專利名稱：預(yù)防或治療再狹窄的化合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及預(yù)防或治療再狹窄的新方法和組合物，所述再狹窄如用于恢復(fù)通向缺 血組織血流的旁路移植術(shù)和或經(jīng)皮冠狀血管或外周血管基于導(dǎo)管的介入術(shù)后的再狹窄。
背景技術(shù)：
對(duì)本說明書中顯然在先的出版資料的列表或討論不應(yīng)必然地被認(rèn)為是承認(rèn)該資 料是公知知識(shí)技術(shù)發(fā)展水平的一部分。缺血性心臟病(IHD) —般是冠狀動(dòng)脈中動(dòng)脈粥樣硬化的結(jié)果。動(dòng)脈粥樣硬化是動(dòng) 脈內(nèi)膜的疾病，起始癥狀為脂質(zhì)物質(zhì)和炎癥細(xì)胞的局部沉積。當(dāng)這些載滿脂質(zhì)的病變進(jìn)展 到晚期時(shí)，它們變得狹窄(即導(dǎo)致血管變窄)并因此能限制通向心肌的血流。動(dòng)脈粥樣硬 化也在其他動(dòng)脈中發(fā)生并能導(dǎo)致特別是通向腿部、腦部和腎臟的血管的狹窄。該血流限制 能導(dǎo)致缺血性疼痛，如心絞痛和間歇性跛行。動(dòng)脈粥樣硬化的另一個(gè)后果是病變能變得不穩(wěn)定并破裂，導(dǎo)致在破裂點(diǎn)形成動(dòng)脈 血栓。該血栓嚴(yán)重危害下游組織的氧供應(yīng)，除非血栓被溶解，否則它將導(dǎo)致缺血組織的梗塞 形成(心肌梗塞、中風(fēng)等)。心肌梗塞和中風(fēng)是世界范圍內(nèi)最常見的兩類致死原因?；謴?fù)缺血組織的正常血液供給是治療缺血失調(diào)的最重要的急切目標(biāo)，這可通過藥 物治療或介入術(shù)獲得。在患有急性動(dòng)脈血栓形成事件如急性心肌梗塞的患者中，盡快恢復(fù) 通向缺血組織的血流是重要的，以減少血栓形成事件的后果，并且外科干預(yù)在這種情況下 是普遍的?；加胁荒苡盟幬锍浞挚刂频姆€(wěn)定型心絞痛或其他缺血失調(diào)的患者也可進(jìn)行手術(shù) 治療。利用旁路移植術(shù)(如冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)，CABG)或基于導(dǎo)管的介入術(shù)(catheter based intervention)進(jìn)行外科干預(yù)(surgicalintervention)，如用于冠狀動(dòng)脈重建術(shù)的 外科干預(yù)。在旁路移植術(shù)如CABG的情況下，將乳動(dòng)脈暴露，將其末端從乳房移開并縫合入 冠狀動(dòng)脈狹窄區(qū)段遠(yuǎn)端的位置，因此允許灌注缺血組織。假如不能使用乳動(dòng)脈，或假如需要 多個(gè)旁路，外科醫(yī)生將使用來源于腿部的靜脈(靜脈移植)。在這種情況下，將靜脈區(qū)段移 開并按從主動(dòng)脈到狹窄遠(yuǎn)端的位置進(jìn)行放置。在基于導(dǎo)管的介入如PCI (經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入)時(shí)，一般將氣囊導(dǎo)管通過股動(dòng)脈插 入并引導(dǎo)入狹窄區(qū)段，在此處使氣囊膨脹，因此狹窄區(qū)段被擴(kuò)張。這也稱為氣囊血管成形 術(shù)。在PCI過程中完成的其他操作可包括植入支架或進(jìn)行動(dòng)脈粥樣硬化斑塊切除術(shù)，如旋 轉(zhuǎn)或激光動(dòng)脈粥樣硬化斑塊切除術(shù)(移除動(dòng)脈粥樣硬化斑塊物質(zhì))。為了改善介入術(shù)的功 效，可使用支架導(dǎo)管(stent catheter)來植入支架。在這種情況下，導(dǎo)管也放置金屬支架 來支撐動(dòng)脈壁以維持管腔口徑。用于恢復(fù)通向缺血組織的正常血流的介入術(shù)能導(dǎo)致再狹窄，其由新內(nèi)膜形成或新 內(nèi)膜變厚導(dǎo)致。根本原因在于血管平滑肌損傷和內(nèi)皮襯里(endothelial lining)完整 性的破壞。該過程的特征也在于炎癥細(xì)胞的存在和活性以及患者所罹患的最后的并存病 (co-morbidities)。原發(fā)性狹窄和繼發(fā)性再狹窄發(fā)展過程的根本分子機(jī)理是不同的，但在二者間存在大量重疊旁路移植是有效的介入術(shù)，但常見的并發(fā)癥為所謂的再狹窄，將導(dǎo)致在移植血管 中形成新狹窄的新生膜的快速發(fā)展，經(jīng)常導(dǎo)致對(duì)進(jìn)行重復(fù)的血管再形成操作的需求。在靜 脈移植時(shí)這特別常見，其中在第一年大約有15%的移植物封閉，在10年內(nèi)50%的移植血管 是狹窄的(Motwani和Topol，1998)?？蓪㈧o脈移植失敗視為損傷誘導(dǎo)的炎癥疾病，這包括 巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和激活，以及中膜平滑肌細(xì)胞激活(Zhang等人，2004)。PCI后再狹窄也是一個(gè)常見并發(fā)癥。在PCI后進(jìn)行重復(fù)的血管再形成操作比在 CABG后進(jìn)行重復(fù)的血管再形成操作更為常見；在第5年時(shí)的絕對(duì)比率分別為氣囊血管成 形術(shù)后為46. 1%，在用支架進(jìn)行的PCI后為40. 1%，在CABG后為9.8% (Bravata等人， 2007)。具有基質(zhì)合成表型(matrix synthesising phenotype)的平滑肌細(xì)胞增殖是導(dǎo)致 新生膜形成過程的重要因素。近期的有效減少再狹窄的發(fā)展是所謂的藥物洗脫支架(DES)。 這些支架用含有細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑(如雷帕霉素)的聚合物涂覆，其有效抑制針對(duì)外科干預(yù) 的增生性反應(yīng)。在接受DES的患者中，再狹窄發(fā)生率一般低于4%。然而，DES支架并不能 完全地整合入血管壁，伴隨而來的是增加的血栓形成風(fēng)險(xiǎn)，該風(fēng)險(xiǎn)用藥物不能有效地控制。 實(shí)際上，關(guān)于再狹窄的DES的優(yōu)點(diǎn)沒有顯著改善患者預(yù)后，因?yàn)樵黾拥难L(fēng)險(xiǎn)抵消了該 效果。實(shí)際上，現(xiàn)在有了謹(jǐn)慎使用DES的建議，還提出了增加抗血栓治療的建議(Smith等 人，2006)。再狹窄病變是炎性病變，其至少在表面上與原發(fā)性動(dòng)脈粥樣硬化病變具有相似 性。主要的細(xì)胞是平滑肌細(xì)胞，但也可以是巨噬細(xì)胞/泡沫細(xì)胞，并且在再狹窄病變中存在 T-淋巴細(xì)胞。CABG和PCI可有效治療狹窄，且藥物方法有限制介入相關(guān)的并發(fā)癥的某種優(yōu) 點(diǎn)，但有效預(yù)防再狹窄的有效治療能進(jìn)一步改善治療。即使是在DES的情況下，如果支架能 用不增加動(dòng)脈血栓形成風(fēng)險(xiǎn)的有效的抗再狹窄劑涂覆將是有利的。由上述概要明顯可見，降低再狹窄形成的有效治療是疾病狀況的治療機(jī)會(huì)，在所 述疾病狀況中進(jìn)行了血管再形成操作，這不依賴于用于獲得血管再形成的技術(shù)是有支架植 入或無支架植入的旁路移植術(shù)或狹窄血管區(qū)段的氣囊擴(kuò)張術(shù)。膜聯(lián)蛋白A5是結(jié)合到帶電荷的磷脂類如磷脂酰絲氨酸(PS)的內(nèi)源性蛋白質(zhì) (Cederholm和Frostegard，2007)。膜聯(lián)蛋白A5是有效的抗血栓劑(Thiagarajan和 Benedict, 1997)，據(jù)建議，膜聯(lián)蛋白A5通過結(jié)合到暴露的PS上能形成‘保護(hù)性屏障’，該保 護(hù)性屏障能抑制PS對(duì)血栓形成的效應(yīng)(Rand，2000)。據(jù)顯示，除了具有抗血小板效應(yīng)和抗凝效應(yīng)外，膜聯(lián)蛋白A5和其類似物_膜聯(lián)蛋 白A5 二聚體(二聚膜聯(lián)蛋白(diarmexin))在預(yù)防肝臟再灌注損傷中也是有效的(Teoh等 人，2007)，且其改善了大鼠肝移植物的結(jié)果(Shen等人，2007)。有意思的是，在這兩個(gè)研究 中，治療均伴隨降低的肝臟內(nèi)皮炎癥活性，這通過降低的粘附分子表達(dá)測(cè)得，即膜聯(lián)蛋白A5 具有抗炎效應(yīng)。據(jù)建議，二聚膜聯(lián)蛋白通過引起維持通向肝臟的血液供應(yīng)的抗血栓效應(yīng)改 善了肝臟移植物的存活率(Shen等人，2007)。更早前也已建議，膜聯(lián)蛋白A5能用于穩(wěn)定患 者冠狀動(dòng)脈中的動(dòng)脈粥樣硬化病變，其降低了這些患者中心肌梗塞的風(fēng)險(xiǎn)(Cederholm等 人，2005 ；WO 2005/099744)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一方面提供了預(yù)防或治療再狹窄的方法，其包含給予需要這樣的治療的患者治療有效量的膜聯(lián)蛋白A5或其功能類似物或變體。本發(fā)明的第二方面提供了治療患者中狹窄的方法，其包含進(jìn)行用于狹窄治療的介 入術(shù)并聯(lián)合給予治療有效量的膜聯(lián)蛋白A5或其功能類似物或變體。本發(fā)明的第三方面提供了包含用于預(yù)防或治療再狹窄的治療有效量的膜聯(lián)蛋白 A5或其功能類似物或變體的藥物組合物。本發(fā)明的第四方面提供了藥物洗脫支架，其中藥物是膜聯(lián)蛋白A5或其功能類似 物或變體。本發(fā)明的第五方面提供了制備用于向患者遞送膜聯(lián)蛋白A5或其功能類似物或變 體的支架的方法，該方法包含將膜聯(lián)蛋白A5或其功能類似物或變體整合進(jìn)入支架體或整 合在支架體上?？紤]了可以將此處公開的任何方法或組合物用此處公開的任何其他方法或組合 物進(jìn)行實(shí)施。當(dāng)在權(quán)利要求書和/或說明書中與術(shù)語“包含”聯(lián)用時(shí)，單詞“a”或“an”的使用 可指“一”，但它也與“一個(gè)或更多個(gè)”、“至少一個(gè)”和“一個(gè)或多于一個(gè)”的意思一致。當(dāng)與下述說明和附圖共同考慮時(shí)，本發(fā)明的這些具體實(shí)施方案和其他具體實(shí)施方 案可以被更好地評(píng)價(jià)和理解。然而，應(yīng)理解，盡管指出了本發(fā)明的多個(gè)具體實(shí)施方案和其眾 多的具體細(xì)節(jié)，給出下述說明僅為了例證的目的，而不是為了限制。在沒有背離本發(fā)明精神 的情況下，可在本發(fā)明的范圍內(nèi)做出許多的替換、修改、添加和/或重新整理，本發(fā)明也包 括所有這樣的替換、修改、添加和/或重新整理。


