專利名稱：調(diào)節(jié)性t細胞及它們在免疫治療和抑制自身免疫反應(yīng)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)性T細胞和長期、培養(yǎng)擴增、活化以及在免疫治療和抑制免疫反應(yīng)(包括移植物抗宿主疾病，GVHD)中使用該細胞的方法。
背景技術(shù)：
長期以來，抑制細胞被認為在癌癥發(fā)展中起作用(Dye等人，J.Exp.Med.1541033-1042(1981))。事實上，T調(diào)節(jié)細胞的活性抑制作用在下調(diào)T細胞對外源和自身抗原反應(yīng)中起著重要的作用。
T細胞是一類淋巴細胞，具有以基因重排結(jié)果而形成的特異性T細胞受體(TCR)。T細胞具有各種作用，由T細胞不同亞基的分化來完成，可由基因表達的分離模式來識別。幾種主要T細胞亞基是基于受體表達而被識別，如TCR-α/β、TCRγ/Δ和未變異的自然殺傷細胞。其他T細胞亞基由表面分子和其分泌的細胞因子來確定。例如，T輔助細胞(CD4細胞)分泌細胞因子，幫助B細胞和細胞毒性T細胞來存活并實現(xiàn)效應(yīng)因子作用。細胞毒性T細胞(CTL)通常是CD8細胞，它們專門殺傷靶細胞，如感染細胞或腫瘤細胞。自然殺傷(NK)細胞涉及T細胞，盡管它們與T細胞共有某些功能并能夠分泌細胞因子并殺傷某些種類的靶細胞，但是它們沒有T細胞受體(TCR)，且生命期短。
人和鼠的外周血液包含小量的T淋巴細胞，表現(xiàn)為T調(diào)節(jié)性表型(“Treg”)，即，對CD4和CD25抗原都呈陽性(即，那些CD4+T細胞也明顯對CD25呈陽性)。該細胞首先在小鼠中得到鑒定，構(gòu)成淋巴結(jié)和脾臟CD4+T細胞數(shù)量的6-10％，這個數(shù)量的CD4+CD25+細胞大約只是人外周血液單核細胞(PBMC)的5-10％，或是CD4+T細胞的2-7％，盡管一些供體表現(xiàn)出更加不同的CD4+和CD25+細胞數(shù)量。大約有1-2％的人外周血液PBMC同時是CD4陽性(CD4+)和CD25陽性(CD25+)的細胞。
有幾種Treg細胞的亞基(Bluestone等人，Nature Rev.Immunol.3253(2003))。調(diào)節(jié)細胞的一種亞基形成于胸腺。胸腺衍生的Treg細胞功能是通過一種細胞因子非依賴性的機制，涉及細胞與細胞的接觸(Shevach，Nature Rev.Immunol 2389(2002))。它們對自身耐受性的誘導(dǎo)和維持以及對自身免疫的預(yù)防來說是必需的(Shevach，Annu.Rev.Immunol.18423-449(2000)；Stephens等人，2001；Taams等人，2001；Thornton等人，1998；Salomon等人，Immunity 12431-440(2000)；Sakaguchi等人，Immunol.Rev.18218-32(2001))。這些專門的調(diào)節(jié)細胞防止那些逃過胸腺清除的自身反應(yīng)性T細胞的活化和繁殖或者識別胸腺外抗原，因而它們對內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和免疫調(diào)節(jié)是至關(guān)重要的，同時也保護宿主抵制自身免疫的發(fā)展(Suri-Payer等人，J.Immunol.1571799-1805(1996)；Asano等人，J.Exp.Med.184387-396(1996)；Bonomo等人，J.Immunol.1546602-6611(1995)；Willerford等人，Immunity 3521-530(1995)；Takahashi等人，Int.Immunol.101969-1980(1998)；Salomon等人，Immunity 12431-440(2000)；Read等人，J.Exp.Med.192295-302(2000))。因此，免疫調(diào)節(jié)性CD4+CD25+T細胞經(jīng)常被稱為“專業(yè)抑制細胞”。
但是，Treg細胞也能通過成熟的外周CD4+T細胞的活化而生成。研究表明外周衍生Treg細胞通過生成免疫抑制性細胞因子來介導(dǎo)其抑制活性，如轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)和IL-10(Kingsley等人，J.Immunol.1681080(2002)；Nakamura等人，J.Exp.Med.194629-644(2001))。抗原特異性活化之后，這些Treg細胞能夠非特異性的抑制CD4+或CD25+T細胞的增殖(Baecher-Allan等人在小劑量固定的抗CD3mAb基共培養(yǎng)抑制試驗中通過FACS分類證實，J.Immunol.167(3)1245-1253(2001))。
研究表明，當與自身抗原呈遞細胞(APC)共培養(yǎng)，但只通過直接接觸的方式時，CD4+CD25+細胞能夠抑制T細胞的抗CD3刺激(Stephens等人，Eur.J.Immunol.311247-1254(2001)；Taams等人，Eur.J.Immunol.311122-1131(2001)；Thornton等人，J.Exp.Med.188287-296(1998))。但是，小鼠體內(nèi)的這種抑制作用不能克服固定化的抗CD3或抗CD3/CD28的直接T細胞刺激(Thornton等人，1998)。之前的報道中，從外周血液分離的人CD4+CD25+T細胞需要預(yù)活化來表現(xiàn)其抑制特性，由于調(diào)節(jié)細胞的直接培養(yǎng)物一般不足以介導(dǎo)抑制作用(Dieckmann等人，J.Exp.Med.1931303-1310(2001))。其他人也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，人CD4+CD25+T細胞的抑制特性是活化依賴性的，而非抗原特異性(Jonuleit等人，J.Exp.Med.1931285-1294(2001)；Levings等人.，J.Exp.Med.193(11)1295-1302(2001)；Yamagiwa等人，J.Immunol.1667282-7289(2001))，并證明了細胞內(nèi)存在的細胞毒性T淋巴細胞抗原-4(CTLA-4)的組成性表達(Jonuleit等人，2001；Read等人，J.Exp.Med.192295-302(2000)；Yamagiwa等人，2001；Takahashi等人，J.Exp.Med.192303-310(2000))。另外，在T細胞受體介導(dǎo)的刺激后，CD4+CD25+T細胞抑制了由同種抗原和分裂素對原始CD4+CD25+T細胞的活化(Jonuleit等人，2001)。
鼠和人的Treg細胞都表達CTLA-4，但是，CTLA-4在耐受誘導(dǎo)中的作用以及它賦予調(diào)節(jié)性CD4+CD25+T細胞抑制功能的能力還存在爭議。CTLA-4(已知為CD152)是CD28的同系物，是CD80和CD86配基的一個受體。CTLA-4以一種抗原及TCR依賴的方式抑制T細胞反應(yīng)。CTLA-4功能受損的T細胞具有增強的繁殖和細胞因子生成能力。相反，提高的CTLA-4功能在體外和體內(nèi)導(dǎo)致細胞因子分泌的抑制和細胞周期進程的損傷。在鼠中，Treg細胞的抑制功能不需要CTLA-4，這與人體中需要的情況正好相反。這可以通過最近的發(fā)現(xiàn)得到一些解釋，發(fā)現(xiàn)存在多種形式的CTLA-4，并在鼠和人之間有所不同。
最近的一項研究也表明Treg細胞在體內(nèi)廣泛生長(Tang，J.Immunol.1713348(2003))，而其他研究表明治療性癌癥疫苗的功效可以通過去除CD4+CD25+T細胞而得到提高(Sutmuller等人.，J.Exp.Med.194823-832(2001))。研究還表明調(diào)節(jié)細胞的清除在不同于無反應(yīng)動物中引起了提高的腫瘤特異性免疫反應(yīng)和腫瘤消除(Onizuka等人.，Cancer Res.593128-3133(1999)；Shimizu等人.，J.Immunol.1635211-5218(1999))。通過新生期胸腺切除而致使CD4+CD25+缺陷的易感小鼠表現(xiàn)出廣譜的組織特異性自身免疫，可以通過在其10-14天時注入CD4+CD25+T細胞來預(yù)防(Suri-Payer等人，J.Immunol.1601212-1218(1998))。這項研究還發(fā)現(xiàn)，CD4+CD25+T細胞能夠抑制由自身抗原特異性T細胞克隆誘導(dǎo)的自身免疫。據(jù)報道，CD4+CD25-T細胞轉(zhuǎn)入裸小鼠還導(dǎo)致了自身免疫性疾病的發(fā)生，這可以通過CD4+CD25+T的共轉(zhuǎn)移來預(yù)防，利用首先消除了CD25+細胞的淋巴細胞(Sakaguchi等人，J.Immunol.1551151-1164(1995))。但是，數(shù)據(jù)還表明CD4+CD25+細胞的作用不限于自身耐受和自身免疫預(yù)防。幾項研究已經(jīng)說明了CD4+CD25+T細胞在同種反應(yīng)或移植中的作用，報道CD4+CD25+T細胞在體外和體內(nèi)都能預(yù)防同種移植排斥(Hara等人，J.Immunol.1663789-3796(2001)；Taylor等人，J.Exp.Med.1931311-1318(2001))。人T細胞繁殖的同種刺激也被CD4+CD25+T細胞阻斷(Yamagiwa等人，2001)，而Wood的實驗室已經(jīng)表明CD4+CD25+T細胞抑制混合淋巴細胞反應(yīng)(MLR)，但只適用于同種抗原通過間接的，而非直接的，同種識別途徑的情況(Hara等人，2001)。直接的抗原呈遞很可能發(fā)生于調(diào)節(jié)性T細胞和抗CD3/28刺激反應(yīng)T細胞之間，因為這類CD4+CD25+細胞是高度清除的專業(yè)APC。
該發(fā)明人已經(jīng)表明CD4+CD25+T細胞高比例存在于非小細胞肺癌(NSCLC)患者的腫瘤浸潤淋巴細胞中(Woo等人，Cancer Res.614766-4772(2001))，并且表明CD4+CD25+細胞對于通過共刺激阻斷進行的同種抗原耐受的體外誘導(dǎo)來說是必需的(Taylor等人，J.Exp.Med.1931311-1318(2001)。但是，大多數(shù)文獻說明免疫系統(tǒng)對外周實體腫瘤處于無知狀態(tài)，因而是無反應(yīng)性的(Ochsenbein，等人，Nature4111058-1064(2001)；Staveley-O′Carroll等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 951178-1183(1998))。解釋CD4+CD25+T細胞抑制自體和同種異體的T細胞繁殖的差異化能力是很復(fù)雜的。因此，CD4+CD25+T細胞在人腫瘤中的作用或在預(yù)防宿主產(chǎn)生對自體抗原(如腫瘤抗原)免疫反應(yīng)過程中的任何作用至今還是未知的。
文獻已經(jīng)報道了Treg在體外的再生障礙性(Sakaguchi，Ann.Rev.Immunol. 22531(2004))。Trenado等人提供了體外活化并擴增的CD4+CD25+調(diào)節(jié)細胞在一種體內(nèi)疾病動物模型中的治療效果的首次評價(Trenado等人，J.Clin.Invest.112(11)1688-1696(2002))。在那個環(huán)境下，體外活化并擴增的供體CD4+CD25+細胞的融合顯著抑制了快速致死GVHD，但是，這些數(shù)據(jù)只針對小鼠，而不是在人體中。另外，在確定實驗條件的鼠研究中，盡管新分離或培養(yǎng)的Treg細胞已經(jīng)能夠抑制GVHD，但是移植物抗白血病作用(GVL活性)被允許(Trenado等人，2002；Jones等人.，Biol.Blood Marrow Transplant9(4)243-256(2003)；Edinger等人，Nat.Med.9(9)1144-1150(2003))作為免疫重建(Trenado等人，2002)。
但是，人血液在組成上完全不同于鼠的血液，這意味著如果沒有多方面的實驗，鼠的研究不能轉(zhuǎn)變?yōu)槿思毎械牡葍r反應(yīng)。人血液含有記憶細胞(～50％)，可以是CD25暗淡細胞，并與CD4+CD25+抑制細胞群重疊，使Treg細胞非常難于純化。通過比較，CD25暗淡細胞只以最低量存在于嚙齒類動物，或者在幼小的無病原體的小鼠(大多數(shù)鼠研究中利用的條件)中完全不存在。人體中，基于CD25選擇的Treg純化(唯一已知的循環(huán)抑制細胞表面標志物，因為CTLA-4不是位于新生細胞的表面)導(dǎo)致了Treg細胞的富集，但這不足以完全純化。部分純化的抑制細胞可以暫時證明短期培養(yǎng)/活化后的抑制作用，但是這些細胞因染有常規(guī)T細胞而快速生長過度。
因此，還沒有報道與Trenado等人的發(fā)現(xiàn)相當?shù)年P(guān)于人類細胞的結(jié)果。那些顯示了CD4+CD25+細胞繁殖的公開報道沒能發(fā)現(xiàn)抑制功能，在本發(fā)明之前，沒有人能夠獲得人類Treg細胞的體外大量增殖，并同時保持GMP條件。只有一份在先公開描述了人類CD4+CD25+細胞的增殖(Levings等人，2001)。然而，在這篇文獻中，只有一張圖顯示了抑制功能，且只顯示了一種溫和的效果。抑制細胞與響應(yīng)細胞的比例為1∶1，只記錄有大約60％-65％的繁殖抑制作用，這要低于使用鼠Treg細胞所觀察到的一般效果。因此，該報道的抑制作用的強度是如此之小，以至于可能產(chǎn)生于非特異性作用(如，生長因子消耗、過度密集、來自抗原呈遞細胞的替換等等)。另外，該培養(yǎng)物只被Levings等人短期保持(只有14天)，這些細胞極可能是調(diào)節(jié)細胞和常規(guī)T細胞的混合培養(yǎng)物。
為培養(yǎng)Treg細胞，Leavings等人使用了JY淋巴樣干細胞(EBV病毒性轉(zhuǎn)化淋巴樣干細胞系)，用含有同種PBMC喂養(yǎng)細胞混合物的可溶性抗CD3(1μg/ml)培養(yǎng)。根據(jù)他們的報道，CD4+CD25+細胞的繁殖采用了兩步磁珠的實驗設(shè)計，其中，首先使用抗CD8、CD11b、CD16、CD19、CD36和CD56的抗體來清除非T細胞和CD8型T細胞，這使得到的產(chǎn)品不適合人體中醫(yī)療用途。然后，選擇CD25陽性細胞。
而且，雖然Leavings等人報道了90％純度的Treg細胞，但是沒有公開有關(guān)嚴格性(stringency)的內(nèi)容。這是有問題的，因為很高水平的嚴格性是絕對關(guān)鍵的，對于分離足夠純(CD25+)的人細胞而用于抑制細胞系的生成，在本發(fā)明之前的在先技術(shù)中沒有討論或評價這樣的發(fā)現(xiàn)。但是，正如下文將要表明的，其他用于生成抑制細胞系的分離和增殖方法的不足已經(jīng)顯著阻礙了關(guān)于人Treg細胞研究的進展。因此，之前還不可能使用Treg細胞有效用于治療目的。
因此，需要用于生成足夠數(shù)量的這些Treg細胞的方法，來實現(xiàn)鑒定并提供對人類患者安全有效的治療應(yīng)用。還需要更多理解CD4+CD25+細胞及其在腫瘤免疫監(jiān)視和癌癥(特別是實體瘤癌癥，如肺癌)的免疫治療或免疫抑制中的功能。同樣重要的，還需要抑制體內(nèi)異體反應(yīng)和自身免疫反應(yīng)，例如(但不限于)移植物抗宿主疾病(GVHD)，還需要闡明并擴展CD4+CD25+細胞治療以及確定分離或生產(chǎn)這樣的CD4+CD25+抑制細胞的方法。

發(fā)明內(nèi)容
針對上文說明的現(xiàn)有技術(shù)中存在的需求，本發(fā)明提供了一些方法，用于處理和調(diào)控調(diào)節(jié)性T細胞(Treg細胞)亞群，CD4+CD25+T細胞，作為實體腫瘤(如肺癌)中癌癥免疫治療的組成部分，以及用于異體反應(yīng)和自身免疫反應(yīng)的抑制、阻礙和預(yù)防。發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+T細胞介導(dǎo)了對自體T細胞繁殖的有效抑制；而來自患者腫瘤的調(diào)節(jié)性T細胞不能抑制同種異體T細胞的繁殖并顯示出誘導(dǎo)或保持肺癌患者體內(nèi)腫瘤的耐受性。因此，本發(fā)明的一個目的是提供調(diào)節(jié)和控制體內(nèi)Treg細胞形成的方法，Treg細胞能夠?qū)е履[瘤免疫監(jiān)視故障或增加的腫瘤生長。
另外，本文提供的數(shù)據(jù)表明CD4+CD25+細胞在體內(nèi)同種反應(yīng)中起著重要的作用，特別是移植物抗宿主病(GVHD)的生成。CD4+CD25+細胞從T細胞接種物的體外清除或者受體移植前的體內(nèi)CD25清除導(dǎo)致了增加的GVHD反應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)被觀察到，不考慮種間結(jié)合或全身照射(TBI)調(diào)節(jié)療法，也不考慮GVHD是由CD4+T細胞介導(dǎo)還是由CD4+和CD8+T細胞共同介導(dǎo)。
因此，本發(fā)明還有一個目的是提供促進人體移植組織植入的方法，所述移植組織包括血液或骨髓移植物的全部或選用群落，特別是通過體內(nèi)注入活化的并在體外培養(yǎng)增殖的Treg細胞來抑制、阻礙、阻斷或預(yù)防GVHD。有利的是，這樣的方法的實施帶來了降低強度的療法和很少或沒有免疫抑制。因此，這樣的移植物植入促進作用能夠作為一種較少或不需要調(diào)節(jié)療法而獲得免用藥物耐受性的方法被應(yīng)用于實體組織移植患者，或者作為免疫系統(tǒng)重建方法被應(yīng)用于具有自體或同種異體骨髓的同種異體骨髓或自體免疫患者。
本發(fā)明的另外一個目的是提供一種用于體外處理CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞的方法，以便經(jīng)活化并培養(yǎng)增殖的細胞可以被注入宿主來產(chǎn)生免疫治療性反應(yīng)。在其最簡單的方式中，本發(fā)明提供了CD4+CD25+調(diào)節(jié)細胞的優(yōu)選的體外長期培養(yǎng)增殖方法，同時保持升高的抑制活性，包括a)從患者或同種異體供者獲得調(diào)節(jié)性T細胞；b)通過嚴格的微珠純化方法從獲得的細胞中分離CD4+CD25+Treg細胞群；接著c)活化并長期培養(yǎng)物提高經(jīng)培養(yǎng)的CD4+CD25+細胞，從而增加培養(yǎng)物中改良的CD4+CD25+抑制細胞數(shù)目。
優(yōu)選的細胞分離方法被設(shè)計成是對CD25+細胞分離高度嚴格的，只要發(fā)明人確定了CD25暗淡細胞不是抑制細胞。因此，CD25暗淡細胞必需被仔細的挑除。因此，非常高水平的嚴格性對分離用于抑制細胞系生成的足夠純(CD25+)的細胞而來說是絕對關(guān)鍵的，因為CD25暗淡細胞生長的比CD25+細胞快，如果被引入了初始細胞群，將過度生長而蓋過CD25+細胞并阻礙了抑制功能的表現(xiàn)。如果缺乏一種嚴格的方法學，不可能分離純度足夠用于有效抑制并長期生長的抑制細胞群。
