一種人免疫活性細胞dc-cik細胞制劑及其有效制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種人免疫活性細胞DC-CIK細胞制劑及其有效制備方法。
【背景技術】
[0002]近年來，隨著生物技術的發(fā)展，研宄發(fā)現(xiàn)非特異性免疫細胞可以殺傷癌細胞的干細胞，防止癌細胞的復發(fā)和轉移(R.Tallerico et al，The Journal of Immunology，2013，190(5):2381-90) ?目前應用最多的非特異性免疫細胞治療方法是CIK細胞、DC-CIK細胞治療。
[0003]樹突狀細胞(dendritic cell，DC)是目前研宄發(fā)現(xiàn)的人體內功能最強的專職抗原提呈細胞(antigen presenting, APC)它能識別抗原，激活獲得性免疫系統(tǒng)；而細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine-1nduced killers, CIK細胞)是一種增殖能力強，非特異性殺傷癌細胞的免疫細胞。
[0004]DC細胞就像“雷達”，能識別抗原，激活免疫應答；CIK細胞就像“導彈”，能通過發(fā)揮自身細胞毒性，分泌細胞因子，精確殺傷腫瘤細胞?！袄走_+導彈”產(chǎn)生了一個高效和諧的免疫系統(tǒng)。臨床證明，DC-CIK細胞療法能克服手術、放療、化療三大傳統(tǒng)治療方式的“不徹底、易轉移、副作用大”等弊端，部分患者可提高三到五年生存率，是國際公認的有望消滅癌細胞的腫瘤治療新技術。
[0005]研宄證明DC細胞與CIK細胞共培養(yǎng)后產(chǎn)生的細胞比同源CIK細胞具有更強的增殖活性，DC細胞能促進CIK細胞的增殖，提高CIK細胞的抗癌細胞活性，同時DC-CIK細胞共培養(yǎng)時上清液也能促進DC細胞的成熟(Marten，A et al J Immunother，2001，24(6):502-510)。
[0006]DC-CIK細胞的常規(guī)培養(yǎng)方法都是先從人外周血單個核細胞(PBMC)中分離出貼壁的單核細胞和懸浮的淋巴細胞后再分別誘導，等到單核細胞誘導出成熟的DC細胞后再與懸浮的淋巴細胞共同培養(yǎng)，該方法操作繁瑣，容易造成污染，增殖速度慢，需要培養(yǎng)20天以上。近年來有人對DC-CIK細胞的培養(yǎng)方法進行了改進，直接在單個核細胞的培養(yǎng)基中加入細胞因子和刺激因子，簡化了操作步驟，培養(yǎng)時間也有所縮短，但仍需15?17天，且所得的DC-CIK細胞對癌細胞的殺傷活性不夠強，只能達到32.9%。根據(jù)以往的研宄報道可知，在免疫細胞培養(yǎng)過程中，細胞因子的添加種類、添加順序、添加量是影響免疫細胞增殖速度和殺傷活性的主要因素，因此可以通過優(yōu)化DC-CIK細胞培養(yǎng)方案來達到提高DC-CIK細胞的增殖速度和殺傷活性。由于DC-CIK細胞的常規(guī)培養(yǎng)方法培養(yǎng)時間長且培養(yǎng)所得的DC-CIK細胞殺傷活性低，這些缺陷阻礙了 DC-CIK細胞在臨床上的推廣應用。因此縮短DC-CIK細胞的培養(yǎng)時間與提高DC-CIK細胞的殺傷活性是當前需要解決的問題。

【發(fā)明內容】

[0007]為了解決現(xiàn)有技術存在的問題和缺陷，即DC-CIK細胞增殖速度慢和對癌細胞的殺傷活性低，本發(fā)明通過優(yōu)化培養(yǎng)方案來達到提高DC-CIK細胞的增殖速度和對癌細胞的殺傷活性，目的是提供一種人免疫活性細胞DC-CIK細胞制劑及其有效制備方法。
[0008]為實現(xiàn)上述技術目的，達到上述技術效果，本發(fā)明通過以下技術方案實現(xiàn):
一種人免疫活性細胞DC-CIK細胞制劑的有效制備方法，具體包括以下步驟:
(O從人外周血中分離單個核細胞；
(2)將單個核細胞接種到無血清培養(yǎng)基中，加入IFNγ, GM-CSF, IL-4，培養(yǎng)I天；
(3)加入IL-2、IL-15、抗CD3單抗培養(yǎng)2天；
(4)加入TNFα，繼續(xù)培養(yǎng)I天促進DC細胞的成熟；
