專(zhuān)利名稱(chēng)：促進(jìn)水通道蛋白-5表達(dá)的中藥組合物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種促進(jìn)水通道蛋白-5表達(dá)的中藥組合物及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
干燥綜合征(Siccasyndrome,SS)又名斯耶格倫綜合征(Sjoren’S syndromeSS),是一種主要累及外分泌腺體的慢性炎癥性自身免疫性疾病。以淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的病變主要侵犯淚腺和大小唾液腺等外分泌腺，導(dǎo)致腺體破壞和分泌減少，同時(shí)可累及全身多個(gè)系統(tǒng)組織，引起內(nèi)臟損害。近年來(lái)有學(xué)者證實(shí)水分子通道蛋白-5 (aquaporins-5, AQP5)與涎腺的分布以及腺泡細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)異常上密切相關(guān)。水通道蛋白(aquaporins,AQP)是近10年來(lái)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)的一族細(xì)胞膜水轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它能介導(dǎo)自由水被動(dòng)跨運(yùn)生物膜。迄今為止，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)至少發(fā)現(xiàn)有13種水通道蛋白(AQP0-12)，它們形成一個(gè)AQPS家族。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外專(zhuān)家對(duì)AQP5在干燥綜合征發(fā)病中的作用進(jìn)行不懈探索，國(guó)外學(xué)者研究報(bào)道=AQPl和AQP5被證實(shí)與唾液的分泌密切相關(guān)，AQP5在毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和肌上皮細(xì)胞中AQPl的協(xié)調(diào)下，將唾液轉(zhuǎn)移至紋狀管、分泌管中，對(duì)調(diào)節(jié)水分轉(zhuǎn)運(yùn)的速率，維持唾液的分泌起了重要作用。研究發(fā)現(xiàn)AQP5亦存在于角膜上皮和淚腺中，與唾液、淚液的分泌均均有關(guān)。國(guó)內(nèi)專(zhuān)家在此方面也進(jìn)行相關(guān)研究，但大多從養(yǎng)陰生津或清熱潤(rùn)燥角度探討中藥方對(duì)干燥綜合征的作用，而本研究根據(jù)中醫(yī)“氣能生津、津能載氣”的原理，首次從氣陰兩虛的著手，探討“益氣養(yǎng)陰、布津通絡(luò)”對(duì)SS的作用，從AQP5角度探究增液布津湯對(duì)SS模型鼠的干預(yù)作用，為治療SS提供了靶點(diǎn)，也使我們能夠從細(xì)胞分子水平上明確SS的發(fā)病機(jī)制。

發(fā)明內(nèi)容
解決的技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明提供一種促進(jìn)水通道蛋白-5表達(dá)的中藥組合物及其制備方法和應(yīng)用。技術(shù)方案促進(jìn)水通道蛋白-5表達(dá)的中藥組合物，按質(zhì)量份由以下中藥組成黃苗(Astragali Radix) 15-20 份，麥冬(Ophipogonis Radix) 15-20 份，太子參(Pseudostellariae Radix) 10-15 份，枸杞子(Lych Fructus) 10-15 份，生地(PehmanniaeRadix) 15-20 份，赤茍藥(Paeoniae Radix Rubra) 10 份，白茍藥(Paeoniae Radix Alba)10 份，桃仁(Persicae Semen) 10 份和紫斃(Asteris Radix ET Rhizoma) 10 份。中藥組合物制備增液布津湯的方法，向藥材組合物中加入8-10倍水，浸泡I小時(shí)，煎煮兩次，每次煎煮40min，合并濾液，水浴蒸發(fā)濃縮至每毫升含生藥I. 365g，置于4°C冰箱保存?zhèn)溆谩Ｉ鲜鲋兴幗M合物在制備治療干燥綜合征藥物中的應(yīng)用。上述中藥組合物在制備干預(yù)干燥綜合征模型鼠頜下腺水通道蛋白-5藥物中的應(yīng)用。、
