分，從而增強(qiáng)定向藥物遞送(參見，例如，V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29685)。定向部分的例子包括葉酸或生物素(參見，例如，Low等人的美國(guó)專利5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.1531038)；抗體(P.G.Bloeman等(1995)FEBS Lett.357140；M.Owais等(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39180)；表面活性劑蛋白A受體(Briscoe等(1995)Am.J.Physiol.1233134)；p120(Schreier等(1994)J.Biol.Chem.2699090)；也參見K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4273。
本發(fā)明的應(yīng)用和方法本發(fā)明的抗體，特別是人抗體，抗體組合物和方法，具有與診斷和治療IRTA-4介導(dǎo)的疾病有關(guān)的許多體外和體內(nèi)診斷和治療應(yīng)用。例如，這些分子可以施用于在體外或離體培養(yǎng)的細(xì)胞，或者例如在體內(nèi)施用于人類受試者，以治療、預(yù)防或診斷多種疾病。如此處使用的術(shù)語(yǔ)“受試者”包括人和非人動(dòng)物。非人動(dòng)物包括所有脊椎動(dòng)物，例如哺乳動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物，例如非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物、綿羊、狗、貓、牛、馬、雞、兩棲類動(dòng)物和爬行類動(dòng)物。優(yōu)選的受試者包括患有IRTA-4活性介導(dǎo)的疾病的人類患者。這些方法特別適合治療患有異常IRTA-4表達(dá)相關(guān)疾病的人類患者。當(dāng)抗IRTA-4抗體與另一種藥物一起給藥時(shí)，這兩種藥物可以相繼或同時(shí)給藥。
假如與IRTA-1、2、3、5相比，本發(fā)明的抗體特異性結(jié)合IRTA-4，則本發(fā)明的抗體可以用來特異性檢測(cè)細(xì)胞表面上的IRTA-4表達(dá)，而且能夠用來通過免疫親和純化方法純化IRTA-4。
此外，假如IRTA-4在各種腫瘤細(xì)胞上表達(dá)，則本發(fā)明的人抗體、抗體組合物和方法能夠用來治療患有致腫瘤疾病的受試者，例如特征在于存在表達(dá)IRTA-4的腫瘤細(xì)胞的疾病，包括，例如，伯基特淋巴瘤、間變性大細(xì)胞淋巴瘤(ALCL)、皮膚T細(xì)胞淋巴瘤、結(jié)節(jié)性小卵裂細(xì)胞淋巴瘤、淋巴細(xì)胞性淋巴瘤、外周T細(xì)胞淋巴瘤、倫納特淋巴瘤、免疫母細(xì)胞性淋巴結(jié)瘤、T細(xì)胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、成人T細(xì)胞白血病(T-ALL)、中心母細(xì)胞/中心細(xì)胞性(cb/cc)濾泡性淋巴瘤、B系彌漫性大細(xì)胞淋巴瘤、血管免疫母細(xì)胞性淋巴結(jié)病(AILD)-樣T細(xì)胞淋巴瘤、HIV相關(guān)體腔淋巴瘤、胚胎性癌、未分化鼻咽癌(例如施明克瘤)、卡斯?fàn)柭?、卡波西肉瘤和其他B細(xì)胞淋巴瘤。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體(例如人單克隆抗體、多特異性和雙特異性分子和組合物)可以用于檢測(cè)IRTA-4的水平或在其膜表面上含有IRTA-4的細(xì)胞的水平，然后可將該水平與特定疾病癥狀相關(guān)聯(lián)。此外，也可以利用這些抗體抑制或阻斷IRTA-4的功能，然后可以將其與特定疾病癥狀的預(yù)防或緩解相關(guān)聯(lián)，因此提示IRTA-4作為疾病的介質(zhì)。這可以如下實(shí)現(xiàn)，例如，在抗體與IRTA-4之間能夠形成復(fù)合物的條件下，使樣品和對(duì)照樣品接觸抗-IRTA-4抗體。檢測(cè)并比較樣品和對(duì)照中抗體與IRTA-4之間形成的任何復(fù)合物。
在另一實(shí)施方案中，可以在開始時(shí)檢測(cè)本發(fā)明的抗體(例如人抗體、多特異性和雙特異性分子和組合物)與體外治療或診斷應(yīng)用相關(guān)的結(jié)合活性。例如，能夠用以下實(shí)施例中所述的流式細(xì)胞分析來檢測(cè)本發(fā)明的組合物。
本發(fā)明的抗體(例如人抗體、多特異性和雙特異性分子、免疫偶聯(lián)物和組合物)在IRTA-4相關(guān)疾病的治療和診斷中具有其它的應(yīng)用。例如，人單克隆抗體、多特異性或雙特異性分子和免疫偶聯(lián)物可以用來在體內(nèi)或體外引發(fā)一種或多種下列生物活性抑制表達(dá)IRTA-4的細(xì)胞的生長(zhǎng)和/或?qū)⑵錃⑺?；介?dǎo)表達(dá)IRTA-4的細(xì)胞在人效應(yīng)細(xì)胞存在下的吞噬作用，或者阻斷IRTA-4配體與IRTA-4的結(jié)合。
在一個(gè)特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體(例如人抗體、多特異性和雙特異性分子和組合物)在體內(nèi)用于治療、預(yù)防或診斷多種IRTA-4相關(guān)疾病。IRTA-4相關(guān)疾病的例子包括癌癥、非何杰金氏淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、間變性大細(xì)胞淋巴瘤(ALCL)、皮膚T細(xì)胞淋巴瘤、結(jié)節(jié)性小卵裂細(xì)胞淋巴瘤、淋巴細(xì)胞性淋巴瘤、外周T細(xì)胞淋巴瘤、倫納特淋巴瘤、免疫母細(xì)胞性淋巴結(jié)瘤、T細(xì)胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、成人T細(xì)胞白血病(T-ALL)、中心母細(xì)胞/中心細(xì)胞性(cb/cc)濾泡性淋巴瘤、B系彌漫性大細(xì)胞淋巴瘤、血管免疫母細(xì)胞性淋巴結(jié)病(AILD)-樣T細(xì)胞淋巴瘤、HIV相關(guān)體腔淋巴瘤、胚胎性癌、未分化鼻咽癌(例如施明克瘤)、卡斯?fàn)柭?、卡波西肉瘤和其他B細(xì)胞淋巴瘤。
在體內(nèi)和體外施用本發(fā)明的抗體組合物(例如人單克隆抗體、多特異性和雙特異性分子和免疫偶聯(lián)物)的適當(dāng)途徑在本領(lǐng)域中公知，可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇。例如，抗體組合物可以通過注射(例如靜脈內(nèi)或皮下)給藥。使用的分子的適宜劑量將取決于受試者的年齡和體重以及抗體組合物的濃度和/或制劑。
