通道視蛋白-2(Chop2)突變的鑒定及使用方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了組合物和試劑盒，其包含至少一種編碼突變體ChR2蛋白的核酸或多肽分子。本發(fā)明的方法包括對(duì)受試者施用包含突變體ChR2的組合物以保護(hù)，改善，或恢復(fù)光轉(zhuǎn)導(dǎo)。優(yōu)選地，對(duì)具有受損視覺(jué)的受試者提供本發(fā)明的組合物和方法，由此將視覺(jué)恢復(fù)到正常水平。
【專利說(shuō)明】通道視蛋白-2(Ch〇P2)突變的鑒定及使用方法
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)
[0002] 本申請(qǐng)要求2012年3月5日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No. 61/606, 663的優(yōu)先權(quán)和權(quán) 益，其內(nèi)容完整并入本文。
[0003] 政府支持
[0004] 本發(fā)明是在國(guó)立健康研究所/國(guó)立眼科研究所撥款NIH EY 17130下得到美國(guó)政 府支持進(jìn)行的。政府具有本發(fā)明的某些權(quán)利。 發(fā)明領(lǐng)域
[0005] -般而言，本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域。鑒定了通道視蛋 白-2(Channel〇psin-2，Ch 〇p2)基因中的突變。在治療方法中使用包含突變體Chop2基因 的組合物以改善和恢復(fù)視覺(jué)喪失。
[0006] 發(fā)明背景
[0007] 視網(wǎng)膜由光感受器（或光感受器細(xì)胞，桿和錐體）組成。光感受器是高度特化的 神經(jīng)元，該神經(jīng)元負(fù)責(zé)光轉(zhuǎn)導(dǎo)，或光（為電磁輻射形式）轉(zhuǎn)化成電和化學(xué)信號(hào)，其在視覺(jué)系 統(tǒng)內(nèi)傳播事件級(jí)聯(lián)，最終產(chǎn)生我們世界的畫(huà)像。
[0008] 光感受器喪失或變性若不完全抑制也是嚴(yán)重危及視網(wǎng)膜內(nèi)視覺(jué)信息的光轉(zhuǎn)導(dǎo)。光 感受器細(xì)胞的喪失和/或光感受器細(xì)胞功能的喪失是降低的視覺(jué)敏銳度，降低的光敏感 性，和盲的主要原因。本領(lǐng)域中長(zhǎng)期需要恢復(fù)經(jīng)歷視覺(jué)喪失的受試者的視網(wǎng)膜的光敏感性 的組合物和方法。
[0009] 發(fā)明概述
[0010] 本發(fā)明提供了對(duì)恢復(fù)和/或提高光感受器細(xì)胞的光敏感性的方法的長(zhǎng)期需要的 解決方法，其通過(guò)表達(dá)通道視蛋白-2 (Chop2)基因的有利突變，和/或其組合，隨后提供基 于通道視蛋白_2(Chop2)的基因療法的方法進(jìn)行。
[0011] 基于通道視蛋白_2(Chop2)的基因療法提供了用于恢復(fù)光感受器變性后視黃醛 光敏感性的卓越策略。Chop2基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物在與光可異構(gòu)化發(fā)色團(tuán)全反式視黃醛結(jié)合 時(shí)形成功能性光門(mén)控通道，稱作通道視紫紅質(zhì)-2 (ChR2, channelrhodopsin-2)。天然ChR2 顯示較低的光敏感性。最近，報(bào)告了兩種突變體ChR2,即L132C和T159C顯著提高其光敏感 性（Kleinlogel 等（2011)Nat Neurosci. 14:513-8 ;Berndt 等（2011)Proc Natl Acad Sci USA. 108:7595-600 ;Prigge 等（2012) J Biol Chem. 287(38)3104:12;每篇的內(nèi)容完整并入 本文）。檢查這兩種ChR2突變體（即L132C和T159C)的特性，并且與多種在這兩個(gè)位點(diǎn)處 的雙重突變體比較以鑒定治療方法的合適候選物。為了恢復(fù)視覺(jué)，對(duì)有此需要的受試者提 供包含這些中一種或多種突變的組合物。具體地，將Chop2基因中的期望突變引入細(xì)胞和 /或整合到細(xì)胞的基因組DNA中以改善或恢復(fù)視覺(jué)。Chop2基因中引入細(xì)胞以改善或恢復(fù) 視覺(jué)的期望突變也可以保持為附加體的，尚未整合到基因組DNA中。
[0012] Chop2的L132或T159氨基酸位置處的突變（且因此所得的ChR2)顯著降低引發(fā) ChR2介導(dǎo)的光電流需要的閾值光強(qiáng)度。氨基酸位置L132和T159處的雙重突變體進(jìn)一步 提高低光強(qiáng)度時(shí)的光電流，其超過(guò)任一種相應(yīng)單突變的。表達(dá)L132和T159位置處的雙重 突變體的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞可以響應(yīng)適合于恢復(fù)有用視覺(jué)的光強(qiáng)度，其落入正常戶外光照 條件的范圍內(nèi)，但是應(yīng)當(dāng)仍然維持足夠的，且高的時(shí)間分辨率（temporal resolution)。因 此，形成具有改善的光敏感性的突變體ChR2的本發(fā)明突變體Chop2蛋白單獨(dú)或組合使用以 恢復(fù)或改善視覺(jué)。
[0013] 具體地，本發(fā)明提供了分離的多肽分子，其包含或組成為（consisting of) SEQ ID NO: 26,其中SEQ ID NO: 26的第132位氨基酸不是亮氨酸（L)。在分離的多肽分子的某些實(shí) 施方案中，所述第132位氨基酸是半胱氨酸（C)或丙氨酸（A)。在第132位氨基酸是半胱 氨酸（C)時(shí)，多肽分子可以包含或組成為SEQ ID NO: 13。在第132位氨基酸是丙氨酸（A) 時(shí)，多肽分子可以包含或組成為SEQ ID N0:20。