鑒于對(duì)干燥綜合征病因病機(jī)的深刻認(rèn)識(shí)，根據(jù)氣陰兩虛、肺失宣布、絡(luò)道瘀滯的基本病理變化特點(diǎn)，提出益氣養(yǎng)陰、布津通絡(luò)為干燥綜合征的治療大法，并依法組方，反復(fù)實(shí)踐和摸索，創(chuàng)造出了中藥復(fù)方制劑一益氣增液湯。在養(yǎng)陰生津的同時(shí)應(yīng)注意疏導(dǎo)布散津液，通行絡(luò)道。一則護(hù)正，陰津充足，津有所布，五臟六腑得以充灌，功能恢復(fù)常態(tài)。氣能生津、氣能行津，有利津液補(bǔ)充、絡(luò)道通暢。二則祛邪，陰津充足，津道充盈，有助于清除燥熱。配合涼血散瘀，養(yǎng)血斂陰之品，營(yíng)陰得以收斂補(bǔ)養(yǎng)。少佐辛潤(rùn)活血之藥，通經(jīng)絡(luò)，開(kāi)玄府，暢通津液運(yùn)行的道路，使津液布達(dá)于五官 九竅，五臟六腑，四肢白骸，發(fā)揮濡潤(rùn)作用。增液布津湯由麥冬20g、黃芪20g、太子參10g、枸杞子10g、生地15g、赤芍藥10g、白芍藥log、桃仁10g、紫菀IOg九味藥物組成。方中重用麥冬為君藥。古人云“治火可用苦寒，治燥必用甘寒?！丙湺陡剩晕⒑Ｉ纥S白，能入胃以養(yǎng)胃液，入脾以助脾散精于肺，引肺氣清肅下行，統(tǒng)調(diào)水道以歸膀膚，升降濡潤(rùn)之中，兼具開(kāi)通之力，達(dá)清熱滋陰潤(rùn)燥之旨，防燥熱陰傷之患。重用黃芪為君藥。黃芪味甘，性微溫，歸肺、脾經(jīng)。具有補(bǔ)氣固表，利尿托毒，排膿，斂瘡生肌功效。明《本草綱目》載“耆長(zhǎng)也，黃芪色黃，為補(bǔ)者之長(zhǎng)故名……”《本草匯言》載“黃芪，補(bǔ)肺健脾，衛(wèi)實(shí)斂汗，驅(qū)風(fēng)運(yùn)毒之藥也……”《本草逢原》載“黃芪能補(bǔ)五臟諸虛，治脈弦自汗，瀉陰火，去肺熱，無(wú)汗則發(fā)，有汗則止?！北静》纹⒅畾饩闾?，運(yùn)用黃芪能達(dá)補(bǔ)肺健脾之效。太子參為臣藥，性甘、微苦、平。歸脾、肺經(jīng)。具有補(bǔ)氣健脾，生津潤(rùn)肺功效。用于脾肺氣陰兩虛證。本品能補(bǔ)脾肺之氣，兼能養(yǎng)陰生津，其性略偏寒涼，屬補(bǔ)氣藥中的清補(bǔ)之品。宜用于熱病之后，氣陰兩虧，倦怠自汗，飲食減少，口干少津，而不宜溫補(bǔ)者。因其作用平和，多入復(fù)方作病后調(diào)補(bǔ)之藥。治療脾氣虛弱、胃陰不足所致食少倦怠，口干舌燥，宜與山藥、石斛等益脾氣、養(yǎng)胃陰之品同用，與黃芪共同發(fā)揮補(bǔ)氣作用。枸杞子為臣藥甘，平。歸肝、腎經(jīng)。滋補(bǔ)肝腎，益精明目。用于虛勞精虧，腰膝酸痛，眩暈耳鳴，內(nèi)熱消渴，血虛萎黃，目昏不明。明代《藥鑒》指出枸杞子“滋陰，不致陰衰……”?！妒朝煴静荨酚涊d枸杞堅(jiān)筋耐老，祛風(fēng)，補(bǔ)益筋骨，能益人，去虛老?！睹t(yī)別錄》記載枸杞下胸肋氣，客熱頭痛，補(bǔ)內(nèi)傷大勞，噓吸強(qiáng)陰，利大小便?！侗静菥V目》記載枸杞性味甘平，歸肝，腎經(jīng)，滋補(bǔ)肝腎，益精明目。《本草備要》記載枸杞潤(rùn)肝清肝，滋腎益氣，生精助陽(yáng)，補(bǔ)虛勞，強(qiáng)筋骨，祛風(fēng)明目，利大小便。生地黃味甘、苦，性寒。歸心、肝、肺經(jīng)。既能涼血，又能滋陰，具清熱滋陰、涼血止血、生津止渴的功效。在《神農(nóng)本草經(jīng)》記載生地黃能“逐血痹”、“除寒熱積聚”、“除痹”，《珍珠囊》中記載“生地黃涼血，生血，補(bǔ)腎水真陰”，“為清熱涼血養(yǎng)陰生津之要藥發(fā)”。因此，生地黃為臣藥，與麥冬二藥合用，金水相生，暢利三焦。赤芍藥酸苦性平，有散邪行血之功，《別錄》言“通順血脈，緩中，散惡血，逐賊血?！卑咨炙幩峥?，性平，有斂陰益營(yíng)之力，“收陰氣而泄邪氣”、“斂津液而益榮”一瀉一補(bǔ)，有相輔相成之效。白芍藥斂陰、赤芍藥涼血，合用斂陰涼血而不戀邪。桃仁味苦甘，性平，入心、肝、大腸經(jīng)。具有破血行瘀，潤(rùn)燥滑腸的功效?！侗静菥V目》記載桃仁主血滯風(fēng)痹，《用藥心法》曰“桃仁，苦以泄滯血，甘以生新血，故凝血須用。又去血中之熱。”李杲用桃仁治療“熱入血室，腹中滯血，皮膚血熱燥癢，皮膚凝聚之血”。紫菀雖苦辛而溫，但柔潤(rùn)有余，非燥烈可比。