如前所述，本發(fā)明的人抗-IRTA-4抗體可以與諸如細(xì)胞毒劑、放射性毒劑或免疫抑制劑等一種或多種其他治療劑共同給藥?？贵w可以與該治療劑連接(作為免疫復(fù)合物)，或者可以與該治療劑分開給藥。對(duì)于后者(分開給藥)，抗體可以在治療劑之前、之后或同時(shí)給藥，或者可以與其他已知治療如抗癌治療例如放射治療共同應(yīng)用。這些治療劑包括，抗腫瘤劑，如多柔比星(阿霉素)、順鉑、硫酸博來霉素、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺、羥基脲，它們本身僅在對(duì)患者具有毒性或亞毒性的水平時(shí)有效。順鉑以100mg/劑的劑量靜脈內(nèi)給藥，每4周1次，阿霉素以60-75mg/ml的劑量靜脈內(nèi)給藥，每21天1次。本發(fā)明的人抗-IRTA-4抗體或其抗原結(jié)合片段與化療劑的共同給藥提供了兩種抗癌劑，它們通過對(duì)人腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用的不同的機(jī)制起作用。這種共同給藥能夠解決由于發(fā)展耐藥性或腫瘤細(xì)胞抗原性改變(這將使它們對(duì)抗體沒有反應(yīng)性)引起的問題。
靶特異性效應(yīng)細(xì)胞，例如與本發(fā)明的組合物(例如人抗體、多特異性和雙特異性分子)有關(guān)的效應(yīng)細(xì)胞，也可以用作治療劑。用于靶向的效應(yīng)細(xì)胞可以是人白細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞或單核細(xì)胞。其他細(xì)胞包括嗜酸性細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和其他帶有IgG或IgA受體的細(xì)胞。需要時(shí)，效應(yīng)細(xì)胞可以從所治療的受試者中獲得。靶特異性效應(yīng)細(xì)胞可以作為細(xì)胞在生理學(xué)可接受的溶液中的懸浮液給藥。施用的細(xì)胞數(shù)可以是108-109個(gè)的數(shù)量級(jí)，但是根據(jù)治療目的而不同。通常，該量足以獲得在靶細(xì)胞處如表達(dá)IRTA-4的腫瘤細(xì)胞處的集中，以及通過例如吞噬作用實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的殺傷。給藥途徑也可以不同。
應(yīng)用靶特異性效應(yīng)細(xì)胞的治療可以與其他清除靶細(xì)胞的技術(shù)一起進(jìn)行。例如，使用本發(fā)明的組合物(例如人抗體、多特異性和雙特異性分子)和/或具有這些組合物的效應(yīng)細(xì)胞的抗腫瘤治療可以與化學(xué)治療一起使用。另外，可以應(yīng)用聯(lián)合免疫治療將兩種不同的細(xì)胞毒性效應(yīng)群體導(dǎo)向至腫瘤細(xì)胞排斥。例如，與抗-Fc-γRI或抗-CD3連接的抗-IRTA-4抗體可以與IgG-或IgA-受體特異性結(jié)合劑一起使用。
本發(fā)明的雙特異性和多特異性分子也可以用來調(diào)節(jié)效應(yīng)細(xì)胞上的FcγR或FcγR水平，例如通過對(duì)細(xì)胞表面上的受體加帽以及將其清除?？?Fc受體的混合物也可以用于該目的。
具有補(bǔ)體結(jié)合位點(diǎn)，如來自IgG1、-2或-3或IgM的補(bǔ)體結(jié)合部分的本發(fā)明的組合物(例如人抗體、多特異性和雙特異性分子和免疫偶聯(lián)物)，也可以在補(bǔ)體的存在下使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，用本發(fā)明的結(jié)合劑和適宜的效應(yīng)細(xì)胞離體處理含有靶細(xì)胞的細(xì)胞群體能夠通過加入補(bǔ)體或含有補(bǔ)體的血清來實(shí)現(xiàn)。補(bǔ)體蛋白的結(jié)合能夠改善用本發(fā)明的結(jié)合劑包被的靶細(xì)胞的吞噬作用。在另一實(shí)施方案中，用本發(fā)明的組合物(例如人抗體、多特異性和雙特異性分子)包被的靶細(xì)胞也能夠被補(bǔ)體裂解。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物不激活補(bǔ)體。
本發(fā)明的組合物(例如人抗體、多特異性和雙特異性分子和免疫偶聯(lián)物)也可以與補(bǔ)體一起施用。因此，在本發(fā)明的范圍內(nèi)包括含有人抗體、多特異性或雙特異性分子和血清或補(bǔ)體的組合物。這些組合物是有利的，因?yàn)檠a(bǔ)體與人抗體、多特異性或雙特異性分子緊密接近。另外，本發(fā)明的人抗體、多特異性或雙特異性分子和補(bǔ)體或血清也可以分開施用。
本發(fā)明的范圍內(nèi)還包括藥盒，該藥盒包括本發(fā)明的抗體組合物(例如人抗體、多特異性或雙特異性分子，或免疫偶聯(lián)物)和使用說明。該藥盒可以進(jìn)一步包括一種或多種另外的試劑，如免疫抑制劑、細(xì)胞毒劑或放射性毒劑，或一種或多種另外的本發(fā)明的人抗體(例如，具有補(bǔ)充活性的人抗體，它結(jié)合IRTA-4抗原上與第一人抗體不同的表位)。
因此，可以給用本發(fā)明的抗體組合物治療的患者(在本發(fā)明的人抗體給藥之前、同時(shí)或之后)另外施用另一種治療劑，如細(xì)胞毒劑或放射性毒劑，該治療劑可以增強(qiáng)或增加人抗體的治療效果。
在另外一些實(shí)施方案中，可以另外用調(diào)節(jié)(例如增強(qiáng)或抑制)Fcγ或Fcγ受體的表達(dá)或活性的藥物治療受試者，例如用細(xì)胞因子治療受試者。在用多特異性分子治療過程中施用的優(yōu)選細(xì)胞因子包括粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、干擾素-γ(IFN-γ)和腫瘤壞死因子(TNF)。
本發(fā)明的組合物(例如人抗體、多特異性和雙特異性分子)也可以用來靶向表達(dá)FcγR或IRTA-4的細(xì)胞，例如標(biāo)記這些細(xì)胞。對(duì)于這種應(yīng)用，可以將結(jié)合劑與能夠被檢測(cè)到的分子連接。因此，本發(fā)明提供離體或在體外定位表達(dá)Fc受體如FcγR或IRTA-4的細(xì)胞的方法。可檢測(cè)標(biāo)記物可以是，例如放射性同位素、熒光化合物、酶或酶輔因子。