(5)加入IL-2和IL-15繼續(xù)增養(yǎng)8天，即得DC-CIK細胞；
(6)離心收集(I?5)X 19細胞，用0.9%生理鹽水洗滌2次，離心后棄上清，將細胞移至10ml輸液瓶中，并添加5ml 20%人血清白蛋白和10ml 0.9%的生理鹽水，制作成細胞懸液，即一種人免疫活性細胞DC-CIK細胞制劑。
[0009]進一步的，所述步驟(I)中的單個核細胞是采用人淋巴細胞分離液密度梯度離心的方法制備。
[0010]進一步的，所述步驟(2)中的單個核細胞的細胞濃度調整為2xl06/ml。
[0011]進一步的，所述步驟(2)中的無血清培養(yǎng)基由AM-V、LonzaX-VIV015和RPMI 1640培養(yǎng)基以1:1:1的比例配制而成。
[0012]進一步的，所述步驟(2)中的IFNy的濃度為500?1000U/ml、GM-CSF的濃度為800U/ml、IL-4 的濃度為 500 ?1000U/ml。
[0013]進一步的，所述步驟(3)中的IL-2的濃度為100?500U/ml、IL_15的濃度為10?20ng/ml、抗CD3單抗的濃度為10?50ng/ml。
[0014]進一步的，所述步驟(4)中的TNFa的濃度為500?1000U/ml。
[0015]進一步的，所述步驟(5)中的IL-2的濃度為500?1000U/ml、IL-15的濃度為10?20ng/ml。
[0016]本發(fā)明的優(yōu)點在于:
(I)本發(fā)明是優(yōu)化了的DC-CIK細胞培養(yǎng)方案，不僅縮短了細胞培養(yǎng)時間，將培養(yǎng)時間從15天縮短到12天，且有效地提高了 DC-CIK細胞的增殖速度和對癌細胞的殺傷活性，采用本發(fā)明的培養(yǎng)方案培養(yǎng)12天所得細胞增殖數(shù)量與采用常規(guī)培養(yǎng)方案培養(yǎng)15天所得細胞增殖數(shù)量相比無明顯差異，且對癌細胞的殺傷活性從32.9%提高到41.3%。
[0017](2)本發(fā)明的DC-CIK細胞聯(lián)合使用，充分發(fā)揮了 DC細胞與CIK細胞的優(yōu)勢，不僅能精確殺傷腫瘤細胞，而且能增強腫瘤患者特異性抗腫瘤免疫應答，有效清除體內殘留病灶。
[0018](3)本發(fā)明的DC-CIK細胞共培養(yǎng)時DC細胞能促進CIK細胞的增殖，提高CIK細胞的抗癌細胞活性，同時上清液也能促進DC細胞的成熟，且將DC-CIK細胞同時培養(yǎng)可以避免常規(guī)培養(yǎng)方法的操作繁瑣，操作過程中容易造成污染等缺點。
【附圖說明】
[0019]此處所說明的附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，構成本申請的一部分，本發(fā)明的示意性實施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構成對本發(fā)明的不當限定。在附圖中: 圖1是DC-CIK細胞培養(yǎng)增殖倍數(shù)折線圖，橫坐標表示細胞培養(yǎng)天數(shù)，縱坐標表示細胞的增殖倍數(shù)，實施例1.1為本發(fā)明的培養(yǎng)方案，實施例1.2為對照組；
圖2是DC-CIK細胞表型分析柱狀圖，橫坐標表示的是ra3+ra56+和nkg2d，縱坐標表示這三種表型的表達水平，實施例1.1為本發(fā)明的培養(yǎng)方案，實施例1.2為對照組；
圖3是DC-CIK細胞對癌細胞的殺傷活性柱狀圖，兩個柱狀圖分別對應的實施例1.1和實施例1.2，縱坐標表示DC-CIK細胞對乳腺癌細胞系ZR-75-1的殺傷率，實施例1.1為本發(fā)明的培養(yǎng)方案，實施例1.2為對照組。
【具體實施方式】
[0020]以下通過具體實施，對本發(fā)明做進一步具體說明:
實施例1 DC-CIK細胞的制備
1.1通過本發(fā)明優(yōu)化后的DC-CIK細胞的制備(實驗組)
具體制備步驟如下:采集患者外周血，經(jīng)人淋巴細胞分離液密度梯度離心分離出單個核細胞。將單個核細胞接種到無血清培養(yǎng)基中，調整細胞濃度為2xl06/ml，添加IFN-γ (2000U/ml)、IL-4 (500U/ml)、GM-CSF(800U/ml)在 37°C 5%C02條件下培養(yǎng)，I 天后加入