圖l.AP0E*3-Leiden轉(zhuǎn)基因小鼠中動(dòng)脈壁中白細(xì)胞的定量，該小鼠用富膽固醇膳 食喂養(yǎng)，并在股動(dòng)脈袖套手術(shù)(femoral artery cuffsurgery)后三天及每天用載體或重組 人膜聯(lián)蛋白A5進(jìn)行治療。以平均值士SEM表示白細(xì)胞百分比。圖2.在AP0E*3_Leiden轉(zhuǎn)基因小鼠動(dòng)脈壁中用AIA 31240染色的單核細(xì)胞和巨 噬細(xì)胞的定量，該小鼠用富膽固醇膳食喂養(yǎng)，并在股動(dòng)脈袖套手術(shù)后三天及每天用載體或 重組人膜聯(lián)蛋白A5進(jìn)行治療。以平均值士SEM表示巨噬細(xì)胞在計(jì)數(shù)的細(xì)胞(貼到內(nèi)皮或 浸潤(rùn)到中膜中)總數(shù)目中的百分比。圖3. AP0E*3-Leiden轉(zhuǎn)基因小鼠動(dòng)脈壁中表達(dá)MCP-I的細(xì)胞的定量，該小鼠用富 膽固醇膳食喂養(yǎng)，并在股動(dòng)脈袖套手術(shù)后三天及每天用載體或重組人膜聯(lián)蛋白A5進(jìn)行治 療。以平均值士 SEM表示表達(dá)MCP-I的細(xì)胞百分比。圖4. AP0E*3-Leiden轉(zhuǎn)基因小鼠的靜脈移植物變厚，該小鼠用富膽固醇膳食喂 養(yǎng)，并在靜脈移植手術(shù)后28天及每天用載體或重組人或鼠膜聯(lián)蛋白A5進(jìn)行治療。以平均 值士SEM(mm2)表示管腔和外膜間的面積。n. s.不顯著。圖5.AP0E*3-Leiden轉(zhuǎn)基因小鼠靜脈移植物壁中白細(xì)胞數(shù)目的定量，該小鼠用富 膽固醇膳食喂養(yǎng)，并在靜脈移植手術(shù)后28天及每天用載體、重組人或鼠膜聯(lián)蛋白A5進(jìn)行治 療。以平均值士SEM表示細(xì)胞數(shù)目。
具體實(shí)施例方式發(fā)明人在此顯示，膜聯(lián)蛋白A5能降低兩種再狹窄小鼠模型中新內(nèi)膜的形成。因 此，膜聯(lián)蛋白A5或其類似物給予了具有能降低患者中再狹窄相關(guān)并發(fā)癥數(shù)目的抗再狹窄 性質(zhì)的新治療方式，所述患者經(jīng)歷了用于缺血組織血管再形成的旁路移植術(shù)或血管成形術(shù) 操作。已有報(bào)告未顯示膜聯(lián)蛋白A5具有抗再狹窄性質(zhì)。因此，能使用膜聯(lián)蛋白A5來預(yù)防 再狹窄。能全身性給予膜聯(lián)蛋白A5，也可以將其用作藥物洗脫支架中的抗再狹窄劑。在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供預(yù)防或治療再狹窄的方法，其包含給予需要這樣的治 療的患者治療有效量的膜聯(lián)蛋白A5或其功能類似物或變體。換言之，本發(fā)明的第一方面提供了用于預(yù)防或治療再狹窄的膜聯(lián)蛋白A5或其功 能類似物或變體?！邦A(yù)防”包括預(yù)防，特別是預(yù)防再狹窄的發(fā)展，或減少再狹窄的發(fā)展(原發(fā) 性預(yù)防)和繼發(fā)性預(yù)防，其中再狹窄已經(jīng)發(fā)生，但防止患者狀況惡 化，或使?fàn)顩r更逐漸地惡 化或到降低的程度。“治療”包括的意思是部分地或全部地逆轉(zhuǎn)患者中存在的再狹窄。患者一般為人類患者。另外，患者可以是非人動(dòng)物，如家畜(如貓、犬、兔、牛、羊、 豬、小鼠或其他嚙齒類動(dòng)物)。再狹窄可在為了恢復(fù)通向缺血組織的正常血流而進(jìn)行的介入術(shù)后發(fā)生，所述介入 術(shù)如已經(jīng)用于治療血管狹窄或血管中動(dòng)脈粥樣硬化癍塊積累的血管再形成操作。內(nèi)科醫(yī)生 能根據(jù)本領(lǐng)域的已知方法診斷由于粥樣斑導(dǎo)致的狹窄或血管梗阻。一般用冠狀動(dòng)脈造影術(shù) 或血管內(nèi)超聲(IVUS)評(píng)估冠狀動(dòng)脈狹窄。后者也用于定量動(dòng)脈癍塊。Jasti等人(2004) Circulation 110 :2831_2836描述了能用IVUS測(cè)量的參數(shù)，以及定量冠狀動(dòng)脈造影術(shù)。能 用IVUS測(cè)量的合適的靶病變和參考區(qū)段的參數(shù)是(1)最小的和最大的管腔直徑(mm)； (2)最小的管腔橫斷面積(MLA，mm2) ； (3)等于外彈力膜橫截面積(EEM CSA)減MLA的癍塊 加中膜(media)的橫斷面積(CSA，mm2) ； (4)橫斷面變窄率(CSN)，其以癍塊加中膜CSA除 以EEM CSA而計(jì)算；(5)參考區(qū)段，其是接近或遠(yuǎn)離狹窄的看上去正常的動(dòng)脈橫斷面；通常， 可測(cè)量接近和遠(yuǎn)離狹窄的測(cè)量值的平均值；及(6)狹窄面積(AS)，以參考-管腔CSA-病變 MLAX 100/參考-管腔CSA計(jì)算得。(2. 8mm的平均管腔直徑(MLD)或彡5. 9mm2的平均 管腔面積是本研究中保證介入術(shù)的臨床上顯著狹窄的指征。技術(shù)人員理解，不同的甄別域 (cut-off value)對(duì)不同血管中狹窄的診斷可以是恰當(dāng)?shù)?。?jīng)常將管腔減少至參考區(qū)段的 50%認(rèn)為是臨床相關(guān)的狹窄。也已知診斷狹窄的非侵入性方法。Holte等人(2007)Cardiovascularultrasound 5:33描述了用于直接觀察冠狀動(dòng)脈區(qū)段和評(píng)估冠狀動(dòng)脈流速儲(chǔ)備(coronary velocity flow reserve, CVFR)的經(jīng)胸腔多普勒超聲心動(dòng)描記術(shù)。利用該技術(shù)，冠狀動(dòng)脈狹窄一般顯 示了利用彩色血流多普勒獲取的顏色失真(colour aliasing)表達(dá)的局部血流加速和湍 流，以及穿過狹窄的加速的流速。為了評(píng)估狹窄的嚴(yán)重程度，可通過比較失真位點(diǎn)的流速和 最接近的上游非加速的狹窄前流速而定量血流加速。大于2. 0的最大的與狹窄前峰心臟舒 張流速的比率以高靈敏性和特異性預(yù)測(cè)了顯著狹窄。狹窄不限于冠狀動(dòng)脈，也可發(fā)生在腦血管以及其他外周血管如腎動(dòng)脈和肢體動(dòng)脈 中?？梢砸耘c診斷冠狀動(dòng)脈血管相似的方式或利用功能測(cè)試如跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)診斷這樣的血管中 的狹窄。
通常，再狹窄可以在用于恢復(fù)通向缺血組織的正常血流的介入術(shù)后數(shù)周、數(shù)月或數(shù)年內(nèi)變得明顯，并且，如果不予治療，在數(shù)周、數(shù)月或數(shù)年時(shí)間內(nèi)將發(fā)展。在介入術(shù)后隨訪 的過程中可診斷或不診斷再狹窄，當(dāng)其導(dǎo)致臨床并發(fā)癥如心絞痛、血栓或梗塞時(shí)可第一次 被注意到。內(nèi)科醫(yī)生一般根據(jù)與用于診斷狹窄的方法相同的方法診斷再狹窄。通常，可以利 用冠狀動(dòng)脈造影術(shù)、IVUS或利用非侵入性方法如經(jīng)胸腔多普勒超聲心動(dòng)描記術(shù)評(píng)估冠狀動(dòng) 脈再狹窄。關(guān)于診斷狹窄的上述相似臨床參數(shù)也用于診斷再狹窄。利用經(jīng)胸腔多普勒超聲 心動(dòng)描記術(shù)測(cè)定的大于2. 0的最大的與狹窄前峰心臟舒張流速的比率指示了再狹窄，如上 述Holte等人中所描述的。Hirata等人(2006) J Amer. Soc. Echocardiography 19 :165_191 描述了利用經(jīng)胸腔多普勒超聲心動(dòng)描記術(shù)在成功進(jìn)行冠狀動(dòng)脈左前降支PCI后6個(gè)月的患 者中進(jìn)行的非侵入診斷再狹窄。外周血管如腎動(dòng)脈或肢體動(dòng)脈的再狹窄可以用類似的方法 診斷，或利用功能測(cè)驗(yàn)如跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)進(jìn)行診斷。在用于預(yù)防或降低再狹窄發(fā)展的根據(jù)本發(fā)明第一方面的預(yù)防方法中，一般在用于 恢復(fù)通向缺血組織的正常血流的介入術(shù)時(shí)或之前不久給予膜聯(lián)蛋白A5或其功能類似物或 變體。例如，可在介入術(shù)前至少1周、6天、5天、4天、3天、2天、1天、12小時(shí)、8小時(shí)、4小 時(shí)、2小時(shí)、1小時(shí)或30分鐘或進(jìn)行介入術(shù)時(shí)給予它。通常，在外科干預(yù)后持續(xù)給予膜聯(lián)蛋 白A5或其功能類似物或變體，例如在介入術(shù)后持續(xù)至少1周、2周、1個(gè)月、2個(gè)月、6個(gè)月、 1年、2年、5年或10年。可以通過合適劑量形式的重復(fù)給藥，或通過控釋形式，如在介入術(shù) 過程中使用的藥物洗脫支架的形式給藥，或作為一個(gè)或更多個(gè)給藥形式的組合給予膜聯(lián)蛋 白A5或其功能類似物或變體。應(yīng)理解，可以選擇持續(xù)給予膜聯(lián)蛋白A5或其功能類似物或 變體的準(zhǔn)確時(shí)間以便與介入術(shù)后不同時(shí)間的再狹窄風(fēng)險(xiǎn)程度相吻合。例如，當(dāng)在介入術(shù)過 程中使用裸露金屬支架時(shí)，新內(nèi)膜形成一般在介入術(shù)后大約6個(gè)月時(shí)達(dá)到峰值，然后減退，然而，當(dāng)使用藥物洗脫支架時(shí)，再狹窄傾向于更緩慢地發(fā)展，但在介入術(shù)后持續(xù)發(fā)展多達(dá)1 或 2 年或甚至 2 年以上(Ong 和 Serruys (2005) Curr Issues Cardiol 32:372-377)。在本發(fā)明第一方面的其他具體實(shí)施方案中，膜聯(lián)蛋白A5或其功能類似物或變體 以繼發(fā)性預(yù)防的形式給予，以預(yù)防或減少已發(fā)生的再狹窄的惡化；或以治療的形式給予，以 徹底地或部分地逆轉(zhuǎn)已發(fā)生的再狹窄。通常，膜聯(lián)蛋白A5或其功能類似物或變體在原發(fā)性 血管再形成操作和隨后診斷患者中再狹窄后給予。通常，以合適劑量形式的重復(fù)給藥提供 膜聯(lián)蛋白A5或其功能類似物或變體。通常，給予在診斷再狹窄后持續(xù)至少1周、2周、1個(gè) 月、2個(gè)月、6個(gè)月、1年、2年、5年或10年。也想到的是，進(jìn)行其他血管再形成操作治療再狹 窄，及以控釋藥物的形式，如在其他血管再形成操作中使用的藥物洗脫支架中提供膜聯(lián)蛋 白A5或其功能類似物或變體。提供了一個(gè)或更多個(gè)給藥形式的組合。給予“治療有效量的膜聯(lián)蛋白A5或其功能類似物或變體”指給予在預(yù)防或降低再 狹窄發(fā)展、治療再狹窄、或預(yù)防或降低已存在的再狹窄惡化中具有有益效果的量。通常，當(dāng) 膜聯(lián)蛋白A5或其功能類似物或變體預(yù)防或降低了再狹窄發(fā)展時(shí)，在給藥開始后再狹窄是 不可診斷的或它變得比預(yù)期的(即，與沒有給予膜聯(lián)蛋白A5或其功能類似物或變體時(shí)其發(fā) 展相比較)可診斷時(shí)間更晚，或在診斷后發(fā)展的更慢，或在診斷后發(fā)展到減少的程度，或是 更晚的可診斷性、更慢的進(jìn)展和降低的發(fā)展的任何兩個(gè)或全部三個(gè)的組合。通常，再狹窄 比在沒有給予膜聯(lián)蛋白A5或其功能類似物或變體時(shí)所預(yù)期的時(shí)間晚至少1個(gè)月、至少3個(gè) 月、6個(gè)月、1年、2年、5年或10年才可診斷。