在一個(gè)特定實(shí)施方案中，本發(fā)明提供檢測(cè)樣品中IRTA-4抗原的存在，或測(cè)定IRTA-4抗原量的方法，包括在抗體或其部分與IRTA-4之間能夠形成復(fù)合物的條件下使樣品和對(duì)照樣品接觸特異性結(jié)合IRTA-4的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分。然后檢測(cè)復(fù)合物的形成，其中樣品與對(duì)照樣品之間復(fù)合物形成的不同指示樣品中IRTA-4抗原的存在。
在另外一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通過對(duì)受試者施用上述人抗體治療受試者的IRTA-4介導(dǎo)的疾病的方法，該疾病例如是癌癥、非何杰金氏淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、間變性大細(xì)胞淋巴瘤(ALCL)、皮膚T細(xì)胞淋巴瘤、結(jié)節(jié)性小卵裂細(xì)胞淋巴瘤、淋巴細(xì)胞性淋巴瘤、外周T細(xì)胞淋巴瘤、倫納特淋巴瘤、免疫母細(xì)胞性淋巴結(jié)瘤、T細(xì)胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、成人T細(xì)胞白血病(T-ALL)、中心母細(xì)胞/中心細(xì)胞性(cb/cc)濾泡性淋巴瘤、B系彌漫性大細(xì)胞淋巴瘤、血管免疫母細(xì)胞性淋巴結(jié)病(AILD)-樣T細(xì)胞淋巴瘤、HIV相關(guān)體腔淋巴瘤、胚胎性癌、未分化鼻咽癌(例如施明克瘤)、卡斯?fàn)柭?、卡波西肉瘤和其他B細(xì)胞淋巴瘤。這些抗體及其衍生物用來抑制IRTA-4誘導(dǎo)的與某些疾病有關(guān)的活性，如增殖和分化。通過將抗體與IRTA-4接觸(例如通過對(duì)受試者施用抗體)，IRTA-4誘導(dǎo)這些活性的能力得到抑制，因此相關(guān)疾病得到治療?？贵w組合物可以單獨(dú)給藥或者與諸如細(xì)胞毒劑或放射性毒劑的另一種治療劑一起給藥，該另一種治療劑與抗體組合物聯(lián)合或協(xié)同作用，以治療或預(yù)防IRTA-4介導(dǎo)的疾病。
在另一實(shí)施方案中，通過將化合物與抗體連接，本發(fā)明的免疫偶聯(lián)物可以將該化合物(例如治療劑，標(biāo)記物，細(xì)胞毒素，放射毒素，免疫抑制劑等)靶向至具有IRTA-4細(xì)胞表面受體的細(xì)胞。因此，本發(fā)明也提供用于離體或在體內(nèi)定位表達(dá)IRTA-4的細(xì)胞(例如用可檢測(cè)標(biāo)記物，如放射性同位素、熒光化合物、酶或酶輔因子)的方法。此外，免疫偶聯(lián)物通過將細(xì)胞毒素或放射毒素靶向至IRTA-4，也可以殺傷具有IRTA-4細(xì)胞表面受體的細(xì)胞。
本發(fā)明進(jìn)一步通過下面的實(shí)施例進(jìn)行闡述，不應(yīng)將這些實(shí)施例理解為進(jìn)一步的限制。全部附圖和在本申請(qǐng)中引用的全部參考文獻(xiàn)、專利和公開專利申請(qǐng)的內(nèi)容均在此引用作為參考。
實(shí)施例實(shí)施例1抗IRTA-4人單克隆抗體的制備抗原用標(biāo)準(zhǔn)重組方法制備由連接到非IRTA-4多肽上的IRTA-4胞外域組成的重組融合蛋白，作為免疫用抗原。
轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)染色體KM小鼠TM用表達(dá)人抗體基因的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)染色體KM系小鼠制備抗IRTA-4的完全人單克隆抗體。在該小鼠系中，已經(jīng)如Chen等(1993)EMBO J.12811-820所述將內(nèi)源小鼠κ輕鏈基因純合地破壞，并且已經(jīng)如PCT公布WO 01/09187的實(shí)施例1對(duì)于HuMab小鼠所述將內(nèi)源小鼠重鏈基因純合地破壞。而且，該小鼠如Fishwild等(1996)Nature Biotechnology14845-851所述攜帶人κ輕鏈轉(zhuǎn)基因KCo5。該小鼠也如PCT公布WO02/43478所述攜帶人重鏈轉(zhuǎn)染色體SC20。
KM小鼠TM的免疫為了產(chǎn)生抗IRTA-4的完全人單克隆抗體，用純化的重組IRTA-4融合蛋白免疫KM小鼠TM，該融合蛋白是由用含有編碼該融合蛋白的基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的NS0細(xì)胞產(chǎn)生的。用于HuMab小鼠的一般性免疫方案在Lonberg，N.等(1994)Nature 368(6474)856-859；Fishwild，D.等(1996)Nature Biotechnology 14845-851和PCT公開WO 98/24884中描述。在第一次輸注抗原時(shí)小鼠為6-16周齡。利用純化的重組IRTA-4融合蛋白制劑(5-50μg)腹膜內(nèi)(IP)免疫KM小鼠TM。
轉(zhuǎn)基因小鼠用完全弗氏佐劑或Ribi佐劑中的抗原腹膜內(nèi)免疫兩次，然后用不完全弗氏佐劑或Ribi佐劑中的抗原腹膜內(nèi)免疫3-21天(最多可達(dá)總共11次免疫)。通過眼眶后采血監(jiān)測(cè)免疫應(yīng)答。通過ELISA對(duì)血漿進(jìn)行篩選(如下文所述)，用具有足夠的抗-IRTA-4人免疫球蛋白效價(jià)的小鼠進(jìn)行融合。用抗原經(jīng)靜脈內(nèi)對(duì)小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫，3天后處死并取出脾臟。
產(chǎn)生抗-IRTA-4抗體的KM小鼠TM的選擇為了選擇產(chǎn)生結(jié)合IRTA-4的抗體的KM小鼠TM，開始時(shí)如Fishwild，D.等(1996)所述通過改良ELISA檢測(cè)來自被免疫的小鼠的血清。簡(jiǎn)要地說，用純化的重組IRTA-4融合蛋白，在PBS中以1-2μg/ml的濃度，50μl/孔的量，包被微量滴定板，4℃下溫育過夜，然后用PBS中的5％BSA以200μl/孔封閉。將來自IRTA-4免疫的小鼠的血漿稀釋液加入各孔中，室溫溫育1-2小時(shí)。用PBS/Tween洗滌培養(yǎng)板，然后與堿性磷酸酶偶聯(lián)的山羊抗人κ輕鏈多克隆抗體室溫溫育1小時(shí)。洗滌后，培養(yǎng)板用pNPP底物顯色，并用分光光度計(jì)在OD 415-650處分析。用顯示最高抗-IRTA-4抗體效價(jià)的小鼠進(jìn)行融合。融合如下文所述進(jìn)行，通過ELISA檢測(cè)雜交瘤上清液的抗-IRTA-4活性。