專(zhuān)能開(kāi)泄肺郁，宣通窒滯，兼疏肺家氣血，達(dá)宣開(kāi)肺氣，輸布津液之效，以助藥力，引諸藥直達(dá)病所。以上五藥共為佐使。諸藥合用，共奏養(yǎng)陰益氣、宣肺布津、活血化瘀之功效。在臨床研究中證實(shí)，增液布津湯能有效緩解患者在口干、口腔燒灼感、眼干、眼異物感、鼻干方面的主觀(guān)癥狀，提高生活質(zhì)量；與我們觀(guān)察到患者舌質(zhì)、舌面、舌苔、舌下唾液聚集的臨床體征相吻合。在實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)方面，增液布津湯能有效增加患者的唾液流量、淚流量；并且能糾正T淋巴細(xì)胞亞群等異常的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。說(shuō)明中藥不僅能緩解患者口、眼干癥狀，而且能夠糾正免疫紊亂。增液布津湯的組成藥物大多數(shù)具有調(diào)節(jié)免疫的作用。現(xiàn)代藥理證明，麥冬含多種沿階草留體皂苷、P —谷留醇、氨基酸、多量葡萄糖及其葡萄糖苷等。具多種藥理作用。其中對(duì)免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)主要體現(xiàn)在麥冬多糖及皂苷上。國(guó)內(nèi)外大量的研究表明，多糖對(duì)體液免疫、細(xì)胞免疫功能的促進(jìn)和誘生多種細(xì)胞因子，是多糖發(fā)揮藥效作用的機(jī)制之一。麥冬多糖能顯著增加小鼠脾重量、增強(qiáng)小鼠碳粒廓清作用、刺激小鼠血清中溶血素的產(chǎn)生，可顯著對(duì)抗環(huán)磷酰胺引起的小鼠白細(xì)胞下降，并能抑制淋巴細(xì)胞粘附于細(xì)胞外基質(zhì)，改善由淋巴 細(xì)胞浸潤(rùn)所致肝功能損傷。同時(shí)短葶山麥冬皂苷C能顯著的增加小鼠免疫器官胸腺、脾臟的重量，可顯著增加小鼠的碳粒廓清作用。黃芪能增強(qiáng)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬功能，使血白細(xì)胞及多核白細(xì)胞數(shù)量顯著增加，使巨噬細(xì)胞吞噬百分率及吞噬指數(shù)顯著上升，對(duì)體液免疫、細(xì)胞免疫均有促進(jìn)作用。正常人服用后，血漿IgM，IgE顯著增加，以全草效果最好。黃芪能促進(jìn)血清溶血素形成，提高空斑形成細(xì)胞的溶血能力，具明顯的碳粒廓清作用和增加脾重的作用。黃芪具有增強(qiáng)病毒誘生干擾素的能力，易感冒者在感冒流行季節(jié)服用黃芪，不僅可使感冒次數(shù)明顯減少，而且可使感冒癥狀較輕，病程較短。黃芪多糖有明顯的抗疲勞作用，能顯著延長(zhǎng)氫化可的松耗竭小鼠的游泳時(shí)間和增加腎上腺素重量，對(duì)小鼠多種缺氧模型均具有顯著的耐受能力，可明顯減少全身性耗氧以及增加組織耐缺氧能力。黃芪多糖有明顯的耐低溫作用，能使正常以及虛損小鼠的抗生存時(shí)間明顯延長(zhǎng)。黃芪可使細(xì)胞的生理代謝增強(qiáng)，這可能是通過(guò)細(xì)胞內(nèi)cAMP，cGMP的調(diào)節(jié)作用來(lái)完成的。黃芪還能促進(jìn)血清和肝臟的蛋白質(zhì)更新，對(duì)蛋白質(zhì)代謝有促進(jìn)作用，同時(shí)還有降壓作用、保肝作用、調(diào)節(jié)血糖、抗菌及抑制病毒作用、激素樣作用。太子參含氨基酸、多糖、皂苷、黃酮、鞣質(zhì)、香豆素、留醇、三萜及多種微量元素等。太子參總皂甙對(duì)小鼠抗疲勞、耐缺氧、耐低溫有明顯的作用。太子參總皂甙能增加小鼠免疫器官的重量，對(duì)小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)吞噬功能有明顯的激活作用，對(duì)小鼠免疫后血清中溶血素的生成有一定的促進(jìn)趨勢(shì)。太子參對(duì)淋巴細(xì)胞有明顯的刺激作用。枸杞子有增強(qiáng)非特異性免疫作用，對(duì)白細(xì)胞介素II也有雙向調(diào)解作用。小鼠灌服枸杞子水提取物或肌注醇提取物和枸杞多糖，均有提高巨噬細(xì)胞的吞噬功能，增強(qiáng)血清溶菌酶的作用，提高血清中抗綿羊紅細(xì)胞抗體的效價(jià)，還能增加鼠脾臟中抗綿羊紅細(xì)胞的抗體形成細(xì)胞的數(shù)量。從枸杞子提取的枸杞多糖可見(jiàn)到對(duì)動(dòng)物有放射增敏現(xiàn)象，可保護(hù)小鼠免受因放射損傷引起的免疫功能低下，對(duì)下降的白血球有提升效果。