其中，在診斷再狹窄后，在給予了膜聯(lián)蛋白A5或其功能類似物或變體的患者中再狹窄進(jìn)展更慢，這通常引起對(duì)重復(fù)血管再形成操作的需 求發(fā)生的時(shí)間比沒有給予膜聯(lián)蛋白A5或其功能類似物或變體時(shí)所預(yù)期的發(fā)生時(shí)間晚，通 常，至少1個(gè)月、至少3個(gè)月、6個(gè)月、1年、2年、5年或10年。通常，當(dāng)給予膜聯(lián)蛋白A5或 其功能類似物或變體來治療再狹窄時(shí)，再狹窄癥狀隨時(shí)間而消失，以至再狹窄在給藥后10 年、5年、2年、1年、6個(gè)月、3個(gè)月或1個(gè)月后不再可診斷。當(dāng)給予膜聯(lián)蛋白A5或其功能類 似物或變體以預(yù)防或降低已發(fā)生再狹窄的惡化時(shí)，這通常引起對(duì)重復(fù)血管再形成操作的需 求發(fā)生的時(shí)間比沒有給予膜聯(lián)蛋白A5或其功能類似物或變體時(shí)所預(yù)期的時(shí)間晚通常至少 1個(gè)月、至少3個(gè)月、6個(gè)月、1年、2年、5年或10年合適地，針對(duì)再狹窄給予膜聯(lián)蛋白A5或其功能類似物或變體的有益效果(例如更 晚的可診斷性、更慢的進(jìn)展和/或降低的發(fā)展)可通過利用IVUS測(cè)定以下而進(jìn)行鑒定已 經(jīng)給予和/或正在給予膜聯(lián)蛋白A5或其功能類似物或變體的患者在進(jìn)行血管再形成操作 后處于再狹窄風(fēng)險(xiǎn)中或已經(jīng)經(jīng)歷再狹窄的血管的平均管腔直徑或平均管腔面積，并將其與 在類似時(shí)間段之前經(jīng)歷相同類型血管中的相同類型血管再形成操作但沒有給予膜聯(lián)蛋白 A5或其功能類似物或變體的患者中的相同參數(shù)進(jìn)行比較。合適地，在進(jìn)行血管再形成操作 后的時(shí)間點(diǎn)1周、2周、1個(gè)月、2個(gè)月、4個(gè)月、6個(gè)月、9個(gè)月、1年、2年、5年或10年，治療的 受試者中的平均管腔直徑比沒有用膜聯(lián)蛋白A5或其功能類似物或變體治療的受試者中的 平均管腔直徑大至少 1% >2%,3%,4%,5%,7% ,10% ,15%,20%,25%,30%,40%,50%, 75%、100%、125%Λ50%或甚至200%，假定在血管再形成操作時(shí)或之前開始給予膜聯(lián)蛋 白Α5或其功能類似物或變體。另外，在上述任何時(shí)間點(diǎn)，治療的受試者中的平均管腔面積 比未治療的受試者的平均管腔面積通常大至少2%、3%、4%、5%、7%、10%、15%、20%、 45%、55%、70%、100%、225%、300%、400%、500%、600%或甚至 900%。優(yōu)選地，以上紀(jì)錄 的平均管腔直徑或面積的增加在血管再形成操作后的第6個(gè)月觀察到。技術(shù)人員將理解，其他終末點(diǎn)對(duì)于鑒定給予膜聯(lián)蛋白Α5或其功能類似物或變體 的治療效果也可是合適的。例如，心肌梗塞和/或死亡是再狹窄的常見結(jié)局。給予了膜聯(lián) 蛋白Α5或其功能類似物或變體的受試者可經(jīng)歷比沒有給予膜聯(lián)蛋白Α5或其功能類似物或 變體的受試者中預(yù)期的心肌梗塞風(fēng)險(xiǎn)降低的心肌梗塞風(fēng)險(xiǎn)，和/或存活更長(zhǎng)時(shí)間?？赏ㄟ^通常涉及數(shù)十個(gè)、數(shù)百個(gè)或數(shù)千個(gè)患者(如10、50、100、1000或10000或這 些數(shù)字之間的值)的臨床試驗(yàn)測(cè)定給予膜聯(lián)蛋白Α5或其功能類似物或變體對(duì)血管再形成 操作后再狹窄可診斷性的影響。另外，可使用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，如那些在下面描述的與測(cè)驗(yàn)?zāi)ぢ?lián)蛋 白Α5的功能類似物和變體有關(guān)的和實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)。可受益于根據(jù)本發(fā)明第一方面的預(yù)防或治療的受試者包括將要進(jìn)行目的為恢復(fù) 通向缺血組織的正常血流的介入術(shù)的受試者，或那些正在進(jìn)行介入術(shù)或進(jìn)行介入術(shù)后的受 試者?；颊呖梢允钦诮?jīng)歷或已經(jīng)經(jīng)歷了冠狀動(dòng)脈循環(huán)或外周血管內(nèi)的血管再形成操作的 受試者。這樣的介入術(shù)可以是外科干預(yù)或經(jīng)皮介入。例如，操作可以是旁路移植術(shù)，如冠狀 動(dòng)脈旁路移植術(shù)，或基于導(dǎo)管的介入術(shù)，如有支架植入或無支架植入和進(jìn)行或未進(jìn)行動(dòng)脈 粥樣硬化斑塊切除術(shù)的氣囊血管成形術(shù)，如經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)或血管成形術(shù)。合適地，在 本發(fā)明的第一方面中，再狹窄與旁路移植術(shù)相關(guān)。換言之，再狹窄由于旁路移植術(shù)操作已經(jīng) 發(fā)生，或處于發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)中。合適地，在本發(fā)明的第一方面中，再狹窄與基于導(dǎo)管的介入術(shù) 有關(guān)。換言之，再狹窄由于基于導(dǎo)管的介入術(shù)已經(jīng)發(fā)生，或處于發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)中。合適地，再狹窄與植入支架有關(guān)，不管該操作是否已經(jīng)在外科干預(yù)如旁路移植術(shù)或基于導(dǎo)管的介入術(shù) 的情況下進(jìn)行。其他合適的受試者包括已經(jīng)或?qū)⒁缤ㄟ^支架移植術(shù)進(jìn)行動(dòng)脈瘤治療的 受試者。膜聯(lián)蛋白A5或其功能類似物或變體能與一種或更多種其他活性劑聯(lián)合給予，所 述活性劑如溶血栓治療劑如阿司匹林、氯吡格雷、噻氯匹定(triclopidine)、組織型纖溶酶 原激活物、尿激酶或細(xì)菌酶如鏈激酶。膜聯(lián)蛋白A5或其功能類似物或變體可以與任何一種 或更多種其他活性劑共同給予，或單獨(dú)、同時(shí)或連續(xù)地與這樣的藥劑給予。通常，使用一種 或更多種這些藥劑來降低血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)，其可封閉血管，包括植入支架的血管。合適地， 在涉及使用支架的血管再形成操作之前用噻氯匹定或氯吡格雷開始治療，并在操作后持續(xù) 至少3、6或甚至12個(gè)月(Ong和Serruys，上文)。通常，阿司匹林與噻氯匹定或氯吡格雷 同時(shí)給予，然后持續(xù)一定時(shí)間。將阿司匹林與氯吡格雷或噻氯匹定一起使用稱為二元抗血 小板治療?？稍谄渌愋偷慕槿胄g(shù)之前和之后應(yīng)用相似的抗凝血藥給藥方案。膜聯(lián)蛋白A5或其功能類似物或變體能以胃腸外、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、 皮下或局部從藥物洗脫支架的方式給予。當(dāng)將支架植入受試者中時(shí)，膜聯(lián)蛋白A5或其功能 類似物或變體可從支架釋放(即支架是藥物洗脫支架)或可以用上面列出的另外途徑給予 受試者膜聯(lián)蛋白A5或其功能類似物或變體。 在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供了治療患者中狹窄的方法，其包含進(jìn)行用于治療狹窄 的介入術(shù)并聯(lián)合給予治療有效量的膜聯(lián)蛋白A5或其功能類似物或變體。換言之，本發(fā)明的 第二方面提供了和狹窄治療聯(lián)合的用于治療狹窄的膜聯(lián)蛋白A5或其功能類似物或變體。狹窄可發(fā)生并可如上述進(jìn)行診斷?！坝糜谥委煪M窄的介入術(shù)”指用于治療患者中狹 窄的任何介入術(shù)。本領(lǐng)域已知的狹窄介入術(shù)包括外科干預(yù)，如靜脈移植術(shù)，包括旁路移植術(shù) 如冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)，和基于導(dǎo)管的介入術(shù)，如有支架植入或無支架植入的和進(jìn)行或未 進(jìn)行動(dòng)脈粥樣硬化斑塊切除術(shù)的氣囊血管成形術(shù)，包括經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)。在本發(fā)明的第二方面，膜聯(lián)蛋白A5或其功能類似物或變體與用于治療狹窄的介 入術(shù)聯(lián)合給予。換言之，單獨(dú)地、同時(shí)地或連續(xù)地進(jìn)行給藥和介入術(shù)。如在本發(fā)明第一方面 相關(guān)部分中討論的，可在介入術(shù)之前至少1周、6天、5天、4天、3天、2天、1天、12小時(shí)、8小 時(shí)、4小時(shí)、2小時(shí)、1小時(shí)或30分鐘給予膜聯(lián)蛋白A5或其功能類似物或變體，或在介入術(shù)進(jìn) 行時(shí)給予膜聯(lián)蛋白A5或其功能類似物或變體。通常，在外科干預(yù)后，持續(xù)給予膜聯(lián)蛋白A5 或其功能類似物或變體例如在介入術(shù)后至少1周、2周、1個(gè)月、2個(gè)月、6個(gè)月、1年、2年、5 年或10年。為了預(yù)防或降低狹窄治療后再狹窄的發(fā)展，給予膜聯(lián)蛋白A5或其功能類似物或 變體。因此，如以上在本發(fā)明第一方面的相關(guān)部分中所描述的，“治療有效量的”膜聯(lián)蛋白 A5或其功能類似物或變體在預(yù)防或降低再狹窄發(fā)展中具有有益效果?？墒芤嬗诒景l(fā)明第二方面的方法的合適受試者和患者群、合適的給藥途徑和劑量 及合適的附加治療如以上本發(fā)明第一部分的相關(guān)部分所述。本發(fā)明的第三方面提供了包含用于預(yù)防或治療再狹窄的治療有效量的膜聯(lián)蛋白 A5或其功能類似物或變體的藥物組合物。換言之，本發(fā)明的第三方面提供了膜聯(lián)蛋白A5或 其功能類似物或變體在制備用于預(yù)防或治療再狹窄的藥用產(chǎn)品中的用途。預(yù)防和治療再狹窄如本發(fā)明第一方面的相關(guān)部分所述。