[0014] 本發(fā)明提供了分離的多肽分子，其包含或組成為SEQ ID NO:26,其中SEQ ID NO: 26的第159位氨基酸不是蘇氨酸（T)。在分離的多肽分子的某些實(shí)施方案中，第159位 氨基酸是半胱氨酸（C)，絲氨酸（S)，或丙氨酸（A)。在第159位氨基酸是半胱氨酸（C)時(shí)， 多肽分子可以包含或組成為SEQ ID NO: 14。在第159位氨基酸是絲氨酸（S)時(shí)，多肽分子 可以包含或組成為SEQ ID NO: 17。在第159位氨基酸是丙氨酸（A)時(shí)，多肽分子可以包含 或組成為SEQ ID NO:23。
[0015] 本發(fā)明提供了分離的多肽分子，其包含或組成為SEQ ID NO:26,其中SEQ ID NO: 26的第132位氨基酸不是亮氨酸（L)，且第159位氨基酸不是蘇氨酸（T)。在分離的多 肽分子的某些實(shí)施方案中，所述分離的多肽分子包含或組成為SEQ ID N0:26,其中SEQ ID NO: 26的第132位氨基酸不是亮氨酸（L)，且第159位氨基酸不是蘇氨酸（T)，第132位氨基 酸是半胱氨酸（C)，且第159位氨基酸是半胱氨酸（C)。在此分離的多肽分子的優(yōu)選的實(shí)施 方案中，多肽分子包含或組成為SEQ ID NO: 16。本發(fā)明提供了編碼分離的多肽的分離的核 酸分子，所述分離的多肽包含或組成為SEQ ID NO: 16。優(yōu)選地，編碼包含或組成為SEQ ID NO: 16的分離的多肽的分離的核酸分子是包含或組成為SEQ ID NO: 15的核酸分子。
[0016] 在分離的多肽分子的某些實(shí)施方案中，所述分離的多肽分子包含或組成為SEQ ID NO: 26,其中SEQ ID NO: 26的第132位氨基酸不是亮氨酸（L)，且第159位氨基酸不是蘇氨 酸（T)，第132位氨基酸是半胱氨酸（C)，且第159位氨基酸是絲氨酸（S)。分離的多肽分子 可以包含或組成為SEQ ID NO: 19,所述分離的多肽分子包含或組成為SEQ ID NO:26,其中 SEQ ID NO: 26的第132位氨基酸不是亮氨酸（L)，且第159位氨基酸不是蘇氨酸（T)?；蛘?/另外，分離的多肽分子可以包含或組成為SEQ ID N0:19,所述分離的多肽分子包含或組成 為SEQ ID NO: 26,其中SEQ ID NO: 26的第132位氨基酸不是亮氨酸（L)，且第159位氨基 酸不是蘇氨酸（T)，其中第132位氨基酸是半胱氨酸（C)，且其中第159位氨基酸是絲氨酸 (S)。本發(fā)明提供了編碼分離的多肽的分離的核酸分子，所述分離的多肽包含或組成為SEQ ID NO: 19。優(yōu)選地，核酸分子包含或組成為SEQ ID NO: 18。
[0017] 在分離的多肽分子的某些實(shí)施方案中，所述分離的多肽分子包含或組成為SEQ ID NO:26,其中SEQ ID NO:26的第132位氨基酸不是亮氨酸（L)且第159位氨基酸不是蘇氨 酸（T)，第132位氨基酸是丙氨酸（A)且第159位氨基酸是半胱氨酸（C)。分離的多肽分子 可以包含或組成為SEQ ID N0:22,所述分離的多肽分子包含或組成為SEQ ID N0:26,其中 SEQ ID NO: 26的第132位氨基酸不是亮氨酸（L)且第159位氨基酸不是蘇氨酸（T)?；蛘?/另外，分離的多肽分子可以包含或組成為SEQ ID N0:22,所述分離的多肽分子包含或組成 為SEQ ID N0:26,其中SEQ ID N0:26的第132位氨基酸不是亮氨酸（L)且第159位氨基 酸不是蘇氨酸（T)，其中第132位氨基酸是丙氨酸（A)且其中第159位氨基酸是半胱氨酸 (C)。本發(fā)明提供了編碼分離的多肽的分離的核酸分子，所述分離的多肽包含或組成為SEQ ID N0:22。優(yōu)選地，核酸分子包含或組成為SEQ ID N0:21。
[0018] 在分離的多肽分子的某些實(shí)施方案中，所述分離的多肽分子包含或組成為SEQ ID NO:26,其中SEQ ID NO:26的第132位氨基酸不是亮氨酸（L)且第159位氨基酸不是蘇氨 酸（T)，第132位氨基酸是半胱氨酸（C)且第159位氨基酸是丙氨酸（A)。分離的多肽分子 可以包含或組成為SEQ ID N0:25,所述分離的多肽分子包含或組成為SEQ ID N0:26,其中 SEQ ID NO: 26的第132位氨基酸不是亮氨酸（L)且第159位氨基酸不是蘇氨酸（T)。或者 /另外，分離的多肽分子可以包含或組成為SEQ ID N0:25,所述分離的多肽分子包含或組成 為SEQ ID NO: 26,其中SEQ ID NO: 26的第132位氨基酸不是亮氨酸（L)且第159位的氨基 酸不是蘇氨酸（T)，其中第132位氨基酸是半胱氨酸（C)且其中第159位氨基酸是丙氨酸 (A)。本發(fā)明提供了編碼分離的多肽的分離的核酸分子，所述分離的多肽包含或組成為SEQ ID N0:25。優(yōu)選地，核酸分子包含或組成為SEQ ID N0:24。
[0019] 本發(fā)明提供了本文中描述的任一種分離的多肽分子，其中所述多肽分子編碼突變 體Chop2蛋白，該突變體Chop2蛋白形成突變體ChR2，該突變體ChR2響應(yīng)比野生型ChR2蛋 白的閾值低的閾值光強(qiáng)度而引發(fā)電流。此外，電流傳導(dǎo)陽(yáng)離子。例示性的陽(yáng)離子包括但不 限于H+，Na+，K+，和Ca 2+離子。本文中描述的ChR2野生型和突變體蛋白非特異性傳導(dǎo)陽(yáng)離 子。因此，電流傳導(dǎo)下列一種或多種：H+，Na+，K+，和Ca 2+離子。
[0020] 本發(fā)明提供了本文中描述的任一種分離的多肽分子，其進(jìn)一步包含藥學(xué)可接受載 體。本發(fā)明還提供了組合物，其包含本文中描述的至少一種分離的多核苷酸分子。組合物 可以進(jìn)一步包含藥學(xué)可接受載體。