本公開的純化方法實現(xiàn)了對CD25細胞亞型的評價。CD45RA亞基，一種只包含～15％CD25+細胞的較小的亞基，似乎包含大部分能夠生成細胞系的抑制細胞。本發(fā)明的這一新發(fā)現(xiàn)使抑制細胞能在所有受試供體中的生成(12/12)，而現(xiàn)有技術(shù)報道了一貫10-20％的失敗率(甚至使用非常嚴格的CD25純化和/或譜系清除)。
作為單一選擇性純化的一種選擇，選擇性培養(yǎng)方法也能實現(xiàn)有效抑制性細胞的生成。因此，本發(fā)明還提供了優(yōu)選的體外長期培養(yǎng)擴增人CD4+CD25+細胞的方法，用于生成抑制活性提高的治療性人類Treg細胞。這種方法是優(yōu)選的，但不是必需結(jié)合高度嚴格性分離技術(shù)而使用的。該獨特的細胞增殖方法包括兩個步驟的第二代譜系清除實驗設(shè)計和可分開的微珠。使用了專門的細胞大小的微珠(磁性葡聚糖鐵珠-Dynabeads)，磁珠由抗CD3和CD28抗體包被?？笴D28提供了用于增強激活和再生障礙性Treg細胞生長的關(guān)鍵信號。令人驚訝的是，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)不同的CD3/CD28比例具有一些選擇性的培養(yǎng)效果。與低比例(抗CD3比抗CD28低)磁珠生長的CD4+CD25+細胞系要穩(wěn)定的多，并不容易被常規(guī)T細胞過度生長而覆蓋?？梢酝ㄟ^將培養(yǎng)細胞通過磁性柱而容易的去除磁性珠。不需要對細胞進行分類。具體實施中，優(yōu)選方法還使用了自體CD4+T細胞作為滋養(yǎng)層。因此，不需要轉(zhuǎn)化的腫瘤細胞系來促進生長。
另外，如流式細胞儀的表型鑒定所證明的，通過優(yōu)選方法生成的細胞系是均一的，并且它們能夠被培養(yǎng)2個月或更長時間。附加的優(yōu)點是，培養(yǎng)增殖的細胞保留了有效的功能性抑制活性(＞95％抑制作用，即使是將抑制細胞對響應(yīng)細胞的比例稀釋至1∶10，所述抑制作用排除潛在的非特異性原因引起的抑制)。滴定實驗揭示獲得的抑制細胞能夠被滴定至1∶16(抑制細胞∶響應(yīng)細胞)的低比例，并依然獲得90％的抑制。
測定時，本發(fā)明中培養(yǎng)增殖的人抑制細胞能夠95％的MLR抑制，使用新鮮的CD4+細胞或培養(yǎng)的CD4+CD25-細胞作為響應(yīng)T細胞。另外，這些CD25暗淡的干擾細胞是CD45RO+記憶細胞(說明它們不存在于無病原體的幼鼠中)。通過使用CD45RA(初始細胞標記物)，可以分離純凈的CD4+CD25+CD45RA+細胞群，能統(tǒng)一生成有效抑制細胞系，＞90％供者(n＝20)。另外，功能性數(shù)據(jù)表明所得培養(yǎng)增殖細胞對響應(yīng)T細胞活化的阻斷和對細胞因子生成的預(yù)防。在另外一個實施方式中，活化并增殖的CD4+CD25+細胞抑制了外周血液細胞的自體繁殖。另外一個實施方式中，活化并增殖的CD4+CD25+細胞阻斷或預(yù)防了GVHD，或者抑制或逆轉(zhuǎn)了發(fā)展中的疾病。在另外一個實施方式中，活化并增殖的細胞被導(dǎo)入不同的宿主；而另外一個實施方式中，細胞被建立成為一個細胞系，用于持續(xù)治療應(yīng)用。
另外，培養(yǎng)增殖方法的提供還使用了可選擇的增殖策略，該策略不是必然依賴滋養(yǎng)細胞，例如通過使用抗CD3/28磁珠+IL-2。而且，當這類如抗CD3/28磁珠+IL-2的可選方法被使用時，培養(yǎng)增殖能夠在有或沒有宿主APCs和/或DCs的情況下完成。盡管本發(fā)明也包括了動物-包括模擬人類疾病狀態(tài)的動物模型，且本文也考慮了這類動物的治療方法，但是優(yōu)選的，宿主是人類宿主且培養(yǎng)增殖細胞是人的。本發(fā)明的體外刺激方法具有明顯的優(yōu)點，例如1)活化和增殖是CD4+CD25+細胞特異性的；2)長期培養(yǎng)物中的刺激作用考慮了在宿主體內(nèi)細胞再導(dǎo)入之前去除刺激性抗原；和3)在體內(nèi)沒有系統(tǒng)暴露于刺激性和增強性抗原，清除了與天然產(chǎn)生或誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫源反應(yīng)的顯著干擾。而且，使用體外活化和培養(yǎng)技術(shù)成功獲得了最低的宿主毒性，并且抑制細胞組合物完全按照GMP條件制備，意味著體外培養(yǎng)增殖的CD4+CD25+細胞能夠很快被批準用于人體注入。
對于臨床應(yīng)用，細胞產(chǎn)品必須在體內(nèi)達到一定比例的靶向效應(yīng)，目的是獲得預(yù)期的有益效果。在許多情況下，在細胞培養(yǎng)初期的輸入細胞將是受限制的，由于抑制性前體細胞的稀少或有限量的臨床材料。本發(fā)明提供的方法被設(shè)計來生成109級次的培養(yǎng)增殖細胞，用于臨床應(yīng)用。而且，為了使組織培養(yǎng)過程與臨床適應(yīng)，必須能夠定量擴增，并適應(yīng)FDA批準的操作和試劑。相應(yīng)的，本發(fā)明方法經(jīng)特別設(shè)計來滿足這些要求，有利于生成擴增的CD4+CD25+抑制性細胞輸入，其特異性足以克服體積相關(guān)問題，這些問題會導(dǎo)致使用自然發(fā)生Treg細胞而不能獲得免疫抑制或預(yù)防性治療效果，本發(fā)明方法利用了已經(jīng)被批準用于人類治療的條件。
本發(fā)明長期、培養(yǎng)擴增的方法生成的培養(yǎng)擴增細胞可以被視為本發(fā)明所提供的一種用于治療GVHD的試劑，包含了經(jīng)活化和擴增的(修飾的)CD4+CD25+細胞。優(yōu)選的，T細胞懸浮在適合靜注給人移植物或癌癥患者的介質(zhì)中，如包含生理緩沖溶液的介質(zhì)。盡管不限于任何一種機制，但相信細胞以上述方式長期培養(yǎng)導(dǎo)致了有效的亞基富集和活化，從而產(chǎn)生足夠的細胞群而對患者產(chǎn)生治療益處。
本發(fā)明的另外一個目的是提供一種體內(nèi)誘導(dǎo)抗GVHD反應(yīng)的方法，包括在體外將CD4+CD25+細胞與活化和/或提高組分接觸；進而將經(jīng)活化和/或提高的CD4+CD25+細胞注入具有或即將接受同種異體移植物的自體宿主，所述移植物可以產(chǎn)生或已經(jīng)引發(fā)了移植物受體內(nèi)的GVHD反應(yīng)。細胞是典型的造血細胞，例如外周血液淋巴細胞、脾細胞、腫瘤浸潤淋巴細胞或淋巴結(jié)細胞。
因此，如本發(fā)明提供的，優(yōu)選的人類治療方法包括a)從患者或同種異體供者獲得調(diào)節(jié)T細胞；b)從獲得的細胞分離CD4+CD25+細胞群體；然后c)活化并長期培養(yǎng)物增殖上述培養(yǎng)的CD4+CD25+細胞，其中用于在培養(yǎng)液中生成修飾CD4+CD25+細胞的培養(yǎng)物增殖和活化方法包括了人IL-2、IL-15或其他公開的白介素或化合物的存在，來進一步提高細胞增殖，從而增加培養(yǎng)物中經(jīng)修飾的CD4+CD25+抑制細胞的數(shù)目；和d)將至少一部分經(jīng)修飾的CD4+CD25+抑制T細胞重新導(dǎo)入宿主患者，以便誘導(dǎo)體內(nèi)治療性反應(yīng)。這種反應(yīng)預(yù)防、阻斷、抑制、限制或逆轉(zhuǎn)了GVHD或其他自體免疫反應(yīng)，或癌癥患者體內(nèi)的外周血液細胞繁殖。
在另外一個實施方式中，本方法利用了體內(nèi)長期培養(yǎng)物增殖的CD4+CD25+細胞，該細胞是用本文提供的培養(yǎng)方法生成的。而在另外一個實施方式中，本方法利用了來源于骨髓的體外長期培養(yǎng)物增殖的CD4+CD25+Treg細胞，使用本文提供的用于外周血液的培養(yǎng)方法，除了這種情況，骨髓抽吸物將用于獲得Treg細胞群。
本發(fā)明的另外一個目的是在癌癥發(fā)作之前從無癌宿主體內(nèi)獲得淋巴細胞并使用常規(guī)技術(shù)保存該細胞，直到疾病發(fā)作而被需要，此時，細胞可以如本文之前所描述的被解凍、培養(yǎng)、活化并增殖，用于重新注入宿主?？蛇x擇的，已構(gòu)建的細胞系可以從無癌患者獲得(同種異體或自體)。該細胞系能夠如上保存至需要時而被活化并培養(yǎng)增殖。相似的，本發(fā)明的目的是在同種異體移植之前從移植物受體中獲得淋巴細胞，使用常規(guī)技術(shù)保存該細胞直至移植完成，此時，細胞可以如本文所述被解凍、CD25+消除和/或培養(yǎng)增殖并活化，用于重新注入宿主，來阻斷、抑制、限制或預(yù)防GVHD，或者逆轉(zhuǎn)已經(jīng)引發(fā)的GVHD?？蛇x擇的，已構(gòu)建的細胞系可以在移植前從宿主制備并保存、或經(jīng)CD25+消除和/或培養(yǎng)增殖并活化，直到被需要。
在一個實施方式中，本方法還包括在重新導(dǎo)入修飾CD4+CD25+細胞后為宿主患者體內(nèi)注入人IL-2、IL-15或其他已知試劑。自體重新導(dǎo)入的、體外修飾的細胞因此被認為是一種細胞移植物。在一個可選的實施方式中，在經(jīng)修飾的CD4+CD25+供體細胞同種異體導(dǎo)入受體后，用同樣的方法處理宿主。
本發(fā)明的其他目的、優(yōu)點和新穎特點將在下述說明、實施例和附圖中作部分闡述，這些內(nèi)容只是為了說明性目的，而非以任何方式來限制本發(fā)明，部分內(nèi)容對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將是顯而易見的，或可以通過本發(fā)明實踐而獲知的。


通過參閱附圖，將更好的理解前面的概述，以及接下來對本發(fā)明的詳細說明。但是，應(yīng)該理解，對本發(fā)明不限于附圖所示的精確設(shè)計和手段。
圖1，圖形顯示了CD4+CD25+淋巴細胞在從肺癌腫瘤樣本分離的總CD4+細胞的出現(xiàn)頻率(％)，與肺癌患者的外周血液淋巴細胞(PBL)相比較，使用流式細胞儀檢測。分布和平均值如圖所示正常供體的PBL，n＝7(左)；來自NSCLC患者的未經(jīng)刺激的腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)，n＝8(中)；或來自NSCLC患者的未經(jīng)刺激的PBL，n＝9(右)。使用Student2-tailed(雙側(cè))t檢驗來計算P值。
圖2A-2B，圖形顯示了腫瘤浸潤性CD4+CD25+細胞中增加的CTLA-4表達。圖2A是2個典型患者的流量直方圖，說明CTLA-4在CD4+CD25-與CD4+CD25+的TIL和PBMC中的表達。圖2B顯示了來自5個連續(xù)NSCLC患者的CD4+CD25-腫瘤浸潤淋巴細胞(左)、CD4+CD25+腫瘤浸潤淋巴細胞(中)和CD4+CD25+外周血液單核細胞(PBMC)(右)中CTLA-4表達細胞的平均百分比((±S.E.)。
圖3A-3B，圖形顯示了腫瘤浸潤CD4+CD25+細胞對抗CD3或抗CD3/CD28誘導(dǎo)的自體T細胞繁殖的直接抑制。自體PBL被單獨培養(yǎng)，或者用數(shù)目增加的來自肺癌樣本的一類純化的CD4+CD25+或CD4+CD25-腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)培養(yǎng)，所述細胞被可溶的或平皿固定的抗CD3(圖3A)或被塑膠固定的抗CD3/CD28所刺激(圖3B)，[3H]胸腺嘧啶的整合被測量。結(jié)果表示為單獨培養(yǎng)的PBL的％反應(yīng)；對CD25-曲線的100％繁殖＝37081±4094cpm，對CD25+曲線的100％繁殖＝29465±1007cpm。
圖4A-4D顯示了腫瘤浸潤CD4+CD25+細胞沒能抑制來自同種異體正常供體或肺癌患者的T細胞。來自正常供體的同種異體外周T細胞(圖4A)或來自NSCLC患者的自體PBL(圖4B)與來自癌癥患者的已知數(shù)目的腫瘤浸潤CD4+CD25+細胞一起培養(yǎng)。在圖4C中，來自正常供體的外周血液T細胞與自體類純化的外周血液CD4+CD25+供體T細胞一起培養(yǎng)。在圖4D中，腫瘤浸潤CD4+CD25+或CD4+CD25-細胞與來自NSCLC患者的同種異體PBL一起培養(yǎng)。所有的細胞培養(yǎng)物都用平皿固定的抗CD3/CD28來刺激，檢測[3H]胸腺嘧啶的整合。結(jié)果表示為3次(圖4A)、2次(圖4B)、2次(圖4C)或4次(圖4D)獨立實驗中的一次的三重培養(yǎng)物的平均值(±S.E.)，每一次的結(jié)果相似。
圖5A和5B顯示了由腫瘤浸潤CD4+CD25+細胞分泌的組成性TGF-β分泌物對于自體PBL繁殖的抑制作用是不需要的。圖5A是來源于肺癌患者的CD4+CD25+細胞培養(yǎng)物和CD3+細胞消除的CD4+CD25+細胞培養(yǎng)物的上清液的ELISA，來檢測TGF-β。結(jié)果是6例(三重板孔的±S.E)患者中有代表性的一例。在圖5B中，自體PBL單獨培養(yǎng)或與可變數(shù)目的CD4+CD25+細胞一起培養(yǎng)，用平皿固定的抗CD3/CD28刺激。加入抗TGF-β中性抗體，檢測[3H]胸腺嘧啶的整合。結(jié)果表示為三重培養(yǎng)物的平均值(±S.E.)，兩次獨立實驗中的每一次的結(jié)果相似。
圖6A和6B，圖形顯示CD4+CD25+細胞的消除加速了GVHD致死率。全部的CD4+或CD25清除的CD4+B6 T細胞被轉(zhuǎn)入經(jīng)致死量以下輻射的bm12受體(在圖6A中，每個動物注入1×105個細胞；在圖6B中，每個動物注入5×104個細胞)。x軸＝細胞轉(zhuǎn)移后的天數(shù)；y軸＝受體存活的比例。n＝8/組圖6A，p＝0.024；圖6B，p＝0.0068。
圖7，圖形顯示了CD4+CD25+細胞的清除加速了不同種屬組合中的GVHD致死率。經(jīng)致命輻射的BALB/c小鼠被植入B6BM和全部CD4+T細胞或CD25清除的(CD25-)CD4+T細胞。x軸＝移植后天數(shù)；y軸＝受體比例。n＝8/組；p＝0.016。
圖8，圖形顯示了CD25+細胞從全T細胞接種物中的清除加速了非輻射的SCID GVHD模型中的GVHD。全部或CD25+清除的B6 T細胞被注入事先經(jīng)抗anti-asialo GM1進行NK清除的、非輻射的BALB/c SCID小鼠中。x軸＝細胞轉(zhuǎn)移后天數(shù)，y軸＝受體存活比例，n＝4/組；p＝0.021。
圖9，圖形顯示了CD25+細胞從全部脾的清除加速了GVHD致死率。經(jīng)致命輻射的B10.BR小鼠被植入B6 BM和15×106全脾或CD25清除的脾。x軸＝細胞轉(zhuǎn)移后天數(shù)。y軸＝受體比例。n＝8/組；p＝0.055。
圖10，圖形顯示了體內(nèi)移植前的CD25+細胞的清除加速了GVHD。經(jīng)抗CD25單克隆抗體(mAb)處理的或?qū)φ誱Ab處理的切除胸腺的B6小鼠被致命輻射并被植入BALB/c BM和15×106脾細胞?？笴D25mAb在植入后第4、7和4天被注入。x軸＝細胞轉(zhuǎn)移后天數(shù)。y軸＝受體比例。n＝8/組；p＝0.0063。
圖11，圖形顯示了體外擴增和活化的CD25+細胞抑制了GVHD。原始的B6 CD4+T細胞被注入非輻射的、NK清除的BALB/c SCID受體。小鼠隊列接受了活化CD4+CD25+細胞或CD4+CD25-細胞的分別注射。細胞經(jīng)固定化的抗經(jīng)抗CD3mAb和高劑量的IL-2的活化和擴增。x軸＝細胞轉(zhuǎn)移后天數(shù)。y軸＝受體存活比例。n＝8/組；p＝0.022，CD4+對CD4++CD25+。
圖12，圖形顯示了不同條件下培養(yǎng)的CD25+細胞抑制GVHD。CD25清除的(CD25-)B6T細胞被注入非輻射的、NK清除的BALB/cSCID受體。第2組小鼠接受了如圖11所擴增的CD25+細胞的分別注射，采用固定化的抗CD3mAb和高劑量的IL-2(開放盒)。第3組小鼠接受了經(jīng)輻射的BALB/c脾細胞和高劑量IL-2培養(yǎng)的CD25+細胞的分別注射(開放三角形)。第4組小鼠接受了經(jīng)輻射的BALB/c脾細胞、低劑量IL-2和TGF-β(星形)的分別注射。x軸＝細胞轉(zhuǎn)移后天數(shù)。y軸＝受體存活比例。n＝6/組；所有的p≤0.016，與對照組相比(閉合環(huán))。
圖13，圖形顯示了活化并擴增的CD4+CD25+細胞的多重注入抑制了經(jīng)致命輻射的、完全MHC分離供體移植物受體中的GVHD死亡率。
圖14，圖形顯示了GVHD發(fā)作后，經(jīng)活化并擴增的CD4+CD25+的單次注入將40％的致死輻射受體從長的GVHD死亡期(時間至少是對照組的3倍以上)中拯救出來。
圖15A-15D描述了使用代表性的PBMC的雙色FACS曲線從外周血液中純化CD4+CD25+細胞，以及經(jīng)純化的CD4+CD25+和CD4+CD25-細胞。圖15A顯示，外周血液檢測結(jié)果揭示了CD4+CD25+細胞組成1-3％的PBMC。有可變數(shù)目的非CD4+細胞表達CD25，通常是低密度表達(主要是B細胞)。圖15B顯示，一些供體證明了更明顯的CD4+CD25+群體。圖15C顯示，CD4+CD25+細胞經(jīng)過抗CD25-FITC和抗FITC可分微珠純化并隨后進行譜系清除。事先用抗CD25-FITC進行的染色輕微降低了CD25-PE染色的強度。圖15D顯示，CD4+CD25-細胞經(jīng)PBMC的CD25清除而被純化，隨后進行CD4+陽性選擇。數(shù)據(jù)是20個供體評價和10個細胞純化實驗中有代表性的。
圖16A-16C，圖形描述了CD4+CD25+抑制細胞系的擴增，以短期實驗中CD4+CD25+細胞的繁殖和長期培養(yǎng)的累積方式。圖16A顯示了高度純化的CD4+CD25-細胞(△)和雙柱譜系陰性(double columnlineage negative)CD4+CD25+細胞(■)在短期96孔3H-胸腺嘧啶摻入實驗中的繁殖。CD4+CD25-細胞顯著增殖，而CD4+CD25+細胞只有最低限度的短暫繁殖。圖16B顯示了高度純化的雙柱譜系陰性CD4+CD25+細胞(■)繁殖的增強，在短期96孔3H-胸腺嘧啶摻入實驗中。100IU/ml的IL-2增進了繁殖(◆)。但是，受輻射的CD4+CD25-滋養(yǎng)細胞添加物(1∶1的比例)(●)提供了更加持久的提高的增殖。4次實驗的代表。圖16C顯示了CD4+CD25+細胞系的長期培養(yǎng)物累積。細胞系經(jīng)抗CD3/抗CD28mAb包被珠(□)或固定化的抗CD3(■)刺激一次，都補充滋養(yǎng)細胞。細胞被分開并每3-4天給入所需IL2。數(shù)據(jù)報告為細胞數(shù)目的倍增，是22個抗CD3/CD28mAb包被珠培養(yǎng)物和3個塑膠固定的抗CD3mAb培養(yǎng)物的代表。