因此，根據(jù)本發(fā)明第三方面的藥物組合物可包含與藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受的佐 齊IJ、稀釋劑或載體混合的膜聯(lián)蛋白Α5或其功能類似物或變體，所述佐劑、稀釋劑或載體一 般根據(jù)目標(biāo)給藥途徑和標(biāo)準(zhǔn)的制藥實(shí)踐進(jìn)行選擇。該組合物可以是速釋、緩釋或控釋應(yīng)用 的形式。優(yōu)選地，該制劑是含有活性成分的每日劑量或單位、每日亞劑量或其適當(dāng)部分的單 位劑量。短語“制藥上或藥理學(xué)上可接受的”指，當(dāng)以適當(dāng)方式將其給予動(dòng)物如例如人時(shí) 不產(chǎn)生副反應(yīng)、過敏反應(yīng)或其他不良反應(yīng)的組合物。根據(jù)本公開制備這樣的藥物組合物對(duì) 本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，如 Remington' s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company，1990所例證的，通過引用將其并入此處。此外，對(duì)于動(dòng)物(如人)給藥， 應(yīng)理解的是，制備物的無菌度、致熱源性、整體安全和純度標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)滿足FDA辦公室生物制品 標(biāo)準(zhǔn)的要求。如此處所用，“藥學(xué)上可接受的載體”包括本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知的任何和全部 溶劑、分散介質(zhì)、包衣、表面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(如抗菌劑、抗真菌劑)、等滲劑、鹽、 防腐劑、藥物、藥物穩(wěn)定劑、賦形劑、崩解劑、像這樣的物質(zhì)及其組合。除了任何常規(guī)載體與 活性成分不相容的范圍外，考慮到了其在治療組合物和制藥組合物中的用途。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可以或不可以用于(并且，因此以適用于以下的方式進(jìn) 行配方)胃腸外、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)或皮下給藥或從藥物洗脫支架給藥，或它 們可利用灌輸技術(shù)給藥。可通過將合適溶劑中所需量的活性化合物與如上所 列舉的各種其 他成分(如果需要)合并，然后通過滅菌制得無菌可注射溶液。最好以無菌水溶液的形式 使用藥物組合物，所述無菌水溶液可含有其他物質(zhì)，如足量的鹽或葡萄糖，以使溶液與血液 等滲。如果需要，將水溶液進(jìn)行適當(dāng)?shù)木彌_(優(yōu)選PH在3-9之間)?？衫帽绢I(lǐng)域技術(shù)人 員熟知的標(biāo)準(zhǔn)制藥技術(shù)容易地在無菌條件下制備合適的藥物配方。在每日劑量水平基礎(chǔ)上用于給予患者如人類患者的治療有效量的膜聯(lián)蛋白A5或 其功能類似物或變體可以是以單個(gè)或分份劑量給予的每個(gè)成人0. 01 IOOOmg的膜聯(lián)蛋白 A5或其功能類似物或變體(例如，每kg患者體重約0. 001 20mg,如0. 01 10mg/kg,例 如0. lmg/kg以上和20、10、5、4、3或2mg/kg以下，如約lmg/kg)。包括在藥物洗脫支架內(nèi)的 合適劑量在下述的本發(fā)明第四方面的相關(guān)部分進(jìn)行了討論。內(nèi)科醫(yī)生無論如何均能測(cè)定最適合任何個(gè)體患者的實(shí)際劑量，該劑量將隨特定患 者的年齡、體重和反應(yīng)而變化。上述的劑量是平均情況下的范例。當(dāng)然，存在更高或更低的 劑量范圍是更為恰當(dāng)?shù)膫€(gè)別情況，這樣的情況也落入本發(fā)明的范圍。對(duì)于獸醫(yī)應(yīng)用，以符合正常獸醫(yī)實(shí)踐的合適的可接受的配方給予本發(fā)明的化合 物，獸醫(yī)外科醫(yī)生將決定最適于特定動(dòng)物的給藥方案和給藥途徑。本發(fā)明的第四方面提供藥物洗脫支架，其中藥物是膜聯(lián)蛋白A5或其功能類似物 或變體。支架是用于維持開放位置的血管的支架，通常在基于導(dǎo)管的介入術(shù)過程中使用。 藥物洗脫支架除了支架體外還包括至少一種藥物，并且通常地，還有用于控制藥物洗脫的 涂層。典型的支架體是至少部分易彎曲的或是在其長(zhǎng)度上用關(guān)節(jié)聯(lián)接的(即鄰近的可 擴(kuò)張環(huán)段用彼此聯(lián)接的連接物聯(lián)接)，以便于它們可通過脈管系統(tǒng)前進(jìn)。此外，它們?cè)跀U(kuò) 張后應(yīng)具有足夠的機(jī)械強(qiáng)度，以機(jī)械地?cái)U(kuò)大管腔壁強(qiáng)度并因此維持管腔開放性。支架體通常是管形的并具有網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)。合適的支架體公開在US 6,602, 282 (Assignee Avantec Vascular Corporation)中。具有用S形連接物結(jié)合的可擴(kuò)張環(huán)段和軸向柱的支架在TO 99/17680 (Localmed Inc)中有描述。在美國專利 5，922，020 (Localmed Inc)中描述了包 含包括支撐和鉸鏈的可擴(kuò)張環(huán)的支架，其中鉸鏈配置有不同的開啟力。典型的支架長(zhǎng)度范 圍為約5mm 100mm，通常為約8mm 50mm。圓柱狀支架的小(放射狀折疊的)直徑的范 圍一般為約0. 5mm 10mm，更常見的范圍為0. 8mm 1. 25mm。擴(kuò)張的直徑的范圍一般為約 1. 5mm 50mm，優(yōu)選范圍為約2. 5mm 30mm。支架體可使用任何合適的材料制備，包括不銹鋼、鈦、鎳或合金，如鈷鉻合金或其 組合。特別合適的材料包括可鍛造的金屬，如300系列不銹鋼，或有彈性的金屬，如超彈性 和形狀記憶合金，如Nitinol 合金，彈性不銹鋼等?？赡艿氖菑倪@些金屬的組合，或這 些類型金屬和其他非金屬材料的組合形成本體區(qū)段。支架體也可由生物可吸收材料或生 物可降解材料制得。合適的生物可降解支架體從聚酯制得，所述聚酯如Vogt等人(2004) European Heart Journal 25 :1330_40中所描述的聚交酯。該支架體用作洗脫紫杉醇的平 臺(tái)，其能在配置后的多于兩個(gè)月的時(shí)間內(nèi)起作用。通過適于在配置支架后允許膜聯(lián)蛋白A5或其功能類似物或變體逐步釋放的方法 將膜聯(lián)蛋白A5或其功能類似物或變體整合在支架體之上或之內(nèi)。Blindt 等人(1999) Int J Artif Organs 22 :843_853 描述了從生物可吸收聚合物 如聚-D-L-交酯(Iactide)塑造支架的方法，他們稱其為CESP (飽和聚合物的受控?cái)U(kuò)張)。 CESP過程的特征為在高壓下將無定形聚合物暴露于惰性氣體， 如二氧化碳，其具有塑化效 應(yīng)，使在接近室溫的溫度下處理聚交酯成為可能。低處理溫度構(gòu)成了對(duì)于熱敏感聚合物而 言的關(guān)鍵優(yōu)點(diǎn)，并允許在塑造處理過程中加入熱敏感的藥物添加物。可利用材料的不同孔 隙大小調(diào)節(jié)藥物釋放動(dòng)力學(xué)。上文的Vogt等人使用了 CESP方法來制備聚-D-L-交酯紫杉 醇洗脫支架。也可在支架體已經(jīng)形成后通過涂覆支架體將膜聯(lián)蛋白A5或其功能類似物或變體 整合在支架體之上。在該具體實(shí)施方案中，支架體被涂以膜聯(lián)蛋白A5或其功能類似物或變 體并且一般也涂以其他物質(zhì)，如適于允許膜聯(lián)蛋白A5或其功能類似物或變體緩釋的聚合 物。通常，在該具體實(shí)施方案中，如上所述，支架體包含金屬。然而，在生物可吸收或生物可 降解支架體的情況下也可施用涂層，縱使這些也包括在塑造階段整合的膜聯(lián)蛋白A5或其 功能類似物或變體。合適地，在支架體被涂覆的地方具有至少1、2、3或更多種涂層。US 2006/0083772 (Deffitt等人)描述了合適的涂覆組合物及其在以允許生物活性劑在體內(nèi)從 涂覆物釋放的方式施用生物活性劑到可植入的醫(yī)療器材如支架的表面的用途。組合物包含 具有不同性質(zhì)的多種相容的聚合物，所述性質(zhì)允許將它們組合在一起以提供諸如耐久性、 生物相容性和釋放動(dòng)力學(xué)的性質(zhì)的最佳組合。在US 2006/0083772中描述的涂覆組合物包 含一種或更多種與多種聚合物組合的生物活性劑，所述聚合物包括(a)包含選自(i)與其 他烯烴基的乙烯共聚物，(ii)聚丁烯，(iii)含芳香基的共聚物，(iv)含表氯醇的聚合物， (ν)亞烷基 _(甲基)丙烯酸烷基酯共聚物(poly(alkylene-CO-alkyl(meth)aCrylates)) 或(vi) 二烯屬來源的非芳香聚合物或共聚物的聚合物的第一聚合物成分；和(b)包含選 自聚(甲基)丙烯酸烷基酯或聚(甲基)丙烯酸芳香酯的一種或更多種聚合物的第二聚合物成分，其中“(甲基)”包括丙烯酸和/或甲基丙烯酸形式的分子(分別對(duì)應(yīng)于丙烯酸 和/或甲基丙烯酸)。選擇聚合物和用于測(cè)定活性劑釋放速率的體外試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)也公開 在US 2006/0083772中。此外，US 2006/0083772公開了用如硅烷和/或?qū)β葋喍妆交?(para-chloro-xylylene)的低分子量二聚體的聚合物(Parylene C ；Speciality Coating Systems (Indianapolis))的物質(zhì)涂覆支架進(jìn)行預(yù)處理以改善以后的聚合物層的附著性。也 可包括頂涂層以改善生物相容性，防止脫層和/或降低起始藥物洗脫速率以提供更長(zhǎng)的洗 脫時(shí)間。US2005/0037052 (Medtronic Vascular, Inc.)公開了具有 1 μ m 1000 μ m 間厚度
的涂層的藥物洗脫支架。在一個(gè)結(jié)構(gòu)中，將包含藥物的涂層直接應(yīng)用到裝置表面或聚合物 底涂層如聚對(duì)二甲苯(parylene)上。依賴于所需的溶解速率和溶解概況，藥物在聚合物基 質(zhì)中是完全可溶的或在各處均勻分散。存在于聚合物基質(zhì)中的藥物濃度范圍為0. 重量 比 80%重量比。在另一個(gè)結(jié)構(gòu)中，將不含藥物的聚合物屏障或帽涂層(cap coat)應(yīng)用于 含藥物的涂層之上。含藥物的涂層充當(dāng)儲(chǔ)藥器。通常，存在于儲(chǔ)藥器內(nèi)的藥物濃度范圍為 從約0. 重量比至多達(dá)100%重量比。屏障涂層以至少三種方式參與控制性藥物釋放速 率。首先，如果屏障涂層具有不同于處于下層的含藥涂層的溶解度常數(shù)，藥物穿過屏障涂層 的擴(kuò)散性以屏障涂層溶解度因子的函數(shù)被調(diào)控。藥物在屏障涂層中越易溶，它從裝置表面 洗脫就越快，反之亦然。該涂層結(jié)構(gòu)一般稱為儲(chǔ)藥器涂層(reservoir coating)。其次，屏 障涂層可包含多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其中涂層充當(dāng)分子篩?？紫鄬?duì)于藥物尺寸而言越大，藥物就洗 脫越快。此外，分子內(nèi)相互作用也將決定洗脫速率。最后，盡管涂層厚度通常是決定整體藥 物釋放速率和概況中的一個(gè)小因素，它仍然是能用于調(diào)節(jié)涂層的一個(gè)額外因素?；径?， 如果所有其他物理和化學(xué)因素保持不變，給定藥物擴(kuò)散穿過給定涂層的速率與涂層厚度成 反比?？梢允褂肬S2005/0037 052中描述的具有帽涂層的控釋涂層。例如，US2005/0037052 公開了具有應(yīng)用到其裸露金屬表面的聚對(duì)二甲苯底涂層的金屬支架。在底涂層上應(yīng)用了釋 放藥物的聚合物涂層或聚合物混合物。在含藥涂層上應(yīng)用聚合物帽涂層。帽涂層可可選地 充當(dāng)擴(kuò)散屏障以進(jìn)一步控制藥物釋放，或提供分離的藥物。帽涂層可僅是應(yīng)用到支架表面 以保護(hù)支架和對(duì)洗脫速率沒有影響的生物相容性聚合物。US2005/0037052還公開了用多種 聚合物組合物涂覆支架的方法。當(dāng)在涂層中使用聚合物時(shí)，聚合物可以是耐用聚合物或生物可降解聚合物。聚合 物可選自聚氨基甲酸酯、聚對(duì)苯二甲酸乙二酯、PLLA-聚羥乙酸(PGA)共聚物(PLGA)、聚己 酸內(nèi)酯、聚鏈烷酸酯(polyalkanoate)聚合物或共聚物，如聚羥基丁酸/羥基纈氨酸共聚 物、聚乙烯替砒咯烷酮、聚四氟乙烯、聚2-羥乙基異丁烯酸酯、聚醚氨酯尿素、硅酮、丙烯酸 酯、環(huán)氧化物、多酯、氨基甲酸乙酯、聚對(duì)二甲苯(parlenes)、聚膦腈聚合物、氟聚合物、聚酰 胺、聚烯烴或其混合物。能用抗血栓物質(zhì)層進(jìn)一步涂覆支架，所述抗血栓物質(zhì)包含一種或更多種選自多 糖、肝素、明膠、膠原、藻酸鹽、透明質(zhì)酸(hyalimic acid)、海藻酸、角叉菜膠、軟骨素、果膠、 殼聚糖或其衍生物或共聚物的試劑，或所述抗血栓物質(zhì)由一種或更多種選自多糖、肝素、明 膠、膠原、藻酸鹽、透明質(zhì)酸(hyalimic acid)、海藻酸、角叉菜膠、軟骨素、果膠、殼聚糖或其 衍生物或共聚物的藥劑組成。合適地，如US 2006/0083772中描述的，可以將這些試劑整合 進(jìn)入生物相容的頂涂層中。