生地藥血清和麥冬藥血清均能夠明顯促進(jìn)VEC線(xiàn)粒體代謝MTT，具有良好的促VEC增殖的作用。赤芍有抗血栓形成、抗血小板聚集、抗凝血、激活纖溶作用，與其清熱涼血功效有關(guān)；其還有保肝、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、解痙等作用，與其散瘀止痛功效有關(guān)。研究表明赤芍抑制血小板聚集是通過(guò)增加cAMP水平來(lái)實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)血小板內(nèi)cAMP水平升高時(shí)，血小板的黏附、聚集、釋放功能均會(huì)受到抑制。桃仁及其多種水提物具有良好的抗炎作用，從其水溶性組織分離出的蛋白質(zhì)PR-B抗酶活性研究證實(shí)，其抗炎機(jī)制是對(duì)炎癥化學(xué)介質(zhì)緩激肽的抑制；有研究表明，桃仁水提物、苦杏仁苷、桃仁脂肪油對(duì)二磷酸腺苷(ADP)誘導(dǎo)的血小板聚集都有不同程度的抑制作用，作用強(qiáng)度以桃仁水提物最強(qiáng)；桃仁還有非常明顯的抑制醋酸扭體反應(yīng)的作用；桃仁對(duì)免疫功能也有良好的調(diào)節(jié)作用，能提高患者NK細(xì)胞活性及血清補(bǔ)體C3、C4水平，促進(jìn)血中免疫復(fù)合物的清除。有益效果當(dāng)SS頜下腺重度破壞時(shí)，AQP5的表達(dá)量顯著減少，導(dǎo)致水分轉(zhuǎn)運(yùn)失代償，引起唾液分泌減少，出現(xiàn)口干癥狀。本發(fā)明中藥組合物可通過(guò)抑制SS模型小鼠頜下腺萎縮，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的病理進(jìn)程，促進(jìn)AQP5的表達(dá)，從而改善唾液腺分泌功能、增加唾液流量，緩解SS 口腔干燥癥狀。


圖I為增液布津湯對(duì)SS模型鼠唾液流量的影響；圖2為各組AQP5表達(dá)的Western blot檢測(cè)結(jié)果；圖3為圖2中Western blot檢測(cè)條帶的相對(duì)灰度值；
圖4為增液布津湯對(duì)SS模型小鼠頜下腺組織結(jié)構(gòu)變化的影響(HEX200)，其中a正常對(duì)照組b模型組c增液布津湯低劑量組d增液布津湯中劑量組e增液布津湯高劑量組f環(huán)戊硫酮組。
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)實(shí)施例形式，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。實(shí)施例I :I實(shí)驗(yàn)材料I. I實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)SD大鼠，早，220 250g，BALb / C小鼠60只，10周齡，重20_22g左右，早，SPF級(jí)，均有蘇州愛(ài)爾麥特科技有限公司提供(動(dòng)物合格證號(hào)SCXK (蘇)2009-0001號(hào))。I. 2實(shí)驗(yàn)藥物增液布津湯(由黃芪20g，麥冬20g，太子參10g，枸杞子10g，生地15g，赤芍藥10g，白芍藥10g，桃仁IOg和紫菀IOg組成，原料藥材購(gòu)自南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院門(mén)診部)，向藥材組合物中加入8-10倍水，浸泡I小時(shí),煎煮兩次,每次煎煮40min，合并濾液，水浴蒸發(fā)濃縮至每毫升含生藥I. 365g，置于4°C冰箱保存?zhèn)溆谩－h(huán)戍硫酮片(山東博士倫福瑞達(dá)制藥有限公司提供，每片25mg)。25mg溶于50mL蒸餾水中，配制成0. 5mg/mL的藥液，4°C冰箱中保存使用。