圖17A-17C描述了顯著抑制MLR的純化培養(yǎng)的CD4+CD25+細胞。MLR培養(yǎng)物包含各種測試細胞群，其抑制細胞/響應(yīng)細胞比例為1∶2。圖示是MLR一周的動態(tài)繁殖曲線。培養(yǎng)物每天經(jīng)3H-胸腺嘧啶脈沖，持續(xù)16小時。圖17A顯示，衍生自CD4+CD25+細胞的典型細胞系(雙柱譜系清除純化，double column-lineage depletionpurification)是良好的抑制細胞(●)。相反，衍生自CD25-細胞(△)的細胞系增強了MLR，相對于對照MLR培養(yǎng)物(□)。結(jié)果代表了22次實驗。圖17B顯示了新鮮的標準MACS純化的CD4+CD25+細胞(◆)，加入MLR，與典型的弱抑制性CD4+CD25+細胞系(●)相比較，對照MLR(□)。結(jié)果代表了4次實驗。圖17C顯示，MLR反應(yīng)幾乎完全被有效抑制培養(yǎng)的CD4+CD25+細胞(●)所阻斷，對照MLR(□)。7個有效抑制細胞系的代表性，在14個MLR中測試。
圖18A-18K展示了CD25+與CD25-細胞系在3-4州培養(yǎng)增殖后的流式細胞計數(shù)比較。FACS分析描繪了抗原表達。圖示為細胞系衍生CD25-的典型圖，與有效抑制細胞系和弱抑制性細胞系比較(圖18A-18C)。圖18A顯示，衍生自CD25-細胞的細胞系表達了低水平的CD25，因為它們回復(fù)到一個更加休眠的狀態(tài)。圖18B顯示，有效抑制細胞系保持高水平的CD25表達。圖18C顯示，弱抑制功能的CD4+CD25+細胞衍生的細胞系表達了中等水平CD25。(圖18D-18F)。圖18D顯示，CD4+CD25-衍生細胞系表達了最低的胞內(nèi)CTLA4。圖18E顯示，有效抑制細胞系保持了高的細胞內(nèi)CTLA4表達。圖18F顯示，弱抑制細胞系表達水平為中等。(圖18G-18I)。圖18G顯示，CD25-衍生細胞系表達了可變水平的CD62L和減少的CD27。圖18H顯示，有效抑制細胞系含有高百分比的細胞，表達CD62L和CD27。圖18I顯示，弱抑制細胞系含有低百分比的細胞，表達CD62L和CD27。圖18J-18K顯示，抑制性細胞系亞基的分類揭示了有效抑制細胞表達CD62L和CD27。圖18J是FACS圖，顯示了CD62L和CD27亞基的分類門。圖18K展示了MLR中的功能性分析，揭示了單獨存在于CD62L和CD27雙陽性亞基(條紋柱)中的抑制活性。對照MLR培養(yǎng)物(灰色柱)和受抑制的MLR(黑色柱)。如圖所示，CD62L+/CD27-亞基(磚塊柱)和CD62L-/CD27-亞基(編織柱)都增強了MLR。
圖19A-19D，圖形描述了培養(yǎng)的CD4+CD25+細胞持久顯著抑制MLR繁殖和細胞因子分泌。有效CD25+抑制細胞系在來自多個無關(guān)供體的多重MLR中被檢測。圖19A顯示了8個單獨的MLR，表現(xiàn)了對照和受抑制繁殖的差異。在所有供體結(jié)合中，大多數(shù)被顯著損傷。對照MLR培養(yǎng)物(灰色柱)和受抑制的MLR(黑色柱)。結(jié)果是7個不同的有效抑制細胞系的20次實驗的代表。圖19B顯示了當分級數(shù)目的有效的、經(jīng)培養(yǎng)的抑制細胞加入MLR反應(yīng)中來測定抑制所需最小數(shù)目時的效果。當使用最有效的抑制細胞系時，直到稀釋至1∶16(大約3125個抑制細胞)，依然顯著損傷MLR。三個圖顯示了6個有效抑制細胞系的代表性。圖19C展示了培養(yǎng)上清液中IL-2水平的每日評估，揭示了受抑制的MLR培養(yǎng)物(●)中IL2累積的強烈阻斷，對照MLR培養(yǎng)物(□)。4個MLR分析的典型代表。圖19D反映了由活化的T細胞生成的其他細胞因子的評估，揭示了對累積的強烈損傷。沒有生成有效水平的TNF-α、IFN-γ、GM-CSF5、IL-6或IL-10。圖示為第6天的水平，對照MLR培養(yǎng)物中的累積峰(亮柱)與受抑制的MLR培養(yǎng)物(暗柱)。4個MLR分析的典型代表。
圖20A-20G顯示，培養(yǎng)的Treg細胞影響了響應(yīng)性T細胞的活化，并能抑制成熟DC驅(qū)動的MLR。在培養(yǎng)一天后評估MLR中活化抗原的表達。圖示為對照MLR的CD69染色(圖20A)、CD25染色(圖20B)和OX40染色(CD134)(圖20C)。在受抑制MLR中，響應(yīng)性T細胞首次在HLA-A2上門控來使之與HLA-A2陰性抑制細胞區(qū)分開。分別顯示的是來自受抑制MLR的響應(yīng)細胞的CD69染色(圖20D)、CD25(圖20E)和OX40(CD134)(圖20F)。結(jié)果是3次實驗的典型代表。圖20G顯示了DC的成熟，在MLR之前，通過LPS或TNF/多聚IC結(jié)合，或這些MLR中刺激因子的包含物沒能繞過抑制作用。對照MLR培養(yǎng)物(灰柱)和受抑制的MLR(黑色柱)。
圖21A-21D圖形描述了MLR中抑制的功能性分析結(jié)果。圖21A顯示，在鉻釋放測定中，抑制細胞系缺乏對DC顯著的細胞毒性(·)。由NK細胞系NK92介導(dǎo)的對照裂解(□)。圖21B顯示，抑制細胞系缺乏自然殺傷(NK)或淋巴素活化殺傷(LAK)型活性，并在鉻釋放測定中沒有顯示出對K562的裂解活性(·)。由NK細胞系NK92介導(dǎo)的對照裂解(□)。圖21A和21B中都使用了5000個標記靶標，效應(yīng)/靶標比例都達到20∶1。圖21C顯示，在MLR實驗中使用了針對免疫抑制性因子IL-10和TGF-β的抗體和抗IL-10R抗體，或者是三者的結(jié)合使用-每一個都沒能逆轉(zhuǎn)由經(jīng)培養(yǎng)的抑制細胞系介導(dǎo)的抑制作用。圖21D顯示，有效抑制細胞系具有最低抑制活性，加入DC驅(qū)使的MLR，DC與抑制細胞是自體的(而與響應(yīng)細胞是異體的)。抑制細胞系Ts-A(陰影交叉柱)被用于抑制由DC-A(來自與抑制細胞相同的供體)或DC-B(來自與抑制細胞不同的供體)驅(qū)使的MLR培養(yǎng)物。抑制細胞系Ts-B(方格柱)也經(jīng)過DC-A和DC-B的測試。代表4次實驗。
具體實施例方式
在本發(fā)明中，來自早期肺癌患者的原發(fā)肺腫瘤樣本被發(fā)現(xiàn)含有大量具有之前所述調(diào)節(jié)T細胞表型的T細胞(“Treg細胞”)。與之前所述的調(diào)節(jié)T細胞相反，腫瘤中的CD4+CD25+淋巴細胞具有非常高的CTLA-4表面表達，它們直接抑制自體(而不是異體)T細胞的繁殖。腫瘤寄居的CD4+CD25+T細胞的抑制作用是有效的，即使在響應(yīng)性T細胞的充分活化之后也會發(fā)生，在Treg細胞和細胞毒性細胞的響應(yīng)及抑制活化之間建立強大的聯(lián)系。因此，本發(fā)明提供了體外活化并特異性長期培養(yǎng)增殖Treg細胞的方法、經(jīng)活化增殖的Treg細胞本身、在免疫治療中應(yīng)用經(jīng)活化增殖的Treg細胞的方法和用于抑制自身免疫反應(yīng)(包括GVHD)的方法。
如本文所使用的，“異體細胞”(異體同源)是那些從某一個體(供體)分離并注入另外一個個體(受體或宿主)的細胞；而“自體細胞”(自身)是指那些從個體分離并被重新注入相同個體(受體或宿主)的細胞。相應(yīng)的，異體T細胞的繁殖由來自另外個體的抗原呈遞細胞(“APC”)刺激，而自體T細胞的繁殖由自身APC來刺激。除非特別說明，本發(fā)明中的APC可以是現(xiàn)有技術(shù)已知的任何類型。
“抗原”是引發(fā)免疫反應(yīng)的實體。“異體抗原”指導(dǎo)致某一個體的免疫系統(tǒng)識別并消滅另外個體的細胞(當兩者混合時)的因子?！胺至阉亍笔钦T導(dǎo)所有T細胞以抗原非特異性方式繁殖的因子。
“混合淋巴細胞反應(yīng)”、“混合淋巴細胞培養(yǎng)”、“MLR”和“MLC”被互換使用來指一種包含了最少兩種異型細胞群的混合物。至少一種異型細胞是淋巴細胞。細胞在適宜條件下共同培養(yǎng)一段時間來導(dǎo)致淋巴細胞(本發(fā)明特指Treg細胞)的刺激。MLC的通常目的是提供異體刺激，例如可以引發(fā)Treg細胞的繁殖；但除非指明，培養(yǎng)過程中的繁殖不是必需的。在適當?shù)恼Z言環(huán)境中，這些術(shù)語還可以指從這種培養(yǎng)中衍生的細胞的混合物。當來自MLC的細胞被成團注入人體時，它被稱為“細胞移植物”。
盡管CD4+CD25+免疫調(diào)節(jié)細胞是體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)因子且是預(yù)防自身免疫所必需的，但是這些專職抑制細胞在異體反應(yīng)中的作用還沒有被很好的研究?；赥reg細胞抑制細胞毒T細胞活性的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式利用專職抑制細胞來調(diào)節(jié)T細胞對異體抗原的反應(yīng)并考察移植物抗宿主疾病(GVHD)的生成。這由本實施方式中發(fā)生的GVHD加速和/或死亡率增加而得到說明，其中CD25+細胞在體外從供體T細胞接種物中被清除，或者通過移植前注入抗CD25單克隆抗體(mAb)在體內(nèi)對受體條件化。CD25+細胞的清除導(dǎo)致了GVHD的增加，不論供體抗宿主反應(yīng)是由CD4+T細胞介導(dǎo)還是由CD4+和CD8+T細胞介導(dǎo)。
這與其他文獻(例如，Piccirillo等人，J.Immunol.1671137-1140(2001)；Gao等人，Transplantation 681891-1897(1999))相一致。另外，發(fā)現(xiàn)CD25+細胞清除能夠加速幾個種屬組合中的GVHD，不論條件形成的強度如何，這表明即使是在高度致炎細胞因子環(huán)境中，CD25+細胞也可以行使異體反應(yīng)抑制因子的功能。因此，本發(fā)明關(guān)于清除的資料指明了CD25+細胞在抑制異體反應(yīng)中的作用，并顯示了CD25+細胞的注入能夠預(yù)防或改善GVHD；而以前的文獻指出新鮮的原始CD4+CD25+細胞沒有單獨影響GVHD致死率，而只是當與GVHD誘導(dǎo)T細胞以1∶1的比例一起注入時具有適度的保護作用(Taylor等人，2001)。
雖然存在兩個CD25陽性細胞群體，而CD25+細胞一般只構(gòu)成人外周血液單核細胞(PBMCs)中CD4+細胞總數(shù)的5-10％。然而，只有1-2％的CD25+細胞表達高水平的CD25，并被認為是真正的Treg細胞或至少是功能提高的Treg細胞。因此，要注入足夠數(shù)量的純化的調(diào)節(jié)細胞來達到顯著的治療效果將是困難的。
Thornton和Shevach的研究使用了APC并結(jié)合抗CD3和IL-2來激活Treg細胞，資料指出在小鼠中，CD4+CD25+細胞能夠成為對體外活化更有效的抑制細胞(Thornton等人，J.Immunol.164183-190(2000))。不幸的是，Thornton注入沒有為人類提供治療性益處，因為該方法既不能獲得FDA的批準，也沒有說明任何擴增細胞的方法。如之前提到的，鼠T細胞生長與人T細胞生長的要求明顯不同(參見Mestas，J.Immunol.1722731(2004))。另外，雖然抗CD40L(CD154)或抗B7(抗CD80和CD86)完全阻斷了體外反應(yīng)，但沒有一個能有效防止體內(nèi)GVHD。
有趣的是，一種高效的早期方法利用了抗CD3/28珠(Takahashi等人，Int.Immunol.101969-80(1998))，但Takahashi聲稱可溶性抗CD28mAb和抗CD3mAb的包含體阻斷了抑制。CD4+CD25+細胞已經(jīng)顯示出體外對多重刺激物(除了抗CD3+IL-2)的無反應(yīng)性。然而，經(jīng)過旺盛擴增的無反應(yīng)細胞變成有反應(yīng)性。因此，該文獻表明旺盛擴增的發(fā)生將以抑制細胞活性停滯為代價，并只報道了低水平的擴增。因此，現(xiàn)有技術(shù)沒有預(yù)期本發(fā)明方法能夠在不損失抑制活性的同時而擴增CD4+CD25+細胞，也沒有預(yù)料本發(fā)明方法能夠提供如此旺盛的擴增并提高了抑制細胞的功能。
但是，意識到需要一種有效的治療病人的治療方法來抑制和預(yù)防GVHD，本發(fā)明利用了符合GMP的培養(yǎng)體系來活化并增殖Treg細胞。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式使用了抗CD3/28mAb包被珠并結(jié)合IL-2和受輻射的滋養(yǎng)細胞來誘導(dǎo)(i)旺盛增殖100倍以上，(ii)抑制細胞活性的增加。另外，本文公開的旺盛增殖率伴隨著比之前文獻報道(參見Godfrey等人，Blood in press 2004，在網(wǎng)上電子公開，March 18，2004)更有效的抑制細胞活性。
“細胞系”或“細胞培養(yǎng)物”表示體內(nèi)生長或維持的高等真核細胞。可以理解為細胞后代可能與母細胞不完全相同(在形態(tài)、基因型或表型方面)。骨髓移植鼠模型中的初期研究顯示CD4+CD25+細胞能夠防止GVHD越過主要組織相容性(MHC)障礙(Taylor等人，Blood99(10)3493-3499(2002)，Hoffman等人，J.Exp.Med.196(3)389-399(2002)，Cohen等人，J.Exp.Med.196(3)401-406(2002))。但是，本實施方式證明，CD4+CD25+細胞能夠被擴增到比之前所能達到的更高的水平并有更長的培養(yǎng)時期(“長期”)。因此，本發(fā)明的優(yōu)選實施方式描述了“長期培養(yǎng)增殖的”CD4+CD25+細胞或Treg細胞或CD25+細胞。
“長期”意味著培養(yǎng)時間持續(xù)超過一周，優(yōu)選的≥10天，更優(yōu)選的＞2周，更優(yōu)選的＞3-4周，更優(yōu)選的＞1月，更優(yōu)選的＞6-8周，更優(yōu)選的＞2月，更優(yōu)選的＞3月，更優(yōu)選的＞6月，最優(yōu)選的是1年或更長的時間-只要保持一定的細胞功能，特別是抑制活性。相應(yīng)的，本發(fā)明提供的資料表明，盡管不同的體外活化方案產(chǎn)生不同的回收率或CD4+CD25+細胞增殖，但所有方案都產(chǎn)生了顯著抑制或限制GVHD的細胞。
這些研究中考察的體外活化方案旨在成為醫(yī)護人員可效仿的方法，并為該原則的有效性提供證明。但是，所提供的方案決不意味著是對增殖和活化可能策略的窮盡性列舉，因為有很多已知的體外處理血液的方法可以使用，例如在一些美國專利6251385；6203787；6051227；5962318；5728388；5472867；5399493中使用的方法，同時，還會發(fā)現(xiàn)有更新的方法將對本文所述原則做出改良。如本文使用的，“治療”或“療法”指臨床介入，旨在改變接受治療的個體或細胞的自然病程，并可以為預(yù)防目的或在臨床病理過程中施行。期望的作用包括但不限于防止疾病的發(fā)生或復(fù)發(fā)，緩解癥狀，抑制、減少或限制任何直接或間接的疾病病理結(jié)果，防止病灶轉(zhuǎn)移，降低疾病進展速度，改善或緩和疾病狀態(tài)，引起緩和或改善的預(yù)后。與疾病狀態(tài)相關(guān)的“病理”是包含了健康、正常生理或受感染者生活質(zhì)量的任何狀況。這可以包括但不限于受感染組織破壞性侵入之前未感染的區(qū)域，損害正常組織功能的生長，不規(guī)則或受抑制的生物活性，炎癥或免疫反應(yīng)的惡化或抑制，對其他致病生物或因子增加的敏感性，如疼痛、發(fā)熱、惡心、疲乏、心境改變以及其他由主治醫(yī)師確定的其他特征等不希望的臨床癥狀。
“有效量”是足以產(chǎn)生有益或期望的臨床結(jié)果的量，特別是產(chǎn)生免疫反應(yīng)或臨床狀況顯著提高的量。“致免疫量”是在接受治療或檢測(患病或沒有患病)的受體中顯示的足以引發(fā)免疫反應(yīng)的量，所述免疫反應(yīng)包括體液反應(yīng)或細胞反應(yīng)或兩者都有。優(yōu)選的，根據(jù)本發(fā)明，獲得的抑制作用比沒使用本文公開的培養(yǎng)增殖方法而產(chǎn)生的抑制作用超出＞30％。更優(yōu)選的，抑制作用＞40％，更優(yōu)選的＞50％，更優(yōu)選的＞70％，更優(yōu)選的＞85％，更優(yōu)選的＞90％，更優(yōu)選的＞95％，更優(yōu)選的＞99％，更優(yōu)選的＞100％，只要細胞的體外培養(yǎng)可以長期維持。
術(shù)語“抑制”、“限制”、“防止”在本文中的使用是根據(jù)普遍接受的定義，即，當進行中的免疫反應(yīng)被阻斷或者與未經(jīng)本發(fā)明治療的結(jié)果相比明顯降低時，即產(chǎn)生了“抑制”。相似的，“限制”指阻斷一種免疫反應(yīng)的發(fā)生或與未經(jīng)本發(fā)明治療的結(jié)果相比顯著降低了這種免疫反應(yīng)。當預(yù)防性給藥時，這種阻斷可以是完全的，以至于沒有特定的免疫反應(yīng)發(fā)生，一般把免疫反應(yīng)發(fā)生之前的完全阻斷稱為“防止”；在本發(fā)明中，治療可以有利于減輕作用(與正常的未治療狀態(tài)相比)，一般稱為抑制或限制。
對于腫瘤性疾病患者的臨床反應(yīng)，有效量是足以緩解、改善、穩(wěn)定、逆轉(zhuǎn)或減慢疾病進程，或者其他減輕疾病病理結(jié)果的量。相似的，在經(jīng)歷GVHD發(fā)作的或易感GVHD的移植患者中，有效量是足以阻斷或防止其發(fā)作的量，或者如果GVHD病理已經(jīng)發(fā)作，能夠足以緩解、改善、穩(wěn)定、逆轉(zhuǎn)或減慢疾病進程，或者其他減輕疾病病理結(jié)果的量。無論如何，有效量可以單次或分次劑量給藥。本文其他地方公開了以有效量優(yōu)選使用的量和細胞比例。
由于CD4+CD25+免疫調(diào)節(jié)細胞是非常異質(zhì)的細胞群，似乎不同的活化和增殖方法可以產(chǎn)生具有潛在不同的抑制/效應(yīng)功能的不同細胞群。CD4+CD25+免疫調(diào)節(jié)細胞的非均質(zhì)性還在研究中。目前，它們可以被分為兩個主要類別適應(yīng)性的和天然的。這些細胞類型已經(jīng)被Bluestone等人所定義(2003)，總結(jié)于下面的表格(表1)中。
表1.天然和適應(yīng)性調(diào)節(jié)細胞的比較


例如，一些類型的T調(diào)節(jié)細胞依靠外源性TGF-β或者IL-I0與TGF-β的結(jié)合來產(chǎn)生和傳播抑制細胞的活性，而本發(fā)明的細胞群不依賴這些外源性生長因子。這是人的CD4+CD25+細胞和動物模型(鼠)類似物之間的另一個差別。如IL-10的研究中所顯示的，鼠細胞生成的TGF-β比人Treg細胞生成的TGF-β要少。這給使用經(jīng)培養(yǎng)的鼠細胞而形成的報告結(jié)果增加了未能解釋的可變性，例如包含各種水平的TGF-β。
因為抗CD3/28珠+IL-2表現(xiàn)出能擴增所有CD4+CD25+亞群，本發(fā)明的一個優(yōu)點是CD4+CD25+細胞能夠從異質(zhì)細胞群或具有更強功能的CD4+CD25+亞群增殖而來。最近的發(fā)現(xiàn)已經(jīng)證實，表達高水平L-選擇蛋白(一種引導(dǎo)蛋白)的CD4+CD25+細胞是一種比低水平表達L-選擇蛋白的亞群(CD62L)更強的GVHD抑制細胞(參見下面的實施例)。