產(chǎn)生抗IRTA-4人單克隆抗體的雜交瘤的產(chǎn)生根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序，用PEG將從KM小鼠TM中分離的小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞系融合。然后針對(duì)抗原特異性抗體的產(chǎn)生篩選獲得的雜交瘤。使用50％PEG(Sigma)將來自被免疫小鼠的脾淋巴細(xì)胞單細(xì)胞懸液與1/4數(shù)量的P3X63 Ag8.6.53(ATCC CRL 1580)非分泌型小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合。將細(xì)胞以約1×105/孔的密度接種于平底微量滴定板上，然后在選擇性培養(yǎng)基中溫育約兩周，該培養(yǎng)基含有10％胎牛血清、補(bǔ)充了RPMI(Mediatech，CRL 10013，含有高葡萄糖、L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉)中的origen(IGEN)，加5mM HEPES、0.055mM2-巰基乙醇、鏈霉素、50mg/ml慶大霉素和1×HAT(Sigma，CRLP-7185)。1-2周后，將細(xì)胞在用HT替代了其中的HAT的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。然后通過ELISA(如上所述)針對(duì)人抗IRTA-4單克隆IgG抗體篩選各個(gè)孔。一旦發(fā)生廣泛的雜交瘤生長(zhǎng)，則通常在10-14天后監(jiān)測(cè)培養(yǎng)基。將分泌抗體的雜交瘤再次平板接種，再次篩選，并且如果對(duì)于人IgG仍然是陽(yáng)性，則通過有限稀釋將抗IRTA-4單克隆抗體亞克隆至少兩次。然后在體外培養(yǎng)穩(wěn)定的亞克隆，以在組織培養(yǎng)基中產(chǎn)生小量的抗體用于進(jìn)一步表征。
選擇雜交瘤克隆9G11和13B1用于進(jìn)一步的分析。
實(shí)施例2人單克隆抗體9G11和13B1的結(jié)構(gòu)表征利用標(biāo)準(zhǔn)PCR技術(shù)分別從9G11和13B1雜交瘤中獲得編碼9G11和13B1單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)的cDNA序列，并利用標(biāo)準(zhǔn)DNA測(cè)序技術(shù)進(jìn)行測(cè)序。
9G11的重鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖1A和SEQ ID NO13和17中。
9G11的輕鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖1B和SEQ ID NO15和19中。
9G11重鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白重鏈序列的比較證明，9G11重鏈應(yīng)用了來自人種系VH1-3的VH區(qū)段、來自人種系6-19的D區(qū)段和來自人種系JH 4b的JH區(qū)段。9G11 VH序列與種系VH1-3序列的比對(duì)顯示在圖3中。利用Kabat CDR區(qū)測(cè)定系統(tǒng)對(duì)9G11 VH序列的進(jìn)一步分析勾畫出了重鏈CDR1、CDR2和CDR3區(qū)，分別如圖1A和3以及SEQ ID NO1、3、5所示。
9G11輕鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白輕鏈序列的比較證明，9G11輕鏈應(yīng)用了來自人種系VKL6的VL區(qū)段和來自人種系JK 4的JK區(qū)段。9G11 VL序列與種系VKL6序列的比對(duì)顯示于圖5中。利用Kabat CDR區(qū)測(cè)定系統(tǒng)對(duì)9G11 VL序列的進(jìn)一步分析勾畫出了輕鏈CDR1、CDR2和CDR3區(qū)，分別如圖1B和5以及SEQ ID NO7、9、11所示。
13B1的重鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖2A和SEQ ID NO14和18中。
13B1的輕鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖2B和SEQ ID NO16和20中。
13B1重鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白重鏈序列的比較證明，13B1重鏈應(yīng)用了來自人種系VH1-8的VH區(qū)段、來自人種系1-26的D區(qū)段和來自人種系JH 5b的JH區(qū)段。13B1 VH序列與種系VH1-8序列的比對(duì)顯示于圖4中。利用Kabat CDR區(qū)測(cè)定系統(tǒng)對(duì)13B1 VH序列的進(jìn)一步分析勾畫出了重鏈CDR1、CDR2和CDR3區(qū)，分別如圖2A和4以及SEQ ID NO2、4、6所示。
13B1輕鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白輕鏈序列的比較證明，13B1輕鏈應(yīng)用了來自人種系VKL19的VL區(qū)段和來自人種系JK 4的JK區(qū)段。13B1 VL序列與種系VKL19序列的比對(duì)顯示于圖6中。利用Kabat CDR區(qū)測(cè)定系統(tǒng)對(duì)13B1 VL序列的進(jìn)一步分析勾畫出了輕鏈CDR1、CDR2和CDR3區(qū)，分別如圖2B和6以及SEQ ID NO8、10、12所示。
實(shí)施例3抗-IRTA-4人單克隆抗體的結(jié)合特異性和結(jié)合動(dòng)力學(xué)的表征在該實(shí)施例中，通過Biacore分析檢測(cè)了抗-IRTA-4抗體的結(jié)合親和力和結(jié)合動(dòng)力學(xué)。也通過流式細(xì)胞分析檢測(cè)了結(jié)合特異性。
結(jié)合親和力和動(dòng)力學(xué)通過Biacore分析(Biacore AB，Uppsala，瑞典)表征抗-IRTA-4抗體的親和力和結(jié)合動(dòng)力學(xué)。使用Biacore提供的標(biāo)準(zhǔn)酰胺偶聯(lián)化學(xué)方法和試劑盒，用通過伯胺共價(jià)連接到CM5芯片(羧甲基葡聚糖包被的芯片)上的抗人IgG抗體捕獲純化的抗IRTA-4單克隆抗體。通過使HBSEP緩沖液(Biacore AB提供)中濃度為400、300、200、100和50nM的抗體以20μl/min的流速流過，來檢測(cè)結(jié)合。抗原-抗體結(jié)合動(dòng)力學(xué)檢測(cè)10分鐘，解離動(dòng)力學(xué)檢測(cè)10分鐘。用BAIevaluation軟件(Biacore AB)將結(jié)合和解離曲線擬合為1∶1 Langmuir結(jié)合模型。測(cè)定的KD、kon和koff值顯示在表1中。