I. 3實(shí)驗(yàn)試劑弗氏完全佐劑，SIGMA公司，USA，L0T:129K8700 ;考馬斯亮藍(lán)(G250，RD公司進(jìn)口分裝，批號(hào)911010);吸附無(wú)細(xì)胞百日咳、白喉、破傷風(fēng)聯(lián)合疫苗，武漢生物制品研究所，批號(hào)091147-4 ;卡介苗(BCG)，上海生物制品研究所，批號(hào)09061301 ;小牛血清(BSA)，杭州四季青生物公司，批號(hào)080517 ;AQP5抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；二抗(羊抗兔二抗)購(gòu)自上海博奧森公司；PMSF(苯甲基磺酰氟)購(gòu)自南京生興生物技術(shù)公司；丙烯酰胺、亞甲雙丙烯酰胺、SDS (十二燒基磺酸鈉)、P -巰基乙醇、Glycine (甘氨酸)、Tris-base、溴酹藍(lán)、TEMED (四甲基二乙胺)、AP (過(guò)硫酸胺)均購(gòu)自Sigma公司，北京夏斯生物技術(shù)公司分裝；Western blotting electrochemiluminescence (ECL):購(gòu)自 Amersham 公司；硝酸纖維膜(NC):購(gòu)自Amersham公司；脫脂奶粉光明公司；蛋白定量試劑盒購(gòu)自BIO-RAD公司。I. 4實(shí)驗(yàn)儀器Sff-CJ-IFD型單人單面凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司);5810R型低溫超速離心機(jī)(德國(guó)EPPEND0RE公司);XHF-1高速勻漿器(上海金達(dá)生化儀器廠(chǎng));JA1203型電子天平(上海天平儀器廠(chǎng))；MAX190型酶標(biāo)儀(美國(guó)AD公司)；ELISA試劑盒(Ra D公司分裝)。醫(yī)用X光片購(gòu)自Kodak公司；Power Pac Basic電泳儀購(gòu)自BI0-RAD公司。 2實(shí)驗(yàn)方法2. ISS小鼠模型制作及分組給藥取BALB/C小鼠60只，隨機(jī)分為6組，正常對(duì)照組(生理鹽水20mL. kg—1);模型組(生理鹽水20mL. kg^1);增液布津湯低劑量組(6. 8g. kg—1);增液布津湯中劑量組(13. 6g. kg—1)；增液布津湯高劑量組(27. 3g. kg-1);環(huán)戊硫酮組(I. 25g. kg—1)。取5只SD大鼠頜下腺，分離包膜及結(jié)締組織，剔除淋巴結(jié)，每0. Ig置入IOmL無(wú)菌試管中，加氯化鈉注射液2mL，在冰浴中用勻漿器勻漿，再在4°C低溫離心機(jī)中離心。離心后利用考馬斯亮藍(lán)比色法測(cè)定其蛋白含量。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)及參考文獻(xiàn)[3]，將該上清液加入滅菌生理鹽水中稀釋成0. 4g L-1的上清液，再與弗氏完全佐劑混合，制備終濃度為0. 2gL_i乳化抗原液。于小鼠兩后腳掌及兩側(cè)腹股溝sc乳化抗原，每只0. 2mL (含卡介苗3. 75g - L4)，同時(shí)sc白喉-百日咳-破傷風(fēng)三聯(lián)疫苗，每只0. lmL。首次免疫后第3，7天，用乳化抗原對(duì)模型組和用藥組加強(qiáng)免疫，劑量0. 2mL，多點(diǎn)背部sc。以后每隔14d用乳化抗原加強(qiáng)免疫I次，劑量同首次，共加強(qiáng)免疫2次，多點(diǎn)背部sc，正常對(duì)照組不作任何處理。于免疫后當(dāng)天開(kāi)始灌胃增液布津湯，劑量分別為:增液布津湯地劑低劑量組(ZYBJ I 6. 8g. kg—1)沖劑量組(ZYBJ II 13. 6g. kg-1);高劑量組(ZYBJ III 27. 3g. kg—1);環(huán)戊硫酮組(12. 5mg. Kg—1);正常對(duì)照組(生理鹽水(20mL. Kg—1);模型組對(duì)照組(生理鹽水ZOmLKg-1 )。以上各組每日灌胃I次，連續(xù)5天，停藥2天，第50日眼球放血處死，立即取一側(cè)頜下腺，置于-70°C冰箱中用于Western blot分析AQP5表達(dá)量的變化。2. 2唾液流量的測(cè)定于免疫后第10、20、30、40、50天分別測(cè)定給藥后小鼠唾液分泌量。測(cè)量前禁食lh，不禁水。將無(wú)菌脫脂棉球制成干重5mg的棉球。測(cè)唾液分泌時(shí)將已經(jīng)稱(chēng)好干重的棉球放入小鼠后頰部，3min后取出，電子天平上稱(chēng)濕重。唾液分泌量(mg)=棉球濕重一棉球干重2. 3鏡下觀(guān)察頜下腺病理變化實(shí)驗(yàn)結(jié)束第50天時(shí)，眼眶取血，處死小鼠，立即取一側(cè)頜下腺經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，HE染色。