人類CD4+CD25+細胞培養(yǎng)和擴增。分生抑制細胞培養(yǎng)物的最初含義包括固定化的抗CD3加上用于培養(yǎng)的IL-2和TGF-β(參見，例如，Kung等人，Science 206(4416)347-349關(guān)于CD3抗體克隆OKT3)。細胞在預(yù)先以各種濃度固定了抗CD3的塑料平皿中生長，抗CD3的最佳固定化濃度為1-5μg/ml。如后面實施例所描述的，在早期，對發(fā)明人來說明顯的是TGF-β對功能不是必需的(圖5)，但是它似乎確實輕微增強了抑制活性。但當條件變化時，對TGF-β的需求/受益可能變化。例如，使用實施例中描述的CD62L(L-選擇蛋白hi)時，可以不需要TGF-β，因為后者是比未分化的CD4+CD25+細胞更有效的GVHD抑制細胞。
抗CD3/抗CD28磁珠的使用誘導(dǎo)了抑制細胞的旺盛繁殖，具有塑料結(jié)合抗體的作用。CD28刺激也提高了Treg細胞的活化，本發(fā)明的一個實施方式顯示包被了抗CD3和抗CD28(抗CD3/CD28)抗體(與Treg細胞混合的最佳比例為1∶10)的磁珠擴增并保持了Treg功能。CD28是以二硫鍵結(jié)合的同型二聚體，表達在大部分T細胞表面(June等人，Immunol Today 11211(1990))。正如現(xiàn)有技術(shù)人員知道的，CD28能夠被許多可商業(yè)獲得的CD28單克隆抗體所識別。
初期對共刺激可能會消除抑制的擔心(因為在短期實驗中確實有消除作用)被證明是沒有根據(jù)的。有趣的是，只用CD3包被的磁珠是一種弱的繁殖誘導(dǎo)物。事實上，細胞生長是等量的固定化CD3培養(yǎng)物的5-10倍，并保持了抑制功能。與IL-2或IL15一起的培養(yǎng)物誘導(dǎo)了等量的繁殖和抑制功能(圖11、12)。
本發(fā)明一經(jīng)開發(fā)出了一種可用于適當重復(fù)分離和培養(yǎng)和檢測抑制細胞的可操作體系，發(fā)明人就可以系統(tǒng)的改變參數(shù)來確定改良的細胞分離和培養(yǎng)的方法。通過執(zhí)行更嚴格的純化策略，分離到了更加有效的可重現(xiàn)的抑制細胞系。這導(dǎo)致了抗CD25微珠滴定實驗(滴定度1∶6)，以及雙柱純化方案的發(fā)展，隨之導(dǎo)致了有效抑制細胞系的持續(xù)生成(具有＞80％的成功率)。CD25是IL-2Rα分子(參見，例如，Waldmann，Immunol Today 14264(1993))，由許多可商業(yè)獲得的單克隆抗體(如本文使用的Ab或mAb)或標記IL-2與CD25的結(jié)合來識別。
本發(fā)明中，CD25 Ab被用來富集CD4+CD25+細胞群，基于其CD25表達。在刺激之前進行該步驟，提高了增殖那些具有有效抑制活性的Treg細胞的能力。事實上，當在微珠上檢測各種比例的抗CD3-抗CD28(分別為20∶1，5∶1，1∶1，1∶20)時，較高比例的抗CD28磁珠誘導(dǎo)了抑制性T細胞的選擇性擴增。抗CD3/抗CD28比例為1∶5和1∶20的磁珠生成的細胞系中摻雜的非抑制性T細胞較少。使用較低量的抗CD3衍生而得的細胞系作用更強，并保持了顯著增加的CD27和CD62L表達，意味著這些細胞的原始T細胞表型得到了保持。這些通常是用來區(qū)分原始和記憶T細胞的細胞表面標志物(參見，例如，DeRosa，Nat.Med.7245(2001))。CD27是一種受體，在效應(yīng)細胞分化中丟失，CD62L和CCR7對細胞向淋巴組織的遷移是重要的。因此，在體內(nèi)，這些抑制細胞理論上正常位于淋巴組織并限制這些部位的異體反應(yīng)性細胞的活化和增殖，包括對GVHD誘導(dǎo)來說關(guān)鍵的派伊爾(Peyers)淋巴集結(jié)。
已經(jīng)報道，在人體系統(tǒng)中，必需分離CD4+CD25+細胞的CD25+明亮亞群以便在基于抗體的共培養(yǎng)實驗中檢測抑制活性(與新分離的細胞一起)(Baecher-Allan等人，2001)。這也在本發(fā)明的優(yōu)選培養(yǎng)體系中被發(fā)現(xiàn)，其中最嚴格純化的CD4+CD25+細胞組成了最好的抑制細胞系前體。CD25+餾分中摻入的CD25-暗淡細胞能夠更快生長并壓過CD25+明亮細胞，從而妨礙了抑制細胞功能的完全表現(xiàn)。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中強調(diào)了“嚴格純化”(優(yōu)選的，兩個選擇循環(huán)和擴展洗滌)?！案叨葒栏瘛笔莾?yōu)選的來提高純度，甚至是以較低的細胞產(chǎn)量為代價。這種嚴格技術(shù)對于現(xiàn)有技術(shù)人員來說是已知并可以理解的。
較低的抗CD25磁性微珠滴定度(1/5的生產(chǎn)商推薦)以及第二柱的再次純化極大促進了具有有效抑制能力的Treg細胞系的生成。通過比較，使用更低滴定度的抗CD25mAb包被磁性微珠或者加入第三柱的純化步驟，都沒有顯著提高優(yōu)選培養(yǎng)體系的結(jié)果(見實施例8)，而且事實上，產(chǎn)生了產(chǎn)量減少的不利結(jié)果。
通過提高CD4+CD25+T細胞純化的嚴格性，最終分離到的CD25明亮細胞不再生長，即使是使用抗CD3/抗CD28磁珠。但是，在嘗試了各種輔助細胞群之后，發(fā)現(xiàn)經(jīng)輻射的CD4+T細胞(作為“滋養(yǎng)細胞”)在本發(fā)明中對促進生長是最好的。該細胞似乎分泌了抑制性細胞生長因子，包括(但不限于)IL-2)。但是，條件培養(yǎng)基(CD3/抗CD28刺激的CD4+T細胞的上清液)大大促進了抑制細胞的生長，甚至強于添加IL-2所產(chǎn)生的結(jié)果。
然而，可選的培養(yǎng)增殖策略(例如對現(xiàn)有技術(shù)人員已知的)也被考慮到可能不需要添加滋養(yǎng)細胞群。例如，可以使用抗CD3/28磁珠+IL-2，其中宿主APC和/或樹狀突細胞可以是有益的或必需的，也可以不是。
改良的抑制細胞系的生成。在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，抑制細胞系對CD8+非抑制細胞的過度生長是敏感的。因此，開發(fā)出兩步純化方案來清除CD8+T細胞。這包括了一個多孔磁性微珠方法，其中，首先通過公知方法對細胞進行抗CD25 FITC(熒光素-5-異硫氰酸鹽)染色，然后用抗FITC微珠分離，再次使用已知方法。然后將微珠從制備物中分離，隨后進行第二步，其中抗CD8微珠被用來清除CD8+T細胞。加入抗CD19、抗CD20、抗CD14和抗CD56來同時清除制備物中的B細胞、單核細胞和NK細胞。根據(jù)此純化策略生成的細胞系顯示出更能重復(fù)再生(＞90％)，并且比其他方法在更長的培養(yǎng)期間更加穩(wěn)定。
利用兩步純化方案，可以在新分離的抑制細胞群上得到CD4+CD25+亞群。發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+細胞的次要亞群包括整聯(lián)蛋白β7和CD200(～10％的)，并發(fā)現(xiàn)主要亞群包括LAIR(白血球偶聯(lián)免疫球蛋白樣受體-1，參見，例如，Meyaard等人，Immunity(2)283-90)、CD101細胞(代表～80％的CD4+CD25+細胞，參見，例如，Allez等人，Gastroenterology 123(5)1516-1526(2002))。該細胞系不表達在鼠CD4+CD25+細胞的一個亞群上高水平表達的CD103(整聯(lián)蛋白-α-E)。另外，大約20％的CD4+CD25+細胞表達CD45RA。這一抗原被預(yù)期在抑制細胞上不表達，因為有幾篇報道說明了它們是CD45RO陽性(通常與CD45RA是互相排斥表達，除了在原始細胞的活化過程中短暫表達)。但是，這些細胞的分離物對于生成抑制細胞系來說比CD45RA-細胞要好的多(目前通過該方法分離的12細胞系都是有效的抑制細胞)。原始T細胞時，CD45RA剪切變體表達在T細胞表面。一旦T細胞分化成記憶細胞，它通常表達CD45RO異構(gòu)體(參見，例如，DeRosa，2001；Tchilian等人，Arch.Immunol.Ther.Exp.(Warsz)50(2)85-93(2002))。
盡管具有最低回收率的培養(yǎng)方法(異體脾細胞、低劑量IL-2和生長因子(TGF-β)，如下實施例所示)介導(dǎo)了最佳的保護(不考慮較低數(shù)量的注入細胞)，但是培養(yǎng)方案能夠得到改良，根據(jù)本文提供的信息和已知原理來優(yōu)化增殖和抑制功能。在基于鼠模型結(jié)果而建立的臨床上適用于人的條件下，異體脾細胞沒有產(chǎn)生足夠的CD4+CD25+細胞增殖，即使有高劑量IL-2的存在。但是，預(yù)計有更有效的抗原呈遞細胞(如一種活化的單核衍生樹突細胞(DC))將會通過多重生理信號的傳遞而產(chǎn)生更好的增殖和抑制功能，所述信號還可以幫助細胞存活，如下實施例所示。
但是，因為CD4+CD25+細胞不需要通過異體抗原激活來抑制異體抗原反應(yīng)性CD25-T細胞(即，清除了CD25+細胞的Treg細胞群)，它可以通過TCR信號傳導(dǎo)的多克隆誘導(dǎo)物而獲得最大程度的激活(并擴增)，只要活化誘導(dǎo)的細胞死亡沒有完全抵消有益作用?！凹せ睢敝复碳せ蛟鰪娂毎敝澈图毎只@對原始細胞群產(chǎn)生后代細胞是必需的。盡管經(jīng)固定化抗CD3mAb和高劑量IL-2培養(yǎng)的CD25+細胞具有顯著的GVHD抑制作用，但是可以保證在任何活化方案中包含TGF-β，因為本文數(shù)據(jù)表明TGF-β是CD25+調(diào)節(jié)細胞的一種生長因子，另外它還賦予CD25+調(diào)節(jié)細胞對活化誘導(dǎo)細胞死亡更強的抵抗(Yamagiwa等人，2001；Nakamura等人.，2001)。
令人驚訝的是，樹突細胞的激活或成熟沒有導(dǎo)致繞過抑制。“成熟”是APC的形態(tài)和功能從未成熟到活化成熟狀態(tài)的轉(zhuǎn)變。活化的DC是最有效的APC。樹突細胞經(jīng)歷未成熟＞成熟＞活化狀態(tài)。通過比較，“活化”是未成熟或成熟細胞的細胞表面分子和生物學活性的獲得。因此，APC/DC細胞能夠支持免疫反應(yīng)。一系列信號和細胞因子引發(fā)了細胞分化。TNF、PGE2和干擾素能夠使DC從未成熟走向成熟，而CD40L信號傳導(dǎo)或LPS能夠使DC從成熟走向活化。
因此，本發(fā)現(xiàn)提供了人類細胞與已經(jīng)報道的新分離鼠Treg細胞的顯著差別，其中LPS或CpG-包含DNA寡聚脫氧核苷酸介導(dǎo)的脾衍生DC的信號傳導(dǎo)導(dǎo)致了繞過抑制(Pasare等人.，Science 299(5609)1033-1036(2003))。但是，在該系統(tǒng)中，Treg細胞既沒有培養(yǎng)激活也沒有培養(yǎng)擴增。
與本發(fā)明的優(yōu)選實施方式不同的，活化并擴增的人Treg細胞能夠越過經(jīng)活化的DC所表達的細胞因子和共刺激分子，而依然阻斷MLR反應(yīng)。經(jīng)培養(yǎng)后的抑制功能增強的發(fā)現(xiàn)與鼠Treg細胞激活的表現(xiàn)相一致。抑制功能是激活依賴性的(Shevach等人，2002，同上)，而與抗CD3和IL2的短期培養(yǎng)增強了抑制能力(Thornton等人，2000)。這可以解釋為，長期培養(yǎng)的Treg細胞對于TCR的再激活是首要的(更加敏感)，因此TCR誘導(dǎo)的抑制功能是更容易表達的。
在一個可選的實施方式中，為提高CD4+CD25+細胞產(chǎn)量并從而提高抗GVHD作用，在培養(yǎng)物中加入了細胞因子，例如IL-4和IL-7增加了T細胞存活率(Vella等人，Proc.Natl.Acad.ScL USA953810-3815(1998))，IL-10負責調(diào)節(jié)性T細胞的生成(Groux等人，Nature 389737-42(1997))，IL-15與低劑量IL-2協(xié)同誘導(dǎo)人CD4+CD25+細胞的旺盛繁殖(Dieckmann等人，2001)。
激活和擴增方案的治療效果。本發(fā)明的一個重要貢獻是本模型可以在相關(guān)動物模型中評價CD4+CD25+細胞活化及增殖方案的體內(nèi)治療效果。由于經(jīng)活化培養(yǎng)的細胞在體內(nèi)尋靶、轉(zhuǎn)移、存活和發(fā)揮功能過程中的潛在缺陷，考慮體外活化并擴增的調(diào)節(jié)細胞的調(diào)節(jié)功能的體內(nèi)應(yīng)用是重要的。
CD4+CD25+細胞在對外源或異體抗原的免疫反應(yīng)中的調(diào)節(jié)作用、CD25清除導(dǎo)致的GVHD致死率增加、以及體內(nèi)清除資料-其中抗CD25mAb被注入自身免疫受體-表明了臨床相關(guān)性的治療。為了避免宿主反應(yīng)性供體T細胞(它將上調(diào)CD25，稱為GVHD過程中的活化標志)的清除作用，給移植前的宿主注入抗CD25mAb，導(dǎo)致了加速的GVHD。這一結(jié)果是令人驚訝，因為根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，這種情況將緩解GVHD(Anasetti等人，Bone Marrow Transplant 7375-381(1991)；Harris等人，Bone Marrow Transplant 23137-144(1999)；Cahn等人，Transplantation 60939-942(1995)；Blaise等人，Bone MarrowTransplant 8105-111(1991))。由于通過抗CD25mAb的注入而使GVHD惡化，似乎抵抗的宿主CD25+細胞也可以通過供體T細胞的宿主抗供體耐受機制來抑制GVHD的形成。
如后面的實施例所示，體外擴增并激活的免疫調(diào)節(jié)性CD4+CD25+細胞顯著抑制了體內(nèi)快速致命的GVHD。如上面提到的，很多細胞類型能夠被使用。當使用來自淋巴結(jié)的細胞時，考慮了所有類型的淋巴結(jié)(例如，腹股溝的、腸系膜的、表面末稍輔助的等等)，可以來自健康個體或者住院患者。例如，可以使用本文提供的方法分離、純化并培養(yǎng)增殖腫瘤引流淋巴結(jié)細胞。足量的這類細胞(即，當再次注入自體宿主或注入異體受體中時足夠顯示出所要的抑制或預(yù)防反應(yīng)的數(shù)量)經(jīng)高度嚴格的純化并在合成培養(yǎng)基(例如，RPMI 1640加一些典型添加物)中稀釋，在未公開的條件下持續(xù)適當?shù)臅r間。多種標準培養(yǎng)技術(shù)可以被采用(例如，培養(yǎng)箱中的多孔板在37℃，5％CO2下)。為了體外刺激，在無菌條件下將細胞從宿主和單細胞懸液中分離。如果需要，細胞制備物可以經(jīng)過過濾(如通過一層尼龍網(wǎng))、離心和溫和的裂解過程。
體外培養(yǎng)增殖的細胞可以通過多種方法被重新導(dǎo)入宿主或?qū)肫渌颊?。?yōu)選的是靜脈注射。任選的，宿主可以經(jīng)因子(如IL-2或IL-15)處理來提高體內(nèi)功能和活化細胞的存活。當然，經(jīng)培養(yǎng)增殖的細胞也可以各種藥物制劑的形式被重新導(dǎo)入。這些制劑可以包含正常使用的添加劑，如粘合劑、填充劑、載體、保護劑、穩(wěn)定劑、乳化劑和緩沖液。適當?shù)南♂寗┖洼o料，例如下述方法中使用的水、鹽水和葡萄糖。
因此，供體(異體的)或宿主類型的CD25+(自體的)細胞對抑制GVHD反應(yīng)都是有效的，進一步表明宿主CD25+細胞的保持將是臨床上所希望的。因為人CD4+CD25+調(diào)節(jié)細胞已經(jīng)顯示出抑制原始和記憶CD4 T細胞的體外異體反應(yīng)，并且能夠在體外擴增的同時保持抑制功能(Dieckmann等人，2001；Levings等人.，2001；Jonuleit等人，2001)，這些原理可應(yīng)用于本發(fā)明。Levings的報道是人CD4+CD25+多克隆擴增的唯一公開文獻，使用了可溶性的抗CD3和淋巴樣干細胞和PBMC作為滋養(yǎng)細胞+IL-2。但是，Levings等人記錄的抑制功能在抑制細胞/相應(yīng)細胞的比例為1∶1時只有65％的繁殖減少，比使用鼠Treg細胞觀察的一般結(jié)果要少。因此，不能認為Levings等人的報道對本文使用的長期體外培養(yǎng)增殖方法有暗示意義。
治療方法。本發(fā)明方法對人類特別有用，但也可以用于禽獸受體。“個體”、“受體”、“患者”或“宿主”在這里指脊椎動物，優(yōu)選的是哺乳動物。更優(yōu)選的，這類個體是人，經(jīng)培養(yǎng)增殖的細胞是人類的，盡管動物(包括人類疾病狀態(tài)的動物模型)也包括在本發(fā)明中，并且本文也考慮了這類動物的治療方法。如果想要，這類動物模型能夠用于測驗和調(diào)整本發(fā)明的組合物和方法。某些模型涉及為純系動物注射已構(gòu)建同系基因型細胞系。美國專利嵌合動物模型也是有用的，記載于美國專利5,663,481，5,602,305和5,476,993，歐洲申請379,554，以及國際申請WO 91/01760。非人類哺乳動物包括(但不限于)畜牧或農(nóng)業(yè)動物、體育競技動物和寵物。因此，相對動物模型，這類動物可以接受所選的治療性處理。
受體或宿主的免疫狀態(tài)可以是下述任何一種。個體對組合物中的某些抗原呈遞細胞(APC)或腫瘤相關(guān)抗原(TAA)可以是首次免疫性。個體可以目前沒有表達抗腫瘤免疫，但可以有免疫記憶，特別是有關(guān)特定抗原的T細胞記憶。含有本發(fā)明修飾和/或激活并增殖的細胞群的組合物，或其雞尾酒，能夠被注入用于預(yù)防性和/或治療性處理。在治療應(yīng)用中，組合物以足以預(yù)防、抑制、阻斷或限制、或至少是特別妨礙免疫源反應(yīng)的量為患者注入，例如在GVHD發(fā)作之前或在GVHD反應(yīng)及其并發(fā)癥期間注入。足以實現(xiàn)上述目的的量被稱為“治療有效量”。這一使用的有效量將依賴疾病的嚴重程度和患者自身免疫系統(tǒng)的綜合狀況，但一般范圍在大約0.05mg/kg體重-大約5mg/kg體重，優(yōu)選的在大約0.2mg/kg體重-大約1.5mg/kg體重。
在預(yù)防性應(yīng)用中，含有本發(fā)明修飾和/或激活并增殖的細胞群的組合物，或其雞尾酒，被注入尚未進入疾病狀態(tài)的患者，來提高患者抵抗力。這樣的量被定義為“預(yù)防有效量”。在這種使用中，準確的量還是依賴宿主的健康狀況和綜合免疫水平，但一般的范圍如上所述。
主治醫(yī)師可以選擇單次或多次注入組合物，以及劑量水平和方式。在任何情況下，藥物制劑應(yīng)該提供數(shù)量足以有效治療患者的本發(fā)明修飾的CD25細胞。
術(shù)語“免疫原”或“致免疫的組合物”或“疫苗”在本文用來指一種化合物或組合物，能夠a)在首次個體中產(chǎn)生抵抗抗原的免疫反應(yīng)，或b)重建、提高或保持個體中的免疫反應(yīng)。免疫反應(yīng)包括抗體、免疫反應(yīng)細胞(如輔助/誘導(dǎo)或細胞毒性細胞)或它們的任何組合。
細胞的“滅活”在本文指使細胞失去細胞分化生成子代的能力。但是，所述細胞能夠相應(yīng)刺激物或生物合成和/或細胞產(chǎn)物(如細胞因子)的分泌。滅活方法是現(xiàn)有技術(shù)已知的。優(yōu)選的失活方法是毒素(如絲裂霉素C)處理或輻射。被固定或透化處理并不能分化的細胞也是滅活細胞。