表1IRTA-4 HuMAb的Biacore結(jié)合數(shù)據(jù)抗-IRTA-4抗體 親和力 結(jié)合速率解離速率KD×10-9(M) kon×104(l/Ms)koff×10-4(l/s)9G11 2.80 2.630.7413B1 3.48 12.54.26
經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定的結(jié)合特異性開發(fā)了在細(xì)胞表面表達(dá)5種IRTA蛋白之一的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系，并用它來通過流式細(xì)胞術(shù)確定IRTA4單克隆抗體的特異性。周含有編碼跨膜形式IRTA1、IRTA2、IRTA3、IRTA4或IRTA5的全長(zhǎng)cDNA的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞。另外，被轉(zhuǎn)染的蛋白質(zhì)在N末端含有myc標(biāo)簽，以用myc抗體進(jìn)行檢測(cè)。通過將被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與濃度為10μg/ml的每種IRTA4 Ab溫育，評(píng)價(jià)兩種抗IRTA4單克隆抗體的結(jié)合。洗滌細(xì)胞，用FITC標(biāo)記的抗人IgG Ab檢測(cè)其結(jié)合。用鼠抗myc Ab，然后用標(biāo)記的抗鼠IgG作為陽(yáng)性對(duì)照。用單獨(dú)的第二抗體作為陰性對(duì)照。結(jié)果顯示在圖7中。根據(jù)染色的平均熒光強(qiáng)度(MFI)測(cè)定，IRTA4單克隆抗體9G11和13B1結(jié)合IRTA4轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞系，但是不結(jié)合表達(dá)IRTA1、2、3或5的CHO系。這些數(shù)據(jù)證明了該單克隆抗體對(duì)IRTA4的特異性。
實(shí)施例4IRTA-4抗體與B細(xì)胞來源的腫瘤細(xì)胞系的結(jié)合利用流式細(xì)胞分析評(píng)價(jià)了IRTA4 HuMAb與B細(xì)胞腫瘤系Daudi的結(jié)合。Daudi細(xì)胞系與每種IRTA4 HuMAb或?qū)φ杖丝贵w溫育，洗滌，并用藻紅蛋白標(biāo)記的抗人第二抗體檢測(cè)。洗滌細(xì)胞，并通過流式細(xì)胞術(shù)分析。圖8A和8B分別示出了9G11和13B1抗體的結(jié)合的結(jié)果。IRTA4 HuMAb結(jié)合Daudi細(xì)胞系，而對(duì)照抗體不結(jié)合Daudi細(xì)胞系。這些數(shù)據(jù)表明在B細(xì)胞來源的腫瘤細(xì)胞系的表面上表達(dá)IRTA4蛋白。
IRTA-4(SEQ ID NO25)1 mllwsllvif davteqadsl tlvapssvfe gdsivlkcqg eqnwkiqkma yhkdnkelsv61 fkkfsdfliq savlsdsgny fcstkgqlfl wdktsnivki kvqelfqrpv ltassfqpie121 ggpvslkcet rlspqrkdvq lqfcffrenq vlgsgwsssp elqisavwse dtgsywckae181 tvthrirkqs lqsqihvqri pisnvsleir apggqvtegq klillcsvag gtgnvtfswy241 reatgtsmgk ktqrslsael eipavkesda gkyycradng hvpiqskvvn ipvripvsrp301 vltlrspgaq aavgdllelh cealrgsppi lyqfyhedvt lgnssapsgg gasfnlslta361 ehsgnyscea nnglgaqcse avpvsisgpd gyrrdlmtag vlwglfgvlg ftgvalllya421 lfhkisgess atneprgasr pnpqeftyss ptpdmeelqp vyvnvgsvdv dvvysqvwsm481 qqpessanir tllenkdsqv iyssvkksIRTA-1(SEQ ID NO26)1 mllwasllaf apvcgqsaaa hkpvisvhpp wttffkgerv tltcngfqfy atekttwyhr61 hywgekltlt pgntlevres glyrcqargs prsnpvrllf ssdslilqap ysvfegdtlv121 lrchrrrkek ltavkytwng nilsisnksw dllipqassn nngnyrcigy gdendvfrsn181 fkiikiqelf phpelkatds qptegnsvnl scetqlpper sdtplhfnff rdgevilsdw241 stypelqlpt vwrensgsyw cgaetvrgni hkhspslqih vqripvsgvl letqpsggqa301 vegemlvlvc svaegtgdtt fswhredmqe slgrktqrsl raelelpair qshaggyyct361 adnsygpvqs mvlnvtvret pgnrdglvaa gatggllsal llavallfhc wrrrksgvgf421 lgdetrlppa pgpgesshsi cpaqvelqsl yvdvhpkkgd lvyseiqttq lgeeeeants481 rtlledkdvs vvysevktqh pdnsagkiss kdeesIRTA-2(SEQ ID NO27)1 mllwvillvl apvsgqfart prpiiflqpp wttvfqgerv tltckgfrfy spqktkwyhr61 ylgkeilret pdnilevqes geyrcqaqgs plsspvhldf ssaslilqap lsvfegdsvv121 lrcrakaevt lnntiykndn vlaflnkrtd fhiphaclkd ngayrctgyk esccpvssnt181 vkiqvqepft rpvlrassfq pisgnpvtlt cetqlslers dvplrfrffr ddqtlglgws241 lspnfqitam wskdsgfywc kaatmphsvi sdsprswiqv qipashpvlt lspekalnfe301 gtkvtlhcet qedslrtlyr fyhegvplrh ksvrcergas isfslttens gnyyctadng361 lgakpskavs lsvtvpvshp vlnlsspedl ifegakvtlh ceaqrgslpi lyqfhhedaa421 lerrsansag gvaisfslta ehsgnyycta dngfgpqrsk avslsitvpv shpvltlssa