2. 3ffestern 印跡分析2. 2. I組織總蛋白提取(I)取出-70°C冰箱中的標(biāo)本，稱(chēng)取各組標(biāo)本500mg，將組織置于2mL勻漿器中球狀部位，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎；(2)加400ul單去污劑裂解液(含PMSF)于勻漿器中，進(jìn)行勻漿。裂解30min后，即用移液器將裂解液移至I. 5mL離心管，進(jìn)行超聲，然后在4°C下12000rpm離心5min，取上清分裝于0. 5mL離心管中并置于_20°C保存。2.2. 2Bradford方法定量蛋白濃度(I)將標(biāo)準(zhǔn)蛋白稀釋為以下6個(gè)濃度(mg/mL) :0. 02、0. 05、0. 10、0. 20、0. 40和
0.80，各取2、5、10、20、40、80ii L,再加入 buffer 和雙蒸水(ddH20)，使總體積為 150u L ；Sample為20倍稀釋?zhuān)?0 iiL，加入130 y L雙蒸水(ddH20)，室溫作用20min。(2)各孔加入150 U L經(jīng)三倍稀釋的蛋白定量試劑(Coomassie ProteinReagent),共300 ii L反應(yīng)溶液,室溫下作用lOmin。酶標(biāo)儀550nm處測(cè)得吸光度。以蛋白標(biāo)準(zhǔn)濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)作曲線(xiàn)(利用Excel繪制回歸曲線(xiàn))，得線(xiàn)性回歸方程Y=O. 8004X+0. 5398，R2=O. 9737，將測(cè)定OD值代入方程式，計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。(3)測(cè)樣本濃度將待測(cè)標(biāo)本吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查出其對(duì)應(yīng)的濃度，乘以適當(dāng)稀釋倍數(shù)即為樣本濃度。2. 2. 3免疫印跡測(cè)定方法和步驟(I)樣品中按比例加入6X上樣緩沖液，100°C加熱5min使蛋白變性。⑵根據(jù)蛋白定量結(jié)果上樣，使最終上樣總蛋白為60 yg。取適量處理后的樣品完全加入上樣孔。Tris-Glycine電泳緩沖液以100V恒壓電泳，至溴酚蘭到電泳槽最下端。(3)卸下電泳裝置，撬開(kāi)玻璃板，取下凝膠。(4)將凝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜(濕轉(zhuǎn))，以95mA電壓轉(zhuǎn)膜75min，將分離的蛋白條轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上；(5)蛋白質(zhì)標(biāo)記一抗孵育用PBS-T (PBS，0. 05%Tween-20)洗膜兩次，5min/次。使用阻斷劑(無(wú)菌PBS中含5%脫脂牛奶)37°C孵育I小時(shí)，阻斷硝酸纖維素膜上的非特異性蛋白結(jié)合位點(diǎn)。置于I :1000 (或按抗體生產(chǎn)廠(chǎng)家建議的稀釋度)稀釋的特異性抗體反應(yīng)液(無(wú)菌PBS，抗體，1%脫脂牛奶)，放在脫色搖床上，4°C過(guò)夜。(6) 二抗孵育棄一抗，用PBS-T洗膜2次，5min/次，去除多余的一抗反應(yīng)液和非特異性吸附的抗體。加入含1:5000稀釋的過(guò)氧化物酶酶聯(lián)二抗反應(yīng)液(無(wú)菌PBS，抗體，1%脫脂牛奶)，37°C搖動(dòng)，孵育2小時(shí)。(7)曝片=PBS-T洗膜3次，5min/次。加ECL-plus發(fā)光顯色液，室溫作用Imin后暗盒曝片。顯影之后根據(jù)Western Blot彩色標(biāo)準(zhǔn)電泳指示條帶(Marker)的位置，分析所測(cè)電泳條帶的性質(zhì)。以GAPDH作為內(nèi)參。電泳條帶經(jīng)Image J軟件處理，分析各實(shí)驗(yàn)組條帶與對(duì)照組條帶面積、灰度比值，進(jìn)一步用SPSS15. 0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。2. 4統(tǒng)計(jì)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用SPSS15. 