除非另有說明，本發(fā)明的具體方法的實施一般是采用現(xiàn)有技術(shù)范疇之內(nèi)的分子生物學、微生物學、細胞生物學、生物化學和免疫學的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)和必要的定義在文獻著作中有完整的說明，例如Molecular CloningA Laboratory Manual，第2版(Sambrook等人，1989)；Oligonucleotide Synthesis(Gait，1984)；Animal Cell Culture(Freshney，1987)；Methods in Enzymology(Academic Press，Inc.)；Handbook of Experimental Immunology(Weir & Blackwell)；GeneTransfer Vectors for Mammalian Cells(Miller & Calos，1987)；CurrentProtocols in Molecular Biology(Ausubel等人，1987)；PCRThePolymerase Chain Reaction(Mullis等人，1994)；Current Protocols inImmunology(Coligan等人，1991)。Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版(Martin，Mack Publishing Co.，Pa.，1990)中概括了藥物組合物制備和給藥的一般程序。
受治個體可以表現(xiàn)出有效的自身免疫反應(yīng)(體液或細胞免疫，或兩者同時)或GVHD。然而，患者應(yīng)該至少具有部分免疫能力，為了減小病理范圍的GVHD反應(yīng)。但是，已知癌癥患者或那些受自身免疫或其他免疫原性疾病影響的患者通常表現(xiàn)出一定程度的免疫抑制，這并不必然阻礙本發(fā)明組合物的應(yīng)用，只要該組合物可以安全有效的給藥。
能夠依照本發(fā)明治療的癌癥包括(但不限于)位于那些通常被認為是免疫赦免的部位的癌癥，如腦；和非免疫赦免部位的癌癥，如肺、結(jié)腸、胸腺、肝、子宮或卵巢、胰腺、前列腺、皮膚和血液；以及人體或動物體中許多其他特異性或非特異性部位的癌癥。這些癌癥的例子對于現(xiàn)有技術(shù)人員來說是已知的，并包括小細胞肺癌。
紿藥方式和劑量。本發(fā)明的組合物可以通過任何公知方法進行給藥，全身或局部都可以。為防止GVHD而給移植患者或癌癥患者注入異體活化細胞的最適給藥時間是在手術(shù)期間。為了在手術(shù)過程結(jié)束之前將細胞保持在特定部位，方便的細胞注入方式是以藥物可接受的人工膠或凝結(jié)血漿形式，或者通過使用任何其他已知的緩釋機制。
如果希望有較少的介入性操作，組合物可以通過針頭注射在目標部位。對于深層部位，針頭的定位可以使用超聲內(nèi)鏡技術(shù)、放射性閃爍顯像技術(shù)或其他成像技術(shù)，單獨使用或者與適當?shù)娘@示儀或套管結(jié)合使用。為了這類應(yīng)用，細胞群懸浮于大約10ml的等滲鹽水或中性緩沖液后被適當?shù)淖⑷搿?br> 類似的，在異體移植之前或同時，有效量的分離的CD4+CD25+細胞(優(yōu)選的經(jīng)修飾來提高或培養(yǎng)提高其抑制作用)作為細胞移植物以足以防止或阻斷GVHD發(fā)生的量被注入抑制受體(宿主)。在另外的實施方式中，細胞移植物是在異體移植后被注入來阻斷、限制或逆轉(zhuǎn)可能已經(jīng)發(fā)生的GVHD。所給劑量是有效引發(fā)所要治療反應(yīng)的量，所述反應(yīng)是本文其他地方所述的免疫反應(yīng)的刺激或癌癥的治療。對于本發(fā)明的藥物組合物，有效劑量范圍一般在106-1012個細胞，更優(yōu)選的是108-1011個細胞，包括異體刺激細胞和反應(yīng)細胞。優(yōu)選的，使用1×109-5×1010；更優(yōu)選的是2×109-2×1010。平均需要109培養(yǎng)增殖的Treg細胞用于人體臨床實驗。當多重劑量結(jié)合使用來獲得想要結(jié)果時，每個劑量都落入有效劑量的范圍。
經(jīng)移植或注射入的組合物的各種組分以“有效組合”存在，意味著有足量的每種組分來使組合物有效。優(yōu)選的，存在的響應(yīng)細胞至少為大約1×108，更優(yōu)選的大約為5×107-2×109，更優(yōu)選的大約為2×109-2×1010。存在的抑制細胞至少為大約1×107，更優(yōu)選的大約為5×107-5×109，更優(yōu)選的大約為1×108-2×109。異體淋巴細胞與抑制粒細胞的比例一般為1∶1-100∶1，通常大約為5∶1-25∶1，典型的為大約10∶1，如本文具體實施例中進一步描述的。然而，任何數(shù)目的組成細胞或其他成分可以被使用，只要組合物作為整體是有效的。這還取決于培養(yǎng)條件和制備過程中的其他因子。
對于在患者中產(chǎn)生免疫反應(yīng)或治療癌癥或減輕GVHD作用的其他療法，本發(fā)明的藥物組合物可以在上述療法之后或之前給入，或者替代該療法或與之結(jié)合使用。例如，患者可以在之前已經(jīng)或正在接受化療、放療和其他形式的免疫治療和繼承性轉(zhuǎn)移。
當使用這類藥征時，它們優(yōu)選的運用方式或時間是不干擾本發(fā)明組合物的免疫原性?；颊咭部梢砸呀?jīng)被注入了另外一種組合物(如疫苗)，目的是刺激免疫反應(yīng)。這類替代組合物可以包括腫瘤抗原疫苗、編碼腫瘤抗原的核酸疫苗、抗個體基因型疫苗和其他類型的細胞疫苗，包括表達細胞因子的腫瘤細胞系。當培養(yǎng)增殖的Treg細胞來源于特異源(如癌或癌細胞)時，該術(shù)語將包括，例如，不僅是原發(fā)腫瘤細胞，還包括來源于腫瘤祖細胞、轉(zhuǎn)移癌細胞和體內(nèi)培養(yǎng)物的任何細胞，來源于癌細胞的細胞系。
本發(fā)明的某些具體實施方式
涉及聯(lián)合治療。在一個聯(lián)合療法中，在組織移植之前、之中或之后為患者注入體外培養(yǎng)增殖的自體或異體CD4+CD25+T細胞，來提高移植物移入并抑制或防止GVDH反應(yīng)。盡管只公開了單次注入，但這類注入可以在細胞植入后每周進行并持續(xù)一段時間(如4-6周)，來提高宿主體內(nèi)的抑制反應(yīng)或治療效果。所述注入也可以在間隔幾個月后進行，來補充反應(yīng)。相應(yīng)的，本發(fā)明的某些實施方式涉及注入細胞移植物并隨后通過為患者注入含有異體活化的人類CD4+CD25+T細胞的組合物來增強治療作用或免疫反應(yīng)，所述T細胞對患者來說是自體或異體的，但是在體外處理的。當患者是癌癥患者或后代時，某些實施方式可以進一步包含腫瘤細胞或其后代的滅活細胞群。
優(yōu)選實施方式中，異體細胞移植物也會提供想要的結(jié)果，盡管它可能與使用自體細胞而言需要更多的細胞。另外，如果細胞經(jīng)高度嚴格的純化和CD25清除來減小為獲得治療效果所需的細胞體積并提高細胞移植物的效力，那么該方法具有較高的成功可能。
本發(fā)明組合物的給藥時間由主治醫(yī)師判斷，并取決于患者的臨床情況、治療目標和目前正在接受的療法。免疫監(jiān)測的適宜方法包括一種單向MLR，使用患者PBL作為響應(yīng)細胞以及原發(fā)腫瘤細胞作為刺激細胞。免疫反應(yīng)也可以通過延遲的炎癥反應(yīng)表現(xiàn)在注射部位。監(jiān)測Treg細胞治療效果的適宜方法包括體外實驗，如MLR；或者體內(nèi)追蹤，如CT掃描、磁共振成像MRI)、用適宜成像試劑的放射性閃爍顯像、監(jiān)測腫瘤標志物抗原和患者臨床反應(yīng)?？梢越o入附加劑量，如按周或按月，直到達到想要的效果。此后，特別是當免疫或臨床受益出現(xiàn)消退時，可以按需要給入附加的加強或保持劑量。
當多重細胞移植物或者移植物和細胞疫苗的聯(lián)合使用給入同一患者時，需要注意疫苗中的異體淋巴細胞可能產(chǎn)生抗異型反應(yīng)。使用來自多個供體的異體細胞混合物以及在每次劑量中使用不同的異體細胞群，都是能幫助減小抗異型反應(yīng)發(fā)生的策略。
在治療過程中，定期評價患者的一般副反應(yīng)，例發(fā)熱反應(yīng)。副反應(yīng)通過適當?shù)闹С中耘R床護理來處理。
可選實施方式腫瘤淋巴細胞在體內(nèi)腫瘤生長過程中可以變成無反應(yīng)性和抗激活或表達。多種細胞因子可以部分逆轉(zhuǎn)T記憶細胞的無反應(yīng)性，即IL-2、IL-4、IL-15或IL-I+IL-6。這些細胞因子可以促進T細胞繁殖并可以代表由抗原呈遞細胞典型提供的基本的“二次信號”。因此，腫瘤致敏淋巴細胞的反應(yīng)性能可以通過與多種細胞因子和分裂素(如抗CD3抗體或刀豆球蛋白A)的共培養(yǎng)而得到恢復(fù)。
通過實施例進一步描述本發(fā)明。這些實施例的提供僅以說明為目的，而不是限制目的，除非另有說明。多個方案用于許多實際情況，目的只是為現(xiàn)有技術(shù)人員示范。這些例子不能被解釋為對權(quán)利要求的范圍的限制，更正確的說，權(quán)利要求應(yīng)該被解釋為包括任何所有根據(jù)本文公開說明的結(jié)果而顯而易見的變化形式。
實施例實施例1中描述的材料和方法通常應(yīng)用于實施例2-5，而實施例6中描述的材料和方法通常應(yīng)用于實施例7。
實施例1-患有NSCLC的患者體內(nèi)增加的CD4+CD25+細胞比例。
在機構(gòu)審查委員會批準的協(xié)議下獲得適當?shù)耐ǜ嬖S可后，在給患有I期或II期非小細胞肺癌的患者手術(shù)時收集外周血液和腫瘤。來自NSCLC患者的新鮮腫瘤樣本經(jīng)過無菌機械切割處理后進行酶解，如Woo等人(2001)所描述。細胞經(jīng)硅石膠態(tài)懸浮液Percoll(PharmaciaBiotech AB，Sweden)密度梯度分離。外周血液在收集腫瘤時獲得，并經(jīng)Woo等人(2001)所述方法處理并冷凍。
細胞因子生成的檢測是通過將70000個CD3+CD4+CD25-細胞或CD3+(-CD4+CD25+)細胞置于96孔板(Falcon，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ)中培養(yǎng)2天，總體積為200μl。收集上清液并使用Quantikine人類TGF-β、IL-2和IL-10 ELISA試劑盒(R&D Systems，Minneapolis，MN)來檢測細胞因子的生成。
各自的CD25細胞群被消化，用流式細胞儀分析腫瘤浸潤淋巴細胞(圖1)。對于繁殖實驗，96孔板包被了1μg/mL的抗CD3(Kung等人.，Science 206347-349(1979))或1μg/mL的抗CD3和抗CD28(Hansen等人，Immunogenetics 10247-260(1980))抗體，37℃過夜。來自患者或正常供體的外周血液淋巴細胞經(jīng)解凍后培養(yǎng)于RPMI10％FCS(Hyclone，Logan，UT)，每孔5×104細胞(200μl)，三份，37℃，5％CO2。經(jīng)純化的CD3+CD4+CD25-或CD3+(-CD4+CD25+)T細胞以可變數(shù)目(0-20,000，取決于樣品)被添加。阻斷實驗使用10μg/mL抗TGF-β抗體(R&D Systems)進行。通過測定[3H]胸腺嘧啶的摻入檢測繁殖。CD3+CD4+CD25+、CD3+CD4+CD25-或CD3+(-CD4+CD25+)細胞的濃縮在Cytomation(Fort Collins，CO)MoFIo細胞分類器(通過控制淋巴細胞、CD3+CD4+T細胞)上進行。
因此，當通過流式細胞儀測定CD3+CD4+淋巴細胞在分離于肺癌腫瘤樣本的總CD4+細胞群中出現(xiàn)的頻率(％)與肺癌患者的外周血液淋巴細胞(PBL)比較時，測得33％的腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)是CD4+CD25+。這與活化的調(diào)節(jié)T細胞表型相一致。圖1中，分布和平均值顯示為正常供體的PBL，n＝7；來自NSCLC患者的未刺激的腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)，n＝8；或NSCLC患者的未刺激的PBL，n＝9。注意，NSCLC患者的外周血液的CD4+CD25+細胞百分比有類似的增加。
相反，不足15％的正常供體PBL具有這種CD4+CD25+細胞表型，這與之前的報道(Shimizu等人，J.Immunol.1635211-5218(1999)；Jonuleit等人，2001)；Levings等人，2001；Dieckmann等人，2001)相一致。
實施例2-CD152(CTLA-4)在腫瘤浸潤淋巴細胞表面的明亮的組成性表達。
最近的研究表明，CTLA-4在鼠和人調(diào)節(jié)細胞上被上調(diào)(Jonuleit等人，2001；Dieckmann等人，2001；Read等人，2000)。因此，用流式細胞儀分析正常供體和NSCLC患者淋巴細胞的CD4、CD25和CTLA-4的表達。
在腫瘤細胞樣本衍生的其他淋巴細胞上檢測到了明亮的相當于CD4和CD8表達水平的CTLA4表面表達，而非通常觀察到的(通常需要透過細胞來檢測CTLA-4表達)預(yù)期暗淡或檢測不到的CTLA4表達(圖2)，而在正常供體的其他T細胞中，不足1％的T細胞是CTLA4表達陽性(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，根據(jù)對2種代表性患者(證明了CD4+CD25-和CD4+CD25+TIL，和外周血液單核細胞(PBMC)中的CTLA4表達的患者)的評估，圖2A顯示了流量直方圖，而圖2B顯示了5個連續(xù)NSCLC患者的CD4+CD25-腫瘤浸潤淋巴細胞(左)、CD4+CD25+TIL(中)和CD4+CD25+PBMC(右)中表達CTLA-4的細胞的平均(±S.E.)百分數(shù)。來自腫瘤樣本的CD4+CD25+細胞中，80％是CTLA-4表達并顯示了增加的CTLA-4表達。相反，腫瘤樣本中不足10％的CD4+CD25-淋巴細胞是CTLA-4陽性。
為了排除脫落的CTLA與活化的人T細胞表達的B7分子相結(jié)合(Greenfield等人，J.Immunol.1582025-2034(1997))，通過定量PCR檢測CTLA-4 mRNA。在CD4+CD25+細胞中觀察到比CD4+CD25+細胞中更高水平的CTLA-4 mRNA(2-7倍；n＝3例患者)(數(shù)據(jù)未顯示)。不同于CTLA-4在腫瘤樣本中的CD4+CD25+細胞上的一致表達，只有30％的來自肺癌患者的外周CD4+CD25+細胞的染色呈CTLA-4陽性(圖2)。
實施例3-腫瘤浸潤CD4+CD25+細胞抑制自體外周血液T細胞的繁殖。
為評價肺癌患者中CD4+CD25+CTLA-4+細胞的功能，通過高速細胞分類將CD4+CD25+細胞從保留腫瘤浸潤淋巴細胞中分離，并測定它們的繁殖能力和對T細胞繁殖的作用。調(diào)節(jié)性T細胞在對有絲分裂刺激的反應(yīng)中一般不能繁殖(Shevach等人，J.Exp.Med.193F41-F46(2001))。為證實這一點，50,000個CD4+CD25+或CD3+腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)清除的CD4+CD25+細胞被固定化抗CD3和抗CD28刺激。CD3+細胞清除的CD4+CD25+細胞繁殖了，而CD4+CD25+細胞沒有繁殖(數(shù)據(jù)未顯示)。
接著，自體外周血液淋巴細胞在有數(shù)目增加的推定調(diào)節(jié)細胞存在的次佳或最佳條件下接受刺激。自體PBL被單獨培養(yǎng)或與數(shù)目增加的經(jīng)分類純化的來自肺癌樣本的CD4+CD25+或CD4+CD25-腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)一起培養(yǎng)。對照培養(yǎng)物中加入CD4+CD25+TIL?？扇艿目笴D3或固定化的抗CD3誘導(dǎo)了次佳的繁殖，固定化的抗CD3和抗CD28誘導(dǎo)了最佳的繁殖。4天培養(yǎng)的最后18個小時期間檢測[3H]胸腺嘧啶摻入。結(jié)果表達為單獨培養(yǎng)的PBL的響應(yīng)百分數(shù)。對于CD25-曲線，100％繁殖在37081±4094cpm，對于CD25+曲線，100％繁殖在29465±1007cpm。
正如預(yù)期的，可溶的抗CD3刺激的低水平繁殖，以及加入腫瘤浸潤CD4+CD25+T細胞后觀察到的可溶性抗CD3刺激的繁殖的直接抑制(圖3A)。但是，固定化的(平板固定)抗CD3誘導(dǎo)了更旺盛的繁殖，隨著CD4+CD25+細胞的加入而出現(xiàn)劑量依賴性的T細胞繁殖下降。
但是，不同于之前報道的鼠T細胞(Thornton等人，1998)，抗CD3和抗CD28(塑料固定化的抗CD3/CD28)刺激的最佳繁殖也因加入10-20％的來自肺癌樣本的CD4+CD25+淋巴細胞而被抑制(圖3B)。該抑制是有效的。在5個連續(xù)患者中，向50000個自體PBL加入10000個CD4+CD25+T細胞，產(chǎn)生了對抗CD3/CD28刺激的自體PBL繁殖60％的平均抑制。相反，CD3+腫瘤浸潤淋巴細胞清除的CD4+CD25+細胞細胞(圖3B)或受輻射的與響應(yīng)細胞一起培養(yǎng)的PBL(數(shù)據(jù)未顯示)都抑制了自體PBL的繁殖，說明了該作用不歸因于空間或營養(yǎng)缺陷。
實施例4-CD4+CD25+腫瘤浸潤淋巴細胞未能抑制自體PBL細胞。
為測定新分離的腫瘤浸潤CD4+CD25+T細胞抑制外周血液T細胞繁殖的能力，將正常供體的異體外周T細胞或不相關(guān)肺癌(NSCLC)患者的自體PBL與癌癥患者的腫瘤浸潤CD4+CD25+細胞一起培養(yǎng)(使用的細胞量分別顯示在圖4A和4B)。本實施例中所有的細胞培養(yǎng)物經(jīng)平板固定的抗CD3/CD28刺激。在4天培養(yǎng)期的最后18小時中測定[3H]胸腺嘧啶的摻入。
CD4+CD25+T細胞不能抑制抗CD3/抗CD28刺激的正常供體的PBL的繁殖(圖4A)，而CD4+CD25+T細胞數(shù)目增加實際產(chǎn)生了提高的增殖作用。在對照培養(yǎng)中，腫瘤衍生的CD4+CD25+T細胞有效抑制了抗CD3/28誘導(dǎo)的自體PBL繁殖(圖4B)，證實了這類腫瘤衍生CD4+CD25+T細胞群的抑制功能。結(jié)果表示為三次獨立實驗中一次實驗(圖4A)或兩次獨立實驗中一次實驗(圖4B)的三份培養(yǎng)物的平均值(±S.E.)，每次實驗具有相似的結(jié)果。
然后，將正常供體的外周血液細胞與自體分類純化的外周血液CD4+CD25+供體T細胞一起培養(yǎng)，如圖4C所示。由于是使用腫瘤衍生的CD4+CD25+T細胞的情況，通過與分離于外周血液的增加數(shù)目的自體CD4+CD25+T細胞一起培養(yǎng)，正常供體響應(yīng)PBL的繁殖受到了抑制(圖4C)。結(jié)果表示為兩次獨立實驗中一次實驗的三份培養(yǎng)物的平均值(圖4C)，每次實驗具有相同的結(jié)果。
然后，將腫瘤浸潤CD4+CD25+或CD4+CD25-細胞與NSCLC患者的自體PBL一起培養(yǎng)。然而，來自患者A的腫瘤衍生CD4+CD25+細胞沒能抑制來自無關(guān)NSCLC患者B的PBL的繁殖，如圖4D所示。結(jié)果表示為4次獨立實驗中一次實驗的三份培養(yǎng)物的平均值(圖4D)，每次實驗具有相同的結(jié)果。