[0021] 本發(fā)明提供了分離的核酸分子，其編碼本文中描述的任何分離的多肽。此外，分離 的核酸分子可以進(jìn)一步包含藥學(xué)可接受載體。本發(fā)明還提供了組合物，其包含本文中描述 的至少一種分離的核酸分子。組合物可以進(jìn)一步包含藥學(xué)可接受載體。
[0022] 本發(fā)明提供了細(xì)胞，其中該細(xì)胞已經(jīng)接觸或包含本發(fā)明的分離的多肽分子。此 夕卜，本發(fā)明提供了細(xì)胞，其中該細(xì)胞已經(jīng)接觸或包含本發(fā)明的分離的核酸分子，其編碼 本發(fā)明的分離的多肽分子。本發(fā)明提供了組合物，其包含，組成基本上為（consisting essentially of)，或組成為細(xì)胞，該細(xì)胞包含本發(fā)明的分離的多肽分子或編碼本發(fā)明的分 離的多肽分子的核酸分子。本發(fā)明的細(xì)胞可以在體外，離體，在體內(nèi)，或原位與分離的多肽 或編碼多肽的分離的核酸接觸。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，細(xì)胞是光感受器；水平細(xì)胞； 雙極細(xì)胞（bipolar cell);無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞，和特別是AII無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞；或視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞， 包括感光性視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。優(yōu)選地，細(xì)胞是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，感光性視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì) 胞，雙極細(xì)胞，ON型雙極細(xì)胞，桿狀雙極細(xì)胞，或AII無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞。在本發(fā)明的某些方面，細(xì) 胞是光感受器，雙極細(xì)胞，桿狀雙極細(xì)胞，ON型錐體雙極細(xì)胞，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，感光性視 網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，水平細(xì)胞，無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞，或AII無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞。
[0023] 本發(fā)明提供了改善或恢復(fù)視覺(jué)的方法，其包括對(duì)受試者施用本文中描述的任一種 組合物。本發(fā)明進(jìn)一步提供了保護(hù)視覺(jué)的預(yù)防方法，其包括對(duì)受試者施用本文中描述的任 一種組合物。
[0024] 本文中描述的方法也可以應(yīng)用于那些健康的盲（部分或完全）的受試者，和/或 那些患有視網(wǎng)膜變性（以桿狀和/或錐體光感受器細(xì)胞喪失為特征）的受試者，但是可 以依賴于感光性視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的活性以測(cè)定周?chē)馑?。例如，可以使用本文中?述的方法來(lái)保護(hù)，改善，或恢復(fù)感光性視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的活性，其介導(dǎo)用于將生理節(jié)奏 (circadian rhythm)同步到24小時(shí)光照/黑暗周期的光照信息的轉(zhuǎn)換，瞳孔控制和反射， 和黑素釋放的光調(diào)節(jié)。
[0025] 在本發(fā)明的方法的某些實(shí)施方案中，受試者可以具有正常的視覺(jué)或受損的視 覺(jué)?；蛘?另外，受試者可以有風(fēng)險(xiǎn)形成導(dǎo)致視覺(jué)損傷的眼科疾病。例如，受試者可以 具有眼科疾病，包括黃斑變性（macular degeneration)和色素性視網(wǎng)膜炎（retinitis pigmentosa)的家族史。受試者可以有風(fēng)險(xiǎn)招致眼損傷，其對(duì)視網(wǎng)膜中的感光性細(xì)胞引起 損傷。受試者可以具有遺傳標(biāo)志物或遺傳/先天性狀況，其導(dǎo)致受損的視覺(jué)，低視覺(jué)，法定 盲（legal blindness),部分盲（partial blindness),或完全盲。受試者可以具有屈折 缺陷（refractive defect),其導(dǎo)致近視（myopia)(近視眼（near-sightedness))或遠(yuǎn)視 (hyperopia)(遠(yuǎn)視目艮（far-sightedness))。
[0026] 可以對(duì)受試者系統(tǒng)或局部施用本發(fā)明的方法的組合物。局部施用的優(yōu)選路徑是玻 璃體內(nèi)（intravitreal)注射。
[0027] 本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)從以下詳細(xì)描述和權(quán)利要求書(shū)看會(huì)是顯而易見(jiàn)的，并且 由以下詳細(xì)描述和權(quán)利要求書(shū)涵蓋。
[0028] 附圖簡(jiǎn)述