可使用上述的涂覆方法和物質(zhì)制備合適的藥物洗脫支架。如US2005/0037052和 US 2006/0083772中描述的，可進(jìn)行體外測(cè)試來評(píng)估水介質(zhì)中的藥物釋放概況。合適地，根 據(jù)本發(fā)明第四方面的藥物洗脫支架應(yīng)在配置后至少1天、至少2天、至少3天、至少5天、10 天、20天、30天、40天、50天、60天、70天、80天、90天或甚至100天或150天的期間內(nèi)釋放 膜聯(lián)蛋白A5或其功能類似物或變體。合適地，不超過60%、70%、80%或90%在支架釋放 膜聯(lián)蛋白A5或其功能類似物或變體期間的前三分之一期間釋放。膜聯(lián)蛋白A5或其功能類似物或變體的合適數(shù)量范圍為每cm2的裝置有效表面積 約1微克 約10毫克(mg)生物活性劑，一般為約5 μ g和約IOmg間，更一般為約1 μ g和 約Img間。在上文的Vogt等人中，支架具有87mm2的表面積并含有170 μ g的紫杉醇。本發(fā)明的第五方面提供了制備向患者遞送膜聯(lián)蛋白A5或其功能類似物或變體的 支架的方法，其包含將膜聯(lián)蛋白A5或其功能類似物或變體整合在支架體之中或之上。在 Blindt 等人(1999) Int J Artif 0rgans22 :843_853、US2005/0037052 和 US 2006/0083772 中描述了適于將藥物整合在支架體之中或之上的方法。在本發(fā)明第五方面的優(yōu)選具體實(shí)施方案中，方法包含a)提供具有表面的支架體， 和b)在所述表面的至少一部分上施用涂層，其中所述涂層包含膜聯(lián)蛋白A5或其功能類 似物或變體。合適地，網(wǎng)眼表面或穿腔表面或該兩個(gè)表面都被涂覆。涂覆支架體的方法 和合適的涂層組合物在US2005/0037052和US 2006/0083772中有描述?？梢允褂帽绢I(lǐng) 域已知方法如浸漬、噴霧、超聲沉淀或真空沉淀來應(yīng)用在合適溶劑中的物質(zhì)溶液的涂層。 US2005/0037052描述了可利用相分離法獲得涂層中的孔隙度梯度，如通過向聚合物溶液中 加入非溶劑。非溶劑的量越高，相分 離程度越高并且薄層中的孔隙度也越高。緊靠支架表 面的涂層可用最高量的非溶劑配制以顯示最高的孔隙度。然后，相繼的藥物-聚合物溶液 涂層可用減少量的非溶劑配制，這將提供具有漸進(jìn)降低孔隙度的涂層系統(tǒng)。在本發(fā)明第五方面的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，方法包括從包含聚合物和膜聯(lián)蛋白 A5或其功能類似物或變體的組合物塑造支架。在Blindt等人(1999) Int J Artif Organs 22 843-853中公開了從聚合物和藥物化合物的混合物塑造支架的方法。在本發(fā)明第一方面至第五方面任一方面的相關(guān)方面提及的膜聯(lián)蛋白A5或其功能 類似物或變體可選自a)人膜聯(lián)蛋白 A5 (SEQ ID NO 1)；b)人膜聯(lián)蛋白A5的哺乳動(dòng)物直系同源物；c) a)或b)的等位基因變體或遺傳變體；d)膜聯(lián)蛋白的功能類似物，其是與人膜聯(lián)蛋白A5，SEQ ID NO=I具有50%、60%、 70%、75%以上，如80%、85%以上，90%以上，或甚至更優(yōu)選95%或99%以上的同一性的 蛋白質(zhì)；e)a)、b)、c)或d)任一項(xiàng)的二聚體或包含a)、b)、c)或d)任一項(xiàng)的融合蛋白；及
f) a)、b)、c)、d)或 e)任一項(xiàng)的 PEG 化變體。在特定的具體實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的膜聯(lián)蛋白A5的功能類似物或變體與人 膜聯(lián)蛋白 A5，SEQ ID NO :1 具有 50%、60%、70%、75% 以上，如 80%、85% 以上，90% 以上， 或甚至更優(yōu)選95 %或99 %以上的同一性。按如下方法測(cè)定兩條氨基酸序列間的百分比同一性。首先，使用BLAST 2Sequence (B12seq)程序?qū)被嵝蛄信c例如SEQ ID NO 1比較，所述BLAST 2Sequence 程序來自含有BLASTN版本2. 0. 14和BLASTP版本2. 0. 14的BLAST獨(dú)立版本。該BLASTZ 獨(dú)立版本可從美國政府的國立生物技術(shù)信息中心網(wǎng)點(diǎn)ncbi. nlm. nih. gov獲得?？稍陔S附 BLASTZ的幫助文件中找到解釋如何使用B12seq程序的指導(dǎo)。B12seq使用BLASTP算法進(jìn) 行兩條氨基酸序列間的比較。為了比較兩條氨基酸序列，將B12seq的選項(xiàng)設(shè)置如下_i設(shè) 置到包含待比較的第一氨基酸序列的文件(如C:\seql. txt) ；_j設(shè)置到包含待比較的第二 氨基酸序列的文件(如C:\seq2. txt) ；-ρ設(shè)置為blastp ；-ο設(shè)置為任何目標(biāo)文件名(如 C:\output. txt)；并且所有其他選項(xiàng)保持其默認(rèn)設(shè)置。例如，可使用下述命令產(chǎn)生含有兩條 氨基酸序列間比較的輸出文件C:\B12seq -ic:\seql. txt-j c:\seq2.txt -ρ blastp-o c:\output. txt。如果兩條比較的序列分享了同源性，則指定的輸出文件將以比對(duì)序列的形 式呈現(xiàn)那些同源性區(qū)域。如果兩條比較的序列沒有分享同源性，則指定的輸出文件將不呈 現(xiàn)比對(duì)的序列。一旦得以比對(duì)，通過計(jì)數(shù)存在于兩條序列中相同核苷酸或氨基酸殘基的位 置數(shù)目確定匹配數(shù)。
通過將匹配數(shù)除以在經(jīng)鑒定的序列中所示(set forth)的序列長(zhǎng)度，然后將產(chǎn)生 的值乘以100確定百分比同一性。例如，如果將序列與SEQID NO 1中所示的序列進(jìn)行比較(SEQ ID NO 1中所示的序列長(zhǎng)度為320)并且 匹配數(shù)是288，則該序列具有相對(duì)于SEQ ID NO 1中所示的序列的90的百分比同一性(即 288 + 320*1000 = 90)。因此，膜聯(lián)蛋白A5的功能類似物或變體可以是一種蛋白質(zhì)，在該蛋白質(zhì)的一個(gè)或 更多個(gè)位置具有保守的或不保守的氨基酸插入、缺失或取代，只要這樣的改變產(chǎn)生了這樣 的蛋白質(zhì)其以等同于膜聯(lián)蛋白A5的方式起作用的基本性質(zhì)未被顯著改變?！帮@著地”在該 上下文中指，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)說變體的性質(zhì)可能還是不同的但與原始蛋白質(zhì)的性質(zhì)相 比不是不明顯的?！氨Ｊ氐娜〈?，指組合，如 Gly, Ala ；Val, lie、Leu ；Asp、Glu ；Asn, Gln ；Ser, Thr ； Lys、Arg ；及 Phe、Tyr0可使用本領(lǐng)域熟知的蛋白質(zhì)工程和定點(diǎn)誘變制備這樣的變體。根據(jù)本發(fā)明的膜聯(lián)蛋白A5的功能類似物或變體可以是膜聯(lián)蛋白A5的二聚體(如 二聚膜聯(lián)蛋白A5)或其功能類似物或變體，或可以是PEG化的膜聯(lián)蛋白A5或其功能類似物 或變體。在WO 02/067857中公開了二聚膜聯(lián)蛋白A5和PEG化的膜聯(lián)蛋白A5。PEG化是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，其中多肽或模擬肽(ρ印tidomimetic)化合 物(對(duì)于本發(fā)明的目的而言，膜聯(lián)蛋白A5或其功能類似物或變體)被修飾以便將一個(gè)或更 多個(gè)聚乙二醇(PEG)分子共價(jià)連接到一個(gè)或更多個(gè)氨基酸或其衍生物的側(cè)鏈上。它是最 重要白勺分子改變結(jié)構(gòu)化學(xué)技術(shù)(molecule altering structural chemistry techniques, MASC)之一?？墒褂闷渌鸐ASC技術(shù)；這樣的技術(shù)可改善分子的藥效學(xué)性質(zhì)，如延長(zhǎng)其體內(nèi) 半壽期。通過首先激活PEG部分以使它與本發(fā)明的蛋白質(zhì)或模擬肽化合物反應(yīng)并連結(jié)而形 成PEG-蛋白質(zhì)共軛物。PEG部分在分子量和構(gòu)象上變化相當(dāng)大，早期的PEG部分(單功能 PEG ；mPEG)分子量為12KD或以下且呈線性，稍后的部分具有增加的分子量。PEG2是PEG技 術(shù)的近期革新，涉及將30kDa(或以下)的mPEG聯(lián)結(jié)到賴氨酸氨基酸(盡管PEG化能被擴(kuò) 展到將PEG加到其他氨基酸上)，其能夠被進(jìn)一步反應(yīng)以形成行為像具有大得多的分子量的線性mPEG —樣的分枝結(jié)構(gòu)(Kozlowski等人，(2001) ,Biodrugs 15,419-429) 可用于共 價(jià)結(jié)合 PEG 分子到多肽的方法在 Roberts 等人，(2002)Adv Drug Deliv Rev，54，459-476、 Bhadra等人，(2002) Pharmazie 57，5_29、Kozlowski 等人，(2001) J Control Release 72， 217-224和Veronese (2001) Biomaterials 22，405-417以及在此提及的參考文獻(xiàn)中被進(jìn)一