481 ealtfegatv tlhcevqrgs pqilyqfyhe dmplwssstp svgrvsfsfs lteghsgnyy541 ctadngfgpq rsevvslfvt vpvsrpiltl rvpraqavvg dllelhceap rgsppilywf601 yhedvtlgss sapsggeasf nlsltaehsg nysceanngl vaqhsdtisl svivpvsrpi661 ltfrapraqa vvgdllelhc ealrgsspil ywfyhedvtl gkisapsggg asfnlsltte721 hsgiyscead ngpeaqrsem vtlkvavpvs rpvltlrapg thaavgdlle lhcealrgsp781 lilyrffhed vtlgnrssps ggaslnlslt aehsgnysce adnglgaqrs etvtlyitgl841 tanrsgpfat gvaggllsia glaagallly cwlsrkagrk pasdparspp dsdsqeptyh901 nvpaweelqp vytnanprge nvvysevrii qekkkhavas dprhlrnkgs piiysevkva961 stpvsgslfl assaphrIRTA-3(SEQ ID NO28)1 mllwllllil tpgreqsgva pkavlllnpp wstafkgekv alicssishs laqgdtywyh61 dekllkikhd kiqitepgny qcktrgssls davhvefspd wlilqalhpv fegdnvilrc121 qgkdnknthq kvyykdgkql pnsynlekit vnsvsrdnsk yhctayrkfy ildievtskp181 lniqvqelfl hpvlrassst piegspmtlt cetqlspqrp dvqlqfslfr dsqtlglgws241 rsprlqipam wtedsgsywc evetvthsik krslrsqirv qrvpvsnvnl eirptggqli301 egenmvlics vaqgsgtvtf swhkegrvrs lgrktqrsll aelhvltvke sdagryycaa361 dnvhspilst wirvtvripv shpvltfrap rahtvvgdll elhceslrgs ppilyrfyhe421 dvtlgnssap sgggasfnls ltaehsgnys cdadnglgaq hshgvslrvt vpvsrpvltl481 rapgaqavvg dllelhcesl rgsfpilywf yheddtlgni sahsgggasf nlslttehsg541 nysceadngl gaqhskvvtl nvtgtsrnrt gltaagitgl vlsilvlaaa aallhyarar601 rkpgglsatg tsshspsecq epsssrpsri dpqepthskp lapmelepmy snvnpgdsnp661 iysqiwsiqh tkensancpm mhqeheeltv lyselkkthp ddsageassr graheeddee721 nyenvprvll asdhIRTA-5(SEQ ID NO29)1 mlprllllic aplcepaelf liaspshpte gspvtltckm pflqssdaqf qfcffrdtra61 lgpgwssspk lqiaamwked tgsywceaqt maskvlrsrr sqinvhrvpv advsletqpp121 ggqvmegdrl vlicsvamgt gditflwykg avglnlqskt qrsltaeyei psvresdaeq181 yycvaengyg pspsglvsit vripvsrpil mlrapraqaa vedvlelhce alrgsppily241 wfyheditlg srsapsggga sfnlslteeh sgnysceann glgaqrseav tlnftvptga301 rsnhltsgvi egllstlgpa tvallfcygl krkigrrsar dplrslpspl pqeftylnsp361 tpgqlqpiye nvnvvsgdev yslayynqpe qesvaaetlg thmedkvsld iysrlrkani421 tdvdyedam
序列表概述

權(quán)利要求
1.一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體(a)以1×10-8M或更低的KD與人IRTA-4結(jié)合；(b)基本不與人IRTA-1、IRTA-2、IRTA-3或IRTA-5結(jié)合；且(c)與Daudi B細(xì)胞腫瘤細(xì)胞結(jié)合。
2.權(quán)利要求1的抗體，其為人抗體。
3.權(quán)利要求1的抗體，其為嵌合或人源化抗體。
4.權(quán)利要求2的抗體，其為IgG1或IgG4同種型的全長(zhǎng)抗體。
5.權(quán)利要求2的抗體，其為抗體片段或單鏈抗體。
6.權(quán)利要求2的抗體，其中所述抗體以5×10-9M或更低的KD與人IRTA-4結(jié)合。
7.權(quán)利要求2的抗體，其中所述抗體以3.5×10-9M或更低的KD與人IRTA-4結(jié)合。
8.權(quán)利要求2的抗體，其中人IRTA-4包括具有如SEQ ID NO25[Genbank登錄號(hào)AAL60249]所示氨基酸序列的多肽。
9.權(quán)利要求2的抗體，其中人IRTA-1包括具有如SEQ ID NO26[Genbank登錄號(hào)NP_112572]所示氨基酸序列的多肽。
10.權(quán)利要求2的抗體，其中人IRTA-2包括具有如SEQ ID NO27[Genbank登錄號(hào)NP_112571]所示氨基酸序列的多肽。
11.權(quán)利要求2的抗體，其中人IRTA-3包括具有如SEQ ID NO28[Genbank登錄號(hào)AAL59390]所示氨基酸序列的多肽。
12.權(quán)利要求2的抗體，其中人IRTA-5包括具有如SEQ ID NO29[Genbank登錄號(hào)AAL60250]所示氨基酸序列的多肽。
13.一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體與參比抗體交叉競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合IRTA-4，所述參比抗體包括(a)包含選自SEQ ID NO13和14的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含選自SEQ ID NO15和16的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