[0029] 圖1顯示了用于比較其光敏感性的HEK細(xì)胞中來(lái)自野生型（WT)ChR2, L132C， L132C/T159C，和 L132C/159S 突變體的光引發(fā)電流（light-evoked current)的代表 性記錄（A)。光刺激（光子/cm2, s，于460nm)由氙弧燈產(chǎn)生并且通過(guò)中性密度濾光片 (neutral density filter)減弱：ND4. 0(2. 8xl014)，ND3. 0(1. 4xl015)，ND2. 5(4. 8xl015); ND2. 0(1. 6x1016)，ND1. 0(1. 3xl017)，ND0(l. 2xl018) (B)。以不同電流比例顯示了相同的電流 跡線。以箭頭指向的跡線通過(guò)相同的光強(qiáng)度（ND2. 5)引發(fā)。
[0030] 圖2顯示了用于比較其失活時(shí)間過(guò)程（deactivation time course)(光照關(guān)閉后 的衰減時(shí)間過(guò)程）的HEK細(xì)胞中針對(duì)IOms光脈沖（I. 2xl018個(gè)光子/cm2/s，于460nm)的來(lái) 自野生型（WT) ChR2, T159C，L132C，L132C/T159C，和L132C/T159S突變體的光引發(fā)電流的代 表性記錄。
[0031] 圖3顯示了用于比較其光敏感性的視網(wǎng)膜整裝（retinal whole-mount)中來(lái) 自視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的WT ChR2, L132C，L132C/T159C，和L132C/T159S介導(dǎo)的尖峰形 成活性（spiking activities)的代表性多通道陣列記錄。光刺激（光子/cm2/s)由 473nm藍(lán)色激光產(chǎn)生，并且通過(guò)中性密度濾光片減弱：ND0(6. 3xl016)，NDL 0(7. 4xl015)， NDL 5 (2. 7xl015), ND2. 0 (7. 3xl014), ND2. 5 (3. 2xl014), ND3. 0 (8. 5xl013), ND3. 5 (3. 8xl013), 和 ND4. 0(9. 5xl012)。
[0032] 圖4顯示了用于比較其時(shí)間動(dòng)態(tài)（temporal dynamics)的視網(wǎng)膜整裝中來(lái)自視 網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的WT ChR2, L132C，L132C/T159C，和L132C/T159S介導(dǎo)的尖峰形成活性 的代表性多通道陣列記錄。在每個(gè)小圖中，顯示了源自單個(gè)光子的10個(gè)連續(xù)光引發(fā)尖峰 (light-elicited spike)的光柵圖（頂部）和平均尖峰率（averaged spike rate)直方圖 (底部）。以高于每個(gè)突變體的閾值強(qiáng)度約1個(gè)對(duì)數(shù)單位的強(qiáng)度通過(guò)473nm藍(lán)色激光產(chǎn)生 不同頻率的光脈沖。WT ChR2和L132C的記錄顯示于（A)，且L132C/T159C和L132C/T159S 的記錄顯示于（B)。
[0033] 發(fā)明詳述
[0034] 視覺(jué)系統(tǒng)
[0035] 中樞神經(jīng)系統(tǒng)經(jīng)由視覺(jué)系統(tǒng)中存在的特化細(xì)胞和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的獨(dú)特方法介導(dǎo)視覺(jué) (在本文中又稱為視力）。視覺(jué)系統(tǒng)的原則責(zé)任是將電磁輻射形式的光轉(zhuǎn)化成周?chē)澜绲?畫(huà)像或圖像。在此系統(tǒng)的"視覺(jué)"功能外，視覺(jué)系統(tǒng)還調(diào)節(jié)瞳孔光反射（pupillary light reflex, PLR)，向周期性光照/黑暗周期的生理節(jié)奏光牽引（circadian photoentrainment to periodic light/dark cycle),和激素褪黑素的釋放。
[0036] 視網(wǎng)膜的細(xì)胞是視覺(jué)或神經(jīng)系統(tǒng)遇到光（不同波長(zhǎng)和強(qiáng)度的電磁輻射）的第一種 細(xì)胞。光子在達(dá)到視網(wǎng)膜前穿過(guò)角膜，瞳孔，和晶狀體。視網(wǎng)膜由于直接吸收光子的光感受 器細(xì)胞位于視網(wǎng)膜的外層而具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)。在達(dá)到光感受器細(xì)胞（又稱為桿和椎體）的 外層前，穿過(guò)晶狀體的光子首先遇到視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（少數(shù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞通過(guò)表達(dá) 視蛋白黑視蛋白（melanopsin)而為感光性）的內(nèi)層和雙極細(xì)胞的中間層。桿狀光感受器 在暗淡照明條件（暗適應(yīng)視覺(jué)）中起作用，而椎體光感受器在明亮照明條件（光適應(yīng)視覺(jué)） 中起作用，負(fù)責(zé)顏色視覺(jué)。椎體光感受器直接對(duì)ON和OFF型錐體雙極細(xì)胞上形成突觸，其繼 而直接對(duì)ON和OFF型視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞上形成突觸。桿狀光感受器向桿狀雙極細(xì)胞（一 種獨(dú)特類型的雙極細(xì)胞，其為ON型）形成突觸，所述桿狀雙極細(xì)胞向AII無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞形成 突觸。AII無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞然后通過(guò)縫隙連接對(duì)ON型錐體雙極細(xì)胞及通過(guò)抑制性甘氨酸能突觸 對(duì)OFF型錐體雙極細(xì)胞及OFF神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中繼（relay)視覺(jué)信號(hào)。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞負(fù)責(zé) 將視覺(jué)信號(hào)與腦神經(jīng)元關(guān)聯(lián)。