步公開。PEG化本發(fā)明的多肽或模擬肽化合物的優(yōu)點(diǎn)包括降低腎清除率，對(duì)于某些產(chǎn)物， PEG化導(dǎo)致了給藥后的更持久的吸附以及受限的分布，可能引起更恒定和持久的血漿濃度 并因此增加了臨床功效(Harris 等人，(2001)Clin Pharmacokinet 40,539-551) 其他優(yōu) 點(diǎn)能包括降低治療化合物的免疫原性(Reddy，(2001)Ann Pharmacother 34，915-923)和較 低的毒性(Kozlowski 等人，(2001), Biodrugs 15,419-429) 膜聯(lián)蛋白A5的功能類似物或變體可以是包含膜聯(lián)蛋白A5或其變體的序列的融合 蛋白。因此，例如，膜聯(lián)蛋白A5或其變體能融合到一個(gè)或更多個(gè)融合配偶體多肽序列以延 長(zhǎng)分子在患者循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)的半壽期和/或向分子加入其他功能性。
膜聯(lián)蛋白A5的“功能”類似物或變體能結(jié)合到生物膜上的磷酯酰絲氨酸，優(yōu)選 在相同條件下達(dá)到人膜聯(lián)蛋白A5 (SEQ ID NO :1)所顯示出的至少10%、20%、30%、40%、 50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或大約100%的水平。測(cè)量膜聯(lián)蛋白A5結(jié)合到 生物膜上的磷脂酰絲氨酸的合適方法是本領(lǐng)域已知的(Vermes，I.，等人，A novelassay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserineexpression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. JImmunol Methods, 1995. 184(1) :p. 39-51)。當(dāng)在相同(即等摩爾的)劑量下用于根據(jù)本發(fā)明第一方面預(yù)防或治療再狹窄時(shí)， 膜聯(lián)蛋白A5的“功能”類似物或變體可額外地或另外可選地具有人膜聯(lián)蛋白A5(SEQ ID NO 1)治療活性的至少 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或大約 100%。在該上下文中，與人膜聯(lián)蛋白A5(SEQ ID NO 1)相比的膜聯(lián)蛋白A5的“功能”類似 物或變體的治療活性可通過以下確定通過比較等摩爾量的功能類似物或變體和人膜聯(lián)蛋 白A5治療或提供預(yù)防如上所述的再狹窄的能力，和/或通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，如通過使用在下述 實(shí)施例中展示的方法學(xué)。一個(gè)合適的試驗(yàn)如下1、在外科手術(shù)前將Ap0E*3Leiden小鼠用輕度高膽固醇的 膳食喂養(yǎng)3周；2、在外科手術(shù)前一天及操作的剩余時(shí)間里，通過腹膜內(nèi)注射lmg/kg bw/天 的膜聯(lián)蛋白A5或等摩爾量的膜聯(lián)蛋白A5功能類似物或變體或單獨(dú)的載體治療小鼠；3、將 非壓縮性的細(xì)孔聚乙烯管套在(cuff)股靜脈上；4、在置入袖套(cuff)后三天處死小鼠并 檢查動(dòng)脈損傷內(nèi)的血管組成。5、比較用膜聯(lián)蛋白A5治療的小鼠和那些用膜聯(lián)蛋白A5的 功能類似物或變體治療的小鼠以及未治療小鼠中獲得的結(jié)果。相關(guān)的參數(shù)是與未治療組 相比，用膜聯(lián)蛋白A5類似物或變體治療以降低結(jié)合到內(nèi)皮的可辨認(rèn)為白細(xì)胞的細(xì)胞的百 分比的能力；與未治療組相比，用膜聯(lián)蛋白A5類似物或變體治療以降低中膜內(nèi)的可辨認(rèn)為 白細(xì)胞的細(xì)胞百分比的能力。在任一種情況中，膜聯(lián)蛋白A 5類似物或變體在降低任一種 這些效應(yīng)或這兩種效應(yīng)中具有至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、 95%、99%或大約100%的膜聯(lián)蛋白A5的功效。另一個(gè)合適的試驗(yàn)如下1、在外科手術(shù)前將Ap0E*3Leiden小鼠用高脂肪膳食喂養(yǎng)3周；2、在外科手術(shù)前一天或外科手術(shù)當(dāng)天及操作的剩余時(shí)間里，通過腹膜內(nèi)注射Img/ kg bw/天的膜聯(lián)蛋白A5或等摩爾量的膜聯(lián)蛋白A5功能類似物或變體或單獨(dú)的載體治療小 鼠；3、將來源于同窩仔畜的下腔靜脈移植入頸總動(dòng)脈；4、在靜脈移植后28天處死小鼠并檢 查靜脈移植物的血管組成和尺寸。5、比較用膜聯(lián)蛋白A5治療的小鼠和那些用膜聯(lián)蛋白A5 的功能類似物或變體治療的小鼠以及未治療小鼠中獲得的結(jié)果。相關(guān)的參數(shù)是與未治療 組相比，用膜聯(lián)蛋白A5類似物或變體治療以降低靜脈移植物壁內(nèi)的白細(xì)胞數(shù)目的能力；與 未治療組相比，用膜聯(lián)蛋白A5類似物或變體治療以降低靜脈移植物加厚即縱向橫斷面的 新內(nèi)膜面積的能力。在任一種情況中，膜聯(lián)蛋白A 5類似物或變體在降低任一種這些效應(yīng) 或這兩種效應(yīng)中具有至少 10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,95%,99% 或大約100%的膜聯(lián)蛋白A5的功效。實(shí)施例包括了下述實(shí)施例以證實(shí)本發(fā)明的特定具體實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解， 實(shí)施例中公開的技術(shù)遵循了發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的代表性技術(shù)，其在實(shí)施本發(fā)明中作用良好，因此 能被認(rèn)為是組成了其實(shí)施的優(yōu)選方式。然而，按照本公開，本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，在沒有背 離本發(fā)明精神和范圍的情況下，在公開的特定具體實(shí)施方案中可作出許多改變且仍能獲得 一樣的或相似的結(jié)果。 實(shí)施例1 小鼠靜脈移植模型在CABG小鼠模型中是取自供體小鼠的靜脈移植物。在受體小鼠中，將頸動(dòng)脈從周 圍組織中分離出來，通過放置兩個(gè)動(dòng)脈夾阻斷血流。然后，將血管在兩個(gè)動(dòng)脈夾間橫斷，且 縫合靜脈移植物從而在兩個(gè)動(dòng)脈末端擬合。當(dāng)該操作結(jié)束時(shí)，移除夾子并恢復(fù)血流。該方 法的詳細(xì)描述已經(jīng)出版(Zou等人，1998)。4周后，在靜脈移植物中形成了新內(nèi)膜。在處死小鼠后用組織學(xué)方法測(cè)量了 新內(nèi)膜的尺寸。假如使用的小鼠是高脂血的(hyperlipidemic)，例如給予高脂肪膳 食的apoE (-/")小鼠或也給予高脂肪膳食的ap0E*3-Le i den小鼠，新內(nèi)膜發(fā)展將比正 常小鼠更快。在這樣小鼠中，病變可達(dá)到如此嚴(yán)重的狀態(tài)以至于人們能看到內(nèi)皮侵蝕 (endothelialerosion)、療塊內(nèi)出血(intraplaque haemorrhage)禾口傳才番的i正據(jù),艮口在 者 中能發(fā)生的相似后果。在小鼠靜脈移植物中的新內(nèi)膜的尺寸能被膜聯(lián)蛋白Α5的治療顯著減小。每日腹 膜內(nèi)注射Img膜聯(lián)蛋白A5/kg bw能至少降低20%的新內(nèi)膜，這顯示了治療的功效。實(shí)施例2 小鼠血管周袖套(cuff)模型置于小鼠股動(dòng)脈周的袖套(cuff)能導(dǎo)致新內(nèi)膜的快速發(fā)展。已經(jīng)將該模型用 作PCI導(dǎo)致的新內(nèi)膜形成的模型，且已經(jīng)將其用于評(píng)估抗再狹窄藥物的功效(Pires等人， 2006)。新內(nèi)膜病變含有平滑肌細(xì)胞，但也有循環(huán)的白細(xì)胞募集到病變處，特別是如果該操 作在高脂血小鼠中進(jìn)行。病變發(fā)展是迅速的，顯著的病變?cè)?周內(nèi)已經(jīng)可見。小鼠靜脈移植物中新內(nèi)膜的尺寸可被膜聯(lián)蛋白A5的治療顯著降低和/或連接到 內(nèi)皮和/或存在于中膜內(nèi)的可鑒定為白細(xì)胞的細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞)的總數(shù)目的百分比可被 顯著降低。每日腹膜內(nèi)注射Img膜聯(lián)蛋白A5/kg bw能降低至少20%的新內(nèi)膜，這顯示了治 療的功效?？偨Y(jié)。目的在于恢復(fù)通向缺血組織的正常血流的外科干預(yù)的不想要的影響是已經(jīng)用PCI擴(kuò)張的血管的再狹窄，或在用于繞過狹窄的動(dòng)脈區(qū)段的移植血管中的再狹窄。在再 狹窄動(dòng)物模型中，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)膜聯(lián)蛋白A5降低了再狹窄的發(fā)展。實(shí)施例3 小鼠血管周袖套模型_實(shí)驗(yàn)結(jié)果氣囊血管成形術(shù)(有支架植入或無支架植入)是用于恢復(fù)通向例如患有心絞痛或 心肌梗塞的患者缺血心肌的血流的常見方法。該操作引發(fā)了擴(kuò)張的血管區(qū)段內(nèi)的炎癥，其 可以導(dǎo)致再狹窄，即擴(kuò)張的血管區(qū)段由于所謂的新內(nèi)膜的發(fā)展變得再次狹窄。假如支架未 置于擴(kuò)張的血管區(qū)段內(nèi)，該現(xiàn)象可導(dǎo)致多達(dá)30 50%的患者在3-12個(gè)月內(nèi)需要重復(fù)血管 形成操作。裸露金屬支架能降低再狹窄率，但仍有多達(dá)15 30%在3-12個(gè)月內(nèi)仍需要血 管再形成。在小鼠股動(dòng)脈周圍放置血管周塑料袖套是炎癥驅(qū)動(dòng)的新內(nèi)膜形成的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，?其是再狹窄模型。我們?cè)谠撃Ｐ椭袦y(cè)試了膜聯(lián)蛋白A5是否能影響新內(nèi)膜形成。 鐘在實(shí)驗(yàn)操作前將雄性Ap0E*3Leiden小鼠飼以輕度高膽固醇膳食3周，其持續(xù)到實(shí) 驗(yàn)周期結(jié)束。在外科手術(shù)前一天，根據(jù)血漿膽固醇、甘油三酯水平和體重將小鼠隨機(jī)分到治 療組之一。在放置袖套前一天開始用lmg/kg bw/天的膜聯(lián)蛋白A5(腹膜內(nèi)注射)進(jìn)行治 療并在實(shí)驗(yàn)期間內(nèi)每天持續(xù)進(jìn)行。在第0天進(jìn)行手術(shù)，S卩，將非壓縮性的袖套置于小鼠的每 條股動(dòng)脈周圍。在放置袖套后3天處死小鼠。袖套放置的外科手術(shù)操作在外科手術(shù)前通過腹膜內(nèi)給予咪達(dá)唑侖(5mg/kg，Roche, Woerden，荷蘭)、美托咪 定(0. 5mg/kg, Orion, Espoo，芬蘭)和芬太尼(0. 