這些實驗一起說明，浸潤腫瘤的調(diào)節(jié)性T細胞有效抑制分裂素誘導(dǎo)的自體T細胞的繁殖，但是它們沒能抑制異體PBL的繁殖。
實施例5-TGF-β對抑制繁殖不是必需的為確定從腫瘤分離的調(diào)節(jié)性T細胞的TGF-β分泌是否有助于它們的抑制功能，CD4+CD25+和CD3+細胞清除的來自肺癌樣本的CD4+CD25+細胞于培養(yǎng)液中培養(yǎng)2天。ELISA檢測上清液中的TGF-β。6例患者中的有代表性的一例結(jié)果(三個板孔的平均值±S.E)中，未經(jīng)刺激的、分類純化的CD4+CD25+T細胞組成性地生成了大量TGF-β(圖5A)，但ELISA沒有檢測到IL-2和IL-10的生成(數(shù)據(jù)未顯示)。
自體PBL被單獨培養(yǎng)或用可變數(shù)目的CD4+CD25+細胞培養(yǎng)，并經(jīng)平板固定的抗CD3/CD28刺激。加入0μg/mL和10μg/ml的抗TGF-β中和抗體。在4天培養(yǎng)期的最后18個小時期間內(nèi)檢測[3H]胸腺嘧啶的摻入。結(jié)果表示為兩次獨立實驗中的一次實驗的三份培養(yǎng)物的平均值(±S.E.)，每次實驗的結(jié)果相似。10μg/mL抗TGF-β抗體(已知足以中和50ng/mL TGF-β的作用)的加入沒有消除CD4+CD25+T細胞對抗CD3/28誘導(dǎo)的自體PBL繁殖的抑制作用(圖5B)。因此，圖5A和5B一起表明，腫瘤浸潤CD4+CD25+細胞的組成性TGF-β分泌不是抑制自體PBL繁殖所必需的。
實施例6-免疫調(diào)節(jié)性CD4+CD25+細胞的清除導(dǎo)致體內(nèi)GVHD致死率的加速。
現(xiàn)有研究已經(jīng)證明CD4+CD25+免疫調(diào)節(jié)細胞是通過共刺激阻斷而體外誘導(dǎo)異體抗原耐受所必需的(Taylor等人，2001)。而且，分級數(shù)目的新純化的B6CD4+CD25+細胞的加入導(dǎo)致了組成為B6CD4+CD25-響應(yīng)細胞和受輻射bm12刺激細胞的MLR中劑量依賴性的異體反應(yīng)抑制，而CD25清除的CD4+T細胞導(dǎo)致了升高的反應(yīng)(Taylor等人，2001)。因此，考察了這些專職抑制細胞在調(diào)節(jié)異體抗原的T細胞反應(yīng)和移植物抗宿主疾病(GVHD)中的潛在作用。
為純化整體或CD4+T細胞，在本實施例和下述實施例7和8中，使用鼠衍生的T細胞，液前線、腸系膜、腹股溝的淋巴結(jié)經(jīng)搗碎，單細胞懸液通過網(wǎng)孔并收集于含有2％胎兒牛血清(FBS)的PBS中(HyClone，Logan，UT)。細胞制備物被清除了NK細胞(雜交瘤PK1 36，鼠IgG2a)和CD8+T細胞(為了CD+細胞純化)(雜交瘤2.43，鼠IgG2b)，通過與單克隆抗體(mAb)培養(yǎng)后經(jīng)過山羊抗鼠(mouse)和山羊抗鼠(rat)Ig包被柱(Cellect Cell Enrichment Immunocolumns，Cedarlane，Homby，Ontario，Canada)。通過流式細胞分析測定純化后T細胞的最終組成為≥94％完整或CD+T細胞。
已經(jīng)表明，CD25免疫調(diào)節(jié)細胞通過與抗CD25mAb培養(yǎng)而被清除(雜交瘤3C7，鼠IgG2b，BD PharMingen(San Diego，CA)和綿羊抗鼠Dynabeads(Dynal，Lake Success，NY)，并經(jīng)測定為＞95％清除。為富集CD4+CD25+細胞，用抗CD25生物素培養(yǎng)經(jīng)純化的CD+細胞(雜交瘤7D4，鼠IgM)，然后用抗生物素蛋白鏈霉素-PE培養(yǎng)(兩者均為BDPharMingen產(chǎn)品)。與MACS抗PE微珠培養(yǎng)后，細胞在MS或VSMACS分離柱(均為Miltenyi Biotec，Auburn，CA)上被陽性選擇。細胞被確定為90％CD4+CD25+(也被簡單稱為“CD25+細胞”)。
輻射強度和供體細胞的CD25+細胞清除的作用。為確定T細胞供體接種物中CD25+細胞的清除是否會導(dǎo)致加速或增加的體內(nèi)GVHD致死率，或者是否GVHD致死率只有在不致死的全身照射(TBI)條件下才是可有效的。獲自Jackson實驗室(Bar Harbor，ME)的B6.C-H2bm12/KhEg(bm12)(H2b)小鼠在8-12周大時被使用。所有的小鼠都被養(yǎng)在一個特殊的沒有病原菌的實驗室中，置于隔離的籠子中。bm12受體經(jīng)不致死的輻射(在這一特定實驗和整個實施例過程中)，在細胞注入之前的4個小時，將小鼠暴露于來自137銫輻射源的6.0Gy TBI，劑量率為85cGy/分鐘。經(jīng)不致死的輻射后的bm12小鼠在第一次實驗中被給入1×105II類不同的細胞，完整的B6 CD4+T細胞或CD25清除的B6 CD4+T細胞(圖6A)，而第二次實驗中，給入0.5×105I同樣的細胞，即完整的B6 CD4+T細胞或CD25清除的B6CD4+T細胞(圖6B)。細胞是通過靜脈注射給入。
每天監(jiān)測小鼠的存活，每周測兩次體重并檢查GVHD的臨床表現(xiàn)。存活數(shù)據(jù)通過生命表方法來分析，顯示了精確計算的存活率。通過記錄分類測試數(shù)據(jù)統(tǒng)計進行成組比較。P＜0.05被認為是顯著的。在較高劑量下，所有的小鼠死于GVHD(圖6A)，而在降低的劑量下，存活率是20％長期(圖6B，P＝0.0068)。
CD25清除的CD4+T細胞受體死于GVHD的時間比完整CD4+細胞的受體早1周-10天(p＝0.024)。因為105個細胞導(dǎo)致了快速、高度致死的GVHD，所以采用較低細胞劑量(0.5×105)來重復(fù)實驗，來試圖放大存活率的差別(圖6B)。0.5×105個CD25清除的CD4+T細胞的所有受體在細胞注入后19天死于GVHD。因此，供體T細胞接種物中的CD25+細胞下調(diào)了GVHD反應(yīng)，而供體T細胞接種物中CD25+細胞的清除加速了GVHD。盡管GVHD在完整CD4+T細胞受體中的發(fā)生較慢，但體內(nèi)移植前受體的CD25+細胞清除加速了GVHD。
使用來自不同種屬的、清除了T細胞的骨髓或脾細胞對GVHD的影響。在另外一系列實驗中，BALB/c受體在移植前接受x射線的致死性輻射，所述移植是用異體T細胞清除的骨髓和(i)2×106個完整脾或純化的完整淋巴結(jié)CD4+T細胞或(ii)2×106個CD25清除的CD4+細胞(見圖7)。所有的CD25清除的CD4+T細胞的受體在移植后63天之內(nèi)死亡(平均存活＝35天)。相反，接受了2×106個完整CD4+T細胞的小鼠中有25％存活到100天(8只小鼠/組；平均存活＝91天)(圖7，P＝0.016)。
CD25清除對GVHD生成的影響在3個不同種屬組合中被檢測，所述種屬組合中的GVHD由CD4+和CD8+T細胞介導(dǎo)。BALB/c重度聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠(購買自National Institutes of Health，Bethesda，MD)沒有經(jīng)過輻射，但是在異體T細胞移植前2天和4天，通過腹腔注射25μl的anti-asialo GM1(Wako Chemicals USA，Inc.Richmond，VA)來清除NK(NK清除的BALB/c SCID小鼠)。已經(jīng)指明，供體類型的CD25+細胞通過單獨的靜脈注射被注入。
在首次GVHD模型中，未經(jīng)輻射的、NK清除的BALB/c SCID小鼠受到了完整的T細胞或CD25清除的T細胞(圖8)。T細胞的CD25清除導(dǎo)致了GVHD致死的加速(圖8，P＝0.021)，表明CD4+CD25+細胞在缺少TBI的條件下在CD4+和CD8+T細胞介導(dǎo)的GVHD中起作用。
在第二個種屬聯(lián)合中，經(jīng)致死性輻射的B10.BR小鼠(B1O.BR(H2k)，來自Jackson實驗室，Bar Harbor，ME)被給入B6 BM和15×106個完整的或CD25清除的B6脾細胞(圖9)。(注意B6和bm12(均為H2b)由于II類IA區(qū)域突變而有三個氨基酸不同)。CD25清除的脾細胞的受體死于GVHD的時間比完整脾細胞的受體早10天(P＝0.055)。
在第三個種屬聯(lián)合中，B6受體小鼠在移植前被切除了胸腺，來防止移植后供體BM衍生的CD4+CD25+免疫調(diào)節(jié)細胞的出現(xiàn)。另外，抗CD25mAb(雜交瘤7D4)以0.5mg/每次注射的劑量在移植后第10、7、4天被靜脈注入(0.5mg抗體/每次注射)那些切除了胸腺的成年受體中，來清除宿主體內(nèi)的CD4+CD25+調(diào)節(jié)細胞。裸鼠中產(chǎn)生的腹水經(jīng)硫酸銨沉淀，抗CD25mAb被部分純化?？笴D25mAb處理的或?qū)φ誱Ab處理的胸腺切除的B6小鼠經(jīng)致死性輻射后植入BALB/cBM和15×106個完整的脾細胞，并監(jiān)測存活(圖10)。只有在移植前經(jīng)抗CD25mAb體內(nèi)處理的小鼠與對照相比具有明顯低的平均存活率(22對44天)。所有抗CD25mAb處理的受體在移植后28天內(nèi)死于GVHD，比對照抗體的受體早58天(圖10，P＝0.0063)。
總結(jié)，這些數(shù)據(jù)表明CD4+CD25+免疫調(diào)節(jié)細胞在GVHD生成中起了關(guān)鍵的抑制作用，不論種屬聯(lián)合，也不論GVHD是由CD4+T細胞介導(dǎo)還是由CD4+和CD8+T細胞介導(dǎo)。
實施例7-體外活化并擴增的CD4+CD25+免疫調(diào)節(jié)細胞減輕GVHD。
盡管前面的數(shù)據(jù)表明了新純化的CD4+CD25+細胞與CD4+細胞以1∶1比例注入時只具有非常溫和的防治GVHD作用(Taylor等人，2001)，但是假設(shè)CD4+CD25+細胞的GVHD防治作用能臨床開發(fā)用于抑制GVHD致死。由于CD4+CD25+細胞在鼠和人中只占總CD4+細胞群的5-10％，具有顯著治療益處的足量新純化的免疫調(diào)節(jié)性T細胞的給入可能在臨床上是不能實現(xiàn)的。但是，因為數(shù)據(jù)表明CD4+CD25+細胞能夠成為更有效的活化抑制細胞，假設(shè)CD4+CD25+細胞的體外活化和擴增將使免疫調(diào)節(jié)細胞治療在臨床上能夠?qū)崿F(xiàn)。因此，為了初步確定最佳的培養(yǎng)條件，試驗了4種不同的用于活化CD25+細胞的條件(即條件1-4)，評價了每種條件的效果并將結(jié)果應(yīng)用于其余的實驗。
Treg細胞的培養(yǎng)和體外活化條件條件1最初的嘗試利用了Thornton等人(2000)報道的方法，用可溶性抗CD3mAb、同系基因型的抗原呈遞細胞(APC)和高劑量IL-2(100U/ml)體外培養(yǎng)經(jīng)純化的CD4+CD25+細胞。濃縮的CD25+細胞以0.5×106細胞/ml的終濃度懸浮于24孔板(Costar，Acton，MA)并培養(yǎng)一周。培養(yǎng)介質(zhì)是DMEM(BioWhittaker，Walkersville，MD)，添加了10％FBS(HyClone)、50mM 2-ME(Sigma，St.Louis，MO)、10mM HEPES緩沖液、1mM丙酮酸鈉(Life Technologies，Grand Island，NY)，以及氨基酸添加物(1.5mM L-谷氨酰胺和L-天冬酰胺)(Sigma)和抗生素(青霉素100U/ml，鏈霉素100mg/ml)(Sigma)。最初，可溶性CD3(0.5μg/ml)(雜交瘤145-2C11，倉鼠IgG)(BD PharMingen)和重組人IL-2(5.0ng/ml)(Amgen，Thousand Oaks，CA)被用于激活細胞(“條件1”)。
但是，盡管采用該方案將活化的細胞擴增了10-15倍，但是它們的抑制功能受到顯著損傷。增殖活化的CD4+CD25+細胞與等量的新鮮GVHD誘導(dǎo)CD4+T細胞結(jié)合時沒有抑制GVHD(數(shù)據(jù)未顯示)。另外，不同于新分離的CD4+T細胞，以同樣的體外活化方案擴增的對照CD4+CD25-細胞被注入異體受體后沒能介導(dǎo)死亡，表明這一擴增及活化方案導(dǎo)致了體內(nèi)功能的普遍喪失(數(shù)據(jù)未顯示)。
條件2接下來，利用如上同樣的培養(yǎng)條件對CD25+體外活化方案進行了調(diào)整；但是，不同于可溶性抗CD3mAb，調(diào)整后的方案利用了固定化的抗CD3(5.0μg/ml和IL-2(100U/ml))(″條件2)。3天后，細胞從抗體包被平板上移走并轉(zhuǎn)入新平板，加入含有IL-2的培養(yǎng)基來使T細胞受體(TCR)重新表達。然后在含有IL-2的培養(yǎng)基中擴增4天。這一方案產(chǎn)生了15-20倍的CD4+CD25+細胞擴增。
在C57BL/6(B6)、BALB/c(H2d)和BALB/c重度聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠(NIH)的體內(nèi)評價擴增的CD25+細胞抑制GVHD生成的能力。200萬新純化的B6 CD4+T細胞被注入未輻射的、NK清除的BALB/c SCID受體中。小鼠隊列接受了2×106個活化CD4+CD25+細胞或CD4+CD25-細胞的單獨注射。細胞經(jīng)固定化抗CD3mAb和高劑量IL-2被活化并培養(yǎng)一周，監(jiān)測存活和體重(圖11，數(shù)據(jù)未顯示)。體外擴增的CD25+細胞的注入顯著提高了平均存活時間，從10天到72天(圖11，p＝0.022)。接受了附加的擴增的CD25-細胞的小鼠的存活明顯不同于只接受新CD4+T細胞的對照小鼠(圖11，p＝0.285)，表明防治作用是對CD25+細胞群特異性的。
盡管注入活化并增殖的CD25+細胞顯著延長了存活時間，但是小鼠具有實質(zhì)的GVHD臨床表征(20％體重下降、腹瀉、弓背、粗糙的皮毛和全身性紅斑)并最終死于GVHD。這些數(shù)據(jù)表明盡管CD25+細胞能夠在體外顯著擴增而獲得顯著抑制GVHD的足夠數(shù)量的細胞，但是需要對活化和擴增方案進行額外的改良來提高抗GVHD作用。
比較實驗為優(yōu)化活化并培養(yǎng)B6 CD25+細胞的方法，比較了三種不同的方法。用于比較的標準是條件2活化方案，意味著通過上述的(i)固定化抗CD3和(ii)高劑量IL-2(100U/ml)進行活化。所有的培養(yǎng)物＞95％生命力。
條件3因為固定化抗體能夠?qū)е聫姷腡CR信號傳導(dǎo)和活化誘導(dǎo)的細胞死亡(Lenardo，Nature 353858-861(1991)；Wesselborg等人，J.Immunol.1504338-4345(1993)；Lissy等人，Immunity 857-65(1998)；Carpenter等人，J.Immunol.1656205-6213(2000))，需要實驗一種活性較小而通用的活化方法。因此，在“條件3”中，經(jīng)輻射的BALB/c脾刺激細胞被加入到經(jīng)純化的B6 CD25+細胞(比例為2∶1)，來誘導(dǎo)更多生理水平的TCR信號傳導(dǎo)和活化，細胞在高劑量IL-2(100U/ml)存在下培養(yǎng)。
評價培養(yǎng)條件的一個重要部分是回復(fù)數(shù)據(jù)，因為該方法的臨床可行性取決于能夠注入足夠數(shù)目的活化CD25+調(diào)節(jié)細胞。條件3培養(yǎng)方案利用了固定化抗CD3和高劑量IL-2，在一周內(nèi)產(chǎn)生了12倍的細胞擴增，而異體宿主類型的脾刺激細胞經(jīng)輻射后啟動用于活化的T細胞受體，高劑量的IL-2只產(chǎn)生了1.5倍的細胞擴增。
條件4雖然最佳擴增可能需要相對高劑量的IL-2，但是從高劑量減少到相對高劑量會影響體內(nèi)移植的細胞存活，因此有可能導(dǎo)致不如最佳GVHD防治作用，這是測試“條件4”的另外一個原因((Lenardo，1991)。條件4利用了受輻射的BALB/c脾刺激細胞和低劑量的IL-2(降至10U/ml)，重組人轉(zhuǎn)化生長因子β2(TGF-β2；1.0ng/ml)(R&DSystems)作為CD4+CD25+的一種附加生長因子而被加入。
條件4的方法利用了異體脾刺激細胞、低劑量IL-2和TGF-β，導(dǎo)致了低回復(fù)率，一周內(nèi)只有31％的注入細胞回復(fù)。
評價了經(jīng)培養(yǎng)的所有3個類型CD25+細胞(CD4+；CD4++活化的CD25-；CD4++活化的CD25+)抑制GVHD的能力，所述抑制由CD4+和CD8+T細胞介導(dǎo)(圖12)。6只BALB/c SCID小鼠接受106CD25清除的完整T細胞來誘導(dǎo)GVHD。兩個分開的小鼠隊列(每組6只小鼠)還接受了106CD25+細胞，該細胞是在前兩種條件下培養(yǎng)的(抗CD3/IL-2(條件2，如圖12中一系列空心矩形所示)或者異體APCs/IL-2(條件3，如圖12中一系列空心三角形所示))。第三隊列(每組6只小鼠)接受106CD25-清除的完整T細胞和0.5×106個用受輻射的BALB/c脾細胞培養(yǎng)的CD25+細胞，低劑量IL-2和TGF-β(條件4，如圖12中星形所示)；但是，因這組中不足的回復(fù)率而未能使106CD25+細胞的完全注入。
所有的CD25-T細胞受體在細胞移植后8天內(nèi)死亡(圖12)。相反，培養(yǎng)的CD25+細胞的注入顯著抑制了GVHD致死，不論培養(yǎng)方案如何。新鮮CD25-T細胞和CD25+細胞(經(jīng)固定化抗CD3mAb和高劑量IL-2擴增)的受體有50％(3/6)在細胞移植后2個月依然存活。CD25-T細胞和CD25+細胞(經(jīng)BALB/c脾細胞和高劑量IL-2培養(yǎng))的受體存活時間更長，但是所有小鼠在54天(平均存活時間是31天)內(nèi)死于GVHD(圖12)。與對照組比較，所有P值≤0.016(圖12中一系列圓圈所示)。
盡管注入較低的細胞數(shù)目，該方案培養(yǎng)的CD25+細胞在至少兩個月內(nèi)保護了6個受體中的5個免于GVHD致死。這些數(shù)據(jù)一起說明CD4+CD25+細胞能夠容易的在體外擴增足夠數(shù)目，來提供對快速致死的GVHD的明顯防治。
GVHD癥狀發(fā)生后的GVHD治療為確定注入活化增殖的CD25+Treg細胞能否用于治療GVHD，經(jīng)致死性輻射的B10.BR受體在第0天被給入單獨的C57BL/6BM或BM+脾細胞。在BM移植后第6天，此時有明顯的GVHD癥狀出現(xiàn)，包括在接受脾細胞的組中GVHD誘導(dǎo)的體重下降，表征有效的和正在進行的GVHD，單次靜脈注入經(jīng)活化并增殖的(抗CD3/IL-2/TGF-β)C57BL/6 CD4+CD25+細胞。每組10只小鼠中有9只接受移植和分析。經(jīng)活化增殖的CD4+CD25+細胞的注入能夠使40％的小鼠長期(152天)存活，對照組普遍在51天死亡(P＝0.002，脾+CD4/25對脾)(見圖13)。