[0037] 光轉(zhuǎn)導(dǎo)
[0038] 在視網(wǎng)膜內(nèi)，光感受器細(xì)胞吸收光子顆粒，并將光頻率和波長(zhǎng)的原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成 化學(xué)及隨后電信號(hào)，其遍及視覺(jué)和神經(jīng)系統(tǒng)傳播此種初始信息。具體地，位于光感受器（桿 狀，椎體，和/或感光性視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞）表面上的蛋白質(zhì)視蛋白吸收光子，并且啟動(dòng)胞 內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)，其導(dǎo)致光感受器的超極化。在黑暗中，蛋白質(zhì)視蛋白不吸收光子，光感受 器是去極化的。光感受器的視覺(jué)信號(hào)然后經(jīng)由雙極細(xì)胞，無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞，和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中繼到 腦的高視覺(jué)中心。具體地，當(dāng)桿狀和椎體光感受器去極化（在黑暗中）時(shí)，它們引起桿狀雙 極細(xì)胞和ON型錐體雙極細(xì)胞的去極化，但OFF性錐體雙極細(xì)胞的超極化，這繼而引起AII 無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞的去極化和ON型視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的尖峰形成（spiking)增加和OFF型視網(wǎng) 膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的尖峰形成減少。當(dāng)桿狀和椎體光感受器超極化（響應(yīng)光）時(shí)，發(fā)生相反的 事情（就桿狀，ON和OFF雙極細(xì)胞，AII無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞及ON和OFF神經(jīng)節(jié)細(xì)胞而言）。
[0039] 光照信息通過(guò)光感受器，雙極細(xì)胞，水平細(xì)胞，無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞，和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞 的作用被顯著加工和提煉（refine)。為了增加此系統(tǒng)的復(fù)雜性，光感受器以三種主要種類 發(fā)現(xiàn)，包括桿狀，椎體（其中三類最強(qiáng)烈響應(yīng)不同的光波長(zhǎng)），和感光性視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。 因此，在差異響應(yīng)某些光波長(zhǎng)和強(qiáng)度的光感受器水平發(fā)生第一層信息加工。視網(wǎng)膜的雙極 細(xì)胞接受來(lái)自光感受器細(xì)胞和水平細(xì)胞兩者的信息。視網(wǎng)膜的水平細(xì)胞接受來(lái)自多種光 感受器細(xì)胞的信息，且因此整合視網(wǎng)膜中細(xì)胞類型和穿過(guò)距離之間的信息（information between cell types and across distances in the retina)。雙極細(xì)胞通過(guò)對(duì)視網(wǎng)膜神 經(jīng)節(jié)細(xì)胞產(chǎn)生主要分段電勢(shì)（mainly graded potential)進(jìn)一步整合直接來(lái)自光感受器細(xì) 胞和水平細(xì)胞的信息，盡管一些最近的研究指示一些雙極細(xì)胞可以產(chǎn)生作用電勢(shì)。錐體雙 極細(xì)胞在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞上形成突觸，而桿狀雙極細(xì)胞僅對(duì)AII無(wú)長(zhǎng)突細(xì) 胞形成突觸。類似于水平細(xì)胞，大多數(shù)無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞在視網(wǎng)膜內(nèi)側(cè)向整合信息。不同于水平 細(xì)胞，大多數(shù)無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞是抑制性（GABA能）中間神經(jīng)元。無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞也比水平細(xì)胞更為 特化，因?yàn)槊總€(gè)無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞在特定類型的雙極細(xì)胞（雙極細(xì)胞的10個(gè)種類之一）上特異性 形成突觸。特別地，AII無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞是桿狀途徑（在暗適應(yīng)視覺(jué)下，此時(shí)椎體光感受器不響 應(yīng)）中的一種重要中繼神經(jīng)元。