14.權(quán)利要求13的抗體，其中所述參比抗體包括(a)包含SEQ ID NO13的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQ ID NO15的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
15.權(quán)利要求13的抗體，其中所述參比抗體包括(a)包含SEQ ID NO14的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQ ID NO16的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
16.一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，包括產(chǎn)自或源自人VH1-3基因的重鏈可變區(qū)，其中該抗體特異性結(jié)合IRTA-4。
17.一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，包括產(chǎn)自或源自人VH1-8基因的重鏈可變區(qū)，其中該抗體特異性結(jié)合IRTA-4。
18.一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，包括產(chǎn)自或源自人VKL6基因的輕鏈可變區(qū)，其中該抗體特異性結(jié)合IRTA-4。
19.一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，包括產(chǎn)自或源自人VKL19基因的輕鏈可變區(qū)，其中該抗體特異性結(jié)合IRTA-4。
20.一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，包括(a)人VH1-3或VH1-8基因的重鏈可變區(qū)；和(b)人VKL6或VKL19基因的輕鏈可變區(qū)；其中該抗體特異性結(jié)合IRTA-4。
21.權(quán)利要求20的抗體，其包含人VH1-3基因的重鏈可變區(qū)和人VKL6基因的輕鏈可變區(qū)。
22.權(quán)利要求20的抗體，其包含人VH1-8基因的重鏈可變區(qū)和人VKL19基因的輕鏈可變區(qū)。
23.權(quán)利要求20的抗體，其中該抗體基本不與人IRTA-1、IRTA-2、IRTA-3或IRTA-5結(jié)合。
24.權(quán)利要求23的抗體，其中人IRTA-4包括具有如SEQ ID NO25[Genbank登錄號(hào)AAL60249]所示氨基酸序列的多肽。
25.權(quán)利要求23的抗體，其中人IRTA-1包括具有如SEQ ID NO26[Genbank登錄號(hào)NP_112572]所示氨基酸序列的多肽。
26.權(quán)利要求23的抗體，其中人IRTA-2包括具有如SEQ ID NO27[Genbank登錄號(hào)NP_112571]所示氨基酸序列的多肽。
27.權(quán)利要求23的抗體，其中人IRTA-3包括具有如SEQ ID NO28[Genbank登錄號(hào)AAL59390]所示氨基酸序列的多肽。
28.權(quán)利要求23的抗體，其中人IRTA-5包括具有如SEQ ID NO29[Genbank登錄號(hào)AAL60250]所示氨基酸序列的多肽。
29.一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重鏈可變區(qū)；和包含CDR1、CDR2和CDR3序列的輕鏈可變區(qū)；其中(a)重鏈可變區(qū)CDR3序列包含選自SEQ ID NO5和6的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列；(b)輕鏈可變區(qū)CDR3序列包含選自SEQ ID NO11和12的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列；(c)該抗體以1×10-8M或更低的KD與人IRTA-4結(jié)合；(d)該抗體基本不與人IRTA-1、IRTA-2、IRTA-3或IRTA-5結(jié)合；且(e)該抗體與Daudi B細(xì)胞腫瘤細(xì)胞結(jié)合。
30.權(quán)利要求29的抗體，其中重鏈可變區(qū)CDR2序列包含選自SEQ ID NO3和4的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列；且輕鏈可變區(qū)CDR2序列包含選自SEQ ID NO9和10的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列。
31.權(quán)利要求30的抗體，其中重鏈可變區(qū)CDR1序列包含選自SEQ ID NO1和2的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列；且輕鏈可變區(qū)CDR1序列包含選自SEQ ID NO7和8的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列。
32.權(quán)利要求29的抗體，其為人抗體。
33.權(quán)利要求29的抗體，其為人源化或嵌合抗體。
34.一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中(a)重鏈可變區(qū)包含與選自SEQ ID NO13和14的氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列；(b)輕鏈可變區(qū)包含與選自SEQ ID NO15和16的氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列；(c)該抗體以1×10-8M或更低的KD與人IRTA-4結(jié)合；(d)該抗體基本不與人IRTA-1、IRTA-2、IRTA-3或IRTA-5結(jié)合；且(e)該抗體與Daudi B細(xì)胞腫瘤細(xì)胞結(jié)合。
35.權(quán)利要求34的抗體，其為人抗體。
36.權(quán)利要求34的抗體，其為人源化或嵌合抗體。