0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料全部采用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(I ±S)表示，采用多組重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)資料的方差分析，若方差不齊用秩和檢驗(yàn)。設(shè)P〈0. 05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的界值，以P〈0. 05和P〈0. 01分別表示差異顯著和非常顯著。2. 5實(shí)驗(yàn)結(jié)果2. 5. I各組小鼠唾液量變化比較實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，動(dòng)態(tài)測(cè)定各組小鼠唾液流量的變化，結(jié)果顯示、
(I)實(shí)驗(yàn)第10-20天，各組模型小鼠唾液流量間差異不顯著(P>0. 05)；(2)從第30天開(kāi)始，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠唾液流量明顯減少(P〈0.01)；與模型組比較，中藥中、高劑量組小鼠唾液流量明顯增加(P〈0. 05)。(3)第50天，與正常對(duì)照組相比，模型組，中藥低劑量組小鼠唾液流量明顯減少(P〈0.01，P<0. 05);與模型組相比，中藥各劑量組，環(huán)戊硫酮組小鼠唾液流量明顯增加(P〈0.01)。(見(jiàn)表 1，圖 I)
表2-1-4增液布津湯對(duì)SS模型小鼠唾液流量的影響(X±S) (n=10)
唾液流量(mg )
J.-1-1-^^-
__第10天__第20天__第30天__第40天__第50天
正常對(duì)照11.66 士 2.4111.81 士2.36 12.39士 2.57__12.59^2.73__12.73 土2.48
模型11.03 土 1.7810.11 士 1.419.40 土 1.39* 岵 840±L30^## 7.61 士 1.25**##
ZYBJI11.29 土2.3311.32±2.239.96土2.09* 10.24±2.17^ 10.54±1.65^aa
ZYBJ i[11.4.5+4.22I] 1.03.64“ I 1.90-2.HSa^ 12.1a
ZYBJIIi1L46±2.2211.77士2.2511.84土2.36“ 12.01=1.98^ 12.53±I.93aa
環(huán)戊硫幽11.34士2.1211.47土1.631L30士L8511.賬1.53“__11.67^1,604 4注與正常對(duì)照組比較，樸〈O. 05，#P〈0. 01 ;與模型對(duì)照組比較，▲ P〈0. 05，▲ ▲ P〈0. 01 ;與 ZYBJ III組比較，#P<0. 05，##P<0. 012. 5. 2光鏡觀(guān)察頜下腺病理變化光鏡下顯示正常對(duì)照組頜下腺呈分葉狀，腺泡大小規(guī)則，排列緊密，腺泡上皮和導(dǎo)管未見(jiàn)變性、壞死，間質(zhì)未見(jiàn)充血及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)等病理變化。模型組大部分可見(jiàn)腺體中度萎縮，腺泡大小不等，數(shù)量減少，上皮變性、壞死，導(dǎo)管擴(kuò)張，腺泡周?chē)兄囟攘馨图?xì)胞浸潤(rùn)。而增液布津湯中、高劑量及環(huán)戊硫酮組腺體萎縮程度減輕，腺泡排列緊密，腺泡上皮輕度變性，壞死，導(dǎo)管輕度擴(kuò)張，腺泡周?chē)M織有輕度淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，尤其是高劑量組僅見(jiàn)個(gè)別淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，腺泡、導(dǎo)管、腺泡上皮等接近于正常表現(xiàn)。(見(jiàn)圖4)2. 5. 3 免疫印跡(western blot)結(jié)果不以GAPDH作為內(nèi)參照，用Image J軟件處理，分析各實(shí)驗(yàn)組條帶與對(duì)照組條帶面積，灰度比值，分別出現(xiàn)分子量為35KD，37KD的條帶。(見(jiàn)圖2、3)。各組AQP5表達(dá)量的比較結(jié)果示與正常對(duì)照組比較，模型組AQP5表達(dá)量下降了 27. 90%(p<0. 01);與模型組相比，增液布津湯高、中、低劑量組AQP5表達(dá)量分別升高了 32. 84%(p<0. 01),12. 54%(p<0. 05)、