因此，目前實驗過的抗GVHD療法，利用注入體外活化并擴增的CD25+Treg細胞的方法表現(xiàn)出最大的前途，如本模型系統(tǒng)中所評價的。
為防治GVHD的多次細胞注入除了通過將活化并增殖的CD4+CD25+細胞注入未受輻射的異體供體T細胞的SCID受體中所表現(xiàn)出的抗GVHD作用之外，在受致死性輻射的B10.BR受體中也觀察到了有效的抗GVHD致死作用，所述B10.BR受體接受了主要組織相容性完全不同的C57BL/6脾細胞(15×106)和C57BL/6 T細胞清除的骨髓(BM)。在該模型系統(tǒng)(脾+CD4/25細胞)中，BM移植后第0天和第4天(107/天)，將經(jīng)活化培養(yǎng)的(抗CD3/IL-2/TGF-β)CD4+CD25+細胞注入一列小鼠中。對照由單獨的BM或BM+附加的脾細胞組成，沒有注入CD4/25細胞。每組有8只小鼠接受移植。對照動物中觀察到普遍的GVHD死亡，而接受兩次CD4+CD25+細胞注入的受體具有低的致死率，88％長期存活(見圖14)。因此，這些數(shù)據(jù)表明多次細胞注入是無毒的，沒有引發(fā)GVHD，而事實上是高效防止了經(jīng)致死性輻射的、接受MHC完全不同的供體移植物的受體中的GVHD致死。
因此，由于CD4+CD25+細胞可以被擴增并多次注入，這些數(shù)據(jù)為急性和慢性GVHD治療試驗提供了原理求證，其中多次細胞注入物可以給入患者，從單個供體CD4+CD25+細胞分離程序到人類中出現(xiàn)頻率相對較低的細胞群的體外活化和培養(yǎng)所觀察到的顯著擴增。
移植物移入效果為了試驗促進了擴增的C57BL/6 CD4+CD25+細胞能力的移植物，抗CD3/IL-2/TGF□被單獨使用或與存活因子(IL-4，IL-7)共同使用。BALB/c受體被給入4.25Gy TBI和C57BL/6 T細胞清除的BM(107細胞/受體)，沒有CD4+CD25+細胞或者含有經(jīng)活化并擴增的CD4+CD25+細胞(5×106)。平均供體細胞為對照(41％)與CD4+CD25+細胞相比兩種擴增培養(yǎng)物分別為89％(P＝0.0003)或83％(P＝0.009)。移植物移入是多重譜系的并穩(wěn)定存在(第82天和第139天重復(fù)測試，結(jié)果相似)。受體沒有副反應(yīng)(包括GVHD)證據(jù)，所有組中存活良好(～75％長期)。因此，擴增的培養(yǎng)物能促進移植物移入。
使用活化并擴增的CD4+CD25+細胞富集L選擇蛋白Thorton等人(2000)報道了L選擇蛋白高位細胞沒有L選擇蛋白低位細胞更有效，最近，F(xiàn)u等人報道了新分離的CD4/25L選擇蛋白高位和低位細胞在抑制體內(nèi)基于繼承性轉(zhuǎn)移的自身免疫性胃炎中的體內(nèi)生物學活性上沒有差別(Amer.J.Transplant 465-78，2004)。
然而，為確定歸巢受體表達是否影響了活化并增殖的CD4+CD25+細胞的抗GVHD作用，使用抗CD3+抗CD28mAb包被磁珠(2天)+IL-2(100U/ml)培養(yǎng)C57BL/6 CD4+CD25+細胞。7天后，通過柱分離純化，活化并增殖的細胞因L選擇蛋白(CD62L)高(hi)或低(lo)水平表達而被富集。致死性輻射的bm12小鼠(C.H2bm12(B10.BR(H2k))被給入單獨的II類MHC不同的、C57BL/6 T細胞清除的BM或與附加的C57BL/6 CD4+CD25-T細胞一起給入(106個細胞/受體)。一些接受供體T細胞的受體隊列被給入體外活化增殖的CD4+CD25+CD62L-hi或CD4+CD25+CD62L-lo細胞(3×106細胞/受體)。對照由單獨BM(BM)或BM加C57BL/6 CD4+CD25-細胞(BM+CD4+CD25-)構(gòu)成。每組有8只鼠接受移植。在BM移植后35天，接受供體CD4+CD25-T細胞而沒有接受CD4+CD25+細胞的對照只有25％的存活率。接受了CD4+CD25+CD62L-lo細胞的受體具有38％的存活率，與那些沒有接受這種額外細胞群的受體沒有顯著差別(P＝0.35)。
明顯相反，接受體外活化并分離的CD4+CD25+CD62L-hi細胞的受體具有明顯較高的存活率(100％)，與那些沒有接受額外CD4+CD25+細胞的受體相比(P＝0.0016)或與那些接受CD4+CD25+CD62L-lo細胞的受體相比(P＝0.005)。因此，體內(nèi)注入經(jīng)CD3/28磁珠+IL-2增殖的CD4/25L選擇蛋白高位細胞與低位細胞相比，在抑制GVHD致死方面具有較多益處。這些數(shù)據(jù)進一步證實了體外活化培養(yǎng)的細胞可以細分為在嚙齒類動物中具有有效抗GVHD作用的細胞亞型，并且這個程序在體外活化并擴增后進行，能夠進一步提高這一細胞群在BM移植模型中的生物學活性。CD62L表達水平提供了這樣一種完成該目標的方法，但是其他方法是已知的或?qū)⒃诂F(xiàn)有技術(shù)中被定義。
本數(shù)據(jù)證明，在使用多種模型將體外活化并擴增的CD4+CD25+細胞注入異體受體中時，提供了有效的GVHD抑制和/或限制以及移植物移入促進作用。人類細胞研究已經(jīng)說明了一個體外現(xiàn)象，CD4+CD25+細胞能夠被活化擴增并同時保留對異體抗原的抑制能力。
實施例8-嚴格分離的Treg細胞的體外培養(yǎng)-增殖方法以及由此得到的細胞在人類免疫抑制治療中的應(yīng)用。
基于上述鼠研究和以前的研究(如Taylor等人報道，2002，同上)，采用抗CD3加IL-2體外多克隆擴增的Treg細胞(10天)在本文表現(xiàn)出有效的防治GVHD作用。其他人的研究已經(jīng)表明采用受輻射的異體APC加外源性IL-2體外擴增的Treg細胞能夠抑制GVHD(Cohen等人，2002，同上；Trenado等人，2002，同上)，而后續(xù)研究表明Treg細胞能夠防止GVHD，但是在動物模型中，它們依然具有抗腫瘤或移植物抗白血病(GVL)作用(Trenado等人，2002；Jones等人，2003；Edinger等人，2003，同上)。但是，人類Treg細胞在臨床的人類移植免疫抑制治療中的潛在作用被限制了，除非能夠開發(fā)出分離和長期培養(yǎng)增殖人類Treg細胞的方法，來提供足夠數(shù)量的細胞用于體內(nèi)注入。
為滿足這一需求，利用下調(diào)免疫反應(yīng)的天然生理學機制，發(fā)明人開發(fā)出了獨特的純化方法和體外培養(yǎng)增殖技術(shù)，提供了活化的人CD25+抑制T細胞，用于免疫抑制治療，特別是用于防止移植相關(guān)的免疫反應(yīng)。人類抑制細胞系在隨后的實驗中生成，保持功能的時間至少為3-6周。在一些情況下，培養(yǎng)中的細胞系保持功能性達3個月，依然具有有效抑制性。但是，為更好表現(xiàn)CD4+CD25+Treg細胞的功能，開發(fā)了一種經(jīng)改良提高的MACS純化方法，用來分離并培養(yǎng)增殖這些重要細胞。以下組分和方法在下述實驗中使用，形成了有效的培養(yǎng)物增殖的Treg細胞，能夠提供用于治療目的的顯著的抑制作用。
CD4+T細胞亞型的MACS純化。從正常健康自愿者供體的全血衍生的血沉棕黃層分離T細胞(Memorial Blood Centers，Minneapolis，MN)(在一些早期實驗中還使用了leukophoresis產(chǎn)物)。白細胞富集的血沉棕黃層細胞在聚蔗糖-泛影葡胺(ficoll-hypaque)層上離心收集PBMC。通過陽性選擇將CD25+明亮細胞從直接結(jié)合于抗CD25磁性微珠(2μl/107細胞)(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)的PBMC中分離，并在LS+柱上純化(LS+分離柱和MidiMACS分離裝置的使用可以從Miltenyi Biotec獲得)。然后將細胞上第二個磁性柱，洗滌后再次洗脫。經(jīng)過雙柱程序，經(jīng)FACS分析，細胞純度大約＞93％(對CD25)(其余為少量B細胞(4-8％)和CD8+T細胞(-1％))。
或者，細胞被間接染色，用抗CD25-FITC，克隆2A3(BectonDickinson Immunocytometry Systems，San Jose，CA)，經(jīng)洗滌后結(jié)合于抗FITC多孔微珠(3微升/107細胞，Miltenyi Biotec)并被陽性選擇。由于使用直接微珠系統(tǒng)，細胞再上一個第二柱。經(jīng)過柱純化，多孔珠被分離，使用mAb包被的微珠雞尾酒將CD25+細胞清除掉CD8、CD14、CD19、CD20和CD56表達細胞，為譜系清除。
使用更多的抗CD25微珠(10微升/107細胞)清除PBMC非CD25餾分中的CD25+細胞。然后通過抗CD4 mAb包被的磁性微珠(10微升/107細胞)(Miltenyi Biotec)的陽性選擇將CD4+T細胞從CD25餾分中分離出來。經(jīng)FACS分析，細胞一般為96-98％的純CD4+CD25-。
T細胞培養(yǎng)。分離的CD4+CD25+細胞或?qū)φ誄D4+CD25-細胞用抗CD3/CD28mAb包被的Dynabeads培養(yǎng)(U.Pennsylvania)(Levine等人，J.Immunol.159(12)5921-5930(1997)，Lapor等人，Blood102(6)2004-2013(2003))，磁珠與總細胞的比例為2∶1。CD4+CD25-滋養(yǎng)細胞在30Gy下輻射后以1∶1的比例加入CD4+CD25+細胞。細胞以100萬細胞(未經(jīng)輻射的)/ml的濃度下培養(yǎng)于24孔板中。在第3天加入50IU/ml的IL-2(Chiron，Emeryville，CA)。細胞按需要而被分裂，在快速生長期間大約每三天分裂1∶3。細胞培養(yǎng)液為RPMI-1640(Gibco)，并添加了10％FCS(Gibco)、L谷氨酰胺、青霉素和鏈霉素。
用于MLR培養(yǎng)物的刺激細胞。未成熟的人類樹突細胞(DC)產(chǎn)生于CD14+單細胞(Sallusto等人，J.Exp.Med.179(4)1109-1118(1994)，Banchereau等人，Annu.Rev.Immunol.18767-811(2000))，通過基于磁性微珠的純化(Miltenyi-Biotec)而從PBMC中被分離，并以106個細胞/ml培養(yǎng)于X-Vivo-15培養(yǎng)基，添加了GMCSF(終濃度為50ng/ml)和IL4(終濃度為20ng/ml)細胞因子(R&D Systems，Minneapolis，MN)。細胞在作為MLR刺激細胞使用之前被培養(yǎng)5-10天。
對于某些實驗，DC經(jīng)TNF-α(終濃度20ng/ml)和Poly IC(一種Toll樣受體(TLR)-3因子激動劑配基(終濃度為20μg/ml)(Sigma，St.Louis，MO)培養(yǎng)成熟2天(Cella等人，J.Exp.Med.189(5)821-829(1999)，Spisek等人，Cancer Immunol. Immunother.50(8)417-427(2001)，Godfrey等人，Blood 1031158-1165(2004))。在其他實驗中，TNF和PolyIC(以相同的濃度)或LPS(Sigma-Aldrich)(10-100-1000ng/ml)被直接加入MLR。DC刺激細胞經(jīng)30Gy輻射。
MLR實驗培養(yǎng)。響應(yīng)性CD4+CD25-T細胞和DC刺激性APC分別以5×104/孔和5×103/孔的濃度被培養(yǎng)于96孔U底板中。加入2.5×104/孔的測試培養(yǎng)的抑制性或常規(guī)T細胞系來進行標準測定，或者以梯度數(shù)目用來滴定實驗。對于抗體阻斷實驗，使用了1×104抑制性細胞。培養(yǎng)基為RPMI-1640(Gibco-Life Technologies，Grand Island，NY)，并添加了10％FCS(Gibco)、L谷氨酰胺、青霉素和鏈霉素?？装逶诘?、5、6和7天經(jīng)3H胸腺嘧啶脈沖，為最后16小時的培養(yǎng)。所有時間點具有6次重復(fù)。結(jié)果表示為次數(shù)/分鐘。然而，數(shù)據(jù)是用直接的β-粒子計數(shù)器而收集，因此，報告的cpm要低于用液體閃爍計數(shù)的典型報告值。所以，盡管計數(shù)的絕對量較低，但是實驗樣品間的相對差異保持一致。
細胞因子分析。培養(yǎng)上清液經(jīng)旋轉(zhuǎn)去除細胞，-80℃冷卻。通過Luminex測定系統(tǒng)評價上清液，使用基于橡膠珠的多重分析系統(tǒng)(R&D Systems，Minneapolis，MN)。
細胞毒性。在4小時的51Cr釋放實驗中檢測經(jīng)培養(yǎng)的抑制細胞系抗異種DC或NK敏感細胞系K562的細胞毒性。效應(yīng)細胞與靶細胞的比例為20∶1-0.6∶1。靶細胞經(jīng)200μCi鉻酸鈉-51Cr(DuPont，Wilmington，DE)標記60分鐘。所有檢測進行三份，測定了裂解百分比。陽性對照裂解的NK92細胞來自ATCC(American Type CultureCollection，Rockville，MD)并保存于含有500U/ml重組人IL-2(Chiron)的溶液中。
單克隆抗體(Mabs)。為繼續(xù)純化，細胞經(jīng)抗CD25-PE染色，由抗CD25-微珠，克隆M-A251(BD Pharmingen)，阻斷。其他用于流式細胞計數(shù)的抗體包括抗CD4-PerCP(克隆SK3)、抗CD8-PerCP(SK1)、抗CD 19-APC(4G7)，來自(Becton Dickinson ImmunocytometrySystems)；抗CD 27-FITC(MT271)、anti-CD62L-PE(Dreg56)、抗CD69-FITC(FN50)、抗CD152-PE(BNB)、抗CD122-PE(Mik-b2)、抗CD132-PE(AG184)和抗CD134(ACT35)，來自(BD Pharmingen)；以及抗CCR7-PE(#150503)和抗GITR-PE(#110416)，來自(R&D Systems)。針對阻斷抑制的功能性實驗中，使用的中和抗體的滴定量達20μg/ml?？贵w包括抗IL-10(23738)、抗L-10-受體-α(37607)和抗TNFβ-1，2，3(1D11)，來自(R&D Systems)。
流式細胞計量術(shù)。對于免疫熒光染色，細胞在40℃下用滴定量的每種抗體染色30分鐘。細胞經(jīng)再次洗滌后于FACS Calibur細胞計數(shù)器(BD Immunocytometry Systems)上進行分析。細胞系亞型在FACSVantage上被分選。用FIoJo軟件4.4版(Treestar，Ashland，OR)分析數(shù)據(jù)。使用多聚甲醛固定細胞完成細胞內(nèi)染色，2％、室溫30分鐘，隨后進行透化并染色1小時，在含有0.1％皂素的緩沖液(PBS加5％FCS-5％人類AB血清)中洗滌。
數(shù)據(jù)統(tǒng)計。圖15-21上的所有誤差條圖表示一個高于或低于平均值的標準偏差。成對、雙尾的Studentst檢驗被用來測定繁殖反應(yīng)之間的差異顯著性。P值＜0.05被認為是顯著的。
實驗結(jié)果。本文改良的MACS純化過程中使用了較低滴定度的抗CD25mAb包被微珠，導(dǎo)致細胞分離具有較高的CD25表達平均通道熒光強度。另外，磁性分離的細胞再經(jīng)過第二柱進行附加純化，進一步增加了CD25+細胞的富集?？煞蛛x微珠的使用實現(xiàn)了CD25純化后的磁珠去除，進而允許了后續(xù)的譜系清除(清除CD8、CD14、CD19和CD56細胞)。這一策略實現(xiàn)了高度純化的CD4+CD25+細胞群的生成(圖15C)。細胞的CD25陰性餾分被進一步清除CD25+細胞，并作為CD4+CD25-細胞純化的起源，用于常規(guī)T細胞對照的分離(圖15D)。
抗CD3/CD28珠和IL-2促進Treg細胞擴增。入CD4+CD25+Treg細胞對抗CD3mAb或DC刺激是低反應(yīng)性的。但是，當給入這些刺激物加IL-2或IL-15時，它們能夠繁殖，盡管繁殖的程度遠低于CD4+CD25-Treg細胞(Jonuleit等人.，2001，同上，Dieckmann等人，2001，同上))。因此，在初期實驗中，經(jīng)純化的CD4+CD25+細胞用固定化的抗CD3加IL-2擴增，在2周內(nèi)實現(xiàn)了5-10倍擴增。
為進一步放大擴增潛力，考察了基于附刺激因子的刺激。為此，使用了與抗CD3和抗CD28mAb共價結(jié)合的(3/28微珠)、細胞大小的Dynabeads。這一試劑已經(jīng)成功用于常規(guī)T細胞的臨床規(guī)模擴增，用于免疫治療實驗(Levine等人.，1997，Laport等人，2003)，并實現(xiàn)了超過1百萬倍的T細胞擴增。但出乎意料的是，嚴格純化的CD25+Treg細胞在3/28 beads單獨刺激下繁殖不充分。這與CD4+CD25-Treg細胞產(chǎn)生的積極反應(yīng)相反(圖16A)。但是，CD4+CD25+細胞的弱反應(yīng)被IL-2的添加所顯著放大，這一聯(lián)合足以用于來自大多數(shù)供體的Treg細胞的適度擴增(圖16B)。然而，CD4+CD25+細胞的純化越嚴格，其在培養(yǎng)液中的生長越差，甚至在3/28 beads和IL-2刺激下。
因為CD4+CD25+T細胞表現(xiàn)出細胞因子生成缺陷，得出結(jié)論常規(guī)T細胞能夠彌補這一缺陷，并提供增強的擴增。所以，經(jīng)輻射的CD4+CD25-滋養(yǎng)細胞在一開始被加入3/28微珠刺激的Treg培養(yǎng)物(1∶1)，發(fā)現(xiàn)它能提供持久增加的增殖反應(yīng)(圖16B)。這種放大顯著高于單獨使用100IU/ml的IL-2產(chǎn)生的放大作用。有趣的是，Treg培養(yǎng)物中補加條件培養(yǎng)基(20％v/v)(來源于經(jīng)活化的常規(guī)CD4+CD25-細胞，在3/28微珠刺激后第5天)，能夠大量(不是完全)產(chǎn)生滋養(yǎng)細胞的效果。這表明經(jīng)活化的常規(guī)T細胞生成了用于CD4+CD25+細胞擴增的可溶性生長因子(主要是IL-2，但也可以有其他因子)。重要的是，這些補入了滋養(yǎng)細胞的細胞系保持了有效的抑制功能。因此，由于3/28微珠、IL-2和CD4+CD25-滋養(yǎng)細胞的使用，CD4+CD25+衍生的細胞系表現(xiàn)出顯著的生長，很容易獲得超過100倍的擴增。
擴增表現(xiàn)為經(jīng)典的S型生長曲線，開始緩慢，快速擴增1-2周，然后到達穩(wěn)定期(圖16C)。在到達生長穩(wěn)定期后，細胞系保持在IL-2中，抑制功能維持3-6周。在某些情況下，培養(yǎng)達3個月的細胞系還具有抑制活性，但是，典型抑制功能隨時間下降(未顯示)。
MLR實驗中CD4+CD25+抑制細胞系的功能性評價。所有的細胞系在培養(yǎng)2-3周后初步篩查MLR中的抑制活性，接下來3-4周進一步進行分析。為評價抑制功能，使用了HLA不匹配的異體MLR實驗作為功能性分析。經(jīng)純化的、新分離的CD4+CD25-響應(yīng)T細胞與來自無關(guān)供體的、經(jīng)輻射的未成熟DC反應(yīng)。測試細胞(經(jīng)培養(yǎng)的CD4+CD25+和CD4+CD25-衍生細胞系)在第0天被加入MLR，調(diào)節(jié)性/響應(yīng)性細胞的比例為1∶2。減少的繁殖反映了抑制作用，在第6-7天最明顯，對照MLR峰。這些測定在供體中是非常有效和一致的，并因此成為本文標準的抑制量度。