05mg/kg, Janssen, Berchem,比利時(shí))的 組合物將小鼠進(jìn)行麻醉。該麻醉藥的混合物給出了至少1個(gè)小時(shí)的完全麻醉。在剃掉雙腿 的內(nèi)側(cè)毛和用乙醇(70% )消毒外科手術(shù)區(qū)域后，在腿內(nèi)側(cè)開一縱向Icm的切口。然后，將 3mm長(zhǎng)度的股動(dòng)脈從骨神經(jīng)和股靜脈分離開來。使用仔細(xì)操作動(dòng)脈的6/0絲質(zhì)結(jié)扎線(0.7 米B/BRAUN，Tuttlingen，德國)將股動(dòng)脈扎成環(huán)狀。將非壓縮性細(xì)孔聚乙烯管(Portex， Kent, UK ；0. 40mm內(nèi)徑，0. 80mm外徑和大約2mm的長(zhǎng)度)縱向開口并寬松的套在股動(dòng)脈周 圍。用兩個(gè)6/0絲質(zhì)結(jié)扎線結(jié)將袖套合起來。用連續(xù)的縫線將皮膚閉合。在外科手術(shù)后， 用阿替美唑(Atipamezol)和氟馬西尼皮下拮抗麻醉。將動(dòng)物置于加熱板上的清潔籠子里 至少4小時(shí)。處死動(dòng)物為了進(jìn)行組織分析，在放置袖套后3天處死動(dòng)物。在麻醉(咪達(dá)唑侖/美托咪定/ 芬太尼)和取血樣后，開胸并利用左心室內(nèi)的心臟穿刺用溶于磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)內(nèi)的 3. 7% 甲酸(wt/vol)進(jìn)行弱壓灌注(mild pressure-perfusion) (IOOmmHg) 5 分鐘。在灌注 后，收集帶上袖套的股動(dòng)脈，在溶于PBS的3.7%甲醛(wt/vol)中過夜固定并石蠟包埋。從 完整長(zhǎng)度的帶上袖套的股動(dòng)脈區(qū)段取連續(xù)的橫斷面(5-μπι厚)以進(jìn)行組織學(xué)分析。取血樣將血從尾(外科手術(shù)前一天隨機(jī)取)或從腔靜脈(處死)收集在K2EDTA毛細(xì)管 (Microvette, Sarstedt，德國)中。將毛細(xì)管在4°C放置半小時(shí)，然后在冷卻到4°C的離心 機(jī)中以6000RPM(1200G)離心10分鐘。隨后等分血漿用于進(jìn)一步的分析。在處死時(shí)，將血 漿等分在1.5ml的聚丙烯管(Eppendorf)內(nèi)，一份20 μ 1的樣品用于膽固醇和甘油三酯分析，剩余的血漿用于儲(chǔ)備分析。樣品儲(chǔ)存于-80°C。測(cè)定外科手術(shù)前一天和處死時(shí)取的血漿樣品內(nèi)的膽固醇和總甘油三酯水平。用 試劑盒1489437 (Roche Diagnostics, Almere，荷蘭)酶法測(cè)定總血漿膽固醇，用試劑盒 148872 (Roche Diagnostics，Almere，荷蘭)測(cè)定總甘油三酯濃度。血管組成 用關(guān)于下述套上袖套的股動(dòng)脈中的細(xì)胞數(shù)目的免疫細(xì)胞化學(xué)和組織形態(tài)測(cè)定術(shù) 分析血管組成白細(xì)胞(抗⑶45抗體，稀釋度1 200，Pharmingen, San Diego，美國)、 單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞(ΑΙΑ 31240巨噬細(xì)胞，染色稀釋度1 3000, Accurate Chemical, Wesbury，美國)及表達(dá)腫瘤壞死因子α (腫瘤壞死因子α，染色稀釋度1 200， Bi0Legend，SanDieg0，CA，美國)和單核細(xì)胞趨化蛋白1(單核細(xì)胞趨化蛋白1，染色稀釋度 1 100，Santa Cruz Biotechnology, Inc.，Santa Cruz, CA，美國)的細(xì)胞。MM套上袖套的股動(dòng)脈病變的血管組成與載體組(34. 2士3.0%)相比，在重組人膜聯(lián)蛋白A5治療組中，粘到內(nèi)皮的鑒定 為白細(xì)胞的細(xì)胞總數(shù)目的百分比被顯著降低了 71. 3% (ρ = 0.015)到9. 69士8.9%。與載 體組(19. 55士4. 6%)相比，在重組人膜聯(lián)蛋白A5治療組中，在中膜內(nèi)的鑒定為白細(xì)胞的細(xì) 胞總數(shù)目的百分比被顯著降低了 69. 0% - (ρ = 0. 031)到6. 1 士2. 6% (圖1)。單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞與載體組(24. 5士3. 5% )相比，在重組人膜聯(lián)蛋白A5治療組中，粘到內(nèi)皮的鑒定 為巨噬細(xì)胞的細(xì)胞總數(shù)目的百分比被顯著降低了 51.4% (ρ = 0.014)到11. 9士2.3%。與 載體組(14. 2士5. 5% )相比，在重組人膜聯(lián)蛋白A5治療組中，在中膜內(nèi)的鑒定為巨噬細(xì)胞 的細(xì)胞總數(shù)目的百分比被顯著降低了 87. 3% (ρ = 0.018)到1.8士0.9% (圖2)。與載體組(49. 1 士2. 2% )相比，在重組人膜聯(lián)蛋白A5治療組中，粘到內(nèi)皮的鑒定 為表達(dá)MCP-I的細(xì)胞如炎性細(xì)胞和SMC的細(xì)胞總數(shù)目的百分比被顯著降低了 31. 0% (ρ = 0.003)到33. 9士3. 1%。與載體組(31. 1 士 1.8% )相比，在重組人膜聯(lián)蛋白A5治療組中， 在中膜內(nèi)的鑒定為表達(dá)MCP-I的細(xì)胞的細(xì)胞總數(shù)目的百分比被顯著降低了 52.7% (ρ = 0. 001)到14. 7士2. 8% (圖3)。與對(duì)照組相比，治療組中表達(dá)TNFa的細(xì)胞數(shù)也被顯著降 低。Mrk這些實(shí)驗(yàn)清楚地證實(shí)了膜聯(lián)蛋白A5在該炎癥驅(qū)動(dòng)的血管疾病模型中的抗炎功 效。炎癥(以血管壁內(nèi)白細(xì)胞的積累進(jìn)行測(cè)定)被膜聯(lián)蛋白A5的治療顯著抑制。此外，膜 聯(lián)蛋白A5也能顯著降低被激活的炎癥細(xì)胞的數(shù)目，因?yàn)楹苌俚募?xì)胞對(duì)促炎癥反應(yīng)的細(xì)胞 因子MCP-I染色呈陽性。結(jié)果強(qiáng)力地支持膜聯(lián)蛋白A5是預(yù)防氣囊血管成形術(shù)(有支架置 入或無支架置入)后的再狹窄的有效治療方法。實(shí)施例4 小鼠靜脈移植模型-實(shí)驗(yàn)結(jié)果靜脈移植術(shù)、狹窄血管區(qū)段的旁通術(shù)是恢復(fù)通向缺血器官的血流的方法。最常見 的應(yīng)用為置入所謂的冠狀動(dòng)脈旁路移植物(CABG)?，F(xiàn)在，該操作對(duì)于恢復(fù)通向患者中缺 血心肌的血流是常見的，其中狹窄的位置不適合于基于導(dǎo)管的介入術(shù)。當(dāng)將靜脈移植物置 于動(dòng)脈循環(huán)中時(shí)，其形態(tài)將接受(adopt)動(dòng)脈循環(huán)中的較高血壓和血流速率。盡管該操作是有效的，并已經(jīng)挽救了許多患有冠狀動(dòng)脈心臟病的個(gè)體，但伴隨有再狹窄的風(fēng)險(xiǎn)，再狹窄 是其中移植的靜脈發(fā)展了將堵塞血流的新內(nèi)膜的過程。我們研究了膜聯(lián)蛋白A5能否影響 CABG小鼠模型中新內(nèi)膜的形成。在持續(xù)了 28天的該實(shí)驗(yàn)中，我們使用了人膜聯(lián)蛋白A5和 鼠膜聯(lián)蛋白A5 二者。這是因?yàn)槿说鞍踪|(zhì)可能在小鼠中引起可能掩蓋最終治療效果的非特 異性免疫反應(yīng)。鐘雄性ApoE*3 Leiden小鼠飼以富膽固醇高脂肪膳食以誘導(dǎo)高膽固醇血癥。該膳食 含有0. 05%膽酸鹽(為了改善腸膽固醇攝取并抑制膽汁酸合成，二者均導(dǎo)致增加的血漿膽 固醇水平)和的膽固醇(以及20%的酪蛋白、的氯化膽堿、0.2%的甲硫氨酸、15% 的可可脂、40. 5%的蔗糖、10%玉蜀黍淀粉、的玉米油、5. 的纖維素和5. 礦物質(zhì)混 合物)。它們?cè)谕饪剖中g(shù)前接受該膳食3周并且該膳食在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中貫穿始終。給予小鼠 用HCl酸化到pH 2. 8的飲用水。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中所有動(dòng)物均無限制接受食物和水。jtiX 在該研究中，用三個(gè)不同的治療組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。組如下_對(duì)照組，僅接受載體(磷酸鹽緩沖鹽水(PBS))并經(jīng)歷靜脈移植外科手術(shù)。-治療組I，經(jīng)歷靜脈移植外科手術(shù)并以lmg/kg/天的濃度經(jīng)由腹膜內(nèi)注射接受重 組人膜聯(lián)蛋白A5，在外科手術(shù)當(dāng)天開始。-治療組II，經(jīng)歷靜脈移植外科手術(shù)并以lmg/kg/天的濃度經(jīng)由腹膜內(nèi)注射接受 重組鼠膜聯(lián)蛋白A5，在外科手術(shù)當(dāng)天開始。靜脈移植術(shù)的外科手術(shù)操作在外科手術(shù)前通過腹膜內(nèi)給予咪達(dá)唑侖、美托咪定和芬太尼的組合物以將小鼠進(jìn) 行麻醉。該麻醉藥的混合物給出了至少1個(gè)小時(shí)的完全麻醉。在剃掉頸部區(qū)域的毛和用醇 (70%)消毒外科手術(shù)區(qū)域后，在頸部的前側(cè)開一縱向Icm的切口。將右總頸動(dòng)脈從朝向近 端的遠(yuǎn)端二根分叉部從其周圍組織分離開來。用8.0絲質(zhì)結(jié)扎線(B/BRAUN，Tuttlingen, 德國)將血管結(jié)扎兩次并在中間節(jié)間切開。將袖套置于兩個(gè)末端之上，然后這些被翻卷在 袖套之上并用8.0絲質(zhì)結(jié)扎線結(jié)扎。同窩仔畜用作下腔靜脈供體。仔細(xì)收集的下腔靜脈暫 時(shí)保存在4°C的含有100U/ml肝素的0. 9%的NaCl溶液中，以阻止凝固，并插入在動(dòng)脈末端 之間。用8.0絲質(zhì)縫線將連接物捆在一起。脈搏確證了成功的植入。在外科手術(shù)后，用阿 替美唑(2. 5mg/kg，Roche，Woerden，荷蘭)和氟馬西尼(0. 5mg/kg Orion，Espoo，芬蘭)皮 下拮抗麻醉。將動(dòng)物置于加熱板上的清潔籠子里至少4小時(shí)。處死動(dòng)物如實(shí)施例3中所述進(jìn)行處死，不同的是收集、固定、切片和染色靜脈移植物而不是 帶上袖套的動(dòng)脈。取血樣如實(shí)施例3中所述進(jìn)行取血樣和膽固醇及總甘油三酯的分析。靜脈移植物變厚分析通過使用6片靜脈移植物的等間距垂直切割連續(xù)切片定量靜脈移植物的加厚。白細(xì)胞利用免疫細(xì)胞化學(xué)和組織形態(tài)測(cè)定術(shù)分析血管組成。通過與抗⑶45抗體(Pharmingen,San Diego，美國)的反應(yīng)性鑒定白細(xì)胞并以每高倍視野的陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行定量。