37.一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括(a)包含選自SEQ ID NO1和2的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)CDR1；(b)包含選自SEQ ID NO3和4的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)CDR2；(c)包含選自SEQ ID NO5和6的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)CDR3；(d)包含選自SEQ ID NO7和8的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)CDR1；(e)包含選自SEQ ID NO9和10的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)CDR2；和(f)包含選自SEQ ID NO11和12的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)CDR3；其中該抗體特異性結(jié)合IRTA-4。
38.權(quán)利要求37的抗體，其包括(a)包含SEQ ID NO1的重鏈可變區(qū)CDR1；(b)包含SEQ ID NO3的重鏈可變區(qū)CDR2；(c)包含SEQ ID NO5的重鏈可變區(qū)CDR3；(d)包含SEQ ID NO7的輕鏈可變區(qū)CDR1；(e)包含SEQ ID NO9的輕鏈可變區(qū)CDR2；和(f)包含SEQ ID NO11的輕鏈可變區(qū)CDR3。
39.權(quán)利要求37的抗體，其包括(a)包含SEQ ID NO2的重鏈可變區(qū)CDR1；(b)包含SEQ ID NO4的重鏈可變區(qū)CDR2；(c)包含SEQ ID NO6的重鏈可變區(qū)CDR3；(d)包含SEQ ID NO8的輕鏈可變區(qū)CDR1；(e)包含SEQ ID NO10的輕鏈可變區(qū)CDR2；和(f)包含SEQ ID NO12的輕鏈可變區(qū)CDR3。
40.一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括(a)包含選自SEQ ID NO13和14的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含選自SEQ ID NO15和16的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；其中該抗體特異性結(jié)合IRTA-4。
41.權(quán)利要求40的抗體，其包括(a)包含SEQ ID NO13的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQ ID NO15的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
42.權(quán)利要求40的抗體，其包括(a)包含SEQ ID NO14的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQ ID NO16的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
43.一種組合物，其含有權(quán)利要求1-42中任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分，和藥學(xué)上可接受的載體。
44.一種免疫偶聯(lián)物，其包含與治療劑連接的權(quán)利要求1-42中任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分。
45.一種組合物，其含有權(quán)利要求44的免疫偶聯(lián)物和藥學(xué)上可接受的載體。
46.權(quán)利要求44的免疫偶聯(lián)物，其中所述治療劑是細(xì)胞毒素。
47.一種組合物，其含有權(quán)利要求46的免疫偶聯(lián)物和藥學(xué)上可接受的載體。
48.權(quán)利要求44的免疫偶聯(lián)物，其中所述治療劑是放射性同位素。
49.一種組合物，其含有權(quán)利要求48的免疫偶聯(lián)物和藥學(xué)上可接受的載體。
50.一種雙特異性分子，其包含與第二功能部分連接的權(quán)利要求1-42中任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分，該第二功能部分具有與所述抗體或其抗原結(jié)合部分不同的結(jié)合特異性。
51.一種組合物，其含有權(quán)利要求50的雙特異性分子和藥學(xué)上可接受的載體。
52.一種分離的核酸分子，其編碼權(quán)利要求1-42中任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分。
53.一種表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求52的核酸分子。
54.一種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求53的表達(dá)載體。
55.一種含有人免疫球蛋白重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，其中該小鼠表達(dá)權(quán)利要求1-42中任一項(xiàng)的抗體。
56.由權(quán)利要求55的小鼠制備的雜交瘤，其中該雜交瘤產(chǎn)生所述抗體。
57.一種制備抗-IRTA-4抗體的方法，包括(a)提供(i)重鏈可變區(qū)抗體序列，其包含選自SEQ ID NO1和2的CDR1序列、選自SEQ ID NO3和4的CDR2序列、和選自SEQ IDNO5和6的CDR3序列；或(ii)輕鏈可變區(qū)抗體序列，其包含選自SEQ ID NO7和8的CDR1序列、選自SEQ ID NO9和10的CDR2序列、和選自SEQ IDNO11和12的CDR3序列；(b)改變至少一個(gè)可變區(qū)抗體序列內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸殘基，所述序列選自重鏈可變區(qū)抗體序列和輕鏈可變區(qū)抗體序列，從而產(chǎn)生至少一個(gè)改變的抗體序列；和(c)將所述改變的抗體序列表達(dá)為蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明提供以高親和力結(jié)合IRTA－4的分離的單克隆抗體，特別是人單克隆抗體。也提供了編碼本發(fā)明抗體的核酸分子，用于表達(dá)本發(fā)明抗體的表達(dá)載體、宿主細(xì)胞和方法。還提供了包含本發(fā)明抗體的免疫偶聯(lián)物、雙特異性分子和藥物組合物。本發(fā)明還提供檢測(cè)IRTA－4的方法，以及治療包括非何杰金氏淋巴瘤在內(nèi)的各種B細(xì)胞惡性腫瘤的方法。
文檔編號(hào)A61K39/395GK101044165SQ200580035836
公開日2007年9月26日 申請(qǐng)日期2005年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月29日
發(fā)明者M·斯里尼瓦桑, J·M·卡達(dá)雷利, 黃海春 申請(qǐng)人:米德列斯公司