4.51%，同時(shí)環(huán)戊硫酮組AQP5表達(dá)量升高了 20. 40%(p<0. 01)。說(shuō)明增液布津湯可以增加頜下腺AQP5的表達(dá)量，促進(jìn)唾液分泌，改善SS模型小鼠口干癥狀。效果模型組的AQP-5表達(dá)水平與正常對(duì)照組比較下降了 27. 9% (p<0. 01);予以增液布津湯高、中、低劑量組的AQP-5表達(dá)水平與模型組比較分別升高了 32. 84%(p〈0. 01)、12.54% (p〈0. 05)、4. 51%，同時(shí)陽(yáng)性藥物組AQP-5表達(dá)水平與模型組比較升高了 20. 40%(p〈0. 01)。結(jié)論增液布津湯可能通過(guò)抑制SS模型小鼠頜下腺萎縮，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的病理進(jìn)程，促進(jìn)AQP5的表達(dá)，從而改善唾液腺分泌功能、增加唾液流量，緩解SS 口腔干燥癥狀的。
綜上所述當(dāng)SS頜下腺重度破壞時(shí)，AQP5的表達(dá)量顯著減少，導(dǎo)致水分轉(zhuǎn)運(yùn)失代償，引起唾液分泌減少，出現(xiàn)口干癥狀。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步 表明增液布津湯可能通過(guò)抑制SS模型小鼠頜下腺萎縮，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的病理進(jìn)程，促進(jìn)AQP5的表達(dá)，從而改善唾液腺分泌功能、增加唾液流量，緩解SS 口腔干燥癥狀的。
權(quán)利要求
1.促進(jìn)水通道蛋白-5表達(dá)的中藥組合物，其特征在于按質(zhì)量份由以下中藥組成黃苗(Astragali Radix) 15-20 份，麥冬(Ophipogonis Radix) 15-20 份，太子參(Pseudostellariae Radix) 10-15 份，枸杞子(Lych Fructus) 10-15 份，生地(PehmanniaeRadix) 15-20 份，赤茍藥(Paeoniae Radix Rubra) 10 份，白茍藥(Paeoniae Radix Alba)10 份，桃仁(Persicae Semen) 10 份和紫斃(Asteris Radix ET Rhizoma) 10 份。
2.權(quán)利要求I所述中藥組合物制備增液布津湯的方法，其特征在于向藥材組合物中加入8-10倍水，浸泡I小時(shí)，煎煮兩次，每次煎煮40min，合并濾液，水浴蒸發(fā)濃縮至每毫升含生藥I. 365g，置于4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 3.權(quán)利要求I所述中藥組合物在制備治療干燥綜合征藥物中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求I所述中藥組合物在制備干預(yù)干燥綜合征模型鼠頜下腺水通道蛋白-5藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
促進(jìn)水通道蛋白-5表達(dá)的中藥組合物及其制備方法和應(yīng)用，按質(zhì)量份由以下中藥組成黃芪15-20份，麥冬15-20份，太子參10-15份，枸杞子10-15份，生地15-20份，赤芍藥10份，白芍藥10份，桃仁10份和紫菀10份。本發(fā)明中藥組合物可通過(guò)抑制SS模型小鼠頜下腺萎縮，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的病理進(jìn)程，促進(jìn)AQP5的表達(dá)，從而改善唾液腺分泌功能、增加唾液流量，緩解SS口腔干燥癥狀。
文檔編號(hào)A61P29/00GK102743577SQ201210236469
公開(kāi)日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2012年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月9日
發(fā)明者何慧珍, 金桂蘭 申請(qǐng)人:南京中醫(yī)藥大學(xué)