AII無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞接受來(lái)自桿狀雙極細(xì)胞的突觸輸入，然后 將信號(hào)捎帶確認(rèn)（Piggy-back)到如上文描述的從ON和OFF錐體雙極細(xì)胞至ON和OFF神 經(jīng)節(jié)細(xì)胞的椎體途徑。因此，桿狀雙極細(xì)胞或AII無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞中的Chop2的表達(dá)和所得的 ChR2形成可以在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中創(chuàng)建開(kāi)啟（ON)和關(guān)閉（OFF)響應(yīng)。此外，視網(wǎng)膜神經(jīng) 節(jié)細(xì)胞整合來(lái)自雙極細(xì)胞及來(lái)自無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞的信息。雖然視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞就大小，連接 性（connectivity)，和對(duì)視覺(jué)刺激（例如視野）的響應(yīng)而言顯著變化，所有視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì) 胞將長(zhǎng)的軸突延伸到腦中。除了轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)于瞳孔光反射和生理節(jié)奏光牽引的非視覺(jué)信息的一 小部分視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞外，從視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞延伸的全部軸突形成中樞神經(jīng)系統(tǒng)的視 神經(jīng)，視交叉，和視束。因此，視網(wǎng)膜自身中發(fā)生大量的信息加工。
[0040] 光感受器細(xì)胞表達(dá)內(nèi)源視蛋白蛋白質(zhì)，諸如視紫紅質(zhì)。本發(fā)明的突變體Chop2蛋 白可以在任何細(xì)胞類型中表達(dá)，并且形成功能性ChR2通道。優(yōu)選地，細(xì)胞是視網(wǎng)膜細(xì)胞。例 示性的細(xì)胞包括但不限于光感受器細(xì)胞（例如桿狀，椎體和感光性視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞），水 平細(xì)胞，雙極細(xì)胞，無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞，和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。
[0041] 通道視蛋白-2 (Chop2)
[0042] 通道視蛋白-2 (Chop2)首次從綠藻萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii) 分離。通道視蛋白-2是一種七跨膜域蛋白質(zhì)，其在與發(fā)色團(tuán)全反式視黃醛結(jié)合時(shí)變?yōu)?光可轉(zhuǎn)換的（光敏感性）。Chop2在經(jīng)由Schiff堿連接與視網(wǎng)膜分子連接時(shí)形成光門(mén) 控的，非特異性，內(nèi)部整流的陽(yáng)離子通道，稱作通道視紫紅質(zhì) -2(Channelrhodopsin-2) (Chop2retinalidene，縮寫(xiě)為 ChR2)。
[0043] 如本文中提及的，"通道視蛋白-2"或"Chop2"指編碼通道視蛋白-2的基因，所述 通道視蛋白-2在結(jié)合視黃醛后然后形成通道視紫紅質(zhì)_2(ChR2)。本發(fā)明的基因構(gòu)建體主 要指通道視蛋白-2 (即，沒(méi)有視黃醛），并且本文中公開(kāi)的所有Chop2變體形成功能性通道 視紫紅質(zhì)-2變體。本文中公開(kāi)的方法可以包括將Chop2投遞到?jīng)]有外源視黃醛的細(xì)胞。應(yīng) 當(dāng)理解，在細(xì)胞（即視網(wǎng)膜神經(jīng)元）中表達(dá)Chop2后，內(nèi)源可用的視黃醛結(jié)合野生型Chop2 或本發(fā)明的Chop2突變體以形成功能性光門(mén)控通道WT ChR2或突變體ChR2。因此，如本文 中提及的Chop2蛋白與ChR2也可以是同義的。
[0044] 如本文中使用的，"通道視紫紅質(zhì)-2"或"ChR2"指視黃醛結(jié)合的功能性光敏感性 通道。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以外源提供結(jié)合的視黃醛。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，從細(xì)胞 中可用的內(nèi)源水平提供結(jié)合的視黃醛。本發(fā)明還涵蓋由編碼本文中描述的Chop2突變體的 多肽和多核苷酸形成的功能性通道視紫紅質(zhì)-2通道。
[0045] 在通過(guò)優(yōu)選劑量的光發(fā)射照明后，ChR2開(kāi)放通道的孔，H+，Na+，K+，和/或Ca2+離 子通過(guò)該孔從胞外空間流到細(xì)胞中。ChR2通道的活化通常引起表達(dá)通道的細(xì)胞的去極化。 去極化的細(xì)胞產(chǎn)生分段電勢(shì)和或作用電勢(shì)（action potential)以將信息從Chop2/ChR2表 達(dá)細(xì)胞攜帶到視網(wǎng)膜或腦的其他細(xì)胞。
[0046] ChR2的野生型形式或具有高時(shí)間分辨率的突變體ChR2已經(jīng)變?yōu)樯窠?jīng)科學(xué)研究的 中心焦點(diǎn)。在哺乳動(dòng)物神經(jīng)元中表達(dá)時(shí)，ChR2介導(dǎo)體外或離體培養(yǎng)物的光控制去極化。野 生型ChR2或具有高時(shí)間分辨率的突變體ChR2 (后者通常展現(xiàn)出低光敏感性）提出了使其 能夠用于視覺(jué)恢復(fù)目的必須解決的幾項(xiàng)挑戰(zhàn)。為了視覺(jué)恢復(fù)，具有較高光敏感性而非高時(shí) 間分辨率的ChR2是期望的。