CD4+CD25+衍生的細胞系大部分(19/25，76％)具有明顯的抑制功能(＞65％的增殖抑制)，抑制細胞/響應(yīng)細胞比例為1∶2(圖17A)。相反，發(fā)現(xiàn)CD4+CD25-衍生細胞系對放大MLR沒有變化(圖17A)。其余的CD4+CD25+衍生的細胞系(6/25，24％)具有弱抑制功能(20-65％的增殖抑制)，但是沒有放大MLR(圖17B)。與現(xiàn)有研究(Jonuleit等人，2001，同上)相一致，新分離的、MACS純化的CD4+CD25+細胞系在這些MLR實驗中只有中等的抑制活性，相當于弱抑制細胞系(20-65％的增殖抑制)(圖17B)。重要的是，(9/19，47％)的抑制細胞系具有有效的抑制活性，這些細胞系幾乎完全抑制MLR培養(yǎng)物(＞90％的增殖抑制)(圖3C)。抑制活性水平是每種細胞系的內(nèi)在特征，因為在分析的幾周時間內(nèi)進行的多次單獨MLR實驗中，被檢測的弱或強的抑制細胞系具有一貫相似的活性(見下)。
CD4+CD25+和CD4+CD25-細胞系的特征。有效的抑制細胞系與來自同一個體的CD4+CD25-衍生細胞系(作為常規(guī)T細胞對照)平行培養(yǎng)。弱抑制細胞系還被鑒定和比較，來確定相對有效抑制細胞系的區(qū)別特征。有趣的是，只根據(jù)培養(yǎng)中的生長特征經(jīng)常可以預(yù)測抑制功能，其中最快速生長的CD4+CD25+細胞系通常具有最低的抑制功能(未顯示)。
所有細胞系在經(jīng)3/28微珠刺激后初期表達一定程度典型的活化T細胞表型。細胞系短暫表達相對等量的活化抗原，并在活化后2-3周內(nèi)快速減少。這些包括CD122、CD132、GITR(糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的TNF受體)、OX40(CD134)和細胞表面CTLA4(CD152)。但是，在培養(yǎng)幾周后，當細胞相對靜止時(保持在IL-2中)，表型變得明顯差異化。與來自CD25-細胞的T細胞系相比，強抑制性的Treg細胞系表達了高水平的CD25并維持了這種提高的表達。圖18A和18B顯示了培養(yǎng)3周后的水平(MFI22vs.210)。MFI指平均熒光強度。另外，對CTLA4的細胞內(nèi)染色說明了抑制細胞系中提高的表達(MFI8vs.64)(圖18D，18E)。CD25和細胞內(nèi)CTLA4表達的差別是在我們研究中所確定的最不同的表型特征，來區(qū)別常規(guī)的和CD25+衍生的細胞系。弱抑制性細胞系表達了中等水平的這些關(guān)鍵抗原(圖18C、18F)。
為確定弱細胞系和強細胞系之間的進一步差別，進行了額外的細胞表面抗原分析。記錄了3種抗原(CD62L、CCR7和CD27)的比較，強抑制細胞系中表達這些抗原的細胞百分比高于弱細胞系(圖18G、18H、18I)。為進一步評價功能相關(guān)性，使用磁性珠來分離CD62L+或CD27+細胞(最亮的兩種抗原)，并因在兩種陽性亞型中的抑制活性而富集(數(shù)據(jù)未顯示)。為更確切的確定這些細胞系亞型的功能，細胞系被分類為CD62L+/CD27+、CD62L+/CD27-和CD62L-/CD27+細胞(圖18J)，并檢測每種細胞群在MLR中的抑制活性。
抑制性功能只單獨存在于CD62L+/CD27+亞型中。相反，發(fā)現(xiàn)其他亞基放大了MLR(圖18K)。因此，CD4+CD25+細胞系能包含抑制性和非抑制性細胞的混合物，而抑制作用可以是支配性的超過非抑制細胞的放大作用。CD62L和CD27共表達能夠用來區(qū)分這些亞型并促進具有強抑制潛力的細胞系(或細胞系亞型)的篩選。
MLR實驗中抑制細胞功能的鑒定。為確定MLR實驗中抑制的細胞機制，選出有效細胞系(＞90％第6天MLR抑制)來進一步分析。它們首先表現(xiàn)出一貫的抑制性，然后經(jīng)滴定來測定有效抑制所需的最少細胞數(shù)目。為確定培養(yǎng)的Treg細胞有多廣泛的反應(yīng)性，測試了幾種獨立細胞系在8個單獨的HLA錯配MLR培養(yǎng)物中的抑制作用。在所有情況下，培養(yǎng)的Treg細胞顯著抑制了所有接受分析的MLR培養(yǎng)物(圖19A)。盡管抑制強度存在一些變化(平均92％，范圍81-98％，n＝16)，但有效Treg細胞系在能有效抑制幾乎所有MLR培養(yǎng)物。
為定量有效抑制所需的最少數(shù)目，將滴定數(shù)目的抑制細胞加入指示MLR培養(yǎng)物。滴定曲線(圖19B)顯示了一個轉(zhuǎn)折點，抑制細胞與響應(yīng)細胞的比例低于1∶10(5000抑制細胞對50000響應(yīng)細胞)。該滴定曲線是非線性的，可以說明低Treg細胞劑量在抑制重疊中的協(xié)同作用。受抑制的MLR中，所有時間點上的繁殖都幾乎完全受損，表明抑制作用發(fā)生在前3天內(nèi)，即在MLR中出現(xiàn)增殖之前。為評價免疫反應(yīng)質(zhì)量的早期效果并尋找潛在的調(diào)節(jié)細胞偏離，評估了MLR上清液中的細胞因子含量。存在細胞因子富集的顯著抑制作用。受抑制的MLR形成了最低限度可檢測的IL-2的小型早期波形(在實驗的敏感度閾值)，沒有可檢測到的后期產(chǎn)物(圖19C)。對照MLR證明了上清液中IL-2的富集，甚至在培養(yǎng)開始后一天；早在受抑制MLR的第一天，就已經(jīng)檢測到顯著的抑制作用。另外，后期細胞因子的富集(峰一般在第5-7天)，如TNF-α、IFN-γ、GM-CSF5和IL-6，在整個培養(yǎng)過程中幾乎完全被阻礙(圖19D)。細胞因子上清液在Luminex裝置上被分析，其中小體積(50-100μl)能滿足同時測試多個細胞因子，沒有用來指示偏離TH2或T調(diào)節(jié)1型(Tr1:IL-10生成)分化的IL-4或IL-10誘導(dǎo)。事實上，IL-10富集被有效防止。
為檢測MLR早期的響應(yīng)T細胞活性，通過流式細胞儀來檢測細胞活化標志物的表達。使用來源于HLAA2陽性供體的響應(yīng)細胞和來源于HLA-A2陰性供體的抑制細胞，響應(yīng)細胞能夠在共培養(yǎng)中被區(qū)分。在誘導(dǎo)CD69、CD25和OX40(CD134)的培養(yǎng)開始后24或28小時，評價對照和受抑制的MLR細胞。在對照MLR中，2-4％的響應(yīng)T細胞顯示了這些活化抗原的表達(圖20A-C)，與預(yù)期的用于HLA錯配MLR的異體反應(yīng)性T細胞頻率相一致。值得注意的是，在受抑制的MLR中，很少有響應(yīng)T細胞顯示出這些活化抗原的表達(圖20D-F)。這些數(shù)據(jù)還證明了非常早期的T細胞活化阻斷作為Treg細胞作用的機制。
如果DC刺激的MLR被活化或成熟，抑制活性被明顯保留。DC的成熟/活化，使用脂多糖(一種TLR4配基)或聯(lián)合腫瘤壞死因子/多聚IC(一種雙鏈RNA類似物-TLR3配基)(Spisek等人，2001，同上；Godfrey等人，2004，同上)，沒有導(dǎo)致抑制的繞過(圖20G)。將LPS或TNF/PolyIC包括入MLR培養(yǎng)物中也沒有繞過抑制。因此，經(jīng)培養(yǎng)的人Treg細胞是非常有效的，并且表達大量共刺激分子和細胞因子的經(jīng)活化的DC沒能繞過它們的抑制作用。
MLR有效的早期抑制表明APC失活或消除是一種可能的抑制機制。但是，通過顯微評估，DC表現(xiàn)為持續(xù)整個培養(yǎng)過程。另外，在鉻釋放實驗中，抑制細胞系對異體DC(圖21A)或NK/LAK敏感靶細胞(K562)沒有細胞毒性(圖21B)為確定已知免疫抑制因子是否介導(dǎo)了培養(yǎng)的Treg細胞的作用，能夠中和IL-10或TGF-β抗體的抗體被加入對照和受抑制的MLR培養(yǎng)物中。因為抑制作用的效力，加入較低數(shù)量的抑制細胞來使實驗對抑制的逆轉(zhuǎn)更敏感。盡管數(shù)量減少了，與IL-10、IL-10R-或TGF-β123反應(yīng)的抗體沒能逆轉(zhuǎn)抑制，所有三個抗體一起具有非常適度的作用(圖21C)。
另外，進行了轉(zhuǎn)孔實驗來確定Treg細胞釋放的可溶性因子能否轉(zhuǎn)移抑制。抑制性MLR細胞培養(yǎng)于靜止或活化的Treg細胞或受抑制的MLR培養(yǎng)物之上，經(jīng)孔徑為0.4微米的膜分離。沒有發(fā)現(xiàn)抑制性細胞通過膜(未顯示)。
重要的是，當培養(yǎng)的Treg細胞被加入APC衍生的異體MLR，所述APC來源與抑制細胞供體相同但與響應(yīng)T細胞是異體的，最小抑制被指明(圖21D)。因此，當衍生于供體A的經(jīng)培養(yǎng)的Treg被加入到來自同一供體A的DC所衍生的異體MLR中時，有最小的抑制。但是，當這些相同的Treg細胞被加入到來自供體B的DC衍生的MLR中時，產(chǎn)生了抑制。這些結(jié)果表明，經(jīng)培養(yǎng)的Treg細胞不是組成性抑制所有MLR。經(jīng)培養(yǎng)的Treg需要某種形式的特殊的附加刺激，能夠由異體DC提供(而不是由自體DC提供)。
總之，本實施例證明，抑制細胞能夠從人血液中被分離并培養(yǎng)增殖。重要的是，這些經(jīng)培養(yǎng)的Treg細胞能夠擴增100倍以上，并且純的細胞能表現(xiàn)出提高的、有效的抑制活性。事實上，MLR實驗中這些細胞的抑制功能已經(jīng)表現(xiàn)出幾乎完全阻斷HLA錯配MLR。而且，這些培養(yǎng)增殖的抑制細胞具有許多新分離的CD4+CD25+Treg細胞的標志性特征。它們高度表達CD25和細胞質(zhì)的CTLA4，它們的活性是細胞-細胞接觸依賴性的，并且抑制作用似乎不依賴細胞溶解活性或免疫抑制性細胞因子IL-10或TGFβ。
另外，這些數(shù)據(jù)是首次證明了基于抗CD3/28mAb包被磁珠的方法用于細胞活化增殖的可行性。抑制性細胞系與DC直接共培養(yǎng)中沒有增殖性反應(yīng)。當抗CD28與抗CD3mAb結(jié)合時，形成了一種更有效的增殖策略。盡管基于抗CD3/28mAb包被磁珠和IL-2補加活性，但是經(jīng)嚴格純化的CD4+CD25+細胞(或FACS分類純化的CD4+CD25+明亮細胞)沒有生長良好。更好的生長是由于CD4+CD25-滋養(yǎng)細胞的加入，提供了IL-2和其他生長因子。CD4+CD25+細胞系生長和抑制功能是可變的并反向相關(guān)的，可能因為弱抑制功能的細胞系緣于CD4+CD25+培養(yǎng)物中含有少量常規(guī)T細胞。源于更嚴格純化的細胞的細胞系也沒有良好生長，但是具有更有效的抑制。另外，弱抑制性細胞系的免疫表型(CD25中度，分為CD62L或CD27)與常規(guī)和抑制性細胞的混合細胞群相一致。但值得注意的是，在培養(yǎng)后，功能性活性抑制細胞只限于CD62L和CD27表達細胞群，有效的抑制細胞系幾乎都表達這些抗原。
重要的是，CD4+CD25+細胞的抑制效應(yīng)功能是不受MHC限制的，抑制細胞將影響實際上來自任何供體組合的響應(yīng)。這種HLA限制的缺乏也提供了利用第三方(異體的)供體來產(chǎn)生抑制細胞的可能性。將本文公開的概念和機制應(yīng)用于人類疾病的發(fā)病機理，然后分離Treg細胞用于體外處理并按照本發(fā)明方法長期培養(yǎng)增殖該Treg細胞，隨后將由此培養(yǎng)的Treg注入患者，從而提供了治療自身免疫反應(yīng)或改善骨髓或其他移植效果的方法。大量經(jīng)培養(yǎng)的Treg細胞的獲得將實現(xiàn)這些重要細胞更具體的免疫、生化和分子特征。但是，也許是更重要的，因為本方法能適應(yīng)GMP條件，可以很快實現(xiàn)臨床實驗，經(jīng)培養(yǎng)的Treg細胞可以作為一種新型免疫抑制療法而獲得批準。
本文所引用或描述的每個專利、專利申請和出版物的公開以其完整形式引入本文作為參考。
而上述說明書已經(jīng)通過確定的優(yōu)選實施方式被描述，許多細節(jié)的提出是為了說明目的，顯然，對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，在不偏離本發(fā)明構(gòu)思和范圍的條件下，本發(fā)明可以具有多種調(diào)整和其他的實施方式，本文描述的確定的細節(jié)可以有大的變化，只要不偏離本發(fā)明的基本原理。這樣的調(diào)整和其他實施方式也落入權(quán)利要求書的保護范圍。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)抑制活性提高的治療性人T調(diào)節(jié)細胞(Treg細胞)的方法，所述方法包括選擇CD4+T細胞樣品；從所述樣品中分離人類CD4+CD25+抑制T細胞群，并通過符合GMP的方法在體外長期培養(yǎng)增殖所述CD4+CD25+細胞，從而激活所述分離并培養(yǎng)增殖的細胞中有效的長期抑制活性，其中，在增殖前，天然的CD4+CD25+抑制細胞群在全部分離CD4+T細胞群中的百分比低。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中CD4+CD25+細胞的分離具有高度嚴格性。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述CD4+CD25+細胞的分離還包括充分增加該細胞群中CD4+CD25明亮細胞，同時充分清除該細胞群中的CD4+CD25暗淡細胞，來純化所述分離細胞。
4.權(quán)利要求1-3中任何一項所述的方法，其中所述純化方法包括以預(yù)先確定的微珠與細胞的比例將所述分離細胞與結(jié)合了抗CD25的磁性微珠接觸；將微珠和細胞的混合物流經(jīng)磁性柱來分離微珠結(jié)合細胞，洗滌，再流經(jīng)第二個磁性柱，再次洗滌，直至經(jīng)純化的分離細胞中殘留的非抑制細胞＜1-2％。
5.權(quán)利要求1-4中任何一項所述的方法，其中所述培養(yǎng)增殖CD4+CD25+細胞包括使用兩個步驟和可分離的、細胞大小的、抗體包被的磁性微珠，通過第二代譜系清除方案來激活分離的細胞，進而以充足的時間來擴增培養(yǎng)增殖的Treg抑制細胞，直至細胞培養(yǎng)物中生成有效量的抑制細胞來獲得對人體中免疫或自身免疫反應(yīng)的治療性抑制。
6.權(quán)利要求1-5中任何一項所述的方法，其中微珠由抗CD3和CD28抗體所包被，從而增強了再生障礙性抑制Treg細胞的活化和生長。
7.權(quán)利要求1-6中任何一項所述的方法，還包括補充介質(zhì)，用于用IL-2培養(yǎng)增殖細胞。
8.權(quán)利要求1-6中任何一項所述的方法，還包括在培養(yǎng)的14天內(nèi)獲得至少10-20倍的細胞擴增。
9.權(quán)利要求1-8中任何一項所述的方法，還包括通過額外培養(yǎng)細胞1-2周來獲得至少100倍的細胞擴增。
10.權(quán)利要求1-6中任何一項所述的方法，還包括生成保留有長期向下調(diào)節(jié)抑制功能的抑制細胞系。
11.權(quán)利要求1-10中任何一項所述的方法，其中所述樣品選自全部或部分純化的血液或造血細胞，所述全部或部分純化的血液或造血細胞選自外周血液單核細胞；外周血液淋巴細胞；脾細胞；腫瘤浸潤性淋巴細胞和淋巴結(jié)細胞；和骨髓和外周骨髓細胞。
12.經(jīng)活化及體外培養(yǎng)增殖的抑制Treg細胞群，根據(jù)權(quán)利要求1-11中任何一項所述的方法生成，其中抑制功能被長期保留并且增殖的細胞數(shù)目足夠用于人體中的有效治療。
13.經(jīng)活化及體外培養(yǎng)增殖的抑制Treg細胞群，根據(jù)權(quán)利要求1-12中任何一項所述的方法生成，其中抑制細胞首先被高度嚴格純化，其中抑制功能被長期保留并且增殖的細胞數(shù)目足夠用于人體中的有效治療。
14.一種抑制異體反應(yīng)性T細胞增殖和細胞因子生成的方法，包括將所述異體反應(yīng)性T細胞與根據(jù)權(quán)利要求1-12中任何一項所述方法生成的、經(jīng)活化的、長期體外培養(yǎng)增殖的Treg細胞相接觸。
15.一種抑制CTL活性的方法，包括將所述細胞與根據(jù)權(quán)利要求1-13中任何一項所述方法生成的、經(jīng)活化的、長期體外培養(yǎng)增殖的Treg細胞相接觸。
16.一種獲得患者體內(nèi)免疫抑制作用的方法，包括為患有異體反應(yīng)或自身免疫反應(yīng)的患者注入根據(jù)權(quán)利要求1-13中任何一項所述方法生成的、有效量的、經(jīng)活化的、長期體外培養(yǎng)增殖的Treg細胞，來獲得對所述反應(yīng)的治療性抑制。
17.權(quán)利要求14-16中任何一項所述的方法，還包括抑制、阻斷或限制患者體內(nèi)異體反應(yīng)或自身免疫反應(yīng)，包括為患有所述異體反應(yīng)或自身免疫反應(yīng)的所述患者注入有效量的、經(jīng)活化的、長期體外培養(yǎng)增殖的Treg細胞。
18.權(quán)利要求14-16中任何一項所述的方法，其中所述患者的反應(yīng)發(fā)生在組織移植之后，其中所述方法還包括抑制、阻斷或限制患者體內(nèi)的移植物抗宿主疾病。
19.一種在患者體內(nèi)獲得預(yù)防性治療作用的方法，包括在異體反應(yīng)或自身免疫反應(yīng)發(fā)生之前為所述患者注入根據(jù)權(quán)利要求1-13中任何一項所述方法生成的、有效量的、經(jīng)活化的、長期體外培養(yǎng)增殖的Treg細胞來預(yù)防所述反應(yīng)。
20.權(quán)利要求19所述的方法，還包括預(yù)防患者體內(nèi)的異體反應(yīng)或自身免疫反應(yīng)，通過在所述反應(yīng)發(fā)生之前為所述患者注入有效量的、經(jīng)活化的、長期體外培養(yǎng)增殖的Treg細胞。
21.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述患者在組織移植之前、同時或之后立刻接受治療，其中所述方法還包括預(yù)防所述患者體內(nèi)移植物抗宿主疾病的發(fā)生。
22.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述患者在組織移植之前、同時或之后立刻接受治療，其中所述方法還包括阻斷所述患者體內(nèi)的植入組織的排斥反應(yīng)。
全文摘要
基于調(diào)節(jié)性T細胞(Treg細胞)與細胞毒性T細胞反應(yīng)的抑制或預(yù)防之間的密切關(guān)系，提供了體外生產(chǎn)經(jīng)活化并培養(yǎng)增殖的、分離的CD
文檔編號A61K35/12GK1981031SQ200580014536
公開日2007年6月13日 申請日期2005年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月5日
發(fā)明者B·R·布萊澤爾, C·朱恩, W·R·歌德弗雷, R·G·卡洛爾, B·萊文, J·L·芮雷, P·泰勒 申請人:賓久法尼亞大學理事會