MM靜脈移棺物加厚為 了研究膜聯(lián)蛋白A5在動(dòng)脈移植物變厚中的作用，向不同的組(每組n = 10只 小鼠)每日經(jīng)由腹膜內(nèi)注射給予重組人或鼠膜聯(lián)蛋白A5(lmg/kg，溶于150μ1載體)。僅 有載體的組用作對(duì)照組(n = 10只小鼠)。通過測(cè)量管腔和外膜間的面積定量每一個(gè)組在 外科手術(shù)后28天的平均靜脈移植物變厚。與載體組(0.25士0.05mm2)相比，在重組人和鼠 膜聯(lián)蛋白A5治療組中，靜脈移植物變厚被顯著地降低了 48%到0. 13 士0. Olmm2 (ρ = 0. 006) 和降低了 40%到 0. 15士0. Olmm2(ρ = 0. 018)(圖 4)。與載體組(0.38士0. 03mm2)比較，在重組人(0. 44士0. 03mm2, ρ = 0. 126)和鼠 (0. 41 士0. 04mm2, ρ = 0. 886)膜聯(lián)蛋白Α5治療組內(nèi)看到了更大的管腔面積。白細(xì)胞靜脈壁中的白細(xì)胞數(shù)目在28天后進(jìn)行計(jì)數(shù)，作為炎癥的標(biāo)記，與載體組 (53. 1 士6. 1細(xì)胞)相比較，在重組人膜聯(lián)蛋白Α5治療組中顯著降低了白細(xì)胞數(shù)目45. 8% (28. 8士2. 3細(xì)胞，ρ = 0. 003)和在重組鼠膜聯(lián)蛋白Α5治療組中顯著降低了白細(xì)胞數(shù)目 41. 8% (30. 9士3. 0 細(xì)胞，ρ = 0. 025)(圖 5)。Mrk靜脈移植物中新內(nèi)膜的快速發(fā)展是導(dǎo)致再狹窄的臨床問題，即移植的靜脈管腔變 小且血流受限。該研究清楚顯示了使用人或鼠膜聯(lián)蛋白Α5的膜聯(lián)蛋白Α5治療有效降低了 靜脈移植物中的新內(nèi)膜生長(zhǎng)，并預(yù)防了管腔變窄。新內(nèi)膜的快速發(fā)展是炎癥驅(qū)動(dòng)的過程，膜 聯(lián)蛋白Α5的有益效果可能與治療的抗炎效果有關(guān)(以移植物中白細(xì)胞積累的減少可見，及 如實(shí)施例3中所示)。人和鼠膜聯(lián)蛋白Α5均產(chǎn)生了相似的結(jié)果，這表明人膜聯(lián)蛋白Α5沒 有引發(fā)小鼠中任何可能已經(jīng)掩蓋治療效果的非特異性免疫反應(yīng)。該結(jié)果強(qiáng)烈支持膜聯(lián)蛋白 Α5是預(yù)防靜脈移植物再狹窄的有效治療。此處所公開和要求保護(hù)的所有組合物和/或方法均可根據(jù)本公開在沒有進(jìn)行過 度實(shí)驗(yàn)的情況下進(jìn)行制備和執(zhí)行。盡管本發(fā)明的組合物和方法已經(jīng)根據(jù)優(yōu)選的具體實(shí)施方 案進(jìn)行了描述，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，可以在沒有背離本發(fā)明的概念、精神和范 圍的情況下改變組合物和/或方法及此處描述的方法的步驟或步驟的順序。更具體地，明 顯地，在化學(xué)上和生理上都相關(guān)的某些試劑可以替換此處描述的試劑而仍能獲得相同或相 似的結(jié)果。所有這樣的對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的相似替換和修改均視為落入如隨附 的權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的精神、范圍和概念內(nèi)。參考文獻(xiàn)通過引用具體地將下述參考文獻(xiàn)并入此處，引用的程度為他們提供了范例性操作 或其他對(duì)本文所示那些做出補(bǔ)充的細(xì)節(jié)PCT Appln. 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權(quán)利要求
一種預(yù)防或治療再狹窄的方法，包含給予需要這樣的治療的患者治療有效量的膜聯(lián)蛋白A5或其功能類似物或變體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中再狹窄與旁路移植術(shù)有關(guān)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中再狹窄與基于導(dǎo)管的介入術(shù)有關(guān)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1到3任一項(xiàng)所述的方法，其中再狹窄與植入支架有關(guān)。
5.一種治療患者中再狹窄的方法，包含進(jìn)行用于治療狹窄的介入術(shù)與給予治療有效量 的膜聯(lián)蛋白A5或其功能類似物或變體聯(lián)合。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中用于治療狹窄的介入術(shù)是外科手術(shù)干預(yù)，如旁路 移植術(shù)。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中用于治療狹窄的介入術(shù)是基于導(dǎo)管的介入術(shù)，如 有支架植入或無支架植入及進(jìn)行或未進(jìn)行動(dòng)脈粥樣硬化斑塊切除術(shù)的氣囊血管成形術(shù)。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中以胃腸外、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌 內(nèi)、皮下的方式給予治療有效量的膜聯(lián)蛋白A5或其功能類似物或變體或從藥物洗脫支架 局部給予治療有效量的膜聯(lián)蛋白A5或其功能類似物或變體。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中膜聯(lián)蛋白A5或其功能類似物或變體與 溶血栓治療劑如阿司匹林、氯吡格雷、噻氯匹定、組織型纖溶酶原激活物、尿激酶或細(xì)菌酶 聯(lián)合給予。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中膜聯(lián)蛋白A5或其功能類似物或變體選自a)人膜聯(lián)蛋白A5 (SEQ ID NO 1)；b)人膜聯(lián)蛋白A5的哺乳動(dòng)物直系同源物；c)a)或b)的等位基因變體或遺傳變體；d)膜聯(lián)蛋白的功能類似物，其是與人膜聯(lián)蛋白A5，SEQID NO 1具有50%以上，75%以 上，如80%以上，90%以上，或甚至更優(yōu)選95%以上的同一性的蛋白質(zhì)；e)a)、b)、c)或d)任一項(xiàng)的二聚體或包含a)、b)、c)或d)任一項(xiàng)的融合蛋白；及f)a)、b)、c)、d)或e)任一項(xiàng)的PEG化的變體。
11.一種包含用于預(yù)防或治療再狹窄的治療有效量的膜聯(lián)蛋白A5或其功能類似物或 變體的藥物組合物。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的藥物組合物，預(yù)期用于胃腸外、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌 內(nèi)或皮下給藥或從藥物洗脫支架局部給藥。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或12所述的藥物組合物，其中膜聯(lián)蛋白A5或其功能類似物或變 體選自a)人膜聯(lián)蛋白A5 (SEQ ID NO 1)；b)人膜聯(lián)蛋白A5的哺乳動(dòng)物直系同源物；c)a)或b)的等位基因變體或遺傳變體；d)膜聯(lián)蛋白的功能類似物，其是與人膜聯(lián)蛋白A5，SEQID NO :1具有50%以上，75%以 上，如80%以上，90%以上，或甚至更優(yōu)選95%以上的同一性的蛋白質(zhì)；e)a)、b)、c)或d)任一項(xiàng)的二聚體或包含a)、b)、c)或d)任一項(xiàng)的融合蛋白；及f)a)、b)、c)、d)或e)任一項(xiàng)的PEG化的變體。
14.一種藥物洗脫支架，其中藥物是膜聯(lián)蛋白A5或其功能類似物或變體。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的藥物洗脫支架，其中膜聯(lián)蛋白A5或其功能類似物或變體選自a)人膜聯(lián)蛋白A5 (SEQ ID NO 1)；b)人膜聯(lián)蛋白A5的哺乳動(dòng)物直系同源物；c)a)或b)的等位基因變體或遺傳變體；d)膜聯(lián)蛋白的功能類似物，其是與人膜聯(lián)蛋白A5，SEQID NO :1具有50%以上，75%以 上，如80%以上，90%以上，或甚至更優(yōu)選95%以上的同一性的蛋白質(zhì)；e)a)、b)、c)或d)任一項(xiàng)的二聚體或包含a)、b)、c)或d)任一項(xiàng)的融合蛋白；及f)a)、b)、c)、d)或e)任一項(xiàng)的PEG化的變體。
16.一種制備用于遞送膜聯(lián)蛋白A5或其功能類似物或變體到患者的支架的方法，該方 法包含將膜聯(lián)蛋白A5或其功能類似物或變體整合在支架體內(nèi)或支架體之上。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，該方法包含a)提供具有表面的支架體；及b)在所述表面的至少一個(gè)部分上應(yīng)用涂層，其中所述涂層包含膜聯(lián)蛋白A5或其功能 類似物或變體。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，該方法包括從包含聚合物及膜聯(lián)蛋白A5或其功能類 似物或變體的組合物塑造支架。
19.根據(jù)權(quán)利要求16、17或18任一項(xiàng)所述的方法，其中膜聯(lián)蛋白A5或其功能類似物或 變體選自a)人膜聯(lián)蛋白A5 (SEQ ID NO 1)；b)人膜聯(lián)蛋白A5的哺乳動(dòng)物直系同源物；c)a)或b)的等位基因變體或遺傳變體；d)膜聯(lián)蛋白的功能類似物，其是與人膜聯(lián)蛋白A5，SEQID NO :1具有50%以上，75%以 上，如80%以上，90%以上，或甚至更優(yōu)選95%以上的同一性的蛋白質(zhì)；e)a)、b)、c)或d)任一項(xiàng)的二聚體或包含a)、b)、c)或d)任一項(xiàng)的融合蛋白；及f)a)、b)、c)、d)或e)任一項(xiàng)的PEG化的變體。
全文摘要
一種預(yù)防或治療再狹窄的方法，包含給予需要這樣的治療的患者治療有效量的膜聯(lián)蛋白A5或其功能類似物或變體。一種治療患者中狹窄的方法，包含進(jìn)行用于治療狹窄的介入術(shù)聯(lián)合給予治療有效量的膜聯(lián)蛋白A5或其功能類似物或變體。一種包含用于預(yù)防或治療再狹窄的治療有效量的膜聯(lián)蛋白A5或其功能類似物或變體的藥物組合物。一種藥物洗脫支架，其中藥物是膜聯(lián)蛋白A5或其功能類似物或變體，及制備這樣的支架的方法。
文檔編號(hào)A61K38/17GK101969978SQ200980105834
公開日2011年2月9日 申請(qǐng)日期2009年2月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月22日
發(fā)明者J·菲羅斯特加德, K·彼得松, O·坎貝爾 申請(qǐng)人:阿瑟拉生物技術(shù)公司