[0047] 野生型ChR2蛋白需要來(lái)自較高藍(lán)光強(qiáng)度的照明以實(shí)現(xiàn)完全活化（即IO18-IO 19個(gè) 光子?πΓ2，于480nm的波長(zhǎng)）。此類連續(xù)照明可以損傷細(xì)胞。
[0048] 野生型ChR2蛋白的動(dòng)力學(xué)對(duì)于使通道效力最大化是次優(yōu)的。效力可以通過(guò)修飾 野生型ChR2蛋白的一個(gè)或多個(gè)氨基酸以延長(zhǎng)通道的開(kāi)放狀態(tài)或者提高通道的單位電導(dǎo)， 或兩者提高。野生型ChR2的單通道電導(dǎo)是小的。因此，體內(nèi)的神經(jīng)元活化應(yīng)當(dāng)需要野生型 通道的高表達(dá)或用優(yōu)選的藍(lán)光波長(zhǎng)的非常強(qiáng)烈的活化。更簡(jiǎn)單的解決辦法可以通過(guò)改變通 道電導(dǎo)發(fā)現(xiàn)或延長(zhǎng)通道開(kāi)放時(shí)間。這些機(jī)制的任一種及特別是這些機(jī)制的組合使得能使用 更低且更安全的光強(qiáng)度達(dá)到相同水平的細(xì)胞去極化。
[0049] 例如，本發(fā)明的突變體ChR2蛋白經(jīng)由通道開(kāi)放狀態(tài)的延長(zhǎng)實(shí)現(xiàn)更大的光敏感性。 因此，在被相同光強(qiáng)度活化時(shí)，每個(gè)突變體ChR2通道比野生型ChR2通道傳導(dǎo)更大的光電 流。因此，突變體通道被比野生型ChR2通道活化需要的光強(qiáng)度低的光強(qiáng)度活化?？梢酝ㄟ^(guò) 比引發(fā)來(lái)自表達(dá)野生型ChR2的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的尖峰形成活性需要的光強(qiáng)度低1. 5-2 個(gè)對(duì)數(shù)單位的光強(qiáng)度引發(fā)表達(dá)突變體ChR2蛋白的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的數(shù)量上可檢測(cè)的尖 峰形成活性。因此，活化突變體ChR2蛋白需要的光強(qiáng)度選擇為或落入正常戶外光照條件的 范圍。
[0050] 以下序列提供了野生型和突變體Chop2蛋白，和編碼本發(fā)明的所述WT和突變體 Chop2蛋白的多核苷酸，并形成本發(fā)明的WT和野生型ChR2的多核苷酸的非限制性例子。
[0051] 本發(fā)明的野生型（WT)Chop2可以由以下萊茵衣藻衣視蛋白4(chlamyopsin 4)光 門(mén)控離子通道（C0P4)mRNA序列（GenBank登陸號(hào)XM_001701673和SEQ ID NO: 1)編碼：
【權(quán)利要求】
1. 一種分離的多肽分子，其包含SEQ ID NO: 26,其中SEQ ID NO: 26的第132位氨基酸 不是亮氨酸（L)。
2. 權(quán)利要求1的多肽分子，其中所述第132位氨基酸是半胱氨酸（C)或丙氨酸（A)。
3. 權(quán)利要求2的多肽分子，其中所述第132位氨基酸是半胱氨酸（C)，且其中所述多肽 分子包含SEQ ID NO: 13。
4. 權(quán)利要求2的多肽分子，其中所述第132位氨基酸是丙氨酸（A)，且其中所述多肽分 子包含 SEQ ID NO:20。
5. -種分離的多肽分子，其包含SEQ ID NO: 26,其中SEQ ID NO: 26的第159位氨基酸 不是蘇氨酸（T)。
6. 權(quán)利要求5的多肽分子，其中所述第159位氨基酸是半胱氨酸（C)，絲氨酸（S)，或丙 氨酸（A)。
7. 權(quán)利要求6的多肽分子，其中所述第159位氨基酸是半胱氨酸（C)，且其中所述多肽 分子包含SEQ ID NO: 14。
8. 權(quán)利要求6的多肽分子，其中所述第159位氨基酸是絲氨酸（S)，且其中所述多肽分 子包含 SEQ ID NO: 17。
9. 權(quán)利要求6的多肽分子，其中所述第159位氨基酸是丙氨酸（A)，且其中所述多肽分 子包含 SEQ ID NO:23。
10. -種分離的多肽分子，其包含SEQ ID NO:26,其中SEQ ID NO:26的第132位氨基 酸不是亮氨酸（L)且所述第159位氨基酸不是蘇氨酸（T)。
11. 權(quán)利要求10的多肽分子，其中所述第132位氨基酸是半胱氨酸（C)，其中所述第 159位氨基酸是半胱氨酸（C)。
12. 權(quán)利要求10或11的多肽分子，其中所述多肽分子包含SEQ ID NO: 16。
13. -種分尚的核酸分子，其編碼權(quán)利要求12的分尚的多肽。
14. 權(quán)利要求13的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO: 15。
15. 權(quán)利要求10的多肽分子，其中所述第132位氨基酸是半胱氨酸（C)，其中所述第 159位氨基酸是絲氨酸（S)。
16. 權(quán)利要求10或15的多肽分子，其中所述多肽分子包含SEQ ID NO: 19。
17. -種分尚的核酸分子，其編碼權(quán)利要求16的分尚的多肽。
18. 權(quán)利要求17的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO: 18。
19. 權(quán)利要求10的多肽分子，其中所述第132位氨基酸是丙氨酸（A)，其中所述第159 位氨基酸是半胱氨酸（C)。
20. 權(quán)利要求10或19的多肽分子，其中所述多肽分子包含SEQ ID NO:22。
21. -種分尚的核酸分子，其編碼權(quán)利要求22的分尚的多肽。
22. 權(quán)利要求21的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQ ID N0:21。
23. 權(quán)利要求10的多肽分子，其中所述第132位氨基酸是半胱氨酸（C)，其中所述第 159位氨基酸是丙氨酸（A)。
24. 權(quán)利要求10或23的多肽分子，其中所述多肽分子包含SEQ ID NO:25。
25. -種分尚的核酸分子，其編碼權(quán)利要求24的分尚的多肽。
26. 權(quán)利要求25的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO:24。
27. -種分離的核酸分子，其編碼權(quán)利要求1，3,4,5,6,7,8,9,10,11，15,16,19,20， 23,和24中任一項(xiàng)的分離的多肽。
28. 權(quán)利要求27的分離的核酸分子，其中所述分離的多肽長(zhǎng)約315, 310, 300, 275, 250， 225, 200,175,或 160 個(gè)氨基酸。
29. 權(quán)利要求27或28的分離的核酸分子，其進(jìn)一步包含藥學(xué)可接受載體。 30?權(quán)利要求 1，2, 3,4, 5,6, 7,8,9,10,11，12,13,15,16,19, 20, 23,和 24 中任一項(xiàng)的分 離的多肽分子，其中所述多肽分子編碼突變體ChR2蛋白，其響應(yīng)比野生型ChR2蛋白的閾值 低的閾值光強(qiáng)度而引發(fā)電流。
31. 權(quán)利要求30的分離的多肽分子，其中所述多肽分子長(zhǎng)約315, 310, 300, 275, 250， 225, 200,175,或 160 個(gè)氨基酸。
32. 權(quán)利要求30或31的分離的多肽分子，其進(jìn)一步包含藥學(xué)可接受載體。
33. -種組合物，其包含權(quán)利要求27,28,和29中任一項(xiàng)的分離的核酸分子。 34?-種組合物，其包含權(quán)利要求 1，2, 3,4, 5,6, 7,8,9,10,11，12,13,15,16,19, 20， 23, 24, 29, 30和31中任一項(xiàng)的分離的多肽分子。 35?-種細(xì)胞，其包含權(quán)利要求 1，2, 3,4, 5,6, 7,8,9,10,11，12,13,15,16,19, 20, 23， 24, 29, 30和31中任一項(xiàng)的分離的多肽分子。
36. 一種細(xì)胞，其包含分尚的核酸分子，該分尚的核酸分子編碼權(quán)利要求1，2, 3,4, 5， 6, 7,8,9,10,11，12,13,15,16,19, 20, 23, 24, 29, 30 和 31 中任一項(xiàng)的分離的多肽分子。
37. -種細(xì)胞，其包含權(quán)利要求27或28的分離的核酸分子。
38. -種組合物，其包含權(quán)利要求35, 36,和37中任一項(xiàng)的細(xì)胞。
39. 權(quán)利要求35, 36,和37的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞在體外，離體，在體內(nèi)，或原位與所述 分離的多肽或編碼所述多肽的分離的核酸接觸。
40. 權(quán)利要求35, 36,和37的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是光感受器，雙極細(xì)胞，桿狀雙極細(xì) 胞，ON型錐體雙極細(xì)胞，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，感光性視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，水平細(xì)胞，無(wú)長(zhǎng)突細(xì) 胞，或All無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞。
41. 權(quán)利要求40的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞或感光性視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì) 胞。
42. -種改善或恢復(fù)視覺(jué)的方法，其包括對(duì)受試者施用權(quán)利要求33的組合物。
43. -種改善或恢復(fù)視覺(jué)的方法，其包括對(duì)受試者施用權(quán)利要求34的組合物。
44. 一種改善或恢復(fù)視覺(jué)的方法，其包括對(duì)受試者施用權(quán)利要求38的組合物。
45. 權(quán)利要求42,43和44的方法，其中所述受試者具有正常的視覺(jué)。
46. 權(quán)利要求42,43和44的方法，其中所述受試者具有受損的視覺(jué)。
47. 權(quán)利要求42,43和44的方法，其中所述受試者患有眼疾病。
48. 權(quán)利要求47的方法，其中所述眼疾病是黃斑變性（macular degeneration)或色素 性視網(wǎng)膜炎（retinitis pigmentosa)。
49. 權(quán)利要求42，43和44的方法，其中通過(guò)玻璃體內(nèi)或視網(wǎng)膜下注射施用所述組合物。
50. 權(quán)利要求42,43和44的方法，其中所述改善或恢復(fù)視覺(jué)包括下列任一項(xiàng)：提高光 敏感性；降低引發(fā)光電流需要的閾值光強(qiáng)度；及提高視皮質(zhì)中的視覺(jué)誘發(fā)電位。
【文檔編號(hào)】C07K14/705GK104334575SQ201380022635
【公開(kāi)日】2015年2月4日 申請(qǐng)日期:2013年3月5日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月5日
【發(fā)明者】Z-h.潘 申請(qǐng)人